CN108912348B - 含有蛋白的短肽水凝胶和提高蛋白储存稳定性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种含有蛋白的短肽水凝胶和提高蛋白储存稳定性的方法。所述方法可以明显提高蛋白的储存稳定性。所述含有蛋白的短肽水凝胶为，将短肽与蛋白混合于水溶液中，在2‑6℃(例如4℃)酶促作用下使所述短肽与所述蛋白共组装形成水凝胶，所述短肽可在酶促作用下形成稳定的水凝胶，所述稳定的水凝胶是指在室温下放置15天以上仍可以保持凝胶状态。优选的，所述短肽序列为NBD‑GDFDFpDY。所述方法为，将可在酶促作用下形成水凝胶的短肽与蛋白混合于水溶液中，在2‑6℃酶促作用下使所述短肽与所述蛋白共组装形成水凝胶，储存所述共组装形成的水凝胶。
Description
技术领域
本发明涉及一种含有蛋白的短肽水凝胶和提高蛋白储存稳定性的方法。
背景技术
蛋白疗法近些年也因为其独特的优势迅速发展。人体内的一些生理活性物质如胺类、酶、短肽类激素、神经递质、抗体、核蛋白以及细胞膜上、血液中具有“载体”作用的蛋白都离不开蛋白质，它对调节生理功能，维持新陈代谢起着极其重要的作用。免疫和防御功能是生物体为了维持自身的生存而持有的多种类型的防御手段，其中也有不少是靠蛋白质来执行的。例如抗体即是一类高度专一的蛋白质，它能快速识别和结合侵入生物体本身的外来物质，如异体蛋白质、病毒和细菌等，消灭对方而对自己进行保护。
但是无论是抗体还是蛋白都面临着不稳定、不易保存的缺点，蛋白在37℃的溶液中往往在短时间内就完全降解。如何提高蛋白的储存稳定性是一个亟待解决的问题。
发明内容
发明目的
发明人发现芳香族基团封端的短肽通常可以在酶催化作用(简称酶促作用)下形成稳定的水凝胶。我们用所述短肽与蛋白于水溶液中简单物理混合后，于2-6℃条件下在酶促作用下进行共组装，形成的水凝胶大大提高了蛋白的稳定性。
鉴于上述发现，本发明的一个目的是提供一种含有蛋白的短肽水凝胶，其中含有的蛋白的储存稳定性得到明显提高。
本发明的另一个目的是提供一种提高蛋白储存稳定性的方法。
发明概述
根据本发明的第一方面，本发明提供了一种含有蛋白的短肽水凝胶，将短肽与蛋白混合于水溶液中，在2-6℃(例如4℃)酶促作用下使所述短肽与所述蛋白共组装形成水凝胶，所述短肽可在酶促作用下形成稳定的水凝胶，所述稳定的水凝胶是指在室温下放置15天以上仍可以保持凝胶状态。所述形成水凝胶或保持凝胶状态通过本领域常用的倒置小瓶的方法进行检验，其中保持凝胶状态是指将瓶底装有凝胶的小瓶倒置，凝胶保持不动，同时没有液体流出。
“短肽”为本领域常用术语，指由3-9个氨基酸残基组成的短链肽。
优选的，所述短肽序列为NBD-GDFDFpDY。具体的，NBD-GDFDFpDY的结构式如下：
所述短肽可采用公知的Fmoc-固相合成方法合成，合成方法可参考文献(Nanotechnology,2010,21(22):225606.)。
具体的，所述蛋白可以为抗HPV蛋白，这是一种与HPV病毒相关的蛋白，临床上用于消除HPV病毒。
所述在酶促作用下形成水凝胶的方法为现有技术，可根据短肽的结构选择特异性作用的酶物质。
通过共组装过程，所述蛋白被包裹进入水凝胶纤维中，进而明显提高所述蛋白的储存稳定性。所述共组装形成的水凝胶中短肽和蛋白的含量可由实验确定，以最终可以形成稳定的水凝胶，且蛋白被基本包裹在水凝胶中为准。优选的，所述蛋白的质量不超过所述短肽质量的15％。一般的，水凝胶中短肽的质量百分比为千分之二左右，例如千分之一到千分之三。
根据本发明的第二方面，本发明提供了一种提高蛋白储存稳定性的方法，将可在酶促作用下形成水凝胶的短肽与蛋白混合于水溶液中，在2-6℃酶促作用下使所述短肽与所述蛋白共组装形成水凝胶，储存所述共组装形成的水凝胶。
优选的，于不超过37℃的条件下储存所述共组装形成的水凝胶。
优选的，所述短肽序列为NBD-GDFDFpDY。
具体的，所述蛋白可以为抗HPV蛋白；所述蛋白的质量不超过所述短肽的15％(例如10％-15％)。
本发明的有益效果为：
本发明通过将蛋白和短肽在酶促作用下进行共组装形成水凝胶的方法，大大提高了蛋白的储存稳定性。有些蛋白在37℃的溶液中往往在短时间内(不超过3天)就完全降解，而在本发明实施例所述的共组装水凝胶中37℃条件下放置超过15天(采用所述优选的短肽NBD-GDFDFpDY则可以放置超过30天)，蛋白仍然可以稳定存在。
附图说明
图1：NBD-GDFDFpDY短肽与15％wt蛋白在4℃条件下的共组装情况考察(上清代表共组装体离心后上清溶液的条带，沉淀是代表共组装体离心后沉淀纤维的条带)。
图2：NBD-GDFDFpDY短肽与15％wt蛋白共组装后的稳定性考察(条件：37℃，其中3天代表游离蛋白的条带，30天代表短肽与15％wt蛋白共组装后的条带)。
具体实施方式
下面用实施例进一步描述本发明，但所述实施例仅用于本发明而不是限制本发明。
以下实施例中，通过本领域常用的倒置小瓶的方法检验水凝胶的形成与否。
以下实施例中所涉及制剂来源如下：
2-Cl-Trt树脂，来自天津南开和成科技有限公司，活性1.2mmol/mL；
苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(以下用HBTU表示)，来自吉尔生化(上海)有限公司，纯度98％；
N,N-二异丙基乙胺(DIEPA表示)，来自西格马奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，纯度99％；
三氟乙酸(以下用TFA表示)，来自西格马奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，纯度99％；
三异丙基硅烷(以下用TIS表示)，来自西格马奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，纯度99％；
碱性磷酸酶(ALP)，来自百灵威科技有限公司；
D构型氨基酸，来自吉尔生化(上海)有限公司，纯度98％；
4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并氧杂恶二唑(以下用NBD-Cl表示)，来自百灵威科技有限公司，纯度99％。
抗HPV蛋白溶液：浓度为1mg/mL，由南开大学生命科学学院生物化学与分子生物学系提供。
以下实施例中所涉及设备如下：
高效液相色谱仪(德国Lumtech，HPLC)
透射电子显微镜(Tecnai G2F20系统)；
冷冻干燥机(北京亚泰科隆，LGJ-1-50)；
全数字核磁共振仪(德国Bruker，Bruker 400M)。
NBD-β-Alanine(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-β-丙氨酸)的合成(合成路线如下图所示)：
1)在15mL水中加入980mg的β-Alanine和4.14g碳酸钾，2g的NBD-Cl溶于20mL甲醇中，然后在氮气保护作用下逐滴加入到水系中(注意没有氮气保护的话产率会很低)，室温反应3小时；
2)旋蒸除去甲醇；
3)水溶液用盐酸调pH到3，乙醚萃取3次；
4)水溶液用硫酸镁干燥后旋蒸。
得到的黄色固体可以直接用于固相合成，产率85％左右。
制备实施例1
短肽与蛋白或者抗体共组装体的制备
(1)用Fmoc-固相合成方法合成D构型短肽NBD-GDFDFpDY，结构式如下：
具体步骤如下：
1)溶胀：称取0.5mmol的2-Cl-Trt树脂于固相合成管中，然后加入10-15mL的无水二氯甲烷(以下称DCM)，放置在摇床上摇晃10-15min，使2-Cl-Trt树脂充分溶胀；
2)用洗耳球把DCM移除；
3)称取0.75mmol Fmoc保护的氨基酸pDY溶解在10mL的无水DCM里，加入1.5mmol的DIEPA，充分溶解后转移到上述固相合成管中，在室温下反应1.5-2h；
4)封闭：用洗耳球除去固相合成器中的反应液，然后用10mL无水DCM洗涤，1min/次，共洗3-5次，加入体积比为无水DCM∶甲醇∶DIEPA＝17∶2∶1的封闭液10mL，在室温下封闭15min；
5)洗涤：先用无水DCM洗涤，DCM用量10mL，1min/次，共洗3-5次，再用N,N-二甲基甲酰胺(以下均用DMF表示)洗涤，每次用量10mL，1min/次，共洗3-5次，加入10mL含体积百分比为20％哌啶的DMF，切割保护基Fmoc 30-40min，然后DMF洗涤，每次DMF用量10mL，1min/次，共洗3-5次，准备加下一个氨基酸；
6)加入的第二个Fmoc保护的氨基酸1mmol、HBTU 1mmol、DIEPA 2mmol和15ml DMF，充分溶解后加入固相反应器中，反应2h；
7)DMF洗涤，每次DMF用量10mL，1min/次，共洗3-5次；然后加入10mL含体积百分比为20％哌啶的DMF，切割保护基Fmoc 30-40min，然后用DMF洗涤，每次DMF用量10mL，1min/次，共洗3-5次，准备加下一个氨基酸；
8)重复6)-7)的步骤顺序加入氨基酸，直到最后将封端化合物NBD-β-Alanine加上；
8)DMF和DCM分别洗，每次用量均为10mL，1min/次，分别洗3-5次以后切割，按95％TFA，2.5％TIS，2.5％H2O体积百分比组成的溶液10mL加入到固相合成管中切割30min，将产物从2-Cl-Trt树脂上切下，重复用DCM旋干，除去溶剂后用乙醚沉降，得到粗品，产率约90％左右。之后再用HPLC分离提纯冻干，得到纯品NBD-GDFDFpDY。
它的结构表征数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.48(d,J＝8.9Hz,1H),8.33(d,J＝7.5Hz,1H),8.18(d,J＝7.6Hz,1H),8.05(d,J＝8.3Hz,1H),7.29–6.99(m,2H),6.39(d,J＝8.9Hz,1H),4.59–4.35(m,1H),3.46–3.36(m,1H),3.07–2.82(m,1H),2.74(dd,J＝25.8,9.7Hz,1H),2.66–2.41(m,1H).
(2)取2mg D构型短肽NBD-GDFDFpDY置于4mL的玻璃瓶中，加入200微升或者300微升的抗HPV蛋白溶液，再加入PBS溶液(pH＝7.4)补齐到总体积为1mL，用1M的碳酸钠溶液将其pH值调节至7.4，充分混匀并且室温超声使其完全溶解，加入1U/mL的碱性磷酸酶后置于4℃条件下过夜存放，即可得到短肽与蛋白共组装的水凝胶。
对比制备例1
取2mg D构型短肽NBD-GDFDFpDY置于4mL的玻璃瓶中，再加入PBS溶液(pH＝7.4)补齐到总体积为1mL，用1M的碳酸钠溶液将其pH值调节至7.4，充分混匀并且室温超声使其完全溶解，加入1U/mL的碱性磷酸酶后置于4℃条件下过夜存放，得到仅含有短肽的水凝胶。
共组装体水凝胶分装到1.5mL离心管中，高速离心(15000rpm离心10min)，离心后纤维会和溶液分离。取纤维沉淀和上清液来跑凝胶电泳验证稳定性。结果如图1所示：上清代表离心后的上清液，沉淀代表离心后的沉淀纤维，抗HPV蛋白代表标准品，上清液没有游离的蛋白，而沉淀里有大量蛋白，说明在短肽与蛋白共组装的水凝胶中，蛋白都与凝胶纤维共组装到一起了。
稳定性考察和凝胶电泳
(1)短肽与蛋白共组装体的制备
取1mg D构型短肽NBD-GDFDFpDY置于4mL的玻璃瓶中，加入0.1mg或者0.15mg的蛋白抗HPV，再加入PBS溶液(pH＝7.4)补齐到总体积为500μL，用1M的碳酸钠溶液将其pH值调节至7.4，充分混匀并且室温超声使其完全溶解，加入1U/mL的碱性磷酸酶后置于4℃条件下过夜存放，即可得到短肽与蛋白共组装的水凝胶。
(2)稳定性考察
样品制备完成后，将抗HPV蛋白溶液转移至1.5mL离心管中，将共组装的水凝胶也分装到1.5mL离心管中，并将上述所有样品置于37℃恒温环境中放置。于不同的时间点将样品取出利用凝胶电泳检测蛋白的降解情况。
(3)凝胶电泳
因为共组装体形成了水凝胶，所以要证明蛋白的稳定性或者降解情况，需要将水凝胶高速离心(15000rpm离心10min)，离心后纤维会和溶液分离，蛋白均包裹在纤维中，我们取纤维沉淀来跑凝胶电泳验证稳定性。对于游离的蛋白(即抗HPV蛋白溶液)直接上样来验证稳定性。凝胶电泳结果如图2所示。
(4)结果分析
图2中，抗HPV蛋白代表标准品，3天代表在37℃条件下放置3天的抗HPV蛋白溶液，30天代表放置30天的短肽与15％wt蛋白共组装的水凝胶。从图2的结果分析来看，相对于标准品，蛋白溶液中的抗HPV蛋白溶液几乎已经降解完全，但是共组装的水凝胶中的蛋白条带仍然很清晰，证明了蛋白在与短肽共组装的情况下可以在37℃下稳定存在超过30天。因为蛋白与抗体的储存是存在很多局限的，即使在4℃条件下蛋白和抗体也不可能稳定存在太久。而我们提供的酶促共组装方法无疑为蛋白与抗体的储存提供了一条新的途径。
Claims (3)
1.一种含有蛋白的短肽水凝胶，其特征在于，将短肽与蛋白混合于pH=7.4的PBS水溶液中，在2-6℃、碱性磷酸酶酶促作用下使所述短肽与所述蛋白共组装形成水凝胶，所述短肽可在酶促作用下形成稳定的水凝胶，所述稳定的水凝胶是指在室温下放置15天以上仍可以保持凝胶状态；
所述短肽序列为NBD-GDFDFpDY；
所述蛋白为抗HPV蛋白；
所述蛋白的质量不超过所述短肽的15%。
2.一种提高蛋白储存稳定性的方法，其特征在于，将可在酶促作用下形成水凝胶的短肽与蛋白混合于pH=7.4的PBS水溶液中，在2-6℃、碱性磷酸酶酶促作用下使所述短肽与所述蛋白共组装形成水凝胶，储存所述共组装形成的水凝胶；
所述短肽序列为NBD-GDFDFpDY；
所述蛋白为抗HPV蛋白；
所述蛋白的质量不超过所述短肽的15%。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，于不超过37℃的条件下储存所述共组装形成的水凝胶。
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