CN108884144B - 用于cd20免疫疗法的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本公开提供了用于治疗与CD20表达相关的疾病或病症的组合物和用途。本公开的治疗包括使用表达融合蛋白的宿主细胞，诸如抗CD20CAR，任选地与CD20特异性结合分子、化学治疗剂、免疫抑制成分的抑制剂或其组合结合使用。

Description

用于CD20免疫疗法的组合物和方法

权益的声明

本发明是在美国国立卫生研究院授予的CA81668的支持下完成，其对本发明具有一定的权利。

关于序列表的声明

本申请相关的序列表以文本格式替代纸件而提供，并以此通过引用并入说明书。包含序列表的文本文件的名称是360056_441WO_SEQUENCE_LISTING.txt。该文本文件为210KB，创建于2017年3月16日，并通过EFS网电子递交。

背景技术

转基因T细胞的过继转移已成为各种恶性肿瘤的有效疗法。最广泛采用的策略是输注表达靶向肿瘤相关抗原的嵌合抗原受体(CAR)的源自患者的T细胞。该方法具有许多理论上的优点，包括将T细胞靶向任何细胞表面抗原的能力，避免作为肿瘤逃逸机制的主要组织相容性复合物的丧失，并且采用单一载体构建体来治疗任何患者，而不管人白细胞抗原是否是单倍型。例如，迄今为止，针对B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)的CAR临床试验已经靶向在恶性淋巴细胞和正常B细胞上表达的CD19、CD20或CD22抗原(Brentjens et al.,SciTransl Med 2013；5(177):177ra38；Haso et al.,Blood 2013；121(7):1165-74；James etal.,J Immunol 2008；180(10):7028-38；Kalos et al.,Sci Transl Med 2011；3(95):95ra73；Kochenderfer et al.,J Clin Oncol 2015；33(6):540-9；Lee et al.,Lancet2015；385(9967):517-28；Porter et al.,Sci Transl Med 2015；7(303):303ra139；Savoldo et al.,J Clin Invest 2011；121(5):1822-6；Till et al.,Blood 2008；112(6):2261-71；Till et al.,Blood 2012；119(17):3940-50；Coiffier et al.,N Engl JMed 2002；346(4):235-42)。研究淋巴恶性肿瘤治疗的大多数研究者选择靶向CD19，因为该分子比CD20或CD22从B细胞分化的更早期阶段表达。因此，靶向CD19的CAR T细胞可用于治疗略微更广泛的B细胞恶性肿瘤，包括急性淋巴细胞白血病，其在B细胞前分化阶段出现。

然而，CD20仍然是一种吸引人的抗原，因为它作为成功的免疫治疗靶点具有广泛的临床记录，正如使用利妥昔单抗(一种靶向CD20的单克隆抗体)的试验所证明的(Coiffier et al.,N Engl J Med 2002；346(4):235-42；Lenz et al.,J Clin Oncol2005；23(9):1984-92；Marcus R,et al.,J Clin Oncol 2008；26(28):4579-86；Pfreundschuh et al.,Lancet Oncol 2011；12(11):1013-22)。与CD19相反，CD19在抗体结合时容易内化(Pulczynski等，Blood 1993；81(6)：1549-57)，CD20在抗体结合后经历内吞作用更慢(Press et al.,Blood 1994；83(5):1390-7；Pulczynski et al.,Leuk Res1994；18(7):541-52)。这种稳定性理论上可以影响免疫突触的质量和随后的CAR触发和T细胞活化。已经将肿瘤细胞上CD19表达的丧失描述为用CD19靶向的T细胞治疗的患者中的逃避机制(Grupp et al.,N Engl J Med 2013；368(16):1509-18)。虽然抗CD20抗体治疗后也已描述CD20缺失，但CD20特异性CAR T细胞提供了可以进行序贯治疗的替代靶点，或者可以与CD19 CAR T细胞一起使用以同时靶向多种抗原，从而通过抗原损失降低免疫逃逸的风险。

CD20作为CAR的靶抗原的一个潜在限制是，可能成为CAR T细胞治疗试验候选者的复发或难治性淋巴瘤患者最近将经常用含利妥昔单抗的方案治疗。由于抗体可在血清中存留数月，因此残留的利妥昔单抗可在理论上阻断CAR与CD20的结合并阻止或减弱T细胞活化，可能使治疗失效。在先前的CD20 CAR T细胞试验中(Till et al.,Blood 112:2261-71,2008；Till et al.,Blood 119:3940-50,2012)，合格标准排除了最近用利妥昔单抗治疗的患者。然而，这种方法显著影响应计项目，并最终限制了这种治疗对于最需要新治疗选择的患者的可用性。

目前，在免疫治疗领域仍然需要针对各种疾病，包括癌症(例如，白血病、淋巴瘤)的额外或替代免疫疗法的组合物和方法。目前公开的实施例解决了这种需要并提供了其他相关优点。

附图说明

图1A和1B显示了含有来自不同抗CD20抗体(Leu16、1F5和1.5.3)的scFv的CD20特异性CAR构建体的示意图。(A)显示CD20特异性CAR构建体及其各自的成熟CAR蛋白。(B)显示另外的成熟CD20特异性CAR蛋白。

图2A-2F显示利妥昔单抗和奥法木单抗阻断用于产生CAR scFv的抗体的抗原结合。将Ramos细胞(CD20⁺)与指定的利妥昔单抗(A-C)或奥法木单抗(D-F)浓度一起温育30分钟，然后与PE标记的抗CD20抗体(克隆Leu16)或同种型对照在4℃(A和D)或37℃(B和E)下温育30分钟。洗涤细胞并通过流式细胞术分析以确定通过PE荧光强度测量的可用的CD20结合位点。图2C和图2F中描述的曲线图分别总结了在4℃或37℃下作为利妥昔单抗或奥法木单抗浓度的函数的几何平均荧光强度(MFI)。数据代表三个独立实验。

图3A和3B显示利妥昔单抗在体外对CAR T细胞功能的影响。照射所示的B细胞NHL细胞系并在室温下以不同的利妥昔单抗浓度温育30分钟(在温育期间浓度为2倍，以在加入T细胞后产生指定的最终浓度)。将表达Leu16-28-BB-z-tEGFR CD20特异性CAR的CFSE染色T细胞以1：1的体积和比例加入靶细胞中。(A)4天后通过流式细胞术分析T细胞的增殖以进行CFSE稀释。在左轴(实心条)上显示分裂的CD3⁺T细胞相对于未刺激的T细胞的百分比。通过前向散射的几何平均值(仅减去培养基中细胞的大小)确定的CD3⁺T细胞的细胞大小显示在右轴(空心条)上。(B)使用再刺激后24小时的上清液，通过Luminex测定法测量这些T细胞的细胞因子分泌。白细胞介素(IL)-2浓度显示在左侧y轴上，干扰素(IFN)-γ和肿瘤坏死因子(TNF)-α显示在右侧y轴上。所示数据代表3次独立实验。

图4示出了利妥昔单抗对CAR T细胞介导的细胞毒性的影响。将指示的⁵¹Cr标记的靶细胞与利妥昔单抗预温育30分钟(温育期间浓度为2倍，以在加入T细胞后产生指定的最终浓度)，然后将表达Leu16-28-z CAR的CD8⁺T细胞以标准的5小时⁵¹铬释放试验中显示的E：T比例加入。模拟转导的T细胞和仅具有利妥昔单抗和靶细胞(“0:1”)的样品用作阴性对照。显示了多重孔的平均值，误差条代表标准偏差。数据代表4次独立实验的结果。

图5A-5C显示对利妥昔单抗阻断的敏感性取决于靶细胞上的CD20抗原密度。用CD80和CD20(“K80-20”)转导的K562细胞通过有限稀释克隆，选择高、中或低水平的CD20表达(图10)，并用作测定中的靶细胞(图5A)用于增殖和细胞大小(门控CD3⁺细胞的几何平均前向散射减去仅培养基中细胞的大小)，使用如图3描述的CFSE标记的Leu16-28-z CAR转导的T细胞；通过Luminex测定法在24小时测定从以上(图5A)Leu16-28-z CAR转导的T细胞的细胞因子分泌(图5B)；以及使用Leu16-28-z CAR转导的CD8⁺T细胞通过如图4所描述的⁵¹Cr释放测定法测定的细胞毒性(图5C)。数据代表三个独立实验。细胞因子分泌的绝对值如图11所示。

图6A和6B通过T细胞表达抗CD20 CAR显示了增殖和细胞因子分泌。分选健康的供体T细胞并使用抗CD3/28珠刺激，然后用编码1F5-28-BB-z CAR构建体的慢病毒载体转导。(A)在刺激后第9天，用CFSE标记CAR T细胞，用已经照射的K562-CD80-CD20(“K80-20”)或K562-CD80(“K80”)靶细胞再刺激，并且在4天后通过流式细胞术测量CFSE稀释度以测量T细胞增殖。显示了分裂的CD3⁺T细胞相对于未刺激的T细胞的百分比。模拟转导的T细胞用作阴性对照。(B)通过在再刺激后24小时从上述培养物中收集上清液样品并通过Luminex测定法分析指定的细胞因子浓度来确定T细胞的细胞因子分泌。

图7A-7E显示利妥昔单抗对CD20 CAR T细胞功能的体内作用。Nod-SCID-γ-/-(NSG)小鼠静脉注射(i.v.)5×10⁵利妥昔单抗难治性Raji-ffLuc淋巴瘤细胞，然后进行以下中的一个治疗：无治疗，5天后仅腹腔注射(i.p.)利妥昔单抗(25μg或200μg)，仅在肿瘤后6天施用10⁷个1.5.3-NQ-28-BBz CAR T细胞，或在第5天i.p.利妥昔单抗(25μg或200μg)然后在肿瘤后第6天i.p.10⁷个CAR T细胞。每周两次对小鼠成像以进行生物发光。(A)小鼠实验的模式。(B)通过全身生物发光测量每组在一段时间内的平均肿瘤负荷。显示了具有95％置信区间的几何平均发光值，并且为了防止肿瘤体积图中的误导性波动，每只小鼠的最后生物发光水平在其被杀死之后继续进行，直到该组中没有小鼠保留。各个生物发光痕迹如图13所示。(C)Kaplan-Meier图显示每个治疗组的总体存活率。(D)T细胞输注当天(第6天)和T细胞输注后第1周(第13天)的血清利妥昔单抗水平。水平条表示中值。(E)在前4个月内接受含利妥昔单抗的补救性化疗的淋巴瘤患者的血清利妥昔单抗水平。灰色水平条线表示中值，黑色水平条线表示四分位差范围(25-75％)。

图8A-8C显示了奥法木单抗在体外对CD20 CAR T细胞功能的影响。将照射的Rec-1或Raji-ffLuc细胞或未照射的⁵¹Cr标记的Rec-1细胞与2倍指定浓度的奥法木单抗预温育30分钟，然后使用图3和4的图例中描述的方法，进行实验以确定表达1.5.3--NQ-28-BB-z CAR的T细胞的功能。(A)在左轴(实心条)上显示分裂的CD3⁺T细胞相对于未刺激的T细胞的百分比。通过前向散射的几何平均值(仅减去培养基中细胞的大小)确定的CD3⁺T细胞的细胞大小显示在右轴(空心条)上。(B)使用再刺激后24小时的上清液，通过Luminex测定法测量这些T细胞的细胞因子分泌。IL-2浓度显示在左侧y轴上，以及IFN-γ显示在右侧y轴上。(C)使用Rec-1靶细胞的标准4小时⁵¹铬释放测定法确定1.5.3-NQ-28-BB-z CAR T细胞的细胞毒性。显示了多重孔的平均值，误差条代表标准偏差。

图9显示了通过流式细胞术测定的K80-20^低、K80-20^中、K80-20^高的CD20表达。空心直方图代表用FITC-缀合的1F5抗体(抗CD20)染色的细胞，填充的直方图代表用同种型对照抗体Ab染色的细胞。

图10示出了来自图5中实验的T细胞上清液的绝对细胞因子浓度。

图11A-11E显示具有完全人抗CD20 scFv的CAR T细胞的增殖、细胞因子分泌和细胞毒性。使用抗CD3/28珠刺激健康供体CD14^-CD45RA^-CD62L⁺中枢记忆T细胞，然后用编码1.5.3-NQ-28-z或1.5.3-NQ-28-BB-z CAR的慢病毒载体转导。用CFSE标记CAR T细胞，并用经照射的Raji-ffLuc、利妥昔单抗-难治性Raji-ffLuc(RR-Raji)或Rec-1靶细胞再刺激。(A)1.5.3-NQ-28-z T细胞的增殖通过4天后用于CFSE稀释流式细胞术分析细胞来评估。显示了分裂的CD3⁺T细胞相对于未刺激的T细胞的百分比。(B)通过在再刺激后24小时从上述培养物中收集上清液样品并通过Luminex测定法分析指定的细胞因子浓度来确定1.5.3-NQ-28-z T细胞的细胞因子分泌。IL-2和TNF-α浓度显示在左侧y轴上，以及IFN-γ标绘在右侧y轴上。(C)1.5.3-NQ-28-BB-z T细胞的细胞因子分泌如上文B部分确定。(D)使用指示靶细胞系的标准5小时铬⁵¹释放测定法确定1.5.3-NQ-28-BB-z CAR T细胞的细胞毒性。(E)如上文部分(A)中的1.5.3-NQ-28-BB-z T细胞的细胞因子分泌，并用Granta、Rec-1、FL-18或K80-20细胞刺激。

图12显示利妥昔单抗-难治性Raji-ffLuc具有与亲本Raji-ffLuc细胞相同的CD20表达。Raji-ffLuc(实线直方图)或利妥昔单抗难治性Raji-ffLuc(虚线直方图)细胞用抗CD20-PE或抗CD20-APC抗体染色，然后通过流式细胞术分析。显示了针对每种细胞系的相对于同种型对照抗体(填充直方图)的CD20表达。

图13A和13B显示来自图7用抗CD20 CAR T细胞处理的的异种移植瘤小鼠模型的生物发光痕迹和图像。(A)个体小鼠在一段时间内生物发光肿瘤负荷。每行代表一只单独的小鼠。灰线代表没有肿瘤的小鼠，其定义了基线自发荧光。(B)代表性的小鼠生物发光图像。

图14A-14C示出了小鼠中存在循环T细胞。从肿瘤注射后第28天采集的眶后血液样品中分离外周血单核细胞(PBMC)，并通过流式细胞术分析人CD3、小鼠CD45和人CD19(作为转导的T细胞的标记物)。(A)循环人T细胞(在活淋巴细胞上门控)的代表性点图显示在左图中，并且在人CD3⁺T细胞上门控的CAR⁺细胞(基于CD19表达)显示在右图中。(B)第28天T细胞存留的总结。(C)存留的T细胞的CAR表达总结。对于图14B和图14C，基于未配对的双尾t检验，仅CAR和CAR⁺利妥昔单抗组之间的差异在统计学上不显著。

图15A-15D显示了体外各种CAR构建体的细胞因子分泌。用抗CD3/CD28抗体包被的珠刺激中央记忆(CD14^-CD45RA^-CD62L⁺)T细胞，24小时后用编码所示的CAR构建体的慢病毒载体转导，并在体内扩增。在第14天，用照射的Raji-ffLuc细胞(图15A和图15C)、Granta-519细胞(图15B)和Jeko细胞(图15D)再刺激细胞。“19-BB-z”构建体是用于临床试验的临床级CD19靶向CAR，并且作为阳性对照提供。24小时后收获上清液，并通过Luminex测定法分析干扰素(IFN)-γ、IL-2和肿瘤坏死因子-α水平。

图16A和16B显示CD20 CAR T细胞的细胞因子分泌。(A)用1.5.3-NQ-28-BB-z慢病毒载体转导并离体扩增的CD4⁺和CD8⁺T细胞用经照射的Raji-ffLuc CD20⁺淋巴瘤细胞进行再刺激。通过Luminex测定法测量在24小时后细胞上清液中指定细胞因子的分泌。(B)将冷冻保存的CD4⁺和CD8⁺CD20 CAR T细胞解冻并用K562细胞或表达CD20的K562细胞再刺激，并在24小时通过流式细胞术对IFN-γ进行细胞内染色来分析。

图17A和17B显示了各种CAR构建体的体外细胞毒性。用抗CD3/CD28抗体包被的珠刺激中央记忆(CD14^-CD45RA^-CD62L⁺)T细胞，24小时后用编码所示的CAR构建体的慢病毒载体转导，并在体内扩增。在第14天，使用(图17A和17B)Raji-ffLuc和(图17B)Jeko细胞作为靶标，将细胞用作标准4小时⁵¹Cr释放测定法中的效应物。“19-BB-z”构建体是用于临床试验的临床级CD19靶向CAR，并且作为阳性对照提供。显示了每种CAR T细胞群的特异性靶细胞裂解。

图18A和18B显示CD20 CAR T细胞的增殖。用1.5.3-NQ-28-BB-z慢病毒载体(或模拟转导)转导CD8⁺T细胞并离体扩增，然后冷冻保存。然后将细胞解冻，用羧基荧光素琥珀酰胺酯(CFSE)染色，并用经照射的CD20⁺Raji-ffLuc淋巴瘤细胞、K562细胞或表达CD20的K562细胞再刺激。4天后通过流式细胞术分析细胞。(A)显示了CAR⁺细胞的CFSE稀释(在CD3⁺/tCD19⁺上门控)。虚线直方图仅显示培养基中T细胞的CFSE荧光，实线直方图是与靶细胞共温育的T细胞。(B)显示每组的分裂的细胞百分比。

图19A和19B显示了各种CAR构建体的体内抗肿瘤活性。用抗CD3/CD28抗体包被的珠刺激中央记忆(CD14^-CD45RA^-CD62L⁺)T细胞，24小时后用编码所示的CAR构建体的慢病毒载体转导，并在体外扩增。“19-BB-z”构建体是在我们中心用于临床试验的临床级CD19靶向CAR，并且作为基准对照提供。向NSG小鼠静脉内注射Raji-ffLuc肿瘤细胞，2天后静脉注射扩增的中枢记忆(CD14^-CD45RA^-CD62L⁺)T细胞，其用1.5.3-NQ-28-BB-z CAR、1.5.3-NQ-28-zCAR、JCAR-014(抗-CD19-41BB)，或空载体转导。(A)通过生物发光成像评估的一段时间的肿瘤负荷；以及(B)总生存率的Kaplan-Meier图。

图20显示了CD20 CAR T细胞对套细胞淋巴瘤的体内活性。用1.5.3-NQ-28-BBzCAR转导CD4⁺和CD8⁺CD20 CAR T细胞，并用于处理7天前通过尾静脉接种Granta ffLuc套细胞淋巴瘤细胞的NSG小鼠。总体生存的Kaplan-Meier图。

图21A和21B显示了体内CAR T细胞存留。在携带Raji-ffLuc播散性肿瘤的NSG小鼠中输注CD20 CAR T细胞或空载体tCD19表达T细胞后，在连续时间点获得眶后血液样品。表达tCD19转导标记物的CD20 CAR T细胞在每个时间点通过流式细胞术定量为人CD3⁺/小鼠CD45-阴性/人CD19⁺细胞。(图21A)显示3个输注后时间点的tCD19⁺T细胞，作为血液中总有核细胞的百分比(最初在CAR T细胞组中n＝9)。显示来自空载体小鼠的截短的CD19⁺细胞用于参照。(图21B)在单独的实验中，纵向显示每周测量来自每组中2只小鼠的tCD19⁺细胞(空载体对CAR T细胞)。

图22A和22B显示了具有不同长度的间隔子的各种构建体的比较数据。用抗CD3/CD28抗体包被的珠刺激中央记忆(CD14^-CD45RA^-CD62L⁺)T细胞，24小时后用编码所示的CAR构建体的慢病毒载体转导，并在体外扩增。1F5-28-BB-z，IgG1mut具有全长间隔子。NoLinker是几乎全长但缺少6个氨基酸接头(连接氨基酸)，并且CH3具有截短的间隔子，缺少连接氨基酸和CH2结构域。(A)在第20天，用Granta或Rec-1淋巴瘤细胞再刺激细胞，24小时后收集上清液，并通过Luminex测定法分析IL-2(右)和IFN-γ(左)浓度。用抗CD3/抗CD28抗体包被的珠刺激中央记忆T细胞(CD14^-CD45RA^-CD62L⁺)，24小时后用编码所示的CAR构建体的慢病毒载体转导，并在体外扩增。“IgG1mut NQ”具有全长CH2CH3间隔子，CH3仅是如上所讨论的中间长度，并且Leu16短缺缺少CH2和CH3结构域。在第20天，使用Raji细胞作为靶标，在标准的4小时⁵¹Cr释放测定法中将细胞用作效应细胞。

图23A-23F显示了具有各种修饰的间隔子的各种构建体的比较数据。显示了具有IgG2连接氨基酸(表示为“IgG1mut”)和N297Q(表示为“NQ”)突变的CAR的示意图(图23A)。用生物素化的可溶性CD64(FcγRI)染色表达具有野生型IgG1间隔子，IgG1突变间隔子(IgG1连接氨基酸被IgG2连接氨基酸替换)或没有连接氨基酸(IgG1连接氨基酸缺失)的CAR的T细胞，然后通过链霉抗生物素蛋白-PE和通过流式细胞术分析，证明Fc受体与野生型但未修饰的间隔子结合(图23B)。将表达指示的CAR构建体的T细胞与表达CD64(FcγRI)的K562细胞或缺乏Fc受体的亲本K562共温育。在共温育后24小时，通过流式细胞术评估T细胞的CD25和CD69表达作为活化的指示。点图代表CD3⁺CD19⁺细胞(CAR⁺T细胞)。野生型间隔子与Fc受体的结合导致T细胞活化，而修饰的间隔子没有(图23C)。用抗CD3/CD28抗体包被的珠刺激中央记忆(CD14^-CD45RA^-CD62L⁺)T细胞，24小时后用编码指示的CAR构建体的慢病毒载体转导，体外扩增，并在静脉注射给药Raji-ffLuc细胞后2天注射到NSG小鼠中。(D和E)两种不同实验的生物发光的肿瘤负荷数据。(F)来自上述部分(E)的实验的Kaplan-Meier存活曲线。

图24显示了涉及本公开的免疫治疗方法和组合物的临床试验的治疗方案图。

图25A和25B显示了临床试验中抗CD20 CAR T细胞的制剂方法和给药模型的图。

具体实施方式

本公开提供用于减少表达CD20的细胞的数量或治疗与CD20表达相关的疾病或病症的组合物和方法(例如，减少B细胞的数量或治疗与异常B细胞活性相关的疾病或病症)，包括用治疗有效量的宿主细胞治疗受试者，所述宿主细胞包含编码融合蛋白的异源核酸分子，所述融合蛋白包含细胞外组分和通过疏水部分与细胞外组分连接的细胞内组分，其中所述细胞外组分包括特异性结合CD20的结合结构域和细胞内组分包含效应子结构域。任选地，该方法可以进一步包含治疗有效量的CD20特异性结合分子与表达CD20特异性融合蛋白的宿主细胞的组合。在某些实施例中，融合蛋白是嵌合抗原受体(CAR)。在更进一步的实施例中，CAR包含来自抗CD20抗体的scFv或来自对CD20抗原特异的TCR的scTCR。

作为背景，通常认为残留的抗CD20抗体水平可能代表CD20靶向的CAR T细胞的主要限制因素。例如，之前与其他靶点的研究证实，在可溶性同源抗原水平高达10μg/ml的情况下，靶向癌胚抗原、Lewis-Y抗原或CD30的CAR T细胞的细胞因子分泌和细胞毒性大部分不受损害(Hombach et al.,Gene Ther 2000；7(12):1067-75；Hombach et al.,Gene Ther1999；6(2):300-4；Nolan et al.,Clin Cancer Res 1999；5(12):3928-41；Westwood etal.,J Immunother 2009；32(3):292-301)；观察到高于此的水平是潜在抑制性的(Hombachet al.,Gene Ther 2000；7(12):1067-75)。在本公开中，令人惊讶地发现临床相关浓度的各种抗CD20抗体(例如，利妥昔单抗)在体外或体内很大程度上不影响表达抗CD20 CAR的T细胞的活性(参见，同样，Gall et al.,Exp.Hematol.33:452,2005)。此外，本公开的小鼠实验证明，接受联合治疗的组具有与仅用CAR T细胞治疗的小鼠一样好或更好的结果。

在更详细地阐述本公开之前，提供本文中使用的某些术语的定义可能有助于对其理解。在整个本公开中阐述了另外的定义。

在本说明书中，任何浓度范围、百分比范围、比例范围或整数范围应理解为包括所述范围内的任何整数的值，并且在适当时，包括其分数(诸如整数的十分之一和百分之一)，除非另有说明。此外，除非另有说明，否则本文所述的与任何物理特征相关的任何数字范围，例如聚合物亚单元，大小或厚度，应理解为包括所述范围内的任何整数。除非另有说明，本文所用的术语“约”意味着所指示的范围、值或结构的±20％。应当理解，本文所用的术语“一”和“一个”是指枚举组分中的“一个或多个”。替代选择(例如，“或”)的使用应理解为意味着替代选择中的一个，两个或其任意组合。如本文所使用的，术语“包括”，“具有”和“包含”同义使用，其术语和变体旨在解释为非限制性的。

“可选的”或“任选地”意味着随后描述的元素、部件、事件或情况可能发生或可能不发生，并且该描述包括元元素、部件、事件或情况发生的实例以及它们不发生的实例。

另外，应当理解，本申请公开了衍生自本文所描述的结构和亚基的各种组合的各个构建体或构建体组，其程度如同单独列出每个构建体或构建体组的程度。因此，特定结构或特定亚基的选择在本公开的范围内。

术语“基本上由......组成”将权利要求的范围限制于特定的材料或步骤，或者实质上不影响要求保护的发明的基本特征的那些。例如，蛋白质结构域、区、模块或片段(例如，结合结构域、铰链区、接头模块或标签)或蛋白质(可具有一个或多个结构域、区或模块)基本上由特定氨基酸序列组成，当结构域、区、模块、片段或蛋白质的氨基酸序列包括插入，缺失，取代或其组合时(例如，在氨基或羧基末端或者在结构域之间添加氨基酸)，它们的组合最多为结构域、区、模块、盒或蛋白质的长度的20％(例如，最多15％、10％、8％、6％、5％、4％、3％、2％或1％)并且基本上不影响(即，活性降低不超过50％，诸如不超过40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％)(多个)结构域、(多个)区、(多个)模块、(多个)盒或蛋白质的活性(例如，结合结构域的靶结合亲和力)。

如本文所使用的，“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及后来被修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即与氢、羧基、氨基和R基团结合的α-碳，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这样的类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构但是以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的化学化合物。

“保守取代”是指不显着影响或改变特定蛋白质的结合特征的氨基酸取代。通常，保守取代是其中取代的氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基代替的取代。保守取代包括在以下组中的一个发现的取代：第1组：丙氨酸(Ala或A)、甘氨酸(Gly或G)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)；第2组：天冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(Glu或Z)；第3组：天冬酰胺(Asn或N)、谷氨酰胺(Gln或Q)；第4组：精氨酸(Arg或R)、赖氨酸(Lys或K)、组氨酸(His或H)；第5组：异亮氨酸(Ile或I)、亮氨酸(Leu或L)、甲硫氨酸(Met或M)、缬氨酸(Val或V)；以及第6组：苯丙氨酸(Phe或F)、酪氨酸(Tyr或Y)、色氨酸(Trp或W)。另外或可替代地，氨基酸可通过类似的功能、化学结构或组成(例如，酸性、碱性、脂族、芳族或含硫)分组为保守取代组。例如，出于取代的目的，脂族组可包括Gly、Ala、Val、Leu和Ile。其他保守取代组包括：含硫：Met和半胱氨酸(Cys或C)；酸性：Asp、Glu、Asn和Gln；小的脂肪族、非极性或微极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro和Gly；极性、带负电荷的残基及其酰胺：Asp、Asn、Glu和Gln；极性、带正电荷的残基：His、Arg和Lys；大的脂肪族、非极性残基：Met、Leu、Ile、Val和Cys；和大的芳香族残基：Phe、Tyr和Trp。其他信息可以在Creighton(1984)Proteins,W.H.Freeman and Company中找到。

如本文所使用的，“蛋白质”或“多肽”是指氨基酸残基的聚合物。蛋白质适用于天然存在的氨基酸聚合物，以及其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸和非天然存在的氨基酸聚合物的人工化学模拟物的氨基酸聚合物。

“序列同一性百分比”是指通过比较序列确定的两个或更多个序列之间的关系。设计确定序列同一性的优选方法以给出所比较序列之间的最佳匹配。例如，为了最佳比较目的，比对序列(例如，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一个或两个中引入空位以进行最佳比对)。此外，出于比较目的，可以忽略非同源序列。除非另有说明，否则本文引用的序列同一性百分比是在参比序列的长度上计算的。确定序列同一性和相似性的方法可以在公开的计算机程序中找到。可以使用BLAST程序(例如，BLAST 2.0、BLASTP、BLASTN或BLASTX)进行序列比对和百分比同一性计算。BLAST程序中使用的数学算法可以在Altschulet al.,Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997中找到。在本公开的内容中，应当理解，在使用序列分析软件进行分析的情况下，分析结果基于所参考的程序的“默认值”。“默认值”意味着首次初始化时最初加载软件的值或参数的任何集合。

“核酸分子”或“多核苷酸”是指包括共价连接的核苷酸的聚合化合物，其可以由天然亚基(例如嘌呤或嘧啶碱基)或非天然亚基(例如吗啉环)组成。嘌呤碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤和黄嘌呤，嘧啶碱基包括尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶。核酸分子包括多核糖核酸(RNA)、多聚脱氧核糖核酸(DNA)，其包括cDNA、基因组DNA和合成DNA，其中任一个可以是单链的或双链的。如果是单链的，则核酸分子可以是编码链或非编码链(反义链)。编码氨基酸序列的核酸分子包括编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。一些形式的核苷酸序列还可以包括内含子，其程度是内含子可通过共转录或转录后机制除去。换句话说，不同的核苷酸序列可以编码相同的氨基酸序列，作为遗传密码的冗余或简并性或通过剪接的结果。

还考虑了本公开的核酸分子的变体。变体核酸分子与定义的核酸分子或本文所描述的参比多核苷酸至少70％、75％、80％、85％、90％，优选95％、96％、97％、98％、99％或99.9％相同，或在0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠约65-68℃或0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠和50％甲酰胺约42℃下的严格杂交条件下与多核苷酸杂交。核酸分子变体保留编码具有本文所描述的功能的融合蛋白或其结合结构域的能力，诸如特异性结合靶分子(例如CD20)。

“功能性变体”是指在结构上类似于或基本上在结构上类似于本公开的亲本或参比化合物的多肽或多核苷酸，但在组成上略有不同(例如，一个碱基、原子或官能团是不同的，添加或除去)，以使多肽或编码的多肽能够以至少50％的效率，优选至少55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的亲本多肽的活性水平执行编码的亲本多肽的至少一种功能。换句话说，当在所选测定法中与亲本或参比多肽相比，例如用于测量结合亲和力的测定法(例如，测量缔合(K_a)或解离(K_D)常数的

或四聚体染色)，功能性变体表现出不超过50％的性能降低时，本公开的多肽或编码多肽的功能性变体具有“相似结合”、“相似亲和力”或“相似活性”。

如本文所使用的，“功能性部分”或“功能性片段”是指仅包含亲本或参比化合物的结构域、部分或片段的多肽或多核苷酸，并且所述多肽或编码的多肽保留与亲本或参比化合物的结构域、部分或片段相关的至少50％的活性，优选亲本多肽的至少55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的活性水平，或提供生物学益处(例如，效应子功能)。当在所选测定法中与亲本或参比多肽相比(对于亲和力，优选不超过20％或10％，或不超过与亲本或参比相比的对数差)，诸如测量结合亲和力或测量效应子功能的测定法(例如，细胞因子释放)，功能性部分或片段表现出不超过50％的性能降低时，本公开的多肽或编码的多肽的“功能性部分”或“功能性片段”具有“相似的结合”或“相似的活性”。

如本文所使用的，“异源的”或“非内源的”或“外源的”是指非产自宿主细胞或受试者的任何基因、蛋白、化合物、核酸分子或活性，或非产自已经改变的宿主细胞或受试者的任何基因、蛋白、化合物、核酸分子或、活性。异源的，非内源的或外源的包括已经突变或以其他方式改变的基因、蛋白、化合物或核酸分子，使得天然和改变的基因、蛋白、化合物或核酸分子之间的结构，活性或两者不同。在某些实施例中，异源，非内源或外源基因、蛋白或核酸分子(例如，受体，配体等)可能对宿主细胞或受试者不是内源性的，而是编码这些基因、蛋白或核酸分子的核酸可以通过缀合、转化、转染、电穿孔等添加到宿主细胞中，其中添加的核酸分子可以整合到宿主细胞基因组中或者可以作为外染色体遗传物质而存在(例如，作为质粒或其他自我复制载体)。术语“同源的”或“同源”是指在宿主细胞、物种或菌株中发现或衍生自宿主细胞、物种或菌株的基因、蛋白、化合物、核酸分子或活性。例如，编码多肽的异源或外源多核苷酸或基因可以与天然多核苷酸或基因同源并编码同源多肽或活性，但多核苷酸或多肽可以具有改变的结构、序列、表达水平或其任意组合。非内源多核苷酸或基因以及编码的多肽或活性可以来自相同物种、不同物种或其组合。

如本文所使用的，术语“内源的”或“天然的”是指通常存在于宿主细胞或受试者中的多核苷酸、基因、蛋白、化合物、分子或活性。

“表达”是指与表达控制序列(例如启动子)可操作连接的核酸分子的转录或翻译。

如本文所使用的，术语“工程化的”，“重组的”或“非天然的”是指包含至少一个基因改变或通过引入外源核酸分子修饰的生物、微生物、细胞、核酸分子或载体，其中通过基因工程(即人为干预)引入这种改变或修饰。基因改变包括，例如，引入编码蛋白质、融合蛋白或酶的可表达的核酸分子的修饰，或细胞遗传物质的其他核酸分子添加，缺失，取代或其他功能性破坏。另外的修饰包括，例如，非编码调节区，其中修饰改变多核苷酸、基因或操纵子的表达。

如本文所使用的，“融合蛋白”是指在单链中具有至少两个不同结构域的蛋白，其中所述结构域不是天然地在蛋白质中一起发现的。编码融合蛋白的多核苷酸可以使用PCR、重组工程等构建，或者可以合成这样的融合蛋白。融合蛋白可以进一步含有其他成分，例如标签、接头模块或转导标记物。在某些实施例中，由宿主细胞(例如，T细胞)表达或产生的融合蛋白位于细胞表面，其中融合蛋白锚定于细胞膜(例如，通过跨膜结构域)并且包含细胞外部分(例如，含有结合结构域)和细胞内部分(例如，含有信号结构域、效应子结构域、共刺激结构域或其组合)。

除非本文中有不同的明确定义，否则抗体技术领域的技术人员所理解的术语均赋予本领域中获得的含义。术语“抗体”是指包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的完整抗体，以及具有或保留了结合靶分子的能力的完整抗体的抗原结合部分。抗体包括多克隆和单克隆抗体。抗体可以是天然存在的、重组产生的、基因工程化的或修饰的，并且包括免疫球蛋白的修饰形式，例如胞内抗体、肽体、纳米抗体、单结构域抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体、双抗体、三抗体、四抗体、串联di-scFV、串联tri-scFv)。来自抗体的“抗原结合部分”，“抗原结合片段”或“抗原结合结构域”是指“抗体片段”，其包含完整抗体的一部分并含有抗体的抗原决定可变区或互补决定区。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段、Fab’-SH、F(ab’)₂、双抗体、线性抗体、单链抗体、scFv(即，Ig分子的可变重链(VH)和可变轻链(VL)区的融合蛋白，与通常约10至约25个氨基酸的短链接肽连接)、VHH、单结构域抗体(例如，sdAb、sdFv、纳米抗体)和包含抗体片段的多特异性抗体。单克隆抗体或其抗原结合部分可以是非人的，嵌合的，人源化的或人的，优选人源化的或人的。免疫球蛋白结构和功能综述于例如Harlow et al.,Eds.,Antibodies:ALaboratory Manual,Chapter 14(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor,1988)中。抗体可以是任何类别或亚类，包括IgG及其亚类(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgE、IgA和IgD。

术语“V_L”和“V_H”分别指抗体轻链和重链的可变结合区。可变结合区由离散的，明确定义的称为“互补决定区”(CDR)和“框架区”(FR)的子区组成。

术语“互补决定区”(CDR)或“高变区”(HVR)在本领域中是已知的，是指抗体可变区内的非连续氨基酸序列，其赋予抗原特异性或结合亲和力。通常，每个重链可变区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)中有三个CDR，并且每个轻链可变区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)中有三个CDR。

如本文所使用的“框架区”(FR)是指重链和轻链的可变区的非CDR部分。通常，在每个全长重链可变区(FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4)中有四个FR，并且在每个全长轻链可变区(FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4)中具有四个FR。

术语“CL”是指“免疫球蛋白轻链恒定区”或“轻链恒定区”，即来自抗体轻链的恒定区。术语“CH”是指“免疫球蛋白重链恒定区”或“重链恒定区”，其进一步可分，取决于抗体同种型为CH1、CH2和CH3(IgA、IgD、IgG)，或CH1、CH2、CH3和CH4结构域(IgE、IgM)。

“片段抗原结合”(Fab)区是结合于抗原的抗体的一部分，并且包括通过链间二硫键与轻链连接的重链的可变区和CH1。“可结晶片段”(Fc)区是非Fab区的抗体的一部分，并且包括除CH1之外的CH区(例如，IgG、IgA或IgD抗体的CH2和CH3，或IgE抗体的CH2、CH3和CH4)。作为背景，Fc区负责免疫球蛋白的效应子功能，诸如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，补体依赖性细胞毒性(CDC)和补体固定，与Fc受体结合(例如，CD16、CD32、FcRn)，体内半衰期相对于缺乏Fc区的多肽更长，蛋白A结合，以及可能甚至胎盘转移(参见Capon etal.,Nature 337:525,1989)。

如本文所用，“Fc区部分”是指来自抗体的Fc片段的重链恒定区段，其可包括一个或多个恒定结构域，例如CH2、CH3、CH4或其任意组合。在某些实施例中，Fc区部分包括IgG、IgA或IgD抗体的CH2和CH3结构域或其任意组合，或者IgM或IgE抗体的CH2、CH3和CH4结构域及其任意组合。在其他实施例中，CH2CH3或CH3CH4结构具有来自相同抗体同种型的亚区结构域并且是人，例如人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM(例如来自人IgG1或IgG4的CH2CH3)。在某些实施例中，在本公开的融合蛋白中发现的Fc区部分将能够介导免疫球蛋白的一种或多种效应子功能，能够介导一种或多种增强的效应子功能，或者缺乏一种或多种或所有这些活性，通过例如本领域已知的一种或多种突变。

另外，抗体具有通常位于Fab和Fc区之间的铰链序列(但是铰链的下段可以包括Fc区的氨基末端部分)。作为背景，免疫球蛋白铰链充当柔性间隔子以允许Fab区在空间中自由移动。与恒定区相反，铰链在结构上是多样的，在免疫球蛋白类之间甚至在亚类之间在序列和长度上都不同。例如，人IgG1铰链区是自由柔性的，这允许Fab区围绕它们的对称轴旋转并在以两个重链间二硫键桥中的第一个为中心的球体内移动。相比之下，人IgG2铰链相对较短并且含有由四个重链间二硫键桥稳定的刚性聚脯氨酸双螺旋，这限制了柔性。人IgG3铰链与其他亚类的区别在于其独特的延伸铰链区(长度约为IgG1铰链的4倍)，含有62个氨基酸(包括21个脯氨酸和11个半胱氨酸)，形成不灵活的聚脯氨酸双螺旋并提供更大柔性，因为Fab区相对远离Fc区。人IgG4铰链比IgG1短，但具有与IgG2相同的长度，并且其柔性介于IgG1和IgG2之间。

“T细胞”是在胸腺中成熟并产生T细胞受体(TCR)的免疫系统细胞。T细胞可以是幼稚的(不暴露于抗原；CD62L、CCR7、CD28、CD3、CD127和CD45RA的表达增加，与T_CM相比CD45RO的表达降低)，记忆T细胞(T_M)(经历抗原和长期存活)和效应子细胞(抗原经历，细胞毒性)。T_M可进一步分为中枢记忆T细胞亚组(T_CM，与幼稚T细胞相比，CD62L、CCR7、CD28、CD127、CD45RO和CD95的表达增加，CD54RA表达降低)和效应子记忆T细胞(T_EM，与幼稚T细胞或T_CM相比，CD62L、CCR7、CD28、CD45RA的表达降低，CD127的表达增加)。效应子T细胞(T_E)是指经历抗原的CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞，其具有降低的CD62L、CCR7、CD28的表达，并且与T_CM相比对于颗粒酶和穿孔素是阳性的。T辅助细胞(T_H)释放细胞因子以帮助抗原信号传导，并且当成熟时表达表面蛋白CD4(为CD4⁺)。如本文所使用的，“T细胞”或“T淋巴细胞”来自任何哺乳动物，包括灵长类动物、狗、或马，最好是人类。在一些实施例中，T细胞是自体的、同种异体的或同源的。

“T细胞受体”(TCR)是指在T细胞(或T淋巴细胞)表面上发现的分子，其与CD3缔合，通常负责识别与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的抗原。TCR在大多数T细胞中具有高度可变的α和β链(也分别称为TCRα和TCRβ)的二硫键连接的异二聚体。在一小部分T细胞中，TCR由可变的γ和δ链的异二聚体组成(也分别称为TCRγ和TCRδ)。TCR的每个链是免疫球蛋白超家族的成员，并且具有一个N-末端免疫球蛋白可变结构域，一个免疫球蛋白恒定结构域，跨膜区和在C末端的短的胞质尾区(参见Janeway et al.,Immunobiology:TheImmune System in Health and Disease,3rd Ed.,Current Biology Publications,p.4:33,1997)。如在本公开中使用的，TCR可以来自各种动物物种，包括人、小鼠、大鼠、猫、狗、山羊、马或其他哺乳动物。TCR可以是细胞结合的(即，具有跨膜区或结构域)或可溶形式。如本文所讨论的，根据本公开的结合结构域可以包含单链TCR(scTCR)，其类似于衍生自免疫球蛋白的scFv，并且包含使用例如肽或非肽接头，并任选通过二硫键连接在一起的来自TCRα和TCRβ链的可变结构域。

“主要组织相容性复合物分子”(MHC分子)是指将肽抗原递送至细胞表面的糖蛋白。MHC I类分子是异二聚体，由跨α链(具有三个α结构域)的膜和非共价缔合的β2微球蛋白组成。MHC II类分子由两种跨膜糖蛋白α和β组成，其两者均跨膜。每个链具有两个结构域。MHC I类分子递送源自胞液的多肽至细胞表面，其中肽:MHC复合物由CD8⁺T细胞识别。MHCII类分子递送源自囊泡系统的多肽至细胞表面，其中它们由CD4⁺T细胞识别。MHC分子可以来自各种动物物种，包括人、小鼠、大鼠、猫、狗、山羊、马或其他哺乳动物。

“T细胞谱系的细胞”是指显示T细胞或其前体或祖体的至少一种表型特征的细胞，其区分所述细胞与其他淋巴细胞和红细胞或骨髓谱系的细胞。此类表型特征可包括一种或多种对T细胞特异的蛋白(例如，CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺)的表达，或对T细胞特异的生理学、形态学、功能或免疫学特征。例如，T细胞谱系的细胞可以是定向于T细胞谱系的祖体或前体细胞；CD25⁺未成熟和未激活的T细胞；经历过CD4或CD8谱系定向的细胞；CD4⁺CD8⁺双阳性的胸腺细胞祖细胞；单阳性CD4⁺或CD8⁺；TCRαβ或TCRγδ；或者成熟和功能性或活化的T细胞。

如本文所使用的，相对于混合物中细胞类型的量，“富集的”或“耗尽的”是指，在由一个或多个富集或耗尽过程或步骤产生的细胞混合物中，“富集”类型的数量增加，“耗尽的”细胞数量减少，或两者。因此，取决于经历富集过程的原始细胞群的来源，混合物或组合物可含有30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更多(数量或计数)的“富集”细胞。经历耗尽过程的细胞可以产生含有50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％或更少(数量或计数)的“耗尽的”细胞的混合物或组合物。在某些实施例中，混合物中某种细胞类型的量将富集并且不同细胞类型的量将耗尽，例如在耗尽CD8⁺细胞的同时富集CD4⁺细胞，或在耗尽CD62L^-细胞的同时富集CD62L⁺细胞，或者其组合。

“治疗”或“疗法”或“改善”是指受试者(例如，人或非人哺乳动物，例如灵长类动物、马、猫、狗、山羊、小鼠或大鼠)的疾病、病症或状况的医学管理。通常，合适的剂量或治疗方案包括表达融合蛋白的宿主细胞，融合蛋白包含细胞外组分和通过疏水部分连接的细胞内组分，其中细胞外组分包含特异性结合CD20的结合结构域以及细胞内组分包含本公开的效应子结构域，和任选的佐剂，以足以引发治疗或预防益处的量施用。治疗或预防(prophylactic)/预防(preventive)益处包括改善临床结果；减轻或缓解与疾病相关的症状；症状发生率下降；提高生活质量；更长的无病状态；疾病程度减少；疾病状态稳定；疾病进展延迟；缓解；生存；延长生存期；或其任意组合。如本文进一步描述的，治疗方案可包括组合疗法，其中在施用一种或更多的第二或辅助治疗之前，同时，同期或之后施用一种或多种CD20特异性结合分子，例如抗CD20抗体。适用于本文所描述的治疗方法的示例性抗CD20抗体包括1.5.3、1F5、Leu16、利妥昔单抗、奥法木单抗、维妥珠单抗、ublituximab和ocrelizumab。

表达本公开的融合蛋白(例如，CD20 CAR)的CD20特异性结合分子、融合蛋白或宿主细胞的“治疗有效量”或“有效量”是指CD20特异性结合分子、融合蛋白或宿主细胞的量足以产生治疗效果，包括改善的临床结果；减轻或缓解与疾病相关的症状；症状发生率下降；提高生活质量；更长的无病状态；疾病程度减少；疾病状态稳定；疾病进展延迟；缓解；生存；或以统计学上显著的方式延长生存期。当提及单独施用单个的活性成分或表达单一活性成分的细胞时，治疗有效量是指所述成分或单独表达所述成分的细胞的效果。当提及组合时，治疗有效量是指活性成分或组合的辅助活性成分与表达活性成分的细胞的组合量，其产生治疗效果，无论是连续施用还是同时施用。组合还可以是表达多于一种活性成分的细胞，例如两种不同的CD20 CAR，或一种CD20 CAR和CD20 TCR，或CD20 CAR和另一种相关治疗剂。

术语“药学上可接受的赋形剂或载体”或“生理学上可接受的赋形剂或载体”是指生物学上相容的载剂，例如生理盐水，其在本文中更详细地描述，适于施用于人或其他非人哺乳动物受试者并通常被认为是安全的或不引起严重不良事件。

如本文所使用的，“统计学上显著的”是指当使用Students t-检验计算时p值为0.050或更小，并且表明测量的特定事件或结果不太可能偶然出现。

如本文所使用的，术语“过继性免疫疗法”或“过继性免疫的疗法”是指施用天然存在的或基因工程化的疾病抗原特异性免疫细胞(例如T细胞)。过继性细胞免疫疗法可以是自体的(免疫细胞来自受体)，同种异体的(免疫细胞来自相同物种的供体)或同源的(免疫细胞来自与受体遗传上相同的供体)。

融合蛋白

在某些方面，本公开提供了融合蛋白，其包含细胞外组分和通过疏水部分连接的细胞内组分。

“细胞外组分”包含特异性结合CD20的结合结构域。如本文所使用的，“结合结构域”(也称为“结合区”或“结合部分”)是指具有与靶分子(例如CD20)特异性和非共价缔合、连接或结合的分子，例如肽、寡肽、多肽或蛋白质。结合结构域包括针对生物分子或其他目标靶标的任何天然存在的、合成的、半合成的或重组产生的结合配偶体。在一些实施例中，结合结构域是抗原结合结构域，诸如抗体或TCR，或功能结合结构域或其抗原结合片段。

在某些实施例中，结合结构域包含可变区接头(例如，scFv)。“可变区接头”具体是指将重链免疫球蛋白可变区(VH)与轻链免疫球蛋白可变区(VL)连接，或连接TCR V_α/β和C_α/β链(例如，V_α-C_α、V_β-C_β、V_α-V_β)或将每个V_α-C_α、V_β-C_β或V_α-V_β对连接至铰链或疏水结构域的5个氨基酸至约35个氨基酸序列，其提供足以使两个亚结合结构域相互作用的间隔子功能和柔性，使得所得单链多肽与抗体或TCR保持对同一靶分子的特异性结合亲和力。

在某些实施例中，可变区接头包含约10个氨基酸至约30个氨基酸或约15个氨基酸至约25个氨基酸。在具体的实施例中，可变区接头肽包含1至10个重复的Gly_xSer_y，其中x和y是独立的0至10的整数，条件是x和y不均为0(例如，Gly₄Ser)、Gly₃Ser、Gly₂Ser，或(Gly₃Ser)n(Gly₄Ser)₁、(Gly₃Ser)_n(Gly₂Ser)_n、(Gly₃Ser)_n(Gly₄Ser)_n或(Gly₄Ser)_n，其中n为1、2、3、4、5或6的整数)并且其中连接的可变区形成功能性免疫球蛋白样结合结构域(例如scFv或scTCR)。

示例性结合结构域包括单链抗体可变区(例如，结构域抗体、sFv、scFv或Fab)，TCR的抗原结合区，诸如单链TCR(scTCR)，或选择用于特异性结合于生物分子的能力的合成多肽。

如本文所使用的，“特异性结合”是指结合结构域或其融合蛋白与具有等于或大于10⁵M^-1的亲和力或K_a(即，与1/M的单位的特定结合相互作用的平衡缔合常数)的靶分子的缔合或连接，而不与样品中的任何其他分子或组分显著缔合或连接。结合结构域(或其融合蛋白)可以分类为“高亲和力”结合结构域(或其融合蛋白)或“低亲和力”结合结构域(或其融合蛋白)。“高亲和力”结合结构域(或其融合蛋白)是指具有至少10⁷M^-1、至少10⁸M^-1、至少10⁹M^-1、至少10¹⁰M^-1、至少10¹¹M^-1、至少10¹²M^-1、或至少10¹³M^-1的K_a的那些结合结构域(或其融合蛋白)。“低亲和力”结合结构域(或其融合蛋白)是指具有高达10⁷M^-1、高达10⁶M^-1、高达10⁵M^-1的K_a的那些结合结构域(或其融合蛋白)。

或者，亲和力可以定义为与M单位(例如，10^-5M至10^-13M)特定结合相互作用的平衡解离常数(K_d)。在某些实施例中，结合结构域可具有“增强的亲和力”，其是指选择的或工程化的结合结构域，与靶抗原的结合比野生型(或亲本)结合结构域更强。例如，增强的亲和力可能是由于靶抗原的K_a(平衡缔合常数)大于野生型结合结构域的K_a，因为靶抗原的K_d(解离常数)小于野生型结合结构域的K_d，或由于靶抗原的解离速率(K_off)小于野生型结合结构域的解离速率。已知多种测定法用于识别特异性结合特定靶标的本公开的结合结构域，以及测定结合结构域或融合蛋白亲和力，诸如Western印迹、ELISA以及

analysis(也参见,例如,Scatchard et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.51:660,1949；以及美国专利号5,283,173、5,468,614或等同物)。

分析或计算机模拟结合结构域的一级和二级氨基酸结构以分析蛋白质的三级结构可有助于识别可被取代、添加或缺失的特定氨基酸残基，而不显著改变结构，并因此，可能显著降低结合结构域的结合特异性和亲和力。

在某些实施例中，结合结构域包含V_H区。例如，当与已知单克隆抗体的V_H比较时，本公开的结合结构域中的V_H区可以衍生自或基于已知单克隆抗体的V_H，并且可以包含一个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10)插入，一个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10)缺失，一个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10)氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代)，或以上列举的变化的组合。插入、缺失或取代可以是在V_H区中的任何位置，包括在该区的氨基末端、羧基末端或两端，条件是每个CDR包含零个变化或至多一个、两个、三个或四个来自已知单克隆抗体的V_H区的CDR的变化，并且提供含有修饰的V_H区的结合结构域，其以与野生型结合结构域类似的亲和力特异性结合其靶标。

在某些实施例中，结合结构域包含V_L区。例如，当与已知单克隆抗体的V_L比较时，本公开的结合结构域中的V_L区可以衍生自或基于已知单克隆抗体的V_L，并且可以包含一个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10)插入，一个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10)缺失，一个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10)氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代)，或以上列举的变化的组合。插入、缺失或取代可以是在V_L区中的任何位置，包括在该区的氨基末端、羧基末端或两端，条件是每个CDR包含零个变化或至多一个、两个、三个或四个来自已知单克隆抗体的V_L区的CDR的变化，并且提供含有修饰的V_L区的结合结构域，其以与野生型结合结构域类似的亲和力特异性结合其靶标。

在某些实施例中，结合结构域包含与轻链可变区(V_L)的氨基酸序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％，至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的氨基酸序列；例如，与来自1.5.3(SEQ ID NO.:1)、1F5(SEQID NO.:3)、Leu16(SEQ ID NO.:2)、利妥昔单抗、奥法木单抗、维妥珠单抗、ublituximab或ocrelizumab的V_L。

在进一步的实施例中，结合结构域包含与重链可变区(V_H)的氨基酸序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的氨基酸序列；例如，与来自1.5.3(SEQ ID NO.:4)、1F5(SEQ ID NO.:6)、Leu16(SEQ ID NO.:5)、利妥昔单抗、奥法木单抗、维妥珠单抗、ublituximab或ocrelizumab的V_H。

在更进一步的实施例中，结合结构域包含(a)与V_L的氨基酸序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的氨基酸序列，例如，与来自1.5.3(SEQ ID NO.:4)、1F5(SEQ IDNO.:6)、Leu16(SEQ ID NO.:5)、利妥昔单抗、奥法木单抗、维妥珠单抗、ublituximab或ocrelizumab的V_L；和(b)与V_H的氨基酸序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的氨基酸序列，例如，与来自1.5.3(SEQ ID NO.:4)、1F5(SEQ ID NO.:6)、Leu16(SEQ ID NO.:5)、利妥昔单抗、奥法木单抗、维妥珠单抗、ublituximab或ocrelizumab的V_H。在任何上述实施例中，与特异性结合CD20的亲本单克隆抗体或其片段或衍生物相比，V_L、V_H或两者的每个CDR包含零变化或至多一个、两个、三个、四个、五个或六个变化，条件是含有修饰的V_L、V_H或两个区的结合结构域以与野生型结合结构域相似的亲和力特异性结合CD20。

在某些实施例中，结合结构域包含与scFv的氨基酸序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的氨基酸序列，例如，与来自1.5.3(SEQ ID NO.:64)、1F5(SEQ ID NO.:66)，Leu16(SEQ ID NO.:65)、利妥昔单抗、奥法木单抗、维妥珠单抗、ublituximab或ocrelizumab的scFv；其中与特异性结合CD20的亲本单克隆抗体或其片段或衍生物的相应的CDR相比，scFv的每个CDR包含零变化或至多一个、两个、三个、四个、五个或六个变化，条件是含有一个或多个修饰的CDR的scFv以与野生型scFv或相应抗体相似的亲和力与CD20特异性结合。

在某些实施例中，结合结构域由多核苷酸编码，所述多核苷酸与编码轻链可变区(V_L)的多核苷酸序列至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同；例如，与V_L-编码来自1.5.3(SEQ ID NO.:70)、1F5(SEQ ID NO.:72)、Leu16(SEQ ID NO.:71)、利妥昔单抗、奥法木单抗、维妥珠单抗、ublituximab或ocrelizumab的多核苷酸。

在进一步的实施例中，结合结构域包含多核苷酸，所述多核苷酸与编码重链可变区(V_H)的多核苷酸序列至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同；例如，与V_H-编码来自1.5.3(SEQ ID NO.:73)、1F5(SEQ ID NO.:75)、Leu16(SEQ ID NO.:74)、利妥昔单抗、奥法木单抗、维妥珠单抗、ublituximab或ocrelizumab的多核苷酸。

在更进一步的实施例中，结合结构域包含(a)与编码V_L的多核苷酸序列至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的多核苷酸，例如，与V_L编码来自1.5.3(SEQ ID NO.:70)、1F5(SEQ ID NO.:72)、Leu16(SEQ ID NO.:71)、利妥昔单抗、奥法木单抗、维妥珠单抗、ublituximab或ocrelizumab的多核苷酸；和(b)与编码V_H的多核苷酸序列至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同的多核苷酸，例如，与V_H编码来自1.5.3(SEQ ID NO.:70)、1F5(SEQ IDNO.:72)、Leu16(SEQ ID NO.:71)、利妥昔单抗、奥法木单抗、维妥珠单抗，ublituximab或ocrelizumab的多核苷酸。在任何上述实施例中，当与编码特异性结合CD20的亲本单克隆抗体或其片段或衍生物的多核苷酸相比，编码V_L、V_H或两者的每个CDR的多核苷酸包含零变化或至多一至六个变化，条件是含有修饰的V_L、V_H或两个区的结合结构域以与野生型结合结构域相似的亲和力特异性结合CD20。

在某些实施例中，结合结构域包含多核苷酸，所述多核苷酸与编码scFv的多核苷酸序列至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同；例如，包含来自1.5.3(SEQ ID NO.:67)、1F5(SEQ ID NO.:69)、Leu16(SEQ ID NO.:68)、利妥昔单抗、奥法木单抗、维妥珠单抗、ublituximab或ocrelizumab的抗体的可变区的编码scFv。在上述实施例的每个中，当与编码特异性结合CD20的单克隆抗体的亲本scFv的多核苷酸相比，编码scFv的每个CDR的多核苷酸包含零变化或至多一至六个变化，条件是含有一个或多个修饰的CDR的scFv以与野生型CDR或相应抗体相似的亲和力特异性结合CD20。

在本文所描述的任何实施例中，结合结构域可以组成，包含，基于或衍生自V_H、V_L或两者，来自ublituximab(参见例如，US 2015/0290317)、利妥昔单抗(参见例如，US 2014/0004037)、ocrelizumab(参见例如US 8,679,767)、奥法木单抗(参见例如US 2009/0169550)或维妥珠单抗(参见例如US 2009/0169550)，其核苷酸和氨基酸序列通过引用以其整体并入本文。另外，在本文所描述的任何方法中，CD20结合分子可包含利妥昔单抗、奥法木单抗、维妥珠单抗或ocrelizumab、ublituximab或其任意组合。

本公开的融合蛋白包含细胞内组分，其包含效应子结构域。如本文所使用的，“效应子结构域”是融合蛋白或受体的细胞内部分或结构域，其在接收适当信号时可直接或间接促进细胞中的生物或生理反应。在某些实施例中，效应子结构域来自蛋白或蛋白复合物或其一部分，其在结合时，或当蛋白或其部分或蛋白复合物直接结合靶分子时接收信号，并触发来自效应子结构域的信号。效应子结构域可以在其含有一个或多个信号转导结构域或基序时直接促进细胞反应，例如在共刺激分子中发现的基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。通常已知包含ITAM的共刺激分子或其部分能够在配体接合后启动T细胞活化信号传导。在进一步的实施例中，效应子结构域将通过与一种或多种直接促进细胞反应的其他蛋白缔合而间接促进细胞反应。

在某些实施例中，效应子结构域包含淋巴细胞受体信号传导结构域(例如，CD3ζ)，包含具有来自共刺激分子的一种或多种ITAM的多肽(例如，CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134))，或其组合。在更进一步的实施例中，效应子结构域包含与细胞质信号传导蛋白缔合的细胞质部分，其中细胞质信号传导蛋白是淋巴细胞受体或其信号传导结构域，包含多种ITAM、共刺激因子或其任意组合的蛋白。

示例性效应子结构域包括来自4-1BB(CD137)、CD3ε、CD3δ、CD3ζ、CD25、CD27、CD28、CD79A、CD79B、CARD11、DAP10、FcRα、FcRβ、FcRγ、Fyn、HVEM、ICOS、Lck、LAG3、LAT、LRP、NKG2D、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、Wnt、OX40(CD134)、ROR2、Ryk、SLAMF1、Slp76、pTα、TCRα、TCRβ、TRIM、Zap70、PTCH2或其任意组合的那些。

在某些实施例中，效应子结构域包含来自共刺激分子CD28的部分或结构域，其可任选地包含天然CD28蛋白的第186-187位的LL→GG突变(SEQ ID NO.:15；参见Nguyen etal.,Blood 102:4320,2003)。在进一步的实施例中，效应子结构域包含CD3ζ或其功能部分(SEQ ID NO.:17)和来自共刺激分子的一个或多个部分或结构域，例如CD28(SEQ ID NO.:15)，4-1BB(SEQ ID NO.:16)，CD27或OX40。在特定的实施例中，本公开的融合蛋白的效应子结构域包含来自CD3ζ(SEQ ID NO.:17)和CD28(SEQ ID NO.:15)；CD3ζ(SEQ ID NO.:17)和4-1BB(SEQ ID NO.:16)；或CD3ζ(SEQ ID NO.:17)，CD28(SEQ ID NO.:15)和4-1BB(SEQ IDNO.:16)的效应子结构域或其功能部分。

在某些实施例中，效应子结构域包含CD3ζ或其功能部分，其由与SEQ ID NO.:86具有至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％序列同一性的多核苷酸编码。在进一步的实施例中，效应子结构域包含来自共刺激分子CD28的部分或结构域，其由与SEQ ID NO.:84具有至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％序列同一性的多核苷酸编码。在更进一步的实施例中，效应子结构域包含来自共刺激分子4-1BB的部分或结构域，其由与SEQ ID NO.:85具有至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％序列同一性的多核苷酸编码。

本公开的细胞外结构域和细胞内结构域通过疏水部分连接。如本文所使用的，“疏水部分”意味着具有在细胞膜中热力学稳定的三维结构的任何氨基酸序列，并且通常在约15个氨基酸至约30个氨基酸的长度范围内。疏水部分的结构可包括α螺旋、β桶、β折叠、β螺旋或其任意组合。在某些实施例中，疏水部分由来自已知跨膜蛋白的“跨膜结构域”组成，其是可以插入或跨越细胞膜的跨膜蛋白的一部分。在一些实施例中，疏水部分是跨膜结构域，诸如CD4跨膜结构域、CD8跨膜结构域、CD28(例如，SEQ ID NO.:14)，CD27跨膜结构域和4-1BB跨膜结构域。在某些实施例中，疏水部分是CD28跨膜结构域(SEQ ID NO.:14)。在进一步的实施例中，疏水部分是CD28跨膜结构域，其由与SEQ ID NO.:83具有至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％序列同一性的多核苷酸编码。

本公开的融合蛋白可进一步包含接头模块。“接头模块”可以是具有约2个氨基酸至约500个氨基酸的氨基酸序列，其可以为通过接头连接的两个区、结构域、基序、片段或模块之间的构象运动提供柔性和空间。在某些实施例中，接头模块可位于结合结构域和疏水区之间。在这样的实施例中，接头模块可将结合结构域远离细胞表面而定位，以实现适当的细胞/细胞接触、抗原结合和活化(Patel et al.,Gene Therapy 6:412-419,1999)。可以改变接头模块长度以基于所选择的靶分子、选择的结合表位或抗原结合域大小和亲和力而最大化肿瘤识别(参见，例如，Guest et al.,J.Immunother.28:203-11,2005；PCT公开号WO2014/031687)。示例性接头模块包括具有甘氨酸-丝氨酸(Gly-Ser)接头的那些，其具有1至约10个重复的Gly_xSer_y，其中x和y独立地是0至10的整数，条件是x和y不都是0(例如，(Gly₄Ser)₂、(Gly₃Ser)₂、Gly₂Ser或其组合，例如(Gly₃Ser)₂Gly₂Ser)。在某些实施例中，接头模块包含一个或多个免疫球蛋白重链恒定区，例如单独的CH3，或CH2CH3结构、CH3CH4结构、免疫球蛋白铰链或其任意组合(例如，CH2CH3结构与铰链一起))。在进一步的实施例中，接头模块包含选自以下的Fc结构域的全部或一部分：CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域或其组合(参见，例如，PCT公开WO2014/031687)。

示例性接头模块的长度可以变化，例如，约5个氨基酸至约500个氨基酸，约10个氨基酸至约350个氨基酸，约15个氨基酸至约100个氨基酸，约20个氨基酸至约75个氨基酸，或约25个氨基酸至约35个氨基酸。在进一步的实施例中，接头模块可以进一步包含铰链区、标签或两者。铰链模块的每个这样的组分不是互斥的。

在某些实施例中，本公开的融合蛋白的接头模块可以包含具有N297Q突变的IgG1CH2区(SEQ ID NO.:10)；IgG4 CH2区(SEQ ID NO.:11)；IgG1 CH3区(SEQ ID NO.:12)；或IgG4 CH3区(SEQ ID NO.:13)。在某些实施例中，接头模块可以包含甘氨酸-丝氨酸接头(SEQ ID NO.:20，其可由SEQ ID NO.:89；或SEQ ID NO.:21编码，其可由SEQ ID NO.:90编码)。

在进一步的实施例中，本公开的融合蛋白的接头模块包含具有N297Q突变的IgG1CH2区，其由与SEQ ID NO.:79具有至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％序列同一性的多核苷酸编码。在其他实施例中，本公开的融合蛋白的接头模块包含IgG4 CH2区，其由与SEQ ID NO.:80具有至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％序列同一性的多核苷酸编码。在另一些其他实施例中，本公开的融合蛋白的接头模块包含IgG1 CH3区，其由与SEQ ID NO.:81具有至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％序列同一性的多核苷酸编码。在另一些其他实施例中，本公开的融合蛋白的接头模块包含IgG4 CH3区，其由与SEQ ID NO.:82具有至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％序列同一性的多核苷酸编码。

在某些实施例中，接头模块进一步包含铰链区。如本文所使用的，“铰链区”或“铰链”是指(a)免疫球蛋白铰链序列(由例如上部和核心区组成)，或其功能性片段或变体，(b)II型C-凝集素域间(茎)区，或其功能性片段或变体，或(c)分化簇(CD)分子茎区，或其功能性变体。如本文所使用的，“野生型免疫球蛋白铰链区”是指插入在抗体重链中发现的CH1和CH2结构域之间并将其连接的天然存在的上和中铰链氨基酸序列。在某些实施例中，铰链区是人的，并且在特定实施例中，包含人IgG铰链区。在进一步的实施例中，铰链区是如PCT公开号WO2014/031687中所描述的改变的IgG4铰链区。在特定的实施例中，本公开的融合蛋白的铰链区可以是IgG1铰链(SEQ ID NO.:7)。在相关实施例中，本公开的融合蛋白的铰链区可以是IgG1铰链，其由如SEQ ID NO.:76所示出的多核苷酸编码。

本公开的融合蛋白可进一步包含连接氨基酸。“连接氨基酸”或“连接氨基酸残基”是指蛋白的两个相邻结构域、基序、区、模块或片段之间的一个或多个(例如，约2-20个)氨基酸残基，诸如在结合结构域和相邻的接头模块，在疏水结构域和相邻的效应子结构域之间，或在接头模块的一端或两端上，所述接头模块连接两个结构域、基序、区、模块或片段(例如，在接头模块和相邻的结合结构域之间或接头模块和相邻铰链之间)。连接氨基酸可以由融合蛋白的构建体设计产生(例如，在构建编码融合蛋白的核酸分子的构建过程中使用限制酶位点产生的氨基酸残基)。例如，融合蛋白的疏水部分可以在氨基末端、羧基末端或两者处具有一个或多个连接氨基酸。连接氨基酸的实例包括来自IgG2的连接氨基酸(例如，SEQ ID NO.:9，其可以由SEQ ID NO.:78编码)。在铰链区来自IgG4的一些实施例中，铰链区可包括连接氨基酸(例如，SEQ ID NO.:8，其可由SEQ ID NO.:77编码)。在某些实施例中，疏水部分是具有SEQ ID NO.:14的氨基酸的CD28跨膜结构域，其中CD28跨膜结构域包含例如甲硫氨酸的氨基末端连接氨基酸(参见，例如，SEQ ID NO.30、31、39和40的融合蛋白)。因此，在某些实施例中，接头模块包含IgG4铰链、IgG4连接氨基酸和IgG4CH2-CH3。在某些其他实施例中，接头模块包含IgG1铰链、IgG2连接氨基酸和IgG1CH2-CH3。

在一些实施例中，本公开的融合蛋白可进一步包含标签。如本文所用，“标签”是指附着于，融合至或称为感兴趣的蛋白的一部分的独特肽序列，异源或非内源的同源结合分子(例如，受体、配体、抗体或其他结合配偶体)能够特异性结合至该独特肽序列，其中结合性质可用于检测、识别、分离或纯化、追踪、富集或靶向标记的蛋白或表达标记蛋白的细胞，特别是当标记的蛋白是蛋白或其他材料的异源群体的一部分时，或当表达标记蛋白质的细胞是异源细胞群(例如，外周血等生物样品)的一部分时。(参见，例如，WO 2015/095895。)在所提供的融合蛋白中，标签与同源结合分子特异性结合的能力不同于结合结构域特异性结合(多个)靶标分子的能力，或在此能力之外。标签通常不是抗原结合分子，例如，不是抗体或TCR或其抗原结合部分。标签的例子包括Strep标签、His标签、Flag标签、Xpress标签、Avi标签、Calmodulin标签、Polyglutamate标签、HA标签、Myc标签、Nus标签、S标签、X标签、SBP标签、Softag、V5标签、CBP、GST、MBP、GFP、硫氧还蛋白标签。在特定的实施例中，Strep标签具有SEQ ID NO.:62或SEQ ID NO.:63的氨基酸序列。

本公开的融合蛋白可包含信号肽。“信号肽”是短(例如，5-30个氨基酸)序列，其用于靶向融合蛋白以进行细胞表面表达。示例性信号肽包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)信号肽(SEQ ID NO.:18，其可由SEQ ID NO.:87编码)和鼠kappa信号肽(SEQ IDNO.:19，其可以由SEQ ID NO.:88编码)。

在某些实施例中，融合蛋白是嵌合抗原受体。“嵌合抗原受体”(CAR)是指本公开的融合蛋白，其被工程化以包含两个或更多个天然存在的氨基酸序列，其以不天然存在或不在宿主细胞中天然存在的方式连接在一起，当融合蛋白存在于细胞表面时，其可以起到受体的作用。

在一些实施例中，CAR是完全人的或人源化的。在某些实施例中，CAR具有来自抗CD20抗体的scFv或来自对CD20抗原特异的TCR的scTCR。在特定的实施例中，CAR包含来自1.5.3、1F5、Leu16、利妥昔单抗、奥法木单抗、维妥珠单抗、ocrelizumab、ublituximab或其任意组合的scFv。在特定的实施例中，CAR包含接头模块，其包含IgG1铰链、IgG4铰链或其任意组合。在进一步的实施例中，CAR包含接头模块，其包含具有N297Q突变的IgG1 CH2区、IgG4 CH2区、IgG1 CH3区，IgG4CH3区或其任意组合。在更进一步的实施例中，CAR的疏水部分包含CD28跨膜结构域。在一些实施例中，CAR包含细胞内结构域，其包含来自CD3ζ、4-1BB、CD28或其任意组合的部分或结构域。在以上实施例的任意一个中，CAR包含在两个相邻的结构域、基序、区、模块或片段之间的连接氨基酸。

在某些实施例中，CAR可以与1.5.3-NQ-28-BB-z(SEQ ID NO.:26)；1.5.3-NQ-28-z(SEQ ID NO.:27)；1.5.3-NQ-BB-z(SEQ ID NO.:28)；1.5.3-NQ-z(SEQ ID NO.:29)；Leu16-28-BB-z(SEQ ID NO.:30)；Leu16-28-z(SEQ ID NO.:31)；1F5-NQ-28-BB-z(SEQ ID NO.:32)；1F5-NQ-28-z(SEQ ID NO.:33)；或1F5-NQ-BB-z(SEQ ID NO.:34)至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同。在特定的实施例中，CAR包含或由SEQ ID NO.:26-34中任意一个的氨基酸序列组成。

在某些实施例中，CAR可以与SEQ ID NO.:44 52中任意一个的核酸分子序列至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同。在特定的实施例中，CAR由包含或由SEQ ID NO.:44-52中任意一个的序列组成的多核苷酸编码。

制造融合蛋白，包括CAR的方法在本领域是已知的，并例如在美国专利号6,410,319；U.S.专利号7,446,191；U.S.专利公开号2010/065818；U.S.专利号8,822,647；PCT公开号WO 2014/031687；U.S.专利号7,514,537；以及Brentjens et al.,2007,Clin.CancerRes.13:5426中进行了描述。

宿主细胞、核酸和载体

在某些方面，本公开提供了编码本文所描述的融合蛋白中的任意一个或多个的核酸分子。编码所需融合蛋白的多核苷酸可以使用本领域已知的重组方法，使用标准技术，例如从表达所需序列或其部分的细胞中筛选文库，通过从已知包含其的载体中获得序列，或通过直接从含有其的细胞或组织中分离其序列或部分来获得或产生。或者，可以合成产生感兴趣的序列。可将此类核酸分子插入合适的载体(例如，病毒载体或非病毒质粒载体)中以引入感兴趣的宿主细胞(例如免疫细胞，诸如T细胞)。

“载体”是能够转运另一种核酸的核酸分子。在一些实施例中，载体含有转录或翻译终止子、起始序列或用于调节所需核酸序列表达的启动子。载体可以是，例如，质粒、粘粒、病毒或噬菌体、或转座子系统(例如，Sleeping Beauty，参见，例如，Geurts et al.,Mol.Ther.8:108,2003；Mátés et al.,Nat.Genet.41:753,2009)。“表达载体”是当载体存在于适当环境中时能够指导由载体携带的一种或多种基因编码的蛋白质表达的载体。

编码核心病毒的载体在本文中称为“病毒载体”。存在大量适用于本公开组合物的可用病毒载体，包括识别用于人基因治疗应用的那些(参见Pfeifer and Verma,Ann.Rev.Genomics Hum.Genet.2:177,2001)。合适的病毒载体包括基于RNA病毒的载体，例如逆转录病毒衍生的载体。

“逆转录病毒”是具有RNA基因组的病毒，其使用逆转录酶逆转录成DNA，然后将逆转录的DNA掺入宿主细胞基因组中。“γ逆转录病毒”是指逆转录病毒科的一个属。γ逆转录病毒的实例包括小鼠干细胞病毒、鼠白血病病毒、猫白血病病毒、猫肉瘤病毒和禽网状内皮细胞增殖病毒。“慢病毒”是指能够感染分裂和非分裂细胞的逆转录病毒的另一个属。慢病毒的几个例子包括人类免疫缺陷病毒(HIV；包括HIV 1型和HIV 2型)；马传染性贫血病毒；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；和猴免疫缺陷病毒(SIV)。

在某些实施例中，病毒载体可以是γ逆转录病毒，例如Moloney鼠白血病病毒(MLV)衍生的载体。在其他实施例中，病毒载体可以是更复杂的逆转录病毒衍生的载体，例如慢病毒衍生的载体。HIV-1衍生的载体属于这一类。其他实例包括衍生自HIV-2、FIV、马传染性贫血病毒、SIV和Maedi-Visna病毒(绵羊慢病毒)的慢病毒载体。使用逆转录病毒和慢病毒病毒载体和包装细胞用含有CAR转基因的病毒颗粒转导哺乳动物宿主细胞的方法是本领域已知的，并且先前已在例如U.S.专利8,119,772；Walchli et al.,PLoS One 6:327930,2011；Zhao et al.,J.Immunol.174:4415,2005；Engels et al.,Hum.GeneTher.14:1155,2003；Frecha et al.,Mol.Ther.18:1748,2010；Verhoeyen et al.,Methods Mol.Biol.506:97,2009中描述。逆转录病毒和慢病毒载体构建体和表达系统也是可商购的。其他病毒载体也可用于多核苷酸递送，包括DNA病毒载体，包括例如基于腺病毒的载体和基于腺伴随病毒(AAV)的载体；衍生自单纯疱疹病毒(HSV)的载体，包括扩增子载体、复制缺陷型HSV和减毒HSV(Krisky et al.,Gene Ther.5:1517,1998)。

最近开发用于基因治疗用途的其他载体也可以与本公开的组合物和方法一起使用。这些载体包括衍生自杆状病毒和α-病毒的载体(Jolly，D J.1999.Emerging ViralVectors.pp 209-40in Friedmann T.ed.The Development of Human Gene Therapy.NewYork：Cold Spring Harbor Lab)，或质粒载体(如sleeping beauty或其他转座子载体))。

在某些实施例中，病毒载体用于引入编码对靶标(诸如CD20)特异的融合蛋白的非内源多核苷酸。在这样的实施例中，病毒载体可以是逆转录病毒载体或慢病毒载体。病毒载体还可以包括编码转导标记物的核酸序列。用于病毒载体的转导标记物是本领域已知的，包括可赋予药物抗性的选择标记物、可检测的标记物，例如可通过诸如流式细胞术的方法检测的荧光标记物或细胞表面蛋白。

在某些实施例中，病毒载体包含转导标记物。如本文所使用的，“转导标记物”可以包括在任何构建体中，作为监测转染效率或检测表达融合蛋白的细胞的方式。示例性转导标记物绿色荧光蛋白，人CD2的细胞外结构域，截短的人细胞EGFR(huEGFRt；SEQ ID NO.:25,其可由SEQ ID NO.:94编码；参见Wang et al.,Blood 118:1255,2011)或截短的CD19(SEQ ID NO.:24,其可由SEQ ID NO.:93编码)。在某些实施例中，病毒载体包括自杀基因，诸如iCasp9(参见，例如，Gargett and Brown,Front.Pharmacol.5:235,2104)，或HSV-TK(参见，例如，Fillat et al.,Curr.Gene Ther.3:13,2003)。

当病毒载体基因组包括多个多核苷酸以在宿主细胞中表达为单独的转录时，病毒载体也可以包括在两个(或多个)转录之间的另外的序列，允许双顺反子或多顺反子表达。用在病毒载体中的这样的序列的实例包括内部核糖体进入位点(IRES)、弗林蛋白酶切割位点、病毒2A肽，或其任意组合。在某些实施例中，病毒构建体包含编码自切割肽(例如E2A(SEQ ID NO.:22，其可由SEQ ID NO.:91编码)、T2A(SEQ ID NO.:23，其可由SEQ ID NO.:92编码)、P2A(SEQ ID NO.:95，可由SEQ ID NO.:97编码)或F2A(SEQ ID NO.:96，其可由SEQID NO.:98编码))的多核苷酸，以使得成熟的融合蛋白不含有转导标记物或自杀基因。在某些实施例中，核酸载体可以编码本公开的融合肽，任选地含有转导标记物(诸如tCD19或tEGFR)。在进一步的实施例中，可以对编码本公开的融合蛋白的核酸分子进行密码子优化以增强或最大化某些类型的细胞(例如T细胞)中的表达(Scholten et al.,Clin.Immunol.119:135-145,2006)，并且可任选地含有转导标记物(诸如tCD19或tEGFR)。

在本文所描述的任何实施例中，含有编码本公开的融合蛋白的多核苷酸的载体还可含有编码转导标记物的多核苷酸，其可用于靶向表达用于去除或死亡的转导标记物的宿主细胞。已经表明，功能性抗原靶向的CAR T细胞的存留可导致内源性表达抗原的健康细胞的持续消耗(参见，例如，Paskiewicz et al.,J.Clin.Invest.,126(11):4262-4272(2016)。因此，需要在实现期望的抗肿瘤作用后允许调节(例如去除、杀死或产生另一种细胞毒性作用)转移的T细胞的控制机制。如本文所使用的，术语“细胞毒性作用”包括清除、杀死或以其他方式损害或降低细胞生长、分裂或存活的能力。细胞毒性作用的非限制性实例包括坏死、裂解、凋亡、肿胀、膜完整性丧失，转录水平或速率降低，翻译水平或速率降低，ATP产生水平或速率降低，活性氧水平或速率增加，线粒体功能减少，核浓缩，细胞DNA切割增加，分裂或增殖速率降低，特定细胞功能减少或丧失(例如，B淋巴细胞产生免疫球蛋白的能力)。一种示例性方法是使用可被抗体(例如，西妥昔单抗)或抗体-药物缀合物识别的标记物(例如，tEGFR)，其在结合标记物后促进抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)应答，或递送细胞毒性分子，以清除、杀死或以其他方式对转移的T细胞产生细胞毒性作用。因此，在某些实施例中，载体包括编码融合蛋白的多核苷酸和包括编码转导标记物的多核苷酸。通过细胞毒性抗体、抗体-药物缀合物或其他细胞毒性剂能够特异性结合的转导标记物在本文中称为“自杀转导标记物”。在某些实施例中，治疗与CD20表达相关的疾病或病症的方法包括根据本公开向受试者施用治疗有效量的转化的宿主细胞，其中所述转化的宿主细胞包含编码融合蛋白的异源性多核苷酸和编码自杀转导标记物的异源性多核苷酸，其中所述方法任选地包括施用细胞毒性抗体、抗体-药物缀合物或其他细胞毒性剂，其与自杀转导标记物特异性缔合、结合或形成复合物。在一些实施例中，自杀转导标记物包含或由截短的EGFR(例如，SEQ ID NO.:25)组成，其通过抗EGFR抗体例如西妥昔单抗特异性结合。在进一步的实施例中，自杀转导标记物包含或由截短的CD19(例如，SEQID NO：24)组成，其通过细胞毒性抗CD19抗体或抗体-药物缀合物特异性结合，例如，博纳吐单抗、coltuximabravtansine、MOR208、MEDI-551、denintuzumabmafodotin、Merck专利抗CD19、taplutumomabpaptox、XmAb 5871、MDX-1342、SAR3419、SGN-19A或AFM11(参见，例如，Naddafi and Davami,Int.J.Mol.Cell.Med.,4(3):143-151(2015))。

在本文所描述的任何实施例中，本公开的编码的融合蛋白可以是CAR，诸如CD20特异性CAR。在某些实施例中，由本公开的载体中包含的多核苷酸编码的CAR或其结合结构域是完全人的或人源的。在进一步的实施例中，由本公开的载体编码的CAR具有来自抗CD20抗体的scFv或来自对CD20抗原特异的TCR的scTCR。在更进一步的实施例中，由本公开的载体编码的CAR包含来自1.5.3、1F5、Leu16、利妥昔单抗、奥法木单抗、维妥珠单抗、ocrelizumab、ublituximab或其任意组合的scFv。在特定的实施例中，由本公开的载体中包含的多核苷酸编码的CAR包含接头模块，其包含IgG1铰链、IgG4铰链或其任意组合。在进一步的实施例中，由本公开的载体中包含的多核苷酸编码的CAR包含接头模块，其包含具有N297Q突变的IgG1 CH2区、IgG4 CH2区、IgG1 CH3区、IgG4 CH3区或其任意组合。在特定的实施例中，由本公开的载体编码的CAR的接头模块或可变区接头包括甘氨酸-丝氨酸接头。在更进一步的实施例中，由本公开的载体中包含的多核苷酸编码的CAR的疏水部分包含CD28跨膜结构域。在一些实施例中，由本公开的载体中包含的多核苷酸编码的CAR包含细胞内结构域，其包含来自CD3ζ、4-1BB、CD28或其任意组合的部分或结构域。在以上实施例的任意一个中，由本公开的载体中包含的多核苷酸编码的CAR包含在两个相邻的结构域、基序、区、模块或片段之间的连接氨基酸。

在本文描述的实施例的任意一个中，载体可以包含编码CAR的多核苷酸，CAR可以与1.5.3-NQ-28-BB-z(SEQ ID NO.:26)；1.5.3-NQ-28-z(SEQ ID NO.:27)；1.5.3-NQ-BB-z(SEQ ID NO.:28)；1.5.3-NQ-z(SEQ ID NO.:29)；Leu16-28-BB-z(SEQ ID NO.:30)；Leu16-28-z(SEQ ID NO.:31)；1F5-NQ-28-BB-z(SEQ ID NO.:32)；1F5-NQ-28-z(SEQ ID NO.:33)；或1F5-NQ-BB-z(SEQ ID NO.:34)至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同。在进一步的实施例中，载体可以包含编码CAR的多核苷酸，CAR包含或由SEQ ID NO.:26-34中任意一个的氨基酸序列组成。

在更进一步的实施例中，CD20特异性CAR由包含在载体中的多核苷酸编码，其中多核苷酸与SEQ ID NO.:44-52中任意一个的核酸分子序列具有至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％的同一性。在相关的实施例中，CD20特异性CAR由包含在载体中的多核苷酸编码，其中多核苷酸包含或由SEQ ID NO.:44-52中任意一个的序列组成。

任选地，包含编码本公开的CAR的多核苷酸的本公开的任意载体还能够编码转导标记物(例如tCD19)，其也可以包含自切割肽，以使得转导标记物和CAR分成单独的分子-CAR和转导标记物。在某些实施例中，载体可以包含编码位于CD20特异性CAR和tCD19转导标记物之间的自切割肽的多核苷酸，其中多核苷酸与SEQ ID NO.:53 61中任意一个的核酸分子序列至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同。在某些实施例中，载体可以包含编码位于CD20特异性CAR和tCD19转导标记物之间的自切割肽的多核苷酸，并且包含或由SEQ ID NO.:53 61中任意一个的核酸分子序列组成。

在本文公开的实施例的任意一个中，单独的多核苷酸编码能够特异性结合CD20的融合蛋白，其中所述多核苷酸：(a)与SEQ ID NO.:53-56中任意一个的多核苷酸序列至少80％相同；(b)与SEQ ID NO.:44-47中任意一个的多核苷酸序列至少80％相同；(c)包含SEQID NO.:53-56中任意一个的多核苷酸序列；(d)包含SEQ ID NO.:44-47中任意一个的多核苷酸序列；(e)由SEQ ID NO.:53-56中任意一个的多核苷酸序列组成；(f)由SEQ ID NO.:44-47中任意一个的多核苷酸序列组成。

在本文所公开的任何实施例中，融合蛋白由本文公开的单独的多核苷酸编码。在某些实施例中，融合蛋白包含或由氨基酸序列组成，其中融合蛋白：(a)与成熟融合蛋白至少90％相同，其中成熟融合蛋白包含SEQ ID NO.:26-29和35-38以及32-34中任意一个的氨基酸序列，tCD19转导标记物被移除；(b)包含成熟融合蛋白，其中成熟融合蛋白包含SEQ IDNO.:35-38中任意一个的氨基酸序列，tCD19转导标记物被移除；(c)由成熟融合蛋白组成，其中成熟融合蛋白包含SEQ ID NO.:35-38中任意一个的氨基酸序列，tCD19转导标记物被移除；(d)与SEQ ID NO.:26-29中任意一个的氨基酸序列至少90％相同；(e)包含SEQ IDNO.:26-29中任意一个的氨基酸序列；(f)由SEQ ID NO.:26-29中任意一个的氨基酸序列组成；

在某些实施例中，提供宿主细胞，其包含如本文所公开的异源性多核苷酸并能够表达由异源性多核苷酸编码的融合蛋白。

在本文公开的实施例的任意一个中，宿主细胞包含编码能够特异性结合CD20的融合蛋白的单独的多核苷酸，其中所述多核苷酸：(a)与SEQ ID NO.:53-56中任意一个的多核苷酸序列至少80％相同；(b)与SEQ ID NO.:44-47中任意一个的多核苷酸序列至少80％相同；(c)包含SEQ ID NO.:53-56中任意一个的多核苷酸序列；(d)包含SEQ ID NO.:44-47中任意一个的多核苷酸序列；(e)由SEQ ID NO.:53-56中任意一个的多核苷酸序列组成；(f)由SEQ ID NO.:44-47中任意一个的多核苷酸序列组成。

在某些实施例中，宿主细胞包含融合蛋白，其包含或由氨基酸序列组成，其中融合蛋白：(a)与成熟融合蛋白至少90％相同，其中成熟融合蛋白包含SEQ ID NO.:26-29和35-38以及32-34中任意一个的氨基酸序列，tCD19转导标记物被移除；(b)包含成熟融合蛋白，其中成熟融合蛋白包含SEQ ID NO.:35-38中任意一个的氨基酸序列，tCD19转导标记物被移除；(c)由成熟融合蛋白组成，其中成熟融合蛋白包含SEQ ID NO.:35-38中任意一个的氨基酸序列，tCD19转导标记物被移除；(d)与SEQ ID NO.:26-29中任意一个的氨基酸序列至少90％相同；(e)包含SEQ ID NO.:26-29中任意一个的氨基酸序列；(f)由SEQ ID NO.:26-29中任意一个的氨基酸序列组成；

在某些实施例中，宿主细胞包含如本文所公开的异源性多核苷酸并能够表达由异源性多核苷酸编码的融合肽。

在某些实施例中，宿主细胞包含编码融合蛋白的异源性多核苷酸，所述融合蛋白包含结合结构域，其中所述结合结构域为：(a)包含与SEQ ID No.:64的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的1.5.3scFv，其中与特异性结合CD20的亲本单克隆抗体或其片段或衍生物的相应的CDR相比，如果含有一个或多个修饰的CDR的scFv以与野生型scFv或相应抗体相似的亲和力与CD20特异性结合，scFv的每个CDR包含零变化或至多一个、两个、三个、四个、五个或六个变化；(b)包含或由SEQ ID NO.:64的氨基酸序列组成的1.5.3scFv；(c)包含与SEQ ID No.:66的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的1F5 scFv，其中与特异性结合CD20的亲本单克隆抗体或其片段或衍生物的相应的CDR相比，如果含有一个或多个修饰的CDR的scFv以与野生型scFv或相应抗体相似的亲和力与CD20特异性结合，scFv的每个CDR包含零变化或至多一个、两个、三个、四个、五个或六个变化；(d)包含或由SEQ ID NO.:66的氨基酸序列组成的1F5 scFv；(e)包含与SEQ ID No.:65的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的Leu16 scFv，其中与特异性结合CD20的亲本单克隆抗体或其片段或衍生物的相应的CDR相比，如果含有一个或多个修饰的CDR的scFv以与野生型scFv或相应抗体相似的亲和力与CD20特异性结合，scFv的每个CDR包含零变化或至多一个、两个、三个、四个、五个或六个变化；或者(f)包含或由SEQ ID NO.:65的氨基酸序列组成的Leu16 scFv。

在某些实施例中，宿主细胞包含编码融合蛋白的异源性多核苷酸，所述融合蛋白包含scFv，其中所述scFv由以下编码：(a)与SEQ ID NO.:67的核酸分子序列具有至少80％同一性的多核苷酸，其中，当与编码来自特异性结合CD20的单克隆抗体的亲本scFv的多核苷酸相比，如果含有一个或多个修饰的CDR的scFv以与野生型scFv或相应抗体相似的亲和力特异性结合CD20，编码scFv的每个CDR的多核苷酸序列包含零变化或至多一至六个核苷酸变化；(b)包含或由SEQ ID NO.:67的核酸分子序列组成的多核苷酸；(c)与SEQ ID NO.:69的核酸分子序列具有至少80％同一性的多核苷酸，其中，当与编码来自特异性结合CD20的单克隆抗体的亲本scFv的多核苷酸相比，如果含有一个或多个修饰的CDR的scFv以与野生型scFv或相应抗体相似的亲和力特异性结合CD20，编码scFv的每个CDR的多核苷酸序列包含零变化或至多一至六个核苷酸变化；(d)包含或由SEQ ID NO.:69的核酸分子序列组成的多核苷酸；(e)与SEQ ID NO.:68的核酸分子序列具有至少80％同一性的多核苷酸，其中，当与编码来自特异性结合CD20的单克隆抗体的亲本scFv的多核苷酸相比，如果含有一个或多个修饰的CDR的scFv以与野生型scFv或相应抗体相似的亲和力特异性结合CD20，编码scFv的每个CDR的多核苷酸序列包含零变化或至多一至六个核苷酸变化；或者(f)包含或由SEQ ID NO.:68的核酸分子序列组成的多核苷酸。

在某些实施例中，宿主细胞包含编码融合蛋白的异源性多核苷酸，其中融合蛋白是嵌合抗原受体并包含或由SEQ ID NO.:26-3443中任意一个的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列组成。

在某些实施例中，宿主细胞包含编码融合蛋白的异源性多核苷酸，所述融合蛋白包含疏水部分，其中所述疏水部分为跨膜结构域。在某些实施例中，疏水部分是CD4、CD8、CD28或CD27跨膜结构域。

在某些实施例中，宿主细胞包含编码融合蛋白的异源性多核苷酸，融合蛋白包含效应子结构域或其功能性部分，其中效应子结构域或其功能性部分是4-1BB(CD137)、CD3ε、CD3δ、CD3ζ、CD25、CD27、CD28、CD79A、CD79B、CARD11、DAP10、FcRα、FcRβ、FcRγ、Fyn、HVEM、ICOS、Lck、LAG3、LAT、LRP、NKG2D、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、OX40(CD134)、ROR2、Ryk、SLAMF1、Slp76、pTα、TCRα、TCRβ、TRIM、Zap70、PTCH2或其任意组合。

在某些实施例中，宿主细胞包含编码融合蛋白的异源性多核苷酸，所述融合蛋白包含细胞内组分，其中所述细胞内组分包含：(a)CD3ζ效应子结构域或其功能性部分、CD28共刺激结构域或其功能性部分以及4-1BB(CD137)共刺激结构域或其功能性部分；(b)CD3ζ效应子结构域或其功能性部分、CD28共刺激结构域或其功能性部分以及OX40(CD134)共刺激结构域或其功能性部分；(c)CD3ζ效应子结构域或其功能性部分、CD27共刺激结构域或其功能性部分以及4-1BB(CD137)共刺激结构域或其功能性部分；(d)CD3ζ效应子结构域或其功能性部分、CD27共刺激结构域或其功能性部分以及OX40(CD134)共刺激结构域或其功能性部分；(e)CD3ζ效应子结构域或其功能性部分、CD27共刺激结构域或其功能性部分以及CD28共刺激结构域或其功能性部分；(f)CD3ζ效应子结构域或其功能性部分、4-1BB(CD137)共刺激结构域或其功能性部分以及OX40(CD134)共刺激结构域或其功能性部分。

在本文所描述的任何实施例中，将含有本公开的融合蛋白的载体转导进入宿主细胞。“转导”是指将核酸分子(例如，编码本公开的融合蛋白的载体)引入宿主细胞。转导后，宿主细胞可以在染色体外或整合到染色体中携带载体。整合到宿主细胞基因组或自我复制载体中通常导致转化载体的基因稳定遗传。可以使用任何合适的转导方法。载体可以通过物理、化学或生物方式转移到宿主细胞中。含有转化的核酸分子的宿主细胞称为“工程化的”、“重组的”或“非天然的”。

在某些实施例中，通过引入编码如本文所描述的位于细胞表面的融合蛋白的核酸分子，其中细胞表达融合蛋白，可以将从受试者获得的细胞(诸如T细胞)转化为工程化的、非天然的或重组的细胞(例如，工程化的、非天然的或重组的T细胞)。

在某些实施例中，转染以表达本公开的融合蛋白的宿主细胞是功能性T细胞，诸如病毒特异性T细胞、肿瘤抗原特异性细胞毒性T细胞、幼稚T细胞、记忆干细胞T细胞、中枢或效应子记忆T细胞、γδT细胞或CD4⁺CD25⁺调节性T细胞。在进一步的实施例中，将编码本公开的融合蛋白的核酸分子引入普通CD8⁺T细胞、幼稚CD8⁺T细胞、CD8⁺T_CM细胞、CD8⁺T_EM细胞或其任意组合。在更进一步的实施例中，将编码本公开的融合蛋白的核酸分子引入普通CD4⁺T细胞、幼稚CD4⁺T细胞、CD4⁺T_CM细胞、CD4⁺T_EM细胞或其任意组合。在其他实施例中，将编码本公开的融合蛋白的核酸分子引入富含幼稚CD8⁺T细胞和CD8⁺T_CM细胞的T细胞群中。在又一些其他实施例中，将编码本公开的融合蛋白的核酸分子引入富含幼稚CD4⁺T细胞和CD4⁺T_CM细胞的T细胞群中。在任何上述实施例中，T细胞还含有编码工程化CD20特异性TCR、工程化CD20特异性高亲和力TCR、CD20特异性CAR或其任意组合的核酸分子。

在某些实施例中，在用本公开的融合蛋白构建体扩增和遗传修饰T细胞之前，从受试者(例如，外周血单核细胞(PBMC)、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液或脾组织)获得T细胞来源，使用本领域已知的方法从中分离T细胞。可以根据已知技术收集特异性T细胞亚组，并通过已知技术，诸如与抗体的亲和力结合、流式细胞术或免疫磁性选择富集或耗尽特异性T细胞亚组。在富集或耗尽步骤和融合蛋白的引入后，可以根据已知技术(包括美国专利号6,040,177中描述的那些)或对本领域技术人员是显而易见的其变体，对期望修饰的T细胞进行体外扩增。

例如，可以通过在体外向培养基中添加初始T细胞群，然后向培养基中添加饲养细胞(诸如非分裂的PBMC)来扩增期望的T细胞群或亚群(例如，使得得到的细胞群中对于待扩增的初始群体中的每个T细胞含有至少约5、10、20或40个或更多个PBMC饲养细胞)；并温育培养物(例如，足以扩增T细胞数量的时间)。非分裂饲养细胞可包含γ-辐射的PBMC饲养细胞。在一些实施例中，用约3000至3600rad范围的γ射线照射PBMC。如果需要，可以逆转T细胞和饲养细胞向培养基中添加的顺序。培养物通常可以在适合T细胞生长的温度等条件下温育。例如，对于人T淋巴细胞的生长，温度通常至少约25℃，优选至少约30℃，更优选约37℃。

任选地，扩增方法可以进一步包括添加非分裂的Epstein-Barr病毒(EBV)转化的淋巴样干细胞(LCL)作为饲养细胞。LCL可以用约6000至10000rad范围的γ射线照射。LCL饲养细胞可以以任何合适的量提供，例如LCL饲养细胞与初始T淋巴细胞的比例为至少约10：1。

在分离T淋巴细胞后，CD8⁺细胞毒性和CD4⁺辅助T淋巴细胞可以在用融合蛋白进行基因修饰和扩增之前分选成幼稚、记忆和效应子T细胞亚群。在某些实施例中，经修饰以表达本公开的融合蛋白的T细胞是普通T细胞(例如，普通CD4⁺T细胞或普通CD8⁺T细胞)，或者是T细胞亚群，诸如中枢记忆T细胞(例如，CD8⁺中枢记忆T细胞)或中枢记忆(T_CM)T细胞和幼稚(T_N)T细胞(例如，CD4⁺T_CM ⁺T_N细胞)的组合。

在本文描述的实施例的任意一个中，宿主细胞(例如T细胞)可以包含载体，其含有编码CAR的多核苷酸，所述CAR与1.5.3-NQ-28-BB-z(SEQ ID NO.:26)；1.5.3-NQ-28-z(SEQID NO.:27)；1.5.3-NQ-BB-z(SEQ ID NO.:28)；1.5.3-NQ-z(SEQ ID NO.:29)；Leu16-28-BB-z(SEQ ID NO.:30)；Leu16-28-z(SEQ ID NO.:31)；1F5-NQ-28-BB-z(SEQ ID NO.:32)；1F5-NQ-28-z(SEQ ID NO.:33)；或1F5-NQ-BB-z(SEQ ID NO.:34)至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同。在进一步的实施例中，宿主细胞(例如T细胞)包含载体，其含有编码CAR的多核苷酸，所述CAR包含或由SEQ ID NO.:26-34中任意一个的氨基酸序列组成。在这些实施例的任意一个中，宿主细胞是T细胞，其中T细胞是普通CD4⁺T细胞、普通CD8⁺T细胞、CD4⁺中枢记忆T细胞、CD8⁺中枢记忆T细胞或CD4⁺中枢记忆(T_CM)T细胞和CD4⁺幼稚(T_N)T细胞的组合。在施用给受试者之前，可以将CAR修饰的CD4⁺T细胞和CAR修饰的CD8⁺T细胞以3:1至1:1至1:3的比例混合，或者以相同或相似的比例分别施用给受试者。

在更进一步的实施例中，宿主细胞(例如T细胞)包含载体，其含有编码CD20特异性CAR的多核苷酸，其中多核苷酸与SEQ ID NO.:44-52中任意一个的核酸分子序列具有至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％的同一性。在相关实施例中，宿主细胞(例如T细胞)包含载体，其含有编码CD20特异性CAR的多核苷酸，其中多核苷酸包含或由SEQ ID NO.:44 52中任意一个的序列组成。在这些实施例的任意一个中，宿主细胞是T细胞，其中T细胞是普通CD4⁺T细胞、普通CD8⁺T细胞、CD4⁺中枢记忆T细胞、CD8⁺中枢记忆T细胞或CD4⁺中枢记忆(T_CM)T细胞和CD4⁺幼稚(T_N)T细胞的组合。在施用给受试者之前，可以将CAR修饰的CD4⁺T细胞和CAR修饰的CD8⁺T细胞以3:1至1:1至1:3的比例混合，或者以相同或相似的比例分别施用给受试者。

任选地，包含本公开的任意载体的宿主细胞，其含有编码本公开的CAR的多核苷酸，还能够编码转导标记物(例如tCD19)，其也可以包含自切割肽，以使得转导标记物和CAR分成单独的分子-CAR和转导标记物。在某些实施例中，宿主细胞(例如T细胞)包含含有编码位于CD20特异性CAR和tCD19转导标记物之间的自切割肽的多核苷酸的载体，其中多核苷酸与SEQ ID NO.:53-61中任意一个的核酸分子序列至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同。在进一步的实施例中，宿主细胞(例如T细胞)包含含有编码位于CD20特异性CAR和tCD19转导标记物之间的自切割肽的多核苷酸的载体，并且包含或由SEQ ID NO.:53-61中任意一个的核酸分子序列组成。

T细胞或T细胞群是否对特定细胞表面标记物呈阳性可以通过流式细胞术使用针对表面标记物的特异性抗体和同种型匹配的对照抗体染色来确定。对于标记物而言“阴性”的细胞群是指在同种型对照之上不存在用特异性抗体的细胞群的显著染色，并且“阳性”是指细胞群的均匀染色高于同种型对照上发现的水平。在一些实施例中，一种或多种标记物的表达降低是指当与参比T细胞群相比较时，MFI中1log10的损失或T细胞减少百分比表现出至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或100％、或20％至100％之间任意百分比的细胞标记物。在一些实施例中，标记物阳性的T细胞群是指与参比T细胞群相比，展示标记物的细胞的百分比，其可以是细胞的至少50％、细胞的55％、细胞的60％、细胞的65％、细胞的70％、细胞的75％、细胞的80％、细胞的85％、细胞的90％、细胞的95％、或细胞的100％、或50％至100％之间的任意百分比。

免疫磁选择方法也可以使用CliniMACS装置使用市售的临床级抗体珠缀合物来纯化T细胞亚群(参见，例如，Terakura et al.,2012,Blood 119:72-82；Wang et al.,2012,J.Immunother.35:689-701)。例如，为了分离人CD8⁺T_CM细胞，通过用缀合顺磁珠的抗体的耗尽从外周血单核细胞中除去CD4⁺，CD14⁺和CD45RA⁺细胞，然后用抗CD62L标记的珠从剩余细胞中阳性选择的CD62L⁺部分，以富集CD45RO⁺、CD62L⁺、CD8⁺T_CM亚群。富集的CD8⁺T_CM亚群可以用抗CD3/CD28珠或用抗原激活，用逆转录病毒或慢病毒载体用肿瘤特异性CAR修饰，并扩增用于细胞免疫疗法(参见，例如，Terakura et al.,supra；Wang et al.,supra)。

或者，可以使用与Strep-标签II融合的低亲和性Fab片段来选择T细胞亚组。Fab单体不具有足够的结合亲和力以稳定结合细胞表面上的靶抗原。然而，当在StrepTactin珠上多聚化时，这些试剂稳定地结合靶细胞并且能够基于细胞表面标记物特异性进行选择。Fab多聚体结合可以通过添加过量D-生物素而快速逆转，所述过量D-生物素对StrepTactin具有更高的亲和力并破坏Fab片段上的Strep-标签和Strep-Tactin“骨架”之间的结合。Fab单体不能维持与细胞的稳定结合。该“Fab-Streptamer”技术允许基于多种细胞表面标记物对T细胞进行连续阳性富集，并且可用于选择任何所需的T细胞亚组(参见，例如，Stembergeret al.,PloS One 7:e35798,2012)。

可以通过使用标准方法获得普通CD8⁺T细胞。在一些实施例中，通过鉴定与这些类型的CD8⁺T细胞中的每一种相关的某些细胞表面标记物，将普通CD8⁺T细胞进一步分选为幼稚T细胞、中枢记忆T细胞和效应子T细胞。在某些实施例中，记忆T细胞存在于CD8⁺外周血淋巴细胞的CD62L⁺和CD62L^-亚组中。例如，在用抗CD8和抗CD62L抗体染色后，可以将PBMC分选成CD62L^-CD8⁺和CD62L⁺CD8⁺部分。在一些实施例中，CD8⁺中枢记忆T细胞的表型标记物的表达包括CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3或CD127或对于粒酶B是阴性的。在一些实施例中，中枢记忆T细胞是CD45RO⁺、CD62L⁺、CD8⁺T细胞。在一些实施例中，与CD8⁺中枢记忆T细胞相比，CD8⁺效应子T细胞对CD62L、CCR7、CD28或CD127呈阴性或具有降低的表达，或者对于颗粒酶B或穿孔素呈阳性或具有增加的表达。在一些实施例中，幼稚CD8⁺T细胞的特别之处在于幼稚T细胞的表型标记物的表达包括CD62L、CCR7、CD28、CD3、CD127或CD45RA。

可以通过使用标准方法获得普通CD4⁺淋巴细胞。在一些实施例中，通过识别具有某些细胞表面标记物的细胞群，将普通CD4⁺T细胞进一步分类为幼稚细胞、中枢记忆细胞和效应子细胞。在一些实施例中，幼稚CD4⁺T淋巴细胞是CD45RO^-、CD45RA⁺、CD62L⁺、CD4⁺T细胞。在一些实施例中，中枢记忆CD4⁺细胞为CD62L阳性和CD45RO阳性。在一些实施例中，与中枢记忆CD4⁺细胞相比，效应子CD4⁺细胞为CD62L或CD45RO阴性或具有降低的CD62L或CD45RO表达。

具有抗原特异性的TCR的CD4⁺和CD8⁺群可以通过用抗原刺激幼稚或抗原特异性T淋巴细胞来获得。例如，通过从感染的受试者中分离T细胞并用相同的抗原体外刺激细胞，可以针对例如巨细胞病毒抗原产生具有抗原特异性TCR的T细胞克隆。也可以通过将它们暴露于在抗原呈递细胞或肽-MHC复合物的背景下呈递的肽抗原来使用幼稚T细胞。可以使用来自肿瘤细胞、癌细胞或病原体的任何数量的抗原。这些抗原的实例包括HIV抗原、丙型肝炎病毒(HCV)抗原、乙型肝炎病毒(HBV)抗原、巨细胞病毒(CMV)抗原、EBV抗原、寄生虫抗原和肿瘤抗原，如孤儿酪氨酸激酶受体ROR1、EGFR、EGFRvIII、GD2、GD3、HPV E6、HPV E7、Her2、L1-CAM、Lewis A、Lewis Y、MUC1、MUC16、PSMA、CD19、CD20、CD22、CD56、CD23、CD24、CD37、CD30、CD33、CD38、CD56、CD123、CA125、c-MET、FcRH5、WT1、叶酸受体α、VEGF-α、VEGFR1、VEGFR2、IL-13Rα2、IL-11Rα、MAGE-A1、PSA、肝配蛋白A2、肝配蛋白B2、NKG2D ligands、NY-ESO-1、TAG-72、间皮素、CEA或类似物。这样的具有抗原特异性TCR的T细胞可以进一步修饰以含有如本文所描述的融合蛋白，其中融合蛋白对同一抗原具有特异性，对同一抗原上的不同表位具有特异性，或对不同抗原具有特异性。在任何这些实施例中，CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞将含有不同的CAR，特别是CAR的细胞内信号传导成分将是不同的。

制备和修饰T细胞以表达本公开的融合蛋白，证实融合蛋白修饰的T细胞活性，扩增融合蛋白修饰的T细胞群的方法是本领域已知的，并且描述于例如Hollyman et al.,2009,J.Immunother.32:169-180；PCT公开号WO 2012/079000；美国专利号8,802,374；Brentjens et al.,Blood 118:4817-4828,2011；美国专利公开号US 2014/0271635。

使用

本公开提供了治疗受试者中疾病、状况或病症的方法，包括：向受试者施用本文所描述的任何融合蛋白。在实施例中，本公开的方法包括减少B细胞数量或治疗与受试者中异常B细胞活性相关的疾病或病症的方法。另一个实施例提供治疗受试者的疾病、状况或病症的方法，包括分析受试者的生物样品中是否存在与疾病、状况或病症相关的抗原，并施用本文所描述的融合蛋白，其中所述融合蛋白特异性结合抗原。在一些实施例中，与疾病、状况或病症相关的抗原是肿瘤相关抗原。

可以用本公开中描述的组合物和方法治疗的疾病、状况或病症包括癌症和免疫疾病(例如，自身免疫)。例如，在某些实施例中，表达CD20的细胞包含B细胞。在进一步的实施例中，与CD20表达相关的疾病或病症在于B细胞或异常B细胞活性，例如B细胞相关的癌症。过继性免疫和基因治疗对于各种类型的癌症是有希望的(Morgan et al.,Science 314:126,2006；Schmitt et al.,Hum.Gene Ther.20:1240,2009；June,J.Clin.Invest.117:1466,2007)。

多种癌症，包括实体瘤和白血病，适合于本文公开的组合物和方法。可以治疗的示例性癌症类型包括乳腺癌、前列腺癌和结肠癌；所有形式的肺支气管癌；髓性白血病；黑色素瘤；肝癌；神经母细胞瘤；乳头状瘤；apud瘤；迷芽瘤；鳃原瘤；恶性类癌综合征；类癌心脏病；和癌(例如Walker癌，基底细胞癌，基底鳞状癌，Brown-Pearce癌，导管癌，艾氏瘤，Krebs2癌，Merkel细胞癌，粘液癌，非小细胞肺癌，燕麦细胞癌，乳突癌，硬癌，细支气管癌，支气管原癌，鳞状细胞癌和移行细胞癌)。可以治疗的其他类型的癌症包括组织细胞病症；恶性组织细胞病；白血病；霍奇金病；免疫增殖小；非霍奇金淋巴瘤；浆细胞瘤；网状内皮组织增殖；黑色素瘤；软骨母细胞瘤；软骨瘤；软骨肉瘤；纤维瘤；纤维肉瘤；巨细胞瘤；组织细胞瘤；脂肪瘤；脂肪肉瘤；间皮瘤；粘液瘤；粘液肉瘤；骨瘤；骨肉瘤；脊索瘤；颅咽管瘤；无性细胞瘤；错构瘤；间质瘤；中肾瘤；肌肉瘤；成釉细胞瘤；牙骨质瘤；牙瘤；畸胎瘤；胸腺瘤；滋养细胞瘤。此外，还考虑以下类型的癌症适合于治疗：腺瘤；胆管癌；胆脂瘤；圆柱瘤；囊腺癌；囊腺瘤；颗粒细胞瘤；两性母细胞瘤；肝癌；汗腺瘤；胰岛细胞瘤；睾丸间质细胞瘤；乳头状瘤；支持细胞瘤；卵泡膜细胞瘤；平滑肌瘤；平滑肌肉瘤；肌母细胞瘤；肌瘤；肌肉瘤；横纹肌瘤；横纹肌肉瘤；室管膜瘤；神经节瘤；神经胶质瘤；成神经管细胞瘤；脑膜瘤；神经鞘瘤；神经母细胞瘤；神经上皮瘤；神经纤维瘤；神经瘤；副神经节瘤；副神经节非嗜铬细胞瘤。可以治疗的癌症类型还包括血管角化瘤；血管淋巴样增生伴嗜酸性粒细胞增多；血管瘤硬化；血管瘤硬化；血管瘤病；血管球瘤；血管内皮瘤；血管瘤；血管外皮细胞瘤；血管肉瘤；淋巴管瘤；淋巴管肌瘤；淋巴管肉瘤；松果体瘤；癌肉瘤；软骨肉瘤；叶状囊肉瘤；纤维肉瘤；血管肉瘤；平滑肌肉瘤；白血病性肉瘤；脂肪肉瘤；淋巴管肉瘤；肌肉瘤；粘液肉瘤；卵巢癌；横纹肌肉瘤；肉瘤；赘生物；多发性神经纤维瘤；和宫颈非典型增生。

适合于本文所公开的组合物和方法的多种示例性过度增殖性病症是与CD20表达相关的疾病或病症，诸如异常的B细胞活性，包括B细胞癌，诸如B细胞淋巴瘤(例如各种形式的霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤(NHL)或中枢神经系统淋巴瘤)、白血病(诸如急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病、慢性粒细胞白血病的B细胞母细胞转化)和骨髓瘤(诸如多发性骨髓瘤)。其他B细胞癌包括小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、

巨球蛋白血症、CD37⁺树突细胞淋巴瘤、B细胞前淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、骨单发浆细胞瘤、骨外浆细胞瘤、淋巴结外边缘区粘膜相关(MALT)淋巴组织B细胞淋巴瘤、淋巴结边缘区B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、前体B-淋巴母细胞淋巴瘤、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性积液淋巴瘤、伯基特淋巴瘤/白血病、不确定恶性潜能的B细胞增殖、淋巴瘤样肉芽肿病和移植后淋巴组织增生性疾病。在某些实施例中，本公开的组合物和方法可用于治疗非B细胞病症或与CD20表达相关的疾病，包括多发性骨髓瘤、黑色素瘤、干细胞的多发性骨髓瘤和干细胞的黑色素瘤。

适用于本文公开的组合物和方法的炎性和自身免疫疾病包括关节炎、类风湿性关节炎、幼年类风湿性关节炎、骨关节炎、多软骨炎、银屑病关节炎、银屑病、皮炎、特发性炎性肌病、多发性肌炎/皮肌炎、包涵体肌炎、炎性肌炎、中毒性表皮坏死松解症、系统性硬皮病和硬化症、CREST综合征、炎症性肠病、克罗恩病、格雷夫斯病、溃疡性结肠炎、呼吸窘迫综合征、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、脑膜炎、脑炎、葡萄膜炎、结肠炎、肾小球肾炎、过敏性体质、湿疹、哮喘、涉及T细胞浸润和慢性炎症反应的病症、动脉粥样硬化、自身免疫性心肌炎、白细胞粘附缺陷、系统性红斑狼疮(SLE)、亚急性皮肤红斑狼疮、盘状狼疮、狼疮性脊髓炎、狼疮性脑炎、青少年糖尿病、多发性硬化症、过敏性脑脊髓炎、视神经脊髓炎、风湿热、Sydenham舞蹈病、与细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏反应有关的免疫反应、结核病、结节病、肉芽肿病、包括Wegener’s肉芽肿病和Churg-Strauss病、粒细胞缺乏症、血管炎(包括过敏性血管炎/脉管炎、ANCA和类风湿性血管炎)、再生障碍性贫血、DiamondBlackfan贫血、免疫性溶血性贫血、包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、恶性贫血、纯红细胞再生障碍(PRCA)、因子VIII缺乏、血友病A、自身免疫性中性粒细胞减少、全血细胞减少症、白细胞减少症、涉及白细胞渗出的疾病、中枢神经系统(CNS)炎症性疾病、多器官损伤综合征、重症肌无力、抗原-抗体复合物介导的疾病、抗肾小球基底膜疾病、抗磷脂抗体综合征、过敏性神经炎、Behcet疾病、Castleman综合症、Goodpasture综合征、Lambert-Eaton肌无力综合征、Reynaud综合征、Sjorgen综合征、Stevens-Johnson综合征、实体器官移植排斥、移植物抗宿主病(GVHD)、大疱性类天疱疮、天疱疮、自身免疫性多发性内分泌病、血清阴性脊柱关节病、Reiter病、全身肌强直综合征、巨细胞动脉炎、免疫复合性肾炎、IgA肾病、IgM多发性神经病或IgM介导的神经病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、类过敏性紫癜、自身免疫性血小板减少症、睾丸和卵巢自身免疫性疾病、包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎、原发性甲状腺功能减退症；自身免疫性内分泌疾病包括自身免疫性甲状腺炎、慢性甲状腺炎(桥本氏甲状腺炎)、亚急性甲状腺炎、特发性甲状腺功能减退症、艾迪生病、格雷夫斯病、自身免疫性多腺体综合征(或多腺内分泌综合征)、I型糖尿病、也称为胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)和Sheehan’s综合症；自身免疫性肝炎、淋巴间质性肺炎(HIV)、闭塞性细支气管炎(非移植)、非特异性间质性肺炎(NSIP)、格林-巴利综合征、大血管炎(包括风湿性多肌痛和巨细胞(大动脉)动脉炎)、中血管血管炎(包括川崎病和结节性多动脉炎)、结节性多动脉炎(PAN)强直性脊柱炎、伯格氏病(IgA肾病)、急进性肾小球肾炎、原发性胆汁性肝硬化、口炎性腹泻(麸质肠病)、冷球蛋白血症、与肝炎相关的冷球蛋白血症、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、冠状动脉疾病、家族性地中海热、微观多血管炎、Cogan综合征、Whiskott-Aldrich综合征和血栓闭塞性脉管炎。

可以通过本发明治疗的受试者通常是人和其他灵长类动物受试者，例如用于兽医目的的猴和猿。受试者可以是男性或女性，并且可以是任何合适的年龄，包括婴儿、青少年、青少年、成人和老年受试者。

如本领域技术人员所理解的，本公开的融合蛋白可以以任何合适的方式配制用于施用。本公开的CD20特异性融合蛋白(例如，CAR)(或对不同靶标特异的融合蛋白)可以以细胞结合形式施用于受试者(例如，靶细胞群的离体修饰(成熟T细胞(例如，CD8⁺或CD4⁺T细胞)或T细胞系的其他细胞))。在一个具体实施例中，向受试者施用表达本公开的CD20特异性融合蛋白(或对不同靶标特异的融合蛋白)的T细胞系的细胞是受试者的同源、同种异体或自体细胞。在一些实施例中，通过收获细胞(来自生物样品、组织或培养基)，洗涤、浓缩和配制在适于施用的培养基和容器系统中来制备包含本公开的融合蛋白的细胞。

本公开提供了包含表达如本文公开的融合蛋白的细胞的组合物和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。合适的赋形剂包括水、盐水、右旋糖、甘油等及其组合。在实施例中，包含表达本文公开的融合蛋白的细胞的组合物还包含合适的输注介质。合适的输注介质可以是任何等渗介质制剂，通常可以使用生理盐水、Normosol R(Abbott)或Plasma-LyteA(Baxter)、5％葡萄糖水溶液、林格氏乳酸盐。输注介质可以补充人血清白蛋白或其他人血清成分。

在其他实施例中，本公开的CD20特异性融合蛋白(或对不同靶标特异的融合蛋白)可以以可溶形式施用于受试者。例如，可溶性TCR是本领域已知的(参见，例如，Molloy etal.,Curr.Opin.Pharmacol.5:438,2005；美国专利号6,759,243)。

本公开的融合蛋白或包含其的细胞可以以适合于待治疗的疾病、状况或病症的方式施用，如医学领域的技术人员所确定的。在任何上述实施例中，将包含如本文所描述的融合蛋白的细胞施用于静脉内、腹腔内、瘤内、骨髓中、淋巴结中或脑脊液中。在一些实施例中，将包含本公开的融合蛋白的细胞递送至肿瘤部位。

组合物的合适剂量、合适的持续时间和施用频率将通过如患者疾病、状况或病症的大小，类型和严重程度；特定形式的活性成分；和给药方法的因素来确定。

在任何上述实施例中，本公开的方法包括施用治疗有效量的表达本公开的融合蛋白的宿主细胞或表达本公开的融合体的宿主细胞。组合物中治疗有效量的细胞是至少一种细胞(例如，一种融合蛋白修饰的CD8⁺T细胞亚群；一种融合蛋白修饰的CD4⁺T细胞亚群)或更通常多于10²个细胞，例如，高达10⁶，最多10⁷，最多10⁸个细胞，最多10⁹个细胞，或超过10¹⁰个细胞。在某些实施例中，细胞的施用范围为约10⁶至约10¹⁰个细胞/m²，优选约10⁵至约10⁹个细胞/m²。细胞数量取决于组合物的最终用途以及其中包含的细胞类型。例如，经修饰以含有对特定抗原特异的融合蛋白的细胞将包含含有这些细胞的至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的细胞群。对于本文提供的用途，细胞通常为1升或更低、500毫升或更低、250毫升或更低、或100毫升或更低的体积。在实施例中，所需细胞的密度通常大于10⁴个细胞/ml、通常大于10⁷个细胞/ml、通常为10⁸个细胞/ml或更大。细胞可以在一段时间内作为单次输注或多次输注施用。临床相关数量的免疫细胞可以分配到累积等于或超过10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰或10¹¹个细胞的多次输注中。

在一些实施例中，本公开的方法包括施用表达完全人的或人源化的本公开的CAR的宿主细胞。在本文所述的任何实施例中，本公开的方法包括施用表达CAR的宿主细胞，所述CAR具有来自抗CD20抗体的scFv或来自对CD20抗原特异的TCR的scTCR。在本文所述的任何实施例中，本公开的方法包括施用表达CAR的宿主细胞，所述CAR包含来自1.5.3、1F5、Leu16、利妥昔单抗、奥法木单抗、维妥珠单抗、ocrelizumab、ublituximab或其任意组合的scFv。在本文所述的任何实施例中，本公开的方法包括施用表达CAR的宿主细胞，所述CAR包含含有IgG1铰链、IgG4铰链或其任意组合的接头模块。在本文所述的任何实施例中，本公开的方法包括施用表达CAR的宿主细胞，所述CAR包含接头模块，所述接头模块包含具有N297Q突变的IgG1 CH2区、IgG4 CH2区、IgG1 CH3区、IgG4 CH3区或其任意组合。在本公开的任何实施例中，本公开的方法包括施用表达CAR的宿主细胞，所述CAR包含甘氨酸-丝氨酸接头模块或甘氨酸-丝氨酸可变区接头。在本公开的任何实施例中，本公开的方法包括施用表达CAR的宿主细胞，所述CAR包含由CD28跨膜结构域组成的疏水部分。在本文所述的任何实施例中，本公开的方法包括施用表达CAR的宿主细胞，所述CAR包含细胞内结构域，所述细胞内结构域包含来自CD3ζ、4-1BB、CD28或其任意组合的结构域。在任何上述实施例中，本公开的方法包括施用CAR，所述CAR包含相邻结构域、基序、区、模块或片段之间的连接氨基酸。

在本文所述的任何实施例中，本公开的方法包括向受试者施用包含编码融合蛋白的异源核酸分子的宿主细胞，所述融合蛋白包含细胞外组分和通过疏水部分连接的细胞内组分，其中细胞外组分包含特异性结合CD20的结合结构域，并且细胞内组分包含效应子结构域，其中编码的融合蛋白(例如CAR)与1.5.3-NQ-28-BB-z(SEQ ID NO.:26)；1.5.3-NQ-28-z(SEQ ID NO.:27)；1.5.3-NQ-BB-z(SEQ ID NO.:28)；1.5.3-NQ-z(SEQ ID NO.:29)；Leu16-28-BB-z(SEQ ID NO.:30)；Leu16-28-z(SEQ ID NO.:31)；1F5-NQ-28-BB-z(SEQ IDNO.:32)；1F5-NQ-28-z(SEQ ID NO.:33)；或1F5-NQ-BB-z(SEQ ID NO.:34)的至少90％、至少91％、至少92％、至少93％，与1.5.3-NQ-28-BB-z至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同。在进一步的实施例中，本公开的方法包括向受试者施用包含编码融合蛋白的异源核酸分子的宿主细胞，所述融合蛋白包含细胞外组分和通过疏水部分连接的细胞内组分，其中所述细胞外组分包含特异性结合CD20的结合结构域和细胞内组分包含效应子结构域，其中编码的融合蛋白(例如CAR)包含SEQ IDNO.:26 34中任一个的氨基酸序列或由其组成。在这些实施例的任意一个中，宿主细胞是T细胞，其中T细胞是普通CD4⁺T细胞、普通CD8⁺T细胞、CD4⁺中枢记忆T细胞、CD8⁺中枢记忆T细胞或CD4⁺中枢记忆(T_CM)T细胞和CD4⁺幼稚(T_N)T细胞的组合。在施用给受试者之前，可以将CAR修饰的CD4⁺T细胞和CAR修饰的CD8⁺T细胞以3:1至1:1至1:3的比例混合，或者以相同或相似的比例分别施用给受试者。

在进一步的实施例中，本公开的方法包括向受试者施用包含编码融合蛋白的异源核酸分子的宿主细胞，所述融合蛋白包含细胞外组分和通过疏水部分连接的细胞内组分，其中所述细胞外组分包含特异性结合CD20的结合结构域和细胞内组分包含效应子结构域，其中融合蛋白(例如CAR)由与SEQ ID NO.:44-52中任一个氨基酸序列具有至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一性的多核苷酸编码。在相关实施例中，方法包括向受试者施用包含编码融合蛋白的异源核酸分子的宿主细胞，所述融合蛋白包含细胞外组分和通过疏水部分连接的细胞内组分，其中所述细胞外组分包含特异性结合CD20的结合结构域和细胞内组分包含效应子结构域，其中融合蛋白(例如CAR)由包含或由SEQ ID NO.:44-52中任一个序列组成的多核苷酸编码。在这些实施例的任意一个中，宿主细胞是T细胞，其中T细胞是普通CD4⁺T细胞、普通CD8⁺T细胞、CD4⁺中枢记忆T细胞、CD8⁺中枢记忆T细胞或CD4⁺中枢记忆(T_CM)T细胞和CD4⁺幼稚(T_N)T细胞的组合。在施用给受试者之前，可以将CAR修饰的CD4⁺T细胞和CAR修饰的CD8⁺T细胞以3:1至1:1至1:3的比例混合，或者以相同或相似的比例分别施用给受试者。

任选地，包含本公开的任意载体的宿主细胞还能够编码转导标记物(例如tCD19)，其也可以包含自切割肽，以使得转导标记物和CAR分成单独的分子-CAR和转导标记物，所述载体含有编码本公开的融合蛋白的多核苷酸，用于本文所描述的方法中。在某些实施例中，宿主细胞(例如T细胞)包含含有编码位于CD20特异性CAR和tCD19转导标记物之间的自切割肽的多核苷酸的载体，其中多核苷酸与SEQ ID NO.:53-61中任意一个的核酸分子序列至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％相同。在进一步的实施例中，宿主细胞(例如T细胞)包含含有编码位于CD20特异性CAR和tCD19转导标记物之间的自切割肽的多核苷酸的载体，并且包含或由SEQ ID NO.:53 61中任意一个的核酸分子序列组成。

因此，在本文公开的实施例的任意一个中，宿主细胞包含编码能够特异性结合CD20的融合蛋白的单独的多核苷酸，其中所述多核苷酸：(a)与SEQ ID NO.:53-56中任意一个的多核苷酸序列至少80％相同；(b)与SEQ ID NO.:44-47中任意一个的多核苷酸序列至少80％相同；(c)包含SEQ ID NO.:53-56中任意一个的多核苷酸序列；(d)包含SEQ ID NO.:44-47中任意一个的多核苷酸序列；(e)由SEQ ID NO.:53-56中任意一个的多核苷酸序列组成；(f)由SEQ ID NO.:44-47中任意一个的多核苷酸序列组成。

在某些实施例中，所述方法中使用的宿主细胞包含融合蛋白，其包含或由氨基酸序列组成，其中融合蛋白：(a)与成熟融合蛋白至少90％相同，其中成熟融合蛋白包含SEQID NO.:26-29和35-38以及32-34中任意一个的氨基酸序列，tCD19转导标记物被移除；(b)包含成熟融合蛋白，其中成熟融合蛋白包含SEQ ID NO.:35-38中任意一个的氨基酸序列，tCD19转导标记物被移除；(c)由成熟融合蛋白组成，其中成熟融合蛋白包含SEQ ID NO.:35-38中任意一个的氨基酸序列，tCD19转导标记物被移除；(d)与SEQ ID NO.:26-29中任意一个的氨基酸序列至少90％相同；(e)包含SEQ ID NO.:26-29中任意一个的氨基酸序列；(f)由SEQ ID NO.:26-29中任意一个的氨基酸序列组成；

在某些实施例中，所述方法中使用的宿主细胞包含如本文所公开的异源性多核苷酸并能够表达融合蛋白。

在某些实施例中，所述方法中使用的宿主细胞包含编码融合蛋白的异源性多核苷酸，所述融合蛋白包含结合结构域，其中所述结合结构域为：(a)包含与SEQ ID No.:64的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的1.5.3scFv，其中与特异性结合CD20的亲本单克隆抗体或其片段或衍生物的相应的CDR相比，如果含有一个或多个修饰的CDR的scFv以与野生型scFv或相应抗体相似的亲和力与CD20特异性结合，scFv的每个CDR包含零变化或至多一个、两个、三个、四个、五个或六个变化；(b)包含或由SEQ ID NO.:64的氨基酸序列组成的1.5.3scFv；(c)包含与SEQ ID No.:66的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的1F5scFv，其中与特异性结合CD20的亲本单克隆抗体或其片段或衍生物的相应的CDR相比，如果含有一个或多个修饰的CDR的scFv以与野生型scFv或相应抗体相似的亲和力与CD20特异性结合，scFv的每个CDR包含零变化或至多一个、两个、三个、四个、五个或六个变化；(d)包含或由SEQ ID NO.:66的氨基酸序列组成的1F5 scFv；(e)包含与SEQ ID No.:65的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列的Leu16 scFv，其中与特异性结合CD20的亲本单克隆抗体或其片段或衍生物的相应的CDR相比，如果含有一个或多个修饰的CDR的scFv以与野生型scFv或相应抗体相似的亲和力与CD20特异性结合，scFv的每个CDR包含零变化或至多一个、两个、三个、四个、五个或六个变化；或者(f)包含或由SEQ ID NO.:65的氨基酸序列组成的Leu16 scFv。

在某些实施例中，所述方法中使用的宿主细胞包含编码融合蛋白的异源性多核苷酸，所述融合蛋白包含scFv，其中所述scFv由以下编码：(a)与SEQ ID NO.:67的核酸分子序列具有至少80％同一性的多核苷酸，其中，当与编码来自特异性结合CD20的单克隆抗体的亲本scFv的多核苷酸相比，如果含有一个或多个修饰的CDR的scFv以与野生型scFv或相应抗体相似的亲和力特异性结合CD20，编码scFv的每个CDR的多核苷酸序列包含零变化或至多一至六个核苷酸变化；(b)包含或由SEQ ID NO.:67的核酸分子序列组成的多核苷酸；(c)与SEQ ID NO.:69的核酸分子序列具有至少80％同一性的多核苷酸，其中，当与编码来自特异性结合CD20的单克隆抗体的亲本scFv的多核苷酸相比，如果含有一个或多个修饰的CDR的scFv以与野生型scFv或相应抗体相似的亲和力特异性结合CD20，编码scFv的每个CDR的多核苷酸序列包含零变化或至多一至六个核苷酸变化；(d)包含或由SEQ ID NO.:69的核酸分子序列组成的多核苷酸；(e)与SEQ ID NO.:68的核酸分子序列具有至少80％同一性的多核苷酸，其中，当与编码来自特异性结合CD20的单克隆抗体的亲本scFv的多核苷酸相比，如果含有一个或多个修饰的CDR的scFv以与野生型scFv或相应抗体相似的亲和力特异性结合CD20，编码scFv的每个CDR的多核苷酸序列包含零变化或至多一至六个核苷酸变化；或者(f)包含或由SEQ ID NO.:68的核酸分子序列组成的多核苷酸。

在某些实施例中，所述方法中使用的宿主细胞包含编码融合蛋白的异源性多核苷酸，其中融合蛋白是嵌合抗原受体并包含或由SEQ ID NO.:26-43中任意一个的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列组成。

在某些实施例中，所述方法中使用的宿主细胞包含编码融合蛋白的异源性多核苷酸，所述融合蛋白包含疏水部分，其中所述疏水部分为跨膜结构域。在某些实施例中，疏水部分是CD4、CD8、CD28或CD27跨膜结构域。

在某些实施例中，所述方法中使用的宿主细胞包含编码融合蛋白的异源性多核苷酸，融合蛋白包含效应子结构域或其功能性部分，其中效应子结构域或其功能性部分是4-1BB(CD137)、CD3ε、CD3δ、CD3ζ、CD25、CD27、CD28、CD79A、CD79B、CARD11、DAP10、FcRα、FcRβ、FcRγ、Fyn、HVEM、ICOS、Lck、LAG3、LAT、LRP、NKG2D、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、OX40(CD134)、ROR2、Ryk、SLAMF1、Slp76、pTα、TCRα、TCRβ、TRIM、Zap70、PTCH2或其任意组合。

在某些实施例中，所述方法中使用的宿主细胞包含编码融合蛋白的异源性多核苷酸，所述融合蛋白包含细胞内组分，其中所述细胞内组分包含：(a)CD3ζ效应子结构域或其功能性部分、CD28共刺激结构域或其功能性部分以及4-1BB(CD137)共刺激结构域或其功能性部分；(b)CD3ζ效应子结构域或其功能性部分、CD28共刺激结构域或其功能性部分以及OX40(CD134)共刺激结构域或其功能性部分；(c)CD3ζ效应子结构域或其功能性部分、CD27共刺激结构域或其功能性部分以及4-1BB(CD137)共刺激结构域或其功能性部分；(d)CD3ζ效应子结构域或其功能性部分、CD27共刺激结构域或其功能性部分以及OX40(CD134)共刺激结构域或其功能性部分；(e)CD3ζ效应子结构域或其功能性部分、CD27共刺激结构域或其功能性部分以及CD28共刺激结构域或其功能性部分；(f)CD3ζ效应子结构域或其功能性部分、4-1BB(CD137)共刺激结构域或其功能性部分以及OX40(CD134)共刺激结构域或其功能性部分。

本公开的组合物还可以在施用一种或多种其他治疗剂的同时，之前或之后施用。这种组合疗法包括施用单一剂量制剂，其含有本公开的融合蛋白和一种或多种另外的活性剂，以及施用本发明的融合蛋白和在其自身的单独剂量制剂中的每种活性剂。例如，本公开的融合蛋白和另一种活性剂可以在单一输注剂量组合物中一起施用于受试者，或者每种药剂可以在单独的输注剂量制剂中施用。在使用单独的剂量制剂的情况下，本公开的融合蛋白和一种或多种另外的活性剂可以同时施用，即同时，基本上同时，即同时或在分开交错的时间即顺序地施用；联合治疗应理解为包括所有这些方案。

本公开提供了药物组合物，其包含CD20特异性结合分子、表达如本文公开的融合蛋白的细胞或两者，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在某些实施例中，CD20特异性结合分子是抗体。在这些实施例中，CD20特异性抗体可以是利妥昔单抗、奥法木单抗、ocrelizumab、obinutuzumab、ublituximab、维妥珠单抗、替伊莫单抗、托西莫单抗或其任意组合。

在某些实施例中，治疗与CD20表达相关的疾病或病症的方法包括向患有或怀疑患有与CD20表达相关的疾病或病症的受试者施用治疗有效量的宿主细胞，其包含编码融合蛋白的异源核酸分子，融合蛋白包含细胞外组分和通过疏水部分连接的细胞内组分，其中细胞外组分包含特异性结合CD20的结合结构域，细胞内组分包含效应子结构域，并任选地施用治疗有效量的CD20特异性结合分子、免疫抑制成分的化学治疗剂或抑制剂。在进一步的实施例中，所述方法包括减少B细胞数量或治疗与异常B细胞活性相关的疾病或病症。

因此，在某些实施例中，提供了治疗与CD20表达相关的疾病或病症的方法，包括向患有或怀疑患有与CD20表达相关的疾病或病症的受试者施用治疗有效量的包含编码融合蛋白的异源核酸分子的宿主细胞，所述融合蛋白由与SEQ ID NO.:26-29和32-38以及41-43中任一个的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列组成，并且任选地施用CD20特异性结合分子、化学治疗剂、免疫抑制成分的抑制剂或其组合。在进一步的实施例中，所述方法包括减少B细胞数量或治疗与异常B细胞活性相关的疾病或病症。

在一些实施例中，本文所描述的组合物与化学治疗剂或免疫调节剂(例如免疫抑制剂、或免疫抑制成分的抑制剂，诸如免疫校验点抑制剂)一起施用。免疫校验点抑制剂包括CTLA-4、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、GAL9、IDO、KIR、LAG-3、PD-1、PD-L1、PD-L2、Tim-3、VISTA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、TGFR beta、CEACAM-1、CEACAM-3、CEACAM-5、CD244或其任意组合的抑制剂。免疫校验点分子的抑制剂可以是抗体或其抗原结合片段、融合蛋白、小分子、RNAi分子(例如siRNA、shRNA或miRNA)、核酸酶、适配子或反义寡核苷酸。化学治疗剂可以是B-Raf抑制剂、MEK抑制剂、VEGF抑制剂、VEGFR抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、抗有丝分裂剂或其任意组合。

在本文实施例的任意一个中，治疗与CD20表达相关的疾病或病症的方法包括向患有或怀疑患有与CD20表达相关的疾病或病症的受试者施用治疗有效量的包含编码如本文所公开的融合蛋白的异源核酸分子的宿主细胞，以及治疗有效量的免疫抑制成分的抑制剂，诸如免疫校验点抑制剂。在一些实施例中，免疫校验点抑制剂是CTLA-4、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、GAL9、IDO、KIR、LAG-3、PD-1、PD-L1、PD-L2、Tim-3、VISTA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、TGFR beta、CEACAM-1、CEACAM-3、CEACAM-5、CD244或其任意组合的抑制剂。

因此，在某些实施例中，本公开提供了治疗与CD20表达相关的疾病或病症的方法，包括向患有或怀疑患有与CD20表达相关的疾病或病症的受试者施用治疗有效量的包含编码融合蛋白的异源核酸分子的宿主细胞，所述融合蛋白具有与SEQ ID NO.:26-29和32-38以及41-43中任一个的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列，以及治疗有效量的免疫抑制成分的抑制剂，诸如免疫校验点抑制剂。在一些实施例中，免疫校验点抑制剂是CTLA-4、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、GAL9、IDO、KIR、LAG-3、PD-1、PD-L1、PD-L2、Tim-3、VISTA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、TGFR beta、CEACAM-1、CEACAM-3、CEACAM-5、CD244或其任意组合的抑制剂。在一些实施例中，免疫校验点抑制剂选自：(a)PD-1特异性抗体，诸如pidilizumab、纳武单抗或帕姆单抗；(b)PD-L1特异性抗体，诸如MDX-1105、BMS-936559、MEDI4736、MPDL3280A或MSB0010718C；或(c)CTLA4特异性抗体，诸如tremelimumab或伊匹单抗。

在进一步的实施例中，本公开提供了治疗与CD20表达相关的疾病或病症的方法，包括向患有或怀疑患有与CD20表达相关的疾病或病症的受试者施用治疗有效量的包含编码融合蛋白的异源核酸分子的宿主细胞，所述融合蛋白包括或由与SEQ ID NO.:26-29和32-38以及41-43中任一个的氨基酸序列组成，以及治疗有效量的免疫校验点抑制剂，任选其中免疫校验点抑制剂选自：(a)PD-1特异性抗体，诸如pidilizumab、纳武单抗或帕姆单抗；(b)PD-L1特异性抗体，诸如MDX-1105、BMS-936559、MEDI4736、MPDL3280A或MSB0010718C；或(c)CTLA4特异性抗体，诸如tremelimumab或伊匹单抗。

示例性化学治疗剂包括烷化剂(例如，顺铂、奥沙利铂、卡铂、白消安、亚硝基脲、氮芥诸如苯达莫司汀、乌拉莫司汀、替莫唑胺)、抗代谢物(例如，氨基喋呤、甲氨蝶呤、巯嘌呤、氟尿嘧啶、阿糖胞苷、吉西他滨)、紫杉烷(例如，紫杉醇、白蛋白结合紫杉醇、多西他赛)、蒽环霉素(如多柔比星、柔红霉素、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌、戊柔比星)、博来霉素、丝裂霉素、放线菌素、羟基脲、拓扑异构酶抑制剂(如喜树碱、托泊替康、伊立替康、依托泊苷、替尼泊苷)、单克隆抗体(例如，伊匹单抗、帕姆单抗、纳武单抗、avelumab、阿仑单抗、贝伐单抗、西妥昔单抗、吉妥珠单抗、帕尼单抗、利妥昔单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗)、长春花生物碱(如长春新碱、长春碱、长春地辛、长春瑞滨)、环磷酰胺、泼尼松、甲酰四氢叶酸、奥沙利铂、透明质酸酶(hyalurodinase)或其任意组合。在某些实施例中，化学治疗剂是维罗非尼、达拉菲尼、曲美替尼、cobimetinib、舒尼替尼、厄洛替尼、紫杉醇、多西他赛或其任意组合。在一些实施例中，首先用化学治疗剂治疗患者，所述化学治疗剂抑制或破坏其他免疫细胞，然后是本文所描述的药物组合物。在某些情况下，可以完全避免化疗。

在本文所述的任何实施例中，本公开的方法应用于已经用CD20特异性结合分子预处理的受试者，任选其中CD20特异性结合分子是利妥昔单抗、奥法木单抗、ocrelizumab、ublituximab、维妥珠单抗或其任意组合；或化学治疗剂(例如CHOP[环磷酰胺-羟基柔红霉素-长春新碱-泼尼松]，CHOP-R[R是利妥昔单抗]，或CHOEP或CHOEP-R[E是依托泊苷]方案)；或免疫抑制成分的抑制剂(例如，针对PD-1、PD-L1、CTLA4等的抗体)。

本公开的某些化合物(例如抗体、化学治疗剂或免疫调节剂)或其药学上可接受的盐以纯的形式或在合适的药物组合物中的施用可以使用任何给予类似用途的药剂的给药方式进行。本公开的药物组合物可以通过将本公开的化合物与合适的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合来制备，并且可以配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂，例如片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、软膏、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶、微球和气雾剂。施用这样的药物组合物的示例性途径包括口服、局部、透皮、吸入、肠胃外、舌下、口腔、直肠、阴道和鼻内。

本文所用的术语“肠胃外”包括皮下注射，静脉内、肌肉内、胸骨内注射或输注技术。配制本公开的药物组合物(例如，化学治疗剂或免疫调节剂)以允许其中包含的活性成分在将组合物施用于患者时是生物可利用的。将施用于受试者或患者的组合物采取一个或多个剂量单位的形式，其中例如片剂可以是单剂量单位，并且气雾剂形式的本公开化合物的容器可以容纳多个剂量单位。制备这种剂型的实际方法对于本领域技术人员来说是已知的，或者是显而易见的(参见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,22nd Edition(Pharmaceutical Press,2012)。在任何情况下，待施用的组合物将含有治疗有效量的本公开化合物或其药学上可接受的盐，用于根据本公开教导的治疗方法。

作为用于口服给药的固体组合物、药物组合物可以配制成粉末、颗粒、压缩片剂、丸剂、胶囊、咀嚼胶、薄片等形式。示例性固体组合物可含有一种或多种惰性稀释剂或可食用载体。此外，可以存在一种或多种添加剂，包括粘合剂诸如羧甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂诸如淀粉、乳糖或糊精；崩解剂诸如海藻酸、海藻酸钠、Primogel、玉米淀粉等；润滑剂诸如硬脂酸镁或氢化植物油；助流剂诸如胶体二氧化硅；甜味剂诸如蔗糖或糖精；芳香剂诸如薄荷、水杨酸甲酯或橙子调味料；或着色剂。当药物组合物为胶囊形式时，例如明胶胶囊，除了上述类型的物质外，它还可含有液体载体如聚乙二醇或油或其组合。

药物组合物可以是液体形式，诸如酏剂、糖浆、溶液、乳液或混悬剂。在某些实施例中，作为两个实例，可配制液体组合物用于口服给药或通过注射递送。当用于口服给药时，除一种或多种本公开化合物外，示例性组合物还可含有甜味剂、防腐剂、染料/着色剂、增味剂或其任意组合。用于通过注射给药的示例性组合物可进一步含有表面活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂、等渗剂或其任意组合。

本公开的液体药物组合物，无论它们是溶液、混悬剂或其他类似形式，还可包含佐剂，包括无菌稀释剂，诸如注射用水、盐溶液，优选生理盐水、林格氏溶液、等渗氯化钠、不挥发油，诸如可用作溶剂或悬浮介质的合成单甘油酯或双甘油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它溶剂；抗菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂诸如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐和调节渗透压的试剂如氯化钠或葡萄糖。肠胃外制剂可以封装在安瓿，一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。生理盐水是优选的佐剂。可注射药物组合物优选是无菌的。

本公开的药物组合物可用于局部给药，在这种情况下，载体可包含合适的溶液、乳液、软膏、凝胶基质或其任意组合。例如，基质可包括凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蜡、矿物油、稀释剂如水和醇、乳化剂、稳定剂或其任意组合。增稠剂可以存在于本公开的药物组合物中，用于局部给药。如果旨在用于透皮给药，该组合物可包括透皮贴剂或离子电渗疗法装置。

本公开的药物组合物可以旨在用于例如栓剂形式的直肠给药，其将在直肠中溶化并释放(多种)活性化合物。用于直肠给药的组合物可含有油性基质作为合适的无刺激性赋形剂。示例性的基质包括羊毛脂、可可脂、聚乙二醇或其任意组合。

本公开的药物组合物可包括改变固体或液体剂量单位的物理形式的各种材料。例如，组合物可包括在活性成分周围形成涂层壳的材料。用于形成涂层壳的示例性材料可以是惰性的，例如糖、虫胶或其他肠溶包衣剂。或者，可将活性成分包裹在明胶胶囊中。

在某些实施例中，本发明的化合物和组合物可以是固体或液体的形式。示例性的固体或液体制剂包括半固体、半液体、混悬剂和凝胶形式。固体或液体形式的本公开的药物组合物可以进一步包含与本公开的化合物结合的试剂，并从而有助于化合物的递送。可以以这种能力起作用的合适的试剂包括单克隆或多克隆抗体、蛋白质或脂质体。

本公开的药物组合物可以由可作为气雾剂施用的剂量单位组成。术语气雾剂用于表示从胶体性质到由加压包装组成的系统的各种系统。可以通过液化或压缩气体或通过分配活性成分的合适泵系统进行递送。本公开的化合物的气雾剂可以以单相、双相或三相系统递送，以递送活性成分。气雾剂的递送包括必要的容器、活化剂、阀门、子容器等，其一起可形成试剂盒。

本公开的药物组合物可以通过制药领域熟知的方法制备。例如，旨在通过注射施用的药物组合物可以通过将本公开的化合物与无菌蒸馏水组合以形成溶液来制备。可加入表面活性剂以促进均相溶液或混悬剂的形成。表面活性剂是与本公开的化合物非共价相互作用的化合物，以促进化合物在含水递送系统中的溶解或均匀悬浮。

以治疗有效量施用本公开的化合物或其药学上可接受的盐，其将根据多种因素而变化，包括所采用的特定化合物的活性；化合物的代谢稳定性和作用时长；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用的方式和时间；排泄率；联合用药；特定病症或状况的严重程度；以及受试者正在接受的治疗。在根据本公开的制剂和方法施用治疗之后，与安慰剂治疗的或其他合适的对照受试者相比，测试受试者将表现出与所治疗的疾病或病症相关的一种或多种症状减少约10％多达至约99％。

本公开的化合物或其药学上可接受的衍生物也可以在施用一种或多种其他治疗剂的同时，之前或之后施用。这种组合疗法包括施用单一药物剂量制剂，其含有本公开的化合物和一种或多种另外的活性剂，以及施用本公开的化合物和在其自身的单独药物剂量制剂中的每种活性剂。例如，本公开的化合物和其他活性剂可以在单一口服剂量组合物(诸如片剂或胶囊)中一起施用于受试者，或者每种药剂可以在单独的口服剂量制剂中施用。在使用单独的剂量制剂的情况下，本公开的化合物和一种或多种另外的活性剂可以同时施用，即同时，或在分开交错的时间即顺序地施用；联合治疗应理解为包括所有这些方案。

本领域技术人员还应理解，在本文所述的方法中，中间体化合物的官能团可能需要通过合适的保护基团进行保护。这些官能团包括羟基、氨基、巯基和羧酸。用于羟基的合适的保护基团包括三烷基甲硅烷基或二芳基烷基甲硅烷基(例如，叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基或三甲基甲硅烷基)、四氢吡喃基、苄基等。用于氨基、脒基和胍基的合适保护基团包括叔丁氧羰基、苄氧基羰基等。用于巯基的合适的保护基团包括C(O)R”(其中R”是烷基、芳基或芳基烷基)，对甲氧基苄基、三苯甲基等。用于羧酸的合适的保护基团包括烷基、芳基或芳烷基酯。可以根据标准技术添加或去除保护基团，这些技术是本领域技术人员已知的并且如本文所描述。Green,T.W.and P.G.M.Wutz,Protective Groups inOrganic Synthesis(1999),3rd Ed.,Wiley中详细描述了保护基团的使用。如本领域技术人员所理解的，保护基团也可以是聚合物树脂，例如Wang树脂、Rink树脂或2-氯三苯甲基氯树脂。

本领域技术人员还应理解，尽管本公开化合物的这种受保护的衍生物可能不具有本身的药理学活性，但它们可以施用于哺乳动物，然后在体内代谢形成具有药理活性的本公开的化合物。因此，这些衍生物可以描述为“前药”。在某些实施例中，本公开的化合物可以前药的形式。

此外，通过本领域技术人员已知的方法用适当的无机或有机碱或酸处理，可以将以游离碱或酸形式存在的本公开的所有化合物转化为其药学上可接受的盐。可通过标准技术将本公开的化合物的盐转化为其游离碱或酸形式。

在根据本公开的表达融合蛋白的转化宿主细胞的情况下，可以使用单独的细胞等分试样进行施用。在某些实施例中，转化的宿主细胞包含T细胞，其可包含CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞或两者。在某些实施例中，T细胞包含编码嵌合抗原受体(CAR)的异源核酸。在某些实施例中，对T细胞进行分选以提供1:1比例的CD4⁺和CD8⁺CD20 CAR T细胞，用于向受试者施用。对于每个受试者，可以在指定的细胞剂量下在约20-30分钟内静脉内施用细胞。指定的细胞剂量可以通过与载体中的融合蛋白协同表达的转导标记物的表达水平来确定。例如，在某些实施例中，使用一种或多种协同表达截短的CD19转导标记物和CAR的载体转化T细胞。用于本公开的各种实施例的示例性CD20 CAR T细胞剂量水平列于下表1中。

表1.CD20 CAR T细胞剂型和输注

剂量水平	tCD19<sup>+</sup>CD4<sup>+</sup>/tCD19<sup>+</sup>CD8<sup>+</sup>比例	总tCD19<sup>+</sup>T细胞剂量<sup>*,**</sup>
			0	1:1	1×10<sup>5</sup>/kg
1	1:1	3.3×10<sup>5</sup>/kg
			2	1:1	1×10<sup>6</sup>/kg
3	1:1	3.3×10<sup>6</sup>/kg
			4	1:1	1×10<sup>7</sup>/kg

*每公斤接受者重量；**每剂量水平上限±15％

在某些实施例中，细胞由自体外周血单核细胞(PBMC)产物制备，所述产物通过对受试者进行标准非动员白细胞单采术获得。可以进行免疫磁性选择以富集CD8⁺细胞或CD4⁺T细胞。在某些实施例中，分别富集CD8⁺细胞和CD4⁺T细胞，并且每个亚组分别用例如抗CD3/CD28顺磁珠刺激，然后用编码融合蛋白的载体(例如，慢病毒载体)转导，并且任选地，转导标记物诸如tCD19转导标记物。可以扩增转导的T细胞，然后用表达CD20的靶细胞系再刺激以促进生长，进一步离体扩增，然后配制以达到指定的用于输注的细胞剂量。例如，在某些实施例中，可以根据以下的方法制备根据本公开的抗CD20 CAR T细胞(例如，1.5.3-NQ-28-BB-z)，包括：

1.从一部分白细胞单采产物或来自全血的外周血单核细胞(PBMC)富集CD4⁺T细胞。

2.与CD4⁺T细胞富集平行，从剩余的白细胞单采产物或PBMC富集CD8⁺T细胞。

3.在补充有谷氨酰胺、β巯基乙醇和小牛血清的RPMI 1640(CTL介质⁺10％FBS)，50IU/mL IL-2培养基中用临床级抗CD3和抗CD28包被的顺磁珠(抗CD3/CD28珠)刺激在分别培养中富集的CD4⁺和CD8⁺细胞。

4.在抗CD3/CD28珠刺激后第1天用1.5.3-NQ-28-BB-z CAR慢病毒载体转导CD4⁺和CD8⁺细胞。

5.在CTL介质⁺10％FBS和50IU/mL IL-2中扩增转导的CD4⁺和CD8⁺T细胞。

6.在CD3/CD28刺激后第4天通过磁性耗尽去除抗CD3/CD28珠2次。

7.在抗CD3/CD28刺激后第7天用经辐射的、临床合格的转化的CD20⁺B细胞系(TM-LCL)刺激。如果第7天的过程中细胞计数在没有TM-LCL刺激的情况下预测到足够的细胞扩增，则可以省略该步骤。

8.用CTL介质⁺10％FBS和50IU/mL IL-2扩增G-Rex烧瓶中的CD4⁺和CD8⁺细胞。

9.在抗CD3/CD28刺激后第15天(范围13-17)收获每个亚组的细胞，以及配制组合的CD4⁺/CD8⁺T细胞产物用于冷冻保存或输注。

10.在制造过程中在适当时间点从CD8⁺和CD4⁺T细胞的每组中进行样品采集，以进行过程中和最终的释放测试。

11.通过以1:1比例的tCD19⁺CD4⁺和tCD19⁺CD8⁺T细胞以指定剂量静脉内输注施用给患者。受试者将接受淋巴细胞化疗预处理，并在完成化疗后至少36小时接受T细胞输注。

在某些实施例中，为受试者产生的细胞可以在制造后立即作为新鲜细胞而施用，或者可以首先冷冻保存并储存在液氮冷冻器中，然后洗涤解冻的细胞以除去残留的冷冻保护剂，然后配制用于输注。细胞总数对于从解冻恢复期间的细胞损失并达到临床方案中规定的细胞剂量水平是足够的。在包含CD4⁺和CD8⁺T细胞的某些实施例中，由于个体受试者中各个亚组的转导差异，CD4⁺和CD8⁺T细胞的总比例可以不同于1:1。由于这个原因，可以单独转导亚组以实现转导的T细胞的所需制剂。CD4和CD8CAR T细胞在动物模型中具有已证实的协同效应(Sommermeyer et al.,Leukemia2015)。

可以将转化的细胞悬浮在合适的冷冻保存介质(例如，CryoStor

)中，用于在受控速率的冷冻机中冷冻保存。冷冻保存的细胞可以储存在液氮冷冻机的蒸气相中。然后可将新鲜或解冻的细胞重新悬浮于Normosol⁺1％HSA中，并以临床方案中指定的总细胞剂量水平转移至转移包。配制的产品可以在2-8℃下储存，然后在适当的条件下转移到临床场所进行施用。

在白细胞单采术后，受试者可以接受细胞减少的化疗以在转化细胞的产生过程中控制疾病。例如，在某些实施例中，受试者可以在白细胞单采术后接受低强度化疗(例如来那度胺、依鲁替尼)。在根据本公开施用转化细胞之前，化学疗法或免疫调节疗法可能是合适的，以便提供淋巴清除以促进转移的T细胞的存活，并在输注细胞之前减轻肿瘤负荷。例如，受试者可在输注细胞之前(例如，36-96小时)的预定时间内接受淋巴清除化疗。在某些实施例中，受试者最初可以用单剂量的化疗剂诸如环磷酰胺(CY)i.v.(例如，1g/m²)治疗。然而，如果确定受试者的反应率不充分，则可以改变淋巴清除方案，以便随后患者接受第二种、进一步的化学治疗剂或免疫调节剂(例如CY⁺氟达拉滨)。另外，受试者可以但不必在施用细胞之前接受预先给药。

本文所述细胞的一次或多次静脉内输注可在完成淋巴清除化疗后(例如，此后36-96小时)施用给受试者。施用给受试者的细胞剂量可以根据表1中所示的剂量水平确定，并且可以随后调整以增加、减少或以其他方式改变施用的细胞的量、组成、比例或速率。在某些实施例中，向受试者施用单次输注。在进一步的实施例中，如果第一次输注不产生完全反应(CR)，或者如果疾病在CR后复发，则可以给予第二次输注。在更进一步的实施例中，可以给予第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或另外的输注。在某些实施例中，细胞输注可以在选定的一段时间(例如，约20-30分钟)内静脉内施用，根据需要调整以符合针对肠胃外药物的内毒素限制指南(￡5EU/kg/小时)。如果受试者经历轻度输注相关的不良事件(2级或更低)，也可以调整输注速率。

实例

例1

材料和方法

细胞系

从ATCC获得Raji、Daudi和Ramos(伯基特淋巴瘤)、Rec-1(套细胞淋巴瘤)和K562(CD20-阴性红细胞白血病)肿瘤细胞系。Granta-519(套细胞淋巴瘤)获自DSMZ，FL-18(转化的滤泡性淋巴瘤)获自Dr.David Maloney(Fred Hutchinson Cancer Research Center)。在实验之前，通过流式细胞术在所有细胞系上验证CD20表达。将细胞系在含有25mM HEPES、10％小牛血清(FBS)、1％青霉素/链霉素和1％L-谷氨酰胺的RPMI 1640中培养，并在37℃、5％CO₂中温育。用逆转录病毒载体转导K562细胞以表达CD20，并再次用慢病毒载体转导一些细胞以表达人CD80。在有限稀释克隆后通过选择获得低、中和高CD20表达的K562-CD80细胞系。通过用编码萤火虫荧光素酶-Thy1.1-Neo的逆转录病毒转导Raji细胞并如前所述用G418选择而产生Raji-ffLuc细胞(James et al.,Blood 2009；114(27):5454-63)。如前所述(Czuczman et al.,Clin Cancer Res 2008；14(5):1561-70)，利用递增的利妥昔单抗浓度的重复间歇循环产生利妥昔单抗-难治性Raji-ffLuc细胞。

流式细胞术

将Ramos细胞系与利妥昔单抗(浓度范围为0至200μg/ml)在室温下温育30分钟。在CD20阻断后，加入抗CD20-PE抗体(克隆L27[Leu16]，BD Biosciences)，并将细胞在4℃或37℃温育30分钟。用冷FACS缓冲液(0.5％小牛血清和2.5mM EDTA的PBS溶液)洗涤细胞，并在BD Canto 2流式细胞仪上分析。使用FlowJo版本7.6.1(TreeStar)分析数据。在另一个实验中，用不同浓度的利妥昔单抗阻断FL-18细胞，用FACS缓冲液洗涤一次，然后加入抗CD20-FITC抗体(克隆1F5，由杂交瘤内部产生；Press et al.，Blood 1987；69(2)：584-91)并在4℃下与阻断的细胞一起温育15分钟。然后如上所述洗涤和分析细胞。使用奥法木单抗代替利妥昔单抗也进行了类似的实验。

载体构建体

通过由PCR扩增Leu16 scFv产生CD20特异性Leu16-28-BB-z-tEGFR构建体(SEQ IDNO.:57)(Wang et al.,Hum Gene Ther 2007；18(8):712-25；Wang et al.,Mol Ther2004；9(4):577-86),并克隆到编码IgG4-Fc、CD28和41BB结构域和CD3ζ结构域的epHIV7慢病毒载体的NheI和RsrII位点(Hudecek et al.,Clin Cancer Res2013；19(12):3153-64)。通过Leu16-28-BB-z-tEGFR载体的剪接重叠PCR产生Leu1628-z构建体(SEQ ID NO.:49或58)以除去41BB结构域和截短的EGFR。先前已经描述了编码CD20特异性1F5-28-BB-z CAR的慢病毒载体(Budde et al.,PLoS One2013；8(12):e82742)，但转移至基于HIV-1的RRL.sin.cPPT.PGK.GFP.wpre自失活的第3代慢病毒载体骨架(Becker et al.,Gene Ther2010；17(10):1244-52；from Dr.Hans-Peter Kiem,FHCRC)。通过用IgG2连接氨基酸(SEQID NO.:9)取代IgG1连接氨基酸并添加N297Q突变(SEQ ID NO.:10)，修饰该构建体的Fc间隔区以消除与Fcγ受体的结合，如先前描述的(Hudecek et al.,Cancer immunologyresearch 2014；3(2):125-35；Hombach et al.,Gene Ther 2010；17(10):1206-13)，以产生1F5-NQ-28-BB-z构建体(SEQ ID NO.:50或59)。为了产生1.5.3-NQ-28-BB-z CAR构建体(SEQ ID NO.:44或53)，通过从1.5.3完全人抗CD20抗体合成V_L和V_H序列而产生新的scFv序列(参见，例如，Bornstein et al.,Invest New Drugs 2010；28(5):561-74；PCT公开号WO2006/130458)，使用密码子优化算法(GenScript)，由15个氨基酸的甘氨酸-丝氨酸接头(SEQ ID NO.:20)分开，前面是GM-CSF信号肽(SEQ ID NO.:18)。通过剪接重叠PCR产生的重叠片段用于替换1F5-NQ-28-BB-z构建体的scFv结构域，将其克隆到AgeI/SacII限制性位点中。通过剪接重叠PCR从该构建体中除去诱导型半胱天冬酶9自杀基因和下游2A序列(SEQID NO.:22或23)。通过剪接重叠PCR从1.5.3-NQ-28-BB-z中除去41BB结构域，产生1.5.3-NQ-28-z构建体(SEQ ID NO.:27)。所有构建体均通过Sanger测序确认。用所描述的骨架载体以及包装载体pCGHP-2、pCMV-Rev2和pCMV-G瞬时转染的293T细胞而产生慢病毒，并通过离心将含有包装的慢病毒的上清液浓缩100倍。

T细胞分离和转导

外周血单核细胞(PBMC)通过来自健康供体的单采血液成分术来获得，其由在FHCRC下的机构审查委员会(IRB)批准的研究方案同意，或来自Puget Sound血液中心购买的Pall白细胞过滤器。通过用Ficoll-Paque密度梯度培养基离心分离的PBMC用氯化铵-钾(ACK)缓冲液进行红细胞裂解，并在10％DMSO和90％FBS中冷冻保存。对于体外实验，使用Pan T细胞分离试剂盒II(Miltenyi Biotec)通过MACS从解冻的PMBC中负选择T细胞。对于细胞毒性实验，在冷冻保存之前，使用抗CD8抗体包被的珠(Miltenyi Biotec)通过MACS从健康供体的单采血液成分术PBMC阳性选择CD8⁺T细胞。对于一些实验，在冷冻保存前，用CliniMACS抗CD14和抗CD45RA珠(Miltenyi Biotec)温育后，通过使用AutoMACS装置阴性选择从健康供体的单采血液成分术PBMC来分离中央记忆T细胞(TCM)，随后用CliniMACSCD62L珠阳性选择。在其他实验中，使用抗CD4或抗CD8珠(Miltenyi Biotec)通过阳性免疫磁性选择富集CD4和CD8细胞。用αCD3/αCD28 Ab包被的人T-扩增珠(Invitrogen)以3：1的珠：T细胞比例刺激选择的T细胞。第二天用编码CD20 CAR构建体中的一个的慢病毒载体(2-6的感染复数)加4-8μg/ml聚凝胺旋转转导活化的T细胞(2100rpm，在32℃下60分钟)。转导的T细胞在含有带/或不带10ng/ml rhIL-15(Miltenyi Biotec)的50IU/ml重组人白细胞介素2(rhIL-2)的培养基中培养，在刺激后温育4-5天，然后磁性去除αCD3/αCD28珠，并通过流式细胞术分析以确认CAR表达。CAR⁺T细胞用于功能测定。

对于体内小鼠实验，将T_CM或CD4和CD8富集的T细胞解冻、活化，并在第二天用浓缩的慢病毒上清液转导，所述浓缩的慢病毒上清液编码每个实验中指出的构建体。在第5天除去CD3/CD28珠，将细胞在50IU/mL rhIL-2中扩增，在第7-10天用照射的CD20⁺LCL以1:1的效应子：刺激物比例再次刺激，并在用LCL再刺激后在8-11天注射到小鼠中。

增殖和细胞因子分泌测定

然后将用5μM羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)染色的T细胞(2×10⁵总细胞)以1：1的比例与已经用8000-10000cGy照射的肿瘤靶系共培养。在利妥昔单抗阻断实验中，在与T细胞共温育之前，将经辐照的靶细胞在室温下与各种利妥昔单抗浓度温育30分钟。在接种后24小时收集上清液并储存在-20℃直至随后通过如前所述的Luminex测定法进行细胞因子分析(Till et al.,Blood 2012；119(17):3940-50)以定量干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)和TNF-α。4-5天后，用抗CD3-APC(BioLegend)染色细胞，并通过流式细胞术测定CD3门控淋巴细胞的CFSE稀释度作为增殖的量度。使用前向散射(FSC-A)参数的几何平均值并减去静息T细胞的细胞大小，通过流式细胞术测定细胞大小作为另一种活化的度量。使用FlowJo软件(v7.6.1；Treestar，Ashland，OR)分析流式细胞术数据。在一些实验中，奥法木单抗替代利妥昔单抗。

还通过IFN-γ的细胞内染色确定细胞因子分泌的评估。将CD20 CAR⁺CD4⁺或CD8⁺T细胞与经照射的K562或K562-CD20细胞共培养24小时。对于细胞内染色，将细胞固定，用BDCytofix/Cytoperm试剂盒(BD Biosciences)在冰上透化15分钟。然后在固定和透化后，用抗-IFN-γ(Biolegend)在冰上染色细胞1小时。在BD FACSCanto(BD Biosciences)上分析数据。FlowJo软件用于分析数据。

细胞毒性测定法

如前所述，通过将CD20 CAR CD8⁺T细胞与⁵¹Cr标记的靶细胞系共温育4-5小时来进行标准⁵¹Cr释放测定。(参见Wang，et al.Hum Gene Ther.2007；18：712-725)。通过直接测量用5％IGEPAL CA-630裂解的标记细胞的上清液的⁵¹Cr含量来确定最大的⁵¹Cr释放。将上清液收获到96孔Lumaplates中，空气干燥过夜，并用TopCount(PerkinElmer)测定计数。细胞毒性百分比通过以下等式计算：[样本-Min_avg]/[Max_avg-Min_avg]×100。

对于利妥昔单抗阻断实验，在以各种效应子与靶标(E:T)的比例加入CAR⁺CD8⁺T细胞之前，将⁵¹Cr标记的靶细胞系在各种利妥昔单抗浓度下(范围从0到200μg/mL)温育30分钟(在初始温育期间达到最终浓度的两倍，以产生10、25、50、100和200μg/ml的最终浓度)。将细胞在含有热灭活的FBS的培养基中一式两份，在U-底96孔板中与用⁵¹Cr标记的利妥昔单抗阻断的靶细胞于37℃培养5小时。对照孔含有在不含T细胞的含利妥昔单抗的培养基中培养的靶细胞(在图中表示为“0:1”E:T比例)以排除利妥昔单抗诱导的CDC的可能性。在一些实验中，使用奥法木单抗代替利妥昔单抗。

利妥昔单抗对CAR T细胞功效的体内评估

用5×10⁵个利妥昔单抗抗性Raji-ffLuc或Granta-519淋巴瘤细胞通过尾静脉2-7天接种6-10周龄的5-10只NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ(NOD/SCID/γ-/-[NSG])小鼠组(Jackson Laboratory)。2-7天后(如每个实验中所示)，通过尾静脉注射10⁷个CD20 CAR T细胞(tCD19⁺)或空载体T细胞。在利妥昔单抗阻断实验中，在肿瘤接种后5天和施用CAR T细胞前1天腹腔内施用(i.p.)25或200μg利妥昔单抗。使用已知方法进行生物发光成像以确定肿瘤生长(参见，James et al.,Blood 2009；114(27):5454-63；Rufener et al.,CancerImmunol Res.2016；4:509-519)。调整分档和曝光以实现最大灵敏度而不会导致图像饱和。使用具有GraphPad Prism 6软件的Kaplan-Meier方法产生存活曲线。

为了测试过继转移的T细胞的存留，在不同时间点通过眼眶后取血收集的全血通过ACK裂解缓冲液(Quality Biological)而裂解。在肿瘤接种后第6天和第13天通过从离心来自眼眶后血管丛的凝血血液样品获得小鼠血清，并且使用ELISA测定法测量血清利妥昔单抗水平以确定如前所述的利妥昔单抗浓度(参见，Gopal AK,et al.,Blood 2008；112(3):830-5；Maloney DG,et al.,Blood 1997；90(6):2188-95)。用静脉内注射免疫球蛋白(IVIG)阻断分离的细胞的Fc受体，并用针对mCD45(30-F11，Biolegend)、hCD3(HTT3a，Biolegend)和hCD19(HIB19，BD Bioscience)的单克隆抗体(mAb)染色细胞。用BD Canto 2收集数据并在FlowJo软件(Treestar)上分析。小鼠研究由FHCRC机构动物护理和使用委员会批准。

患者血清样品

在IRB批准和根据赫尔辛基宣言获得的知情同意后，由B细胞淋巴瘤患者提供人血清样品。在含有利妥昔单抗的补救性化学免疫疗法后4个月内收集血清样品。如先前公开的那样测定血清利妥昔单抗浓度(Maloney et al.,Blood 1997；90(6):2188-95)。

例2

利妥昔单抗对通过含有抗CD20 scFv的CAR的CD20结合的影响

先前已使用衍生自两种不同鼠单克隆抗体的scFv测试过CD20定向CAR(参见Polyak et al.,Blood 2002；99(9):3256-62)，Leu16(L27；参见，Till et al.,Blood2008；112(6):2261-71；Till et al.,Blood 2012；119(17):3940-50)或1F5抗体(参见，Wang J,et al.,Hum Gene Ther 2007；18(8):712-25；Budde et al.,PLoS One 2013；8(12):e82742)，其中每一种都与CD20分子的大细胞外环上的表位结合。这些CD20表位与利妥昔单抗表位重叠(参见Polyak et al.,Blood 2002；99(9):3256-62)，因此预期利妥昔单抗会阻断这些CAR的结合。使用流式细胞术，通过在与Leu16 Ab温育之前将这些细胞与利妥昔单抗预温育来评估不同浓度的利妥昔单抗阻断Leu16抗CD20抗体与Ramos淋巴瘤细胞上表达的CD20结合的能力。观察到剂量依赖性的CD20阻断，在4℃下50μg/ml利妥昔单抗接近完全阻断。但是，当抗CD20-PE(Leu16)在37℃的生理学相关温度下温育时，即使在200μg/ml的利妥昔单抗下也发生低水平的CD20结合(图2A-2F)。在FL-18细胞上使用1F5抗CD20抗体的实验中观察到类似的发现(数据未显示)。因此，利妥昔单抗与本公开的抗CD20 CAR结合重叠表位，并且具有干扰针对CD20⁺靶细胞的CAR T细胞活性的潜力。

例3

利妥昔单抗对CAR T细胞体外功能的影响

利用利妥昔单抗阻断CD20对CD20 CAR T细胞功能的影响通过在与各种CD20⁺B细胞NHL细胞系温育后使用五种不同的CD20 CAR慢病毒构建体测量增殖、细胞因子分泌和细胞毒性来评估。CAR构建体(图1A和1B)是第3代Leu16-28-BB-z-tEGFR和1F5-28-BBz构建体(参见Budde et al.,PLoS One 2013；8(12):e82742)，第二代Leu16-28-z构建体和两个CD20 CAR(1.5.3-NQ-28-BB-z和1.5.3-NQ-28-z)来源于完全人1.5.3抗CD20 Ab，其也与利妥昔单抗结合于重叠表位(参见，Bornstein et al.,Invest New Drugs 2010；28(5):561-74)。CAR表达通常在40-80％的T细胞中实现(数据未显示)。

当在利妥昔单抗存在下与各种NHL靶细胞系(Raji，Daudi，Rec-1和FL-18)一起培养时，CFSE标记的CAR T细胞的增殖基本上未受损。在利妥昔单抗存在下以高达200μg/ml的浓度用靶细胞刺激的CAR T细胞在没有利妥昔单抗的情况下在刺激后观察到>96％的增殖(图3A)。细胞大小是T细胞活化的另一种量度(参见Grumont et al.,Immunity 2004；21(1):19-30)。通过流式细胞术分析CAR⁺T细胞的前向散射作为细胞大小的估计，并发现在用利妥昔单抗预温育的Raji、Daudi或Rec-1肿瘤细胞刺激后，CAR T细胞显示中值大小>85％的没有暴露于利妥昔单抗的对照细胞的大小(图3A)。与利妥昔单抗一起温育后，用FL-18细胞温育的T细胞表现出略微更明显但仍然适度的细胞大小的减少(在200μg/ml时73％的对照细胞大小)。

与增殖相反，发现CAR T细胞的细胞因子分泌在利妥昔单抗水平增加的情况下降(图3B)。然而，即使在100μg/ml利妥昔单抗时，细胞因子IFN-γ、IL-2和TNF-α分别以基线水平的34-51％、70-92％和79-108％产生。使用经基因修饰以表达CD80和CD20作为靶标的K562细胞观察到类似的发现，其中CD20阴性K562-CD80细胞作为对照以证明CD20 CAR T细胞活性的抗原特异性(图6A和6B)。

还检查了利妥昔单抗对CAR⁺T细胞针对各种CD20⁺NHL靶细胞系的细胞溶解活性的影响。使用标准的⁵¹Cr释放测定法与CAR⁺/CD8⁺T细胞作为效应子和Raji、FL-18、Granta或REC-1作为靶标，在利妥昔单抗浓度高达50微克/毫升发现细胞毒性最低限度地受到损害(图4)，以及对于所有测试的靶细胞系100μg/ml的利妥昔单抗浓度下保留>65％的基线细胞溶解活性。

在利妥昔单抗存在下测试完全人1.5.3-NQ-28-z和1.5.3-NQ-28-BB-z CAR T细胞的体外功能。与Leu16和1F5 CAR一样，观察到针对利妥昔单抗预处理的靶细胞的细胞因子分泌和细胞毒性的适度剂量依赖性降低，但未观察到增殖。

例4

CD20表达水平对CAR T细胞的抗CD20的敏感性的影响

为了检查肿瘤细胞上CD20表达水平是否会影响对利妥昔单抗阻断的敏感性，选择有限稀释克隆后具有低、中和高水平CD20表达的K562-CD80细胞系(图10)用于测试。在不同浓度的利妥昔单抗存在下再次评估体外CAR T细胞功能。与NHL细胞系一样，无论靶细胞上CD20的表达水平如何，CAR T细胞的增殖都是完整的(图5A)。当CD20^高细胞用作靶标时，细胞大小没有减少，尽管发现对于表达较低水平CD20的细胞，细胞大小适度减少。与增殖和细胞大小相反，CD20^低靶细胞刺激后细胞因子分泌明显受损，在利妥昔单抗为100-200μg/ml时，IFN-γ、IL-2和TNF-α水平分别低至基线值的5％、17％和22％(图5B；图11A-11E)，而用CD20^高靶标刺激的T细胞在利妥昔单抗浓度为100μg/ml时保留>75％的基线活性。

CD20抗原密度对利妥昔单抗介导的CAR T细胞的细胞溶解活性抑制的影响显示在图5C中。表达高水平CD20的靶细胞的T细胞杀伤受利妥昔单抗的影响最小，即使在低E:T比例下也是如此。然而，针对CD20^低和CD20^中K562-CD80靶标的T细胞细胞毒性中存在剂量依赖性降低，其在较低效应子与靶标(E：T)比例下最显著。针对CD20^低靶标的细胞溶解活性在200μg/ml的利妥昔单抗时50:1的E:T比例下保持基线的47％，但在2:1的E:T比例下仅为基线的16％。

例5

在残留的利妥昔单抗存在下CD20 CAR T细胞的体内抗肿瘤活性

上述体外实验表明，尽管存在中等水平的利妥昔单抗，CD20 CAR T细胞仍保留了针对CD20⁺肿瘤的显著功能。为了评估这些观察结果将如何转化为体内环境，检查了残留利妥昔单抗对小鼠淋巴瘤模型中CAR T细胞活性的影响。

作为背景，利妥昔单抗作为单一药剂在免疫功能不全的小鼠异种移植模型中具有显著的抗Raji细胞的抗肿瘤活性(参见，Hernandez-Ilizaliturri FJ,et al.,ClinCancer Res2003；9(16Pt 1):5866-73)。为了克服利妥昔单抗在联合治疗实验中潜在的混杂治疗效果，使用先前描述的方法产生利妥昔单抗-难治性Raji细胞系(RR-Raji)(参见，Czuczman MS,et al.,Clin Cancer Res 2008；14(5):1561-70)，并发现CD20表达保留在该细胞系中(图12)。

静脉内将RR-Raji细胞接种给NSG小鼠，一旦接种后5天确定肿瘤，用高剂量或低剂量利妥昔单抗治疗一些组，然后在第二天静脉内给予CD20 CAR⁺T细胞(图7A)。单独接受利妥昔单抗的小鼠表现出适度的、短暂的抗肿瘤作用，但在第24天均死于肿瘤进展，而单独用CAR T细胞治疗的小鼠有显著的肿瘤消退，40％的小鼠根除肿瘤并且两倍于中位生存期(52天)。与仅接受CAR T细胞的小鼠相比，在T细胞输注前一天接受利妥昔单抗的小鼠体内CART细胞活性没有受损；在25μg/ml利妥昔单抗组中除了一只小鼠之外的所有小鼠和200μg/ml利妥昔单抗组中的所有小鼠都证明了肿瘤根除(图7B和7C；图13A和13B)。

为了证实这些肿瘤缓解在生理学相关的利妥昔单抗血清水平的存在下发生，在T细胞输注当天和一周后收集来自利妥昔单抗治疗的小鼠的血清，并测量血清利妥昔单抗水平。接受200μg/ml利妥昔单抗的小鼠一周后初始中位血清利妥昔单抗浓度为138.5μg/ml(范围54.5-173.6)和39.7μg/ml(范围1.6-51.9)，接受25μg/ml利妥昔单抗的小鼠具有基线时11.7μg/ml(范围2.8-17.8)的中值浓度，并且在T细胞输注后1周为0μg/ml(图7D)。

另外，在肿瘤注射后28天通过流式细胞术定量循环CAR T细胞水平。单独接受CART细胞或接受利妥昔单抗加CAR T细胞的小鼠之间的CAR T细胞水平没有显著差异，表明利妥昔单抗的存在不损害CAR T细胞的体内存留(图14A-14C)。

例6

含有利妥昔单抗的方案治疗的患者的血清利妥昔单抗浓度

为了将上述结果置于临床背景中，在研究方案中接受自体干细胞移植的B细胞NHL患者数据库中查询预期患者群体中临床相关的残留血清利妥昔单抗水平范围，可获得移植前血清利妥昔单抗测量(参见，Gopal et al.,Blood 2008；112(3):830-5)。确认在血清抽血后4个月内接受含利妥昔单抗的化疗方案(范围0.5-3.8个月，中位数为1.8)的总共103名患者，这些患者的利妥昔单抗浓度中位数为38.3μg/ml，四分位数范围为19.1-71.7μg/ml(图7E)。86％的患者利妥昔单抗浓度为100μg/ml或更低。

例7

奥法木单抗对CD20 CAR T细胞功能的影响

为了确定表位定位对抗CD20抗体针对CAR功能的影响的重要性，用奥法木单抗重复进行体外测定，其为与利妥昔单抗结合不同表位的抗CD20抗体，这涉及较小的CD20细胞外环，以及大环的不同区域(参见Du et al.,Mol Immunol 2009；46(11-12):2419-23；Teeling et al.,J Immunol 2006；177(1):362-71)。首先通过流式细胞术评估奥法木单抗阻断Leu16抗CD20抗体结合的能力，其显示尽管表位不同，但第二抗体的结合被奥法木单抗严重阻断。此外，阻断结合的浓度甚至低于利妥昔单抗(图2D-F)。然后对已用不同浓度的奥法木单抗预温育的Rec-1和Raji-ffLuc淋巴瘤细胞进行体外功能测定(图8A-8C)。结果与利妥昔单抗类似，因为增殖和细胞大小受影响最小，但细胞因子的产生受剂量依赖性影响更大。与利妥昔单抗相比，在奥法木单抗存在下细胞毒性更严重受损。这些发现表明抗CD20抗体的抑制作用是由于空间抑制而不是CAR结合表位的直接阻断。因此，与利妥昔单抗相比，奥法木单抗的更强抑制作用是由较慢的解离速率引起的。这得到了4℃或37℃的竞争性细胞结合流式细胞术研究的支持(图2D-F)，其证实了奥法木单抗的解离率低得多，与先前报道的数据一致(参见Teeling et al.,Blood 2004；104(6):1793-800)。

例8

在体外通过各种CAR构建体分泌细胞因子

用抗CD3/CD28抗体包被的珠刺激中央记忆(CD14^-CD45RA^-CD62L⁺)T细胞，24小时后用编码所示的CAR构建体的慢病毒载体转导，并在体内扩增。在第14天，用照射的Raji-ffLuc细胞(图15A和图15C)、Granta-519细胞(图15B)和Jeko细胞(图15D)再刺激细胞。“19-BB-z”构建体是用于临床试验的临床级CD19靶向CAR，并且作为阳性对照提供。24小时后收获上清液，并通过Luminex测定法分析干扰素(IFN)-γ、IL-2和肿瘤坏死因子-α水平。

例9

通过CD20 CAR T细胞分泌细胞因子

用1.5.3-NQ-28-BB-z慢病毒载体转导并离体扩增的CD4⁺和CD8⁺T细胞用经照射的Raji-ffLuc CD20⁺淋巴瘤细胞进行再刺激。通过Luminex测定法测量在24小时后细胞上清液中指定细胞因子的分泌。(图16A)将冷冻保存的CD4⁺和CD8⁺CD20 CAR T细胞解冻并用K562细胞或表达CD20的K562细胞再刺激，并在24小时通过流式细胞术对IFN-γ进行细胞内染色来分析。(图16B)

例10

各种CAR构建体的体外细胞毒性

用抗CD3/CD28抗体包被的珠刺激中央记忆(CD14^-CD45RA^-CD62L⁺)T细胞，24小时后用编码所示的CAR构建体的慢病毒载体转导，并在体内扩增。在第14天，使用(图17A和17B)Raji-ffLuc和(图17B)Jeko细胞作为靶标，将细胞用作标准4小时⁵¹Cr释放测定法中的效应物。“19-BB-z”构建体是用于临床试验的临床级CD19靶向CAR，并且作为阳性对照提供。显示了每种CAR T细胞群的特异性靶细胞裂解。

例11

CD20 CAR T细胞的增殖

用1.5.3-NQ-28-BB-z慢病毒载体(或模拟转导)转导CD8⁺T细胞并离体扩增，然后冷冻保存。然后将细胞解冻，用羧基荧光素琥珀酰胺酯(CFSE)染色，并用经照射的CD20⁺Raji-ffLuc淋巴瘤细胞、K562细胞或表达CD20的K562细胞再刺激。4天后通过流式细胞术分析细胞。(图18A)显示了CAR⁺细胞的CFSE稀释(在CD3⁺/tCD19⁺上门控)。虚线直方图仅显示培养基中T细胞的CFSE荧光，实线直方图是与靶细胞共温育的T细胞。(图18B)显示每组的分裂细胞百分比。

例12

各种CAR构建体的体内抗肿瘤活性

用抗CD3/CD28抗体包被的珠刺激中央记忆(CD14^-CD45RA^-CD62L⁺)T细胞，24小时后用编码所示的CAR构建体的慢病毒载体转导，并在体内扩增。“19-BB-z”构建体是在我们中心用于临床试验的临床级CD19靶向CAR，并且作为基准对照提供。静脉内注射NSG小鼠Raji-ffLuc肿瘤细胞，2天后静脉注射扩增的中枢记忆(CD14^-CD45RA^-CD62L⁺)T细胞，其用1.5.3-NQ-28-BB-z CAR、1.5.3-NQ-28-z CAR、JCAR-014(抗-CD19-41BB)，或空载体转导。(图19A)通过生物发光成像评估的一段时间的肿瘤负荷；以及(图19B)总生存率的Kaplan-Meier图。

例13

CD20 CAR T细胞对套细胞淋巴瘤的体内活性。

用1.5.3-NQ-28-BBz CAR转导CD4⁺和CD8⁺CD20 CAR T细胞，并用于处理7天前通过尾静脉接种GrantaffLuc套细胞淋巴瘤细胞的NSG小鼠。图20中显示了总体生存的Kaplan-Meier图。

例14

体内CAR T细胞存留和相关生理作用

在携带Raji-ffLuc播散性肿瘤的NSG小鼠中输注CD20 CAR T细胞或空载体tCD19表达T细胞后，在连续时间点获得眶后血液样品。表达tCD19转导标记物的CD20 CAR T细胞在每个时间点通过流式细胞术定量为人CD3⁺/小鼠CD45-阴性/人CD19⁺细胞。(图21A)显示3个输注后时间点的tCD19⁺T细胞，作为血液中总有核细胞的百分比(最初在CAR T细胞组中n＝9)。显示来自空载体小鼠的截短的CD19⁺细胞用于参照。(图21B)在单独的实验中，纵向显示每周测量来自每组中2只小鼠的tCD19⁺细胞(空载体对CAR T细胞)。

此外，根据体重、一般行为和外观、身体活动、姿势、清理毛发习惯、肤色、腹泻、眼睛、口腔或皮肤炎症迹象，嗜睡或严重贫血的迹象(耳廓或脚或粘膜苍白)，监测用CD20 CART细胞治疗的小鼠的毒性迹象。在使用CD20 CAR T细胞的11次实验中，在任何小鼠中没有观察到T细胞相关毒性的迹象，除了在晚期时间点在一些小鼠上发生的异种移植物抗宿主疾病的发现。这一发现既发生在接受CD20 CAR T细胞的小鼠中，也发生在接受空载体细胞的小鼠中，因此与CAR载体无关，而是异种T细胞转移的已知结果。在每个实验中，每周记录每只小鼠的重量至少3次，并且除了经历最终肿瘤进展的小鼠外，其通常是稳定的，其中在生命的最后几天发生体重减轻(数据未显示)。

最后，在两个实验中从一小部分小鼠中取血样以确定动物的生理功能。在第一个实验中，荷Granta套细胞淋巴瘤肿瘤的小鼠用未转导的T细胞，未用CD20⁺TM-LCL细胞再刺激的CD20 CAR T细胞或用TM-LCL细胞再刺激的CD20 CAR T细胞进行治疗(新鲜输注或首先冷冻保存，然后解冻和输注)。在处理的小鼠眶后血液样品中，使用血尿素氮(BUN)和肌酸酐测量肾功能，使用丙氨酸和天冬氨酸氨基转移酶(ALT和AST)测量肝功能，并通过白细胞计数(WBC)、血红蛋白和血小板计数测量骨髓功能(数据未显示)。与未处理的小鼠相比，在用CAR T细胞处理的小鼠中未观察到BUN或肌酸酐的增加或肝功能的显著变化。与未处理的小鼠相比，未用TM-LCL细胞再刺激的CAR T细胞处理的小鼠WBC下降，但是在用TM-LCL再刺激的T细胞处理的小鼠中未观察到这种情况。在用TM-LCL再刺激的CAR T细胞处理的小鼠中观察到血细胞压积小幅下降但血红蛋白没有下降，尽管在接受非再刺激的CAR T细胞的小鼠中未观察到这种情况。接受非再刺激的CAR T细胞的小鼠血小板计数增加，但在接受再刺激的CAR T细胞的小鼠中未观察到显著变化。

在第二个实验中，用低剂量(1×10⁶CAR⁺细胞/小鼠)或高剂量(5×10⁶CAR⁺细胞/小鼠)处理具有Raji-ffLuc肿瘤的小鼠，并评估肾和肝功能。在接受T细胞的小鼠中观察到更高BUN的趋势，但血清肌酸酐没有变化(数据未显示)。未观察到肝转氨酶升高。

例15

抗CD20 CAR治疗的临床研究

设计I/II期研究以评估过继性T细胞治疗的安全性和最大耐受剂量(MTD)，其中将1：1的自体CD4⁺和CD8⁺T细胞混合物转导以表达CD20特异性CAR，1.5.3-NQ-28-BB-Z。在该研究中携带用于转导T细胞的该构建体的自失活(SIN)慢病毒载体是第3代HIV-1衍生的慢病毒，其编码来自识别人CD20的大细胞外环中的表位的1.5.3完全人单克隆抗体的scFv，其与修饰的人IgG1铰链/间隔区，人CD28跨膜和细胞内结构域，以及人4-1BB和CD3ζ信号传导结构域连接(图1A)。该载体还编码通过自切割的E2A元件从CAR盒分离的非功能性截短的细胞表面人CD19(tCD19)，其有助于在体内追踪CAR T细胞。CD19的截短将细胞内结构域缩短至19个氨基酸，去除所有用作磷酸化位点的酪氨酸残基，但保留了抗CD19抗体识别的细胞外表位。tCD19还可以用作CD19靶向抗体或抗体-药物缀合物的靶标以消除CAR T细胞，例如，在延长的B细胞发育不良的情况下。

之前研究抗CD20 CAR T疗法的努力取得了一些成功，但低转染效率(<0.1％)需要抗生素选择和延长离体生长，导致CAR表达低和T细胞耗竭(参见，例如Till et al.,Blood119(17):3940-3950,2012；还参见Till et al.,Blood 112(6):2261-2271,2008；Wang etal.,J.Clin.Immunol.155(2):160-75,2014；da Silva et al.,Blood ASH AnnualMeeting Abstracts:Abstract#1851,2016)。

临床试验将招募30名患有B细胞非霍奇金淋巴瘤的受试者，包括套细胞、滤泡、淋巴浆细胞、边缘区、转化的惰性B细胞淋巴瘤(包括转化的CLL)，或对至少一种先前的治疗方案应答后复发的或对先前的治疗是难以治疗的弥漫性大B细胞淋巴瘤。严格的资格标准包括：18岁或以上(任何性别、种族或民族)；具有CD20表达证据的可预测疾病；女性参与者可能没有怀孕或哺乳；如临床方案中所定义的足够的肝、肾、肺、心脏和血液功能；无活动性中枢神经系统转移瘤或过去/目前临床相关的中枢神经系统病变；无HIV，活动的不受控制的感染或需要全身免疫抑制治疗的活动性自身免疫性疾病。

含有新发DLBCL的患者必须符合以下标准之一：

在含有蒽环霉素和利妥昔单抗或其他抗CD20抗体(即“原发性难治性”)的前线方案后经活检证实的难治性疾病，其中在方案完成后3个月内复发的任何疾病认为是难治性的。

至少下列之一后复发或难治性疾病：

至少2线治疗(包括至少一次用蒽环霉素和抗CD20抗体)自体干细胞移植

异体干细胞移植

图24中提供了一般治疗方案的图，并且图25A和25B中提供了CAR T细胞的制剂和给药模型的图示。

将对每位患者进行白细胞单采术以获得外周血单核细胞。不适合静脉-静脉单采血液成分术的患者可以选择放置经皮中心静脉导管以允许这种采集。具有血细胞压积至少38％且总非恶性(正常)淋巴细胞计数>2000/mcl的不适合血浆分离置换的患者可以进行400ml血液的静脉切开术以获得产生CAR T细胞所必需的PBMC。该方法仅用于以0(1×10⁵tCD19⁺细胞/kg)，1(3.3×10⁵tCD19⁺细胞/kg)和2(1×10⁶tCD19⁺细胞/kg)剂量水平招募的患者。参与者将在白细胞单采术前进行肿瘤活检。根据淋巴结的可及性，可以在肿瘤活组织检查和白细胞单采术之前或之后进行PET CT。

CAR T细胞由自体外周血单核细胞(PBMC)产物制备，所述产物通过对每个患者进行标准非动员白细胞单采术获得。PBMC经过免疫磁选，分别富集CD8⁺和CD4⁺T细胞，每个亚组用抗CD3/CD28顺磁珠分别刺激，然后用编码完全人第3代CD20特异性CAR和tCD19转导标记物的1.5.3-NQ-28-BB-ζ慢病毒载体转导。可以扩增转导的T细胞，然后用表达CD20的靶细胞系再刺激以促进生长，进一步离体扩增，然后以1:1的CD4/CD8比例配制以达到指定的用于输注的细胞剂量。细胞产品可以新鲜输注，或冷冻保存，然后解冻、洗涤和输注。

CD20 CAR T细胞产物将由1:1比例的tCD19⁺CD4⁺和tCD19⁺CD8⁺T细胞组成，其中tCD19是与CAR共表达的转导标记物并识别CAR⁺细胞。为每个患者产生的CD20 CAR T细胞产物可以在制造后立即作为新鲜细胞而施用，或者可以首先冷冻保存并储存在液氮冷冻器中，然后洗涤解冻的细胞以除去残留的冷冻保护剂，然后配制用于输注。细胞总数对于从解冻恢复期间的细胞损失并达到临床方案中规定的细胞剂量水平是足够的。由于单个亚组的转导是相似的但单个患者并不相同，CD4⁺和CD8⁺T细胞的总比例可以不同于1:1。由于这个原因，可以单独转导亚组以能够精确配制转导的T细胞。该比例的基本原理基于已发表的工作，证明动物模型中CD4和CD8CAR T细胞之间的协同作用(Sommermeyer et al.,Leukemia2015)以及我们为所有患者提供均一细胞产物以帮助评估毒性和功效的目的，如果每个患者接受不同的组合物，这是很困难的。

可以将CD20 CAR T细胞悬浮在CryoStor

或其他合适的冷冻保存介质中，用于在受控速率的冷冻机中冷冻保存。冷冻保存的细胞可以储存在液氮冷冻机的蒸气相中。然后可将新鲜或解冻的CD20 CAR T细胞重新悬浮于Normosol+1％HSA中，并以临床方案中指定的总细胞剂量水平转移至转移包。配制的产品将在2-8℃下储存，然后在冷藏凝胶包上转移到华盛顿大学或西雅图癌症护理联盟的临床现场进行管理。该产品将由FHCRC细胞处理设施发布。细胞产品应在配制后6小时内输注给研究参与者。FHCRC细胞处理设施将负责对研究产品的分配和退货(如适用)编制文件。

患者将在输注CD20 CAR T细胞之前36-96小时接受淋巴清除化疗。最后一次化疗和T细胞输注之间必须至少间隔36小时。施用化疗的目的是提供淋巴清除以促进转移的T细胞的存活，并在输注CD20 CAR T细胞之前减轻肿瘤负荷。如方案的统计学考虑所概述的，患者最初将用单剂量的环磷酰胺(CY)i.v.1g/m²治疗。然而，如果反应率不充分，则可以改变淋巴清除方案，以便随后患者接受CY+氟达拉滨。

在接受CD20 CAR T细胞之前，将对参与者进行评估，以确保他们未发生该方案禁止的任何肺、心血管、肝、肾或神经毒性；没有发生不受控制的、活动的和严重的感染；并且在T细胞输注后30天内未接受其他研究药物的治疗。

在施用CD20 CAR T细胞产品之前不需要预先给药。研究者可自行决定使用标准的术前用药。

在完成淋巴清除化疗后36-96小时，每位患者将接受单次静脉输注CD20 CAR T细胞。给每个患者施用的CD20 CAR T细胞的剂量将根据临床方案中描述的统计设计来确定。各个剂量水平如表2所示。如果第一次输注不产生CR，或者如果疾病在CR后复发，则可以给予CD20 CAR T细胞的第二次输注。为此，患者必须符合以下临床方案中规定的标准。

细胞管理：从CD4⁺和CD8⁺CD20 CAR T细胞的单个等分试样以1:1的比例组合的单细胞产物将在约20-30分钟内以特定细胞剂量对每个受试者静脉内施用。指定的T细胞剂量是指通过截短的CD19转导标记物的表达而确定的CAR⁺T细胞，其与载体中的CAR协同表达。根据拟议议定书计划管理的剂量水平如下：

表2.CD20 CAR T细胞剂型和输注

剂量水平	tCD19<sup>+</sup>CD4<sup>+</sup>/tCD19<sup>+</sup>CD8<sup>+</sup>比例	总tCD19<sup>+</sup>T细胞剂量<sup>*,**</sup>
			0	1:1	1×10<sup>5</sup>/kg
1	1:1	3.3×10<sup>5</sup>/kg
			2	1:1	1×10<sup>6</sup>/kg
3	1:1	3.3×10<sup>6</sup>/kg
			4	1:1	1×10<sup>7</sup>/kg

*每公斤接受者重量

**每个剂量水平的上限，±15％；剂量水平1是起始剂量水平

在每次T细胞输注期间将监测所有患者。应在输注前和输注期间记录生命体征(包括氧饱和度)，并在输注后大约每小时记录，共记录2小时。应在T细胞输注期间使用连续脉搏血氧仪监测氧饱和度，并在T细胞输注后监测2小时。在输注后，受试者将在细胞输注单元上保留至少2小时，或者直到解决被认为对作为门诊患者的研究对象造成显着风险的任何输注相关毒性。

输液率：每次细胞输注应在约20-30分钟内静脉内给药，并根据需要进行调整，以符合肠外药物内毒素限值指南(￡5EU/kg/小时)。如果受试者经历轻度输注相关的不良事件(2级或更低)，也可以调整输注速率。

该研究的主要目的是估计CAR T细胞的最大耐受剂量(MTD)。用于这些目的的MTD将被定义为25％的真实剂量限制毒性率，其中DLT被定义为在输注后28天内发生的CAR T细胞输注引起的3级或更高的非血液学毒性，至少持续4天，对托西珠单抗、地塞米松或其他抗炎药物无反应。将使用对连续重新评估方法(CRM)的修改版来估计MTD。这些修改包括以两个一组(而不是一个一组)治疗患者，并允许组之间最大程度的增加一个剂量水平。对于第一组两名患者，患者将以剂量水平1开始的四个递增剂量水平之一接受单次静脉内输注CD20 CAR T细胞。考虑到在每个剂量水平下经历严重毒性的患者数量，剂量递增或递减由CRM算法确定(参见上文)。

剂量递增/递减组中的患者的治疗将交错，使得在递增至下一剂量水平之前，在每组2名患者之间需要输注后最少28天的间隔。这些剂量水平最初将与单独的CY组合进行评估，评估CR率以确定单独的CY是否具有足够的活性或是否添加氟达拉滨(CY/flu)。如果满足任何标准转换为CY/flu，CRM将从低于临时推荐剂量(单独使用CY)的一个剂量水平开始重新开始，并结合CY/flu。对于第1次、第2次和第3次中期分析，中期推荐剂量将被定义为迄今为止评估的最大剂量或基于第8、16或20名患者之后的mCRM所选择的下一剂量的较低值。该评估将继续至共30名患者。如果没有满足这些标准，则CRM方法将继续在另外10名患者(达到总共30名患者)中单独使用CY。对于接受第二次输注的患者，将基于其初次输注的剂量评估DLT和疗效结果。

接受CD20 CAR T细胞的患者在与肿瘤抗原相遇后由于T细胞活化，增殖和细胞因子分泌而可能产生严重的毒性。可能发生细胞因子释放综合征，巨噬细胞活化和神经毒性并且需要重症监护支持，并且如果认为它们是由于T细胞识别肿瘤，除非这些毒性在用皮质类固醇和/或托西珠单抗治疗连续4天后是不可逆的，则不将其视为DLT。

如果有足够的证据表明到第100天时与治疗相关死亡的真实概率超过20％(无论剂量如何)，患者的招募将暂停，等待PI，研究监测，统计学家和DSMB的详细审查。为此目的的充分证据将被定义为任何观察到的结果，其80％置信下限超过20％。

还将进行评估以提供疗效的初步评价。该研究的次要目标包括检查疗效(就缓解率，无进展生存期和T细胞的体内存留而言)。将使用所有剂量联合最终淋巴清除方案(单独使用CY或CY/氟达拉滨)治疗的患者进行这些分析，模拟结果作为剂量的函数。逻辑回归模型将用于评估二元结果(CR和CR/PR)。Cox比例风险模型将用于评估事件-时间结果(PFS，OS)。对于这些终点，不会对正式的统计假设进行测试；相反，将以描述性方式提供估计和相关的置信区间。

其他次要目标是评估过继转移的CD20 CAR T细胞的存留期间和过继转移的CD20CAR T细胞的迁移。为了评估CAR T细胞的存留，将估计患者水平的曲线下面积(AUC)并且将评估AUC的汇总统计。迁移(如果处理后存在CAR T细胞)，定义为在第10-16天肿瘤中CAR T细胞的存在，并且如果适用的话，定义为第28天的BM。AUC与临床结果的迁移之间的关联在本质上主要是描述性的，包括图形表示。

为了对与评估治疗抗性的生物学原因相关的次要目标进行评估，将进行以下分析。如果需要，将使用成对t检验来比较基线肿瘤和用适当转化治疗后肿瘤之间的生物标记物谱。Logistic回归模型将用于评估基线生物标记物值与反应之间的关联。在1个月达到CR或PR的患者中的具有里程碑意义的分析，使用Cox比例风险回归模型测量来自具有里程碑意义的时间的存活时间(PFS和OS)，以评估在当时获得活组织检查的患者CR/PR时测量的相关性。模型将包括所有患者/剂量水平的值，并包括剂量水平的变量。

内源性抗肿瘤反应和表位扩散的发展也将以很大程度上的探索性方式进行评价。将汇总每个时间点的数据，并且带有利用足够的数据的混合效应模型将用于模拟时变结果。在具有和不具有证实的表位扩散的患者之间进行差异基因表达分析以识别与免疫应答相关的生物标记物。

如果可以生产足够数量的CD20 CAR T细胞并满足下列标准，研究中未能达到CR，或实现完全反应(CR)但后来复发，希望再次输注CD20 CAR T细胞的患者可能有资格这样做。

a.有证据表明在第一次T细胞输注后持续存在疾病或肿瘤在CR后复发。

b.没有归因于剂量限制或需要剂量递减的第一次输注的毒性。

c.患者在第一次输注T细胞后≥30天。

d.没有临床和/或实验室排除标准(达到CR且后来复发的患者必须进行复发后活检，证明肿瘤细胞上正在进行CD20表达。

参与者将在筛选、淋巴清除化疗之前、T细胞输注期间、以及每次T细胞输注后的间隔进行评估。根据临床方案，将获得以下数据用于安全性和毒性评价：

·T细胞输注之前和输注间隔的历史和体格检查。

·输注前和输注过程中的脉搏血氧饱和度

·T细胞输注之前和输注间隔的血液学、肝脏、肾脏和电解质血液检查

·在T细胞输注之前和输注后实验室测试间隔评估肿瘤裂解综合征、凝血病和细胞因子释放综合征。

·根据NCI CTCAE 4.0版进行毒性分级

·血清细胞因子水平

·B细胞重建

·血清免疫球蛋白水平

·复制能力慢病毒检测

·基因T修饰的细胞的存留

·不良事件的报道

可以组合上述各种实施例以提供进一步的实施例。本说明书中提及和/或在申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物均通过引用整体并入本文。如果需要，可以修改实施例的各方面以采用各种专利，申请和出版物的概念来提供其他实施例。

根据以上详细描述，可以对实施例进行这些和其他改变。通常，在权利要求中，所使用的术语不应解释为将权利要求限制于说明书和权利要求中公开的特定实施例，而是应该解释为包括所有可能的实施例以及这样的权利要求所要求保护的等同物的全部范围。因此，权利要求不受本公开的限制。

序列表

<110> 弗雷德哈钦森癌症研究中心（Fred Hutchinson Cancer Research Center）

B·蒂尔（Till, Brian）

O·普雷斯（Press, Oliver）

<120> 用于CD20免疫疗法的组合物和方法（COMPOSITIONS AND METHODS FOR CD20

IMMUNOTHERAPY）

<130> 360056.441WO

<140> PCT

<141> 2017-03-17

<150> US 62/310,541

<151> 2016-03-18

<150> US 62/320,327

<151> 2016-04-08

<160> 98

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 1

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser

20 25 30

Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Ala

85 90 95

Thr Gln Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 2

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 2

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met

20 25 30

Asp Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 3

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 3

Asp Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Leu Ser Phe Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 4

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 4

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg His Pro Ser Tyr Gly Ser Gly Ser Pro Asn Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 5

<211> 128

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 5

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Asp Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Leu Asp Glu Ser Lys Tyr

115 120 125

<210> 6

<211> 128

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 6

Gln Val Gln Leu Arg Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser His Tyr Gly Ser Asn Tyr Val Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Leu Asp Pro Lys Ser Ser

115 120 125

<210> 7

<211> 12

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 7

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

1 5 10

<210> 8

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 8

Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

1 5

<210> 9

<211> 6

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 9

Pro Val Ala Gly Pro Ser

1 5

<210> 10

<211> 101

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 10

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

1 5 10 15

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

20 25 30

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

35 40 45

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val

50 55 60

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

65 70 75 80

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

85 90 95

Ile Ser Lys Ala Lys

100

<210> 11

<211> 110

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 11

Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

100 105 110

<210> 12

<211> 105

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 12

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

1 5 10 15

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

100 105

<210> 13

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 13

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu

1 5 10 15

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly

65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

100 105

<210> 14

<211> 27

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 14

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

20 25

<210> 15

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 15

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg

35 40

<210> 16

<211> 42

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 16

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 17

<211> 112

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 17

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 18

<211> 22

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 18

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro

20

<210> 19

<211> 20

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 19

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly

20

<210> 20

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 20

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 21

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 21

Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

1 5 10 15

Ser Ser

<210> 22

<211> 20

<212> PRT

<213> 未知的（Unknown）

<220>

<223> E2A self-cleaving peptide

<400> 22

Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 23

<211> 24

<212> PRT

<213> 未知的（Unknown）

<220>

<223> T2A自切割肽（T2A self-cleaving peptide）

<400> 23

Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp

1 5 10 15

Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg

20

<210> 24

<211> 323

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 24

Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met

1 5 10 15

Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp

20 25 30

Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln

35 40 45

Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu

50 55 60

Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile

65 70 75 80

Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu

85 90 95

Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr

100 105 110

Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp

115 120 125

Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro

130 135 140

Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala

145 150 155 160

Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Val Pro Pro

165 170 175

Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro

180 185 190

Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser

195 200 205

Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser

210 215 220

Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp

225 230 235 240

Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala

245 250 255

Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu

260 265 270

Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly

275 280 285

Gly Trp Lys Val Ser Ala Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu

290 295 300

Cys Ser Leu Val Gly Ile Leu His Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg

305 310 315 320

Arg Lys Arg

<210> 25

<211> 357

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 25

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly

20 25 30

Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe

35 40 45

Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala

50 55 60

Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu

65 70 75 80

Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile

85 90 95

Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu

100 105 110

Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala

115 120 125

Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu

130 135 140

Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr

145 150 155 160

Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys

165 170 175

Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly

180 185 190

Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu

195 200 205

Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys

210 215 220

Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu

225 230 235 240

Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met

245 250 255

Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala

260 265 270

His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val

275 280 285

Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His

290 295 300

Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro

305 310 315 320

Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala

325 330 335

Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly

340 345 350

Ile Gly Leu Phe Met

355

<210> 26

<211> 695

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 26

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser

20 25 30

Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Ala

85 90 95

Thr Gln Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

115 120 125

Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser

130 135 140

Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp

145 150 155 160

Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly

165 170 175

Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln

180 185 190

Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Thr Thr Ala Tyr Leu

195 200 205

Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

210 215 220

Arg His Pro Ser Tyr Gly Ser Gly Ser Pro Asn Phe Asp Tyr Trp Gly

225 230 235 240

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

245 250 255

Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

260 265 270

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

275 280 285

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn

290 295 300

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

305 310 315 320

Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

325 330 335

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

340 345 350

Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

355 360 365

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

370 375 380

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

385 390 395 400

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

405 410 415

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

420 425 430

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

435 440 445

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

450 455 460

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val

465 470 475 480

Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile

485 490 495

Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr

500 505 510

Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln

515 520 525

Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly

530 535 540

Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val

545 550 555 560

Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu

565 570 575

Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp

580 585 590

Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn

595 600 605

Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg

610 615 620

Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly

625 630 635 640

Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu

645 650 655

Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu

660 665 670

Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His

675 680 685

Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

690 695

<210> 27

<211> 653

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 27

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser

20 25 30

Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Ala

85 90 95

Thr Gln Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

115 120 125

Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser

130 135 140

Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp

145 150 155 160

Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly

165 170 175

Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln

180 185 190

Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Thr Thr Ala Tyr Leu

195 200 205

Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

210 215 220

Arg His Pro Ser Tyr Gly Ser Gly Ser Pro Asn Phe Asp Tyr Trp Gly

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Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

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<220>

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<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

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Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

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<210> 31

<211> 658

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<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

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Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

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<210> 32

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<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 32

Asp Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly

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Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu

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Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala

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Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser

195 200 205

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275 280 285

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

290 295 300

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

305 310 315 320

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

325 330 335

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

340 345 350

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

355 360 365

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

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Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

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Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

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Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val

485 490 495

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515 520 525

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530 535 540

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

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565 570 575

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg

580 585 590

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

595 600 605

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

610 615 620

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

625 630 635 640

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

645 650 655

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

660 665 670

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

675 680 685

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

690 695

<210> 33

<211> 656

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 33

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<220>

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<220>

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610 615 620

Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val

625 630 635 640

Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg

645 650 655

Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys

660 665 670

Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg

675 680 685

Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys

690 695 700

Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gln Cys

705 710 715 720

Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro

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Gly Pro Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr

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Pro Met Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu

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Lys Leu Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu

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Tyr Leu Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly

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Trp Thr Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val

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Ser Asp Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu

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Gly Pro Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val

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Trp Ala Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Val

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Pro Pro Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met

915 920 925

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Lys Ser Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp

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Met Trp Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln

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Leu Arg Arg Lys Arg

1060

<210> 42

<211> 1019

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 42

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Leu Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys

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Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg

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Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg

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Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Ser

100 105 110

Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Ser

115 120 125

Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser

130 135 140

Gln Val Gln Leu Arg Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

145 150 155 160

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

165 170 175

Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

180 185 190

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

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210 215 220

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

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Ala Arg Ser His Tyr Gly Ser Asn Tyr Val Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp

245 250 255

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Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly

275 280 285

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

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Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

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Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

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Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg

340 345 350

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

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Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

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Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

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Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

500 505 510

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser

515 520 525

Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly

530 535 540

Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala

545 550 555 560

Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala

565 570 575

Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg

580 585 590

Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu

595 600 605

Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn

610 615 620

Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met

625 630 635 640

Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly

645 650 655

Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala

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675 680 685

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Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu

705 710 715 720

Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys

725 730 735

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740 745 750

Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly

755 760 765

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770 775 780

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785 790 795 800

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885 890 895

Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His

900 905 910

Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp

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1010 1015

<210> 43

<211> 1020

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 43

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser

20 25 30

Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser

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Leu Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys

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Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg

65 70 75 80

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg

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180 185 190

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

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Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

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Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro

565 570 575

Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly

580 585 590

Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro

595 600 605

Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr

610 615 620

Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly

625 630 635 640

Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln

645 650 655

Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln

660 665 670

Ala Leu Pro Pro Arg Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala

675 680 685

Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu

690 695 700

Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro

705 710 715 720

Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu

725 730 735

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740 745 750

Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu

755 760 765

Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val

770 775 780

Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser

785 790 795 800

Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr Val Asn Val Glu Gly Ser Gly

805 810 815

Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly

820 825 830

Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu

835 840 845

Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp

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Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser

885 890 895

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900 905 910

His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys

915 920 925

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Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg

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Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val

965 970 975

Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly Gly Trp Lys Val Ser Ala Val

980 985 990

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<210> 44

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 44

gacattgtga tgactcagac accactgagc tccccagtga ctctgggaca gccagccagt 60

atctcatgca gatctagtca gtcactggtc tacagcgacg gcaacaccta tctgagctgg 120

ctgcagcagc gaccaggaca gccacctaga ctgctgatct acaagatttc caataggttc 180

tctggagtgc ccgaccgctt tagcggatcc ggagctggaa ctgatttcac cctgaaaatc 240

tcccgcgtgg aggctgaaga tgtgggcgtc tactattgcg tccaggcaac ccagttccct 300

ctgacatttg gcgggggaac taaggtggag atcaagggag gaggaggatc tggaggagga 360

ggaagtggag gaggaggatc cgaagtgcag ctggtccagt ctggggccga ggtgaagaaa 420

cctggagaaa gtctgaagat ctcatgtaaa ggctccgggt actctttcac aagttattgg 480

attggctggg tccgacagat gccaggaaag ggcctggagt ggatgggaat catctacccc 540

ggcgacagcg atacccggta ttctcctagt tttcagggcc aggtgacaat cagcgcagac 600

aagtccatta ccacagccta tctgcagtgg tcaagcctga aagcctctga taccgctatg 660

tactattgtg ccaggcaccc tagctacggg tcaggaagcc caaactttga ctattggggc 720

caggggacac tggtgactgt ctcctctgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca 780

cctcctgtgg caggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg 840

atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag 900

gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 960

gaggagcagt accagagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 1020

tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc 1080

gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgcca 1140

ccatcacgag atgagctgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 1200

tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 1260

accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg 1320

gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 1380

cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccct tttgggtgct ggtggtggtt 1440

ggtggagtcc tggcttgcta tagcttgcta gtaacagtgg cctttattat tttctgggtg 1500

aggagtaaga ggagcagggg aggtcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 1560

gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 1620

tccaaacggg gcagaaagaa actcctgtat atattcaaac aaccatttat gagaccagta 1680

caaactactc aagaggaaga tggctgtagc tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga 1740

tgtgaactga gagtgaagtt cagcaggagc gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag 1800

aaccagctct ataacgagct caatctagga cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag 1860

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ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa 1980

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<210> 45

<211> 1959

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 45

gacattgtga tgactcagac accactgagc tccccagtga ctctgggaca gccagccagt 60

atctcatgca gatctagtca gtcactggtc tacagcgacg gcaacaccta tctgagctgg 120

ctgcagcagc gaccaggaca gccacctaga ctgctgatct acaagatttc caataggttc 180

tctggagtgc ccgaccgctt tagcggatcc ggagctggaa ctgatttcac cctgaaaatc 240

tcccgcgtgg aggctgaaga tgtgggcgtc tactattgcg tccaggcaac ccagttccct 300

ctgacatttg gcgggggaac taaggtggag atcaagggag gaggaggatc tggaggagga 360

ggaagtggag gaggaggatc cgaagtgcag ctggtccagt ctggggccga ggtgaagaaa 420

cctggagaaa gtctgaagat ctcatgtaaa ggctccgggt actctttcac aagttattgg 480

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caggggacac tggtgactgt ctcctctgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca 780

cctcctgtgg caggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg 840

atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag 900

gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 960

gaggagcagt accagagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 1020

tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc 1080

gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgcca 1140

ccatcacgag atgagctgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 1200

tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 1260

accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg 1320

gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 1380

cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccct tttgggtgct ggtggtggtt 1440

ggtggagtcc tggcttgcta tagcttgcta gtaacagtgg cctttattat tttctgggtg 1500

aggagtaaga ggagcagggg aggtcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 1560

gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 1620

tccagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 1680

ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 1740

ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 1800

aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 1860

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<210> 46

<211> 1962

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 46

gacattgtga tgactcagac accactgagc tccccagtga ctctgggaca gccagccagt 60

atctcatgca gatctagtca gtcactggtc tacagcgacg gcaacaccta tctgagctgg 120

ctgcagcagc gaccaggaca gccacctaga ctgctgatct acaagatttc caataggttc 180

tctggagtgc ccgaccgctt tagcggatcc ggagctggaa ctgatttcac cctgaaaatc 240

tcccgcgtgg aggctgaaga tgtgggcgtc tactattgcg tccaggcaac ccagttccct 300

ctgacatttg gcgggggaac taaggtggag atcaagggag gaggaggatc tggaggagga 360

ggaagtggag gaggaggatc cgaagtgcag ctggtccagt ctggggccga ggtgaagaaa 420

cctggagaaa gtctgaagat ctcatgtaaa ggctccgggt actctttcac aagttattgg 480

attggctggg tccgacagat gccaggaaag ggcctggagt ggatgggaat catctacccc 540

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aagtccatta ccacagccta tctgcagtgg tcaagcctga aagcctctga taccgctatg 660

tactattgtg ccaggcaccc tagctacggg tcaggaagcc caaactttga ctattggggc 720

caggggacac tggtgactgt ctcctctgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca 780

cctcctgtgg caggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg 840

atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag 900

gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 960

gaggagcagt accagagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 1020

tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc 1080

gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgcca 1140

ccatcacgag atgagctgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 1200

tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 1260

accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg 1320

gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 1380

cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccct tttgggtgct ggtggtggtt 1440

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aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 1560

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cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 1740

cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg 1800

tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc 1860

gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag 1920

gacacctacg acgcccttca catgcaggcc ctgccccctc gc 1962

<210> 47

<211> 1836

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 47

gacattgtga tgactcagac accactgagc tccccagtga ctctgggaca gccagccagt 60

atctcatgca gatctagtca gtcactggtc tacagcgacg gcaacaccta tctgagctgg 120

ctgcagcagc gaccaggaca gccacctaga ctgctgatct acaagatttc caataggttc 180

tctggagtgc ccgaccgctt tagcggatcc ggagctggaa ctgatttcac cctgaaaatc 240

tcccgcgtgg aggctgaaga tgtgggcgtc tactattgcg tccaggcaac ccagttccct 300

ctgacatttg gcgggggaac taaggtggag atcaagggag gaggaggatc tggaggagga 360

ggaagtggag gaggaggatc cgaagtgcag ctggtccagt ctggggccga ggtgaagaaa 420

cctggagaaa gtctgaagat ctcatgtaaa ggctccgggt actctttcac aagttattgg 480

attggctggg tccgacagat gccaggaaag ggcctggagt ggatgggaat catctacccc 540

ggcgacagcg atacccggta ttctcctagt tttcagggcc aggtgacaat cagcgcagac 600

aagtccatta ccacagccta tctgcagtgg tcaagcctga aagcctctga taccgctatg 660

tactattgtg ccaggcaccc tagctacggg tcaggaagcc caaactttga ctattggggc 720

caggggacac tggtgactgt ctcctctgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca 780

cctcctgtgg caggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg 840

atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag 900

gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 960

gaggagcagt accagagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 1020

tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc 1080

gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgcca 1140

ccatcacgag atgagctgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 1200

tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 1260

accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg 1320

gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 1380

cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccct tttgggtgct ggtggtggtt 1440

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tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 1620

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gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 1740

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<210> 48

<211> 2100

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 48

gacattgtgc tgacccaatc tccagctatc ctgtctgcat ctccagggga gaaggtcaca 60

atgacttgca gggccagctc aagtgtaaat tacatggact ggtaccagaa gaagccagga 120

tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180

ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 240

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gatacttcct acaatcagaa gttcaaaggc aaggccacat tgactgcaga caaatcctcc 600

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gcaagatcta attattacgg tagtagctac tggttcttcg atgtctgggg cgcagggacc 720

acggtcaccg tctcctcact cgacgaatct aagtacggac cgccctgccc cccttgccct 780

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agcatcgaaa agaccatcag caaggccaag ggccagcctc gcgagcccca ggtgtacacc 1140

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tacaagacca cccctcccgt gctggacagc gacggcagct tcttcctgta cagccggctg 1320

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gtgctggtgg tggtgggcgg ggtgctggcc tgctacagcc tgctggtgac agtggccttc 1500

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acccccagac ggcctggccc cacccggaag cactaccagc cctacgcccc acccagggac 1620

tttgccgcct acagaagcaa acggggcaga aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca 1680

tttatgagac cagtacaaac tactcaagag gaagatggct gtagctgccg atttccagaa 1740

gaagaagaag gaggatgtga actgcgggtg aagttcagca gaagcgccga cgcccctgcc 1800

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ctgtccaccg ccaccaagga tacctacgac gccctgcaca tgcaggccct gcccccaagg 2100

<210> 49

<211> 1974

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 49

gacattgtgc tgacccaatc tccagctatc ctgtctgcat ctccagggga gaaggtcaca 60

atgacttgca gggccagctc aagtgtaaat tacatggact ggtaccagaa gaagccagga 120

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gcccccgagt tcctgggcgg acccagcgtg ttcctgttcc cccccaagcc caaggacacc 840

ctgatgatca gccggacccc cgaggtgacc tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagat 900

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tacaagacca cccctcccgt gctggacagc gacggcagct tcttcctgta cagccggctg 1320

accgtggaca agagccggtg gcaggaaggc aacgtcttta gctgcagcgt gatgcacgag 1380

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gtgctggtgg tggtgggcgg ggtgctggcc tgctacagcc tgctggtgac agtggccttc 1500

atcatctttt gggtgcggag caagcggagc agaggcggcc acagcgacta catgaacatg 1560

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<210> 50

<211> 2094

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 50

gacattgttc tctcccagtc tccagcaatc ctttctgcat ctccagggga gaaggtcaca 60

atgacttgca gggccagctc aagtttaagt ttcatgcact ggtaccagca gaagccagga 120

tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180

ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 240

gatgctgcca cttatttctg ccatcagtgg agtagtaacc cgctcacgtt cggtgctggg 300

accaagctgg agctgaaggg cagtactagc ggtggtggct ccgggggcgg ttccggtggg 360

ggcggcagca gccaggtgca actgcggcag cctggggctg agctggtgaa gcctggggcc 420

tcagtgaaga tgtcctgcaa ggcttctggc tacacattta ccagttacaa tatgcactgg 480

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gatacttcct acaatcagaa gttcaaaggc aaggccacat tgactgcaga caaatcctcc 600

agcacagcct acatgcagct cagcagtctg acatctgagg actctgcggt ctattactgt 660

gcaagatcgc actacggtag taactacgta gactactttg actactgggg ccaaggcacc 720

actctcacag tctcctcact cgaccccaaa tcttctgaca aaactcacac atgcccaccg 780

tgcccagcac ctcctgtggc aggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 840

accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 900

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<210> 51

<211> 1968

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 51

gacattgttc tctcccagtc tccagcaatc ctttctgcat ctccagggga gaaggtcaca 60

atgacttgca gggccagctc aagtttaagt ttcatgcact ggtaccagca gaagccagga 120

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gatgctgcca cttatttctg ccatcagtgg agtagtaacc cgctcacgtt cggtgctggg 300

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gatacttcct acaatcagaa gttcaaaggc aaggccacat tgactgcaga caaatcctcc 600

agcacagcct acatgcagct cagcagtctg acatctgagg actctgcggt ctattactgt 660

gcaagatcgc actacggtag taactacgta gactactttg actactgggg ccaaggcacc 720

actctcacag tctcctcact cgaccccaaa tcttctgaca aaactcacac atgcccaccg 780

tgcccagcac ctcctgtggc aggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 840

accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 900

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caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 1080

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ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 1380

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<210> 52

<211> 1971

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 52

gacattgttc tctcccagtc tccagcaatc ctttctgcat ctccagggga gaaggtcaca 60

atgacttgca gggccagctc aagtttaagt ttcatgcact ggtaccagca gaagccagga 120

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accaagctgg agctgaaggg cagtactagc ggtggtggct ccgggggcgg ttccggtggg 360

ggcggcagca gccaggtgca actgcggcag cctggggctg agctggtgaa gcctggggcc 420

tcagtgaaga tgtcctgcaa ggcttctggc tacacattta ccagttacaa tatgcactgg 480

gtaaagcaga cacctggaca gggcctggaa tggattggag ctatttatcc aggaaatggt 540

gatacttcct acaatcagaa gttcaaaggc aaggccacat tgactgcaga caaatcctcc 600

agcacagcct acatgcagct cagcagtctg acatctgagg actctgcggt ctattactgt 660

gcaagatcgc actacggtag taactacgta gactactttg actactgggg ccaaggcacc 720

actctcacag tctcctcact cgaccccaaa tcttctgaca aaactcacac atgcccaccg 780

tgcccagcac ctcctgtggc aggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 840

accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 900

gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 960

aagccgcggg aggagcagta ccagagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 1020

caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 1080

gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 1140

accctgccac catcacgaga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 1200

aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 1260

aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 1320

ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 1380

gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccctt ttgggtgctg 1440

gtggtggttg gtggagtcct ggcttgctat agcttgctag taacagtggc ctttattatt 1500

ttctgggtga aacggggcag aaagaaactc ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga 1560

ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa 1620

ggaggatgtg aactgagagt gaagttcagc aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag 1680

ggccagaacc agctctataa cgagctcaat ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg 1740

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gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat aagatggcgg aggcctacag tgagattggg 1860

atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca 1920

gccaccaagg acacctacga cgcccttcac atgcaggccc tgccccctcg c 1971

<210> 53

<211> 3180

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 53

atgctgctgc tggtcacctc actgctgctg tgcgaactgc cccaccccgc cttcctgctg 60

attcccgaca ttgtgatgac tcagacacca ctgagctccc cagtgactct gggacagcca 120

gccagtatct catgcagatc tagtcagtca ctggtctaca gcgacggcaa cacctatctg 180

agctggctgc agcagcgacc aggacagcca cctagactgc tgatctacaa gatttccaat 240

aggttctctg gagtgcccga ccgctttagc ggatccggag ctggaactga tttcaccctg 300

aaaatctccc gcgtggaggc tgaagatgtg ggcgtctact attgcgtcca ggcaacccag 360

ttccctctga catttggcgg gggaactaag gtggagatca agggaggagg aggatctgga 420

ggaggaggaa gtggaggagg aggatccgaa gtgcagctgg tccagtctgg ggccgaggtg 480

aagaaacctg gagaaagtct gaagatctca tgtaaaggct ccgggtactc tttcacaagt 540

tattggattg gctgggtccg acagatgcca ggaaagggcc tggagtggat gggaatcatc 600

taccccggcg acagcgatac ccggtattct cctagttttc agggccaggt gacaatcagc 660

gcagacaagt ccattaccac agcctatctg cagtggtcaa gcctgaaagc ctctgatacc 720

gctatgtact attgtgccag gcaccctagc tacgggtcag gaagcccaaa ctttgactat 780

tggggccagg ggacactggt gactgtctcc tctgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 840

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cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 1200

ctgccaccat cacgagatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 1260

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gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctcccttttg ggtgctggtg 1500

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<210> 54

<211> 3054

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 54

atgctgctgc tggtcacctc actgctgctg tgcgaactgc cccaccccgc cttcctgctg 60

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aaaatctccc gcgtggaggc tgaagatgtg ggcgtctact attgcgtcca ggcaacccag 360

ttccctctga catttggcgg gggaactaag gtggagatca agggaggagg aggatctgga 420

ggaggaggaa gtggaggagg aggatccgaa gtgcagctgg tccagtctgg ggccgaggtg 480

aagaaacctg gagaaagtct gaagatctca tgtaaaggct ccgggtactc tttcacaagt 540

tattggattg gctgggtccg acagatgcca ggaaagggcc tggagtggat gggaatcatc 600

taccccggcg acagcgatac ccggtattct cctagttttc agggccaggt gacaatcagc 660

gcagacaagt ccattaccac agcctatctg cagtggtcaa gcctgaaagc ctctgatacc 720

gctatgtact attgtgccag gcaccctagc tacgggtcag gaagcccaaa ctttgactat 780

tggggccagg ggacactggt gactgtctcc tctgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 840

ccagcacctc ctgtggcagg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 900

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atctgggagg gagagcctcc gtgtgtccca ccgagggaca gcctgaacca gagcctcagc 2640

caggacctca ccatggcccc tggctccaca ctctggctgt cctgtggggt accccctgac 2700

tctgtgtcca ggggccccct ctcctggacc catgtgcacc ccaaggggcc taagtcattg 2760

ctgagcctag agctgaagga cgatcgcccg gccagagata tgtgggtaat ggagacgggt 2820

ctgttgttgc cccgggccac agctcaagac gctggaaagt attattgtca ccgtggcaac 2880

ctgaccatgt cattccacct ggagatcact gctcggccag tactatggca ctggctgctg 2940

aggactggtg gctggaaggt ctcagctgtg actttggctt atctgatctt ctgcctgtgt 3000

tcccttgtgg gcattcttca tcttcaaaga gccctggtcc tgaggaggaa aaga 3054

<210> 55

<211> 3057

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 55

atgctgctgc tggtcacctc actgctgctg tgcgaactgc cccaccccgc cttcctgctg 60

attcccgaca ttgtgatgac tcagacacca ctgagctccc cagtgactct gggacagcca 120

gccagtatct catgcagatc tagtcagtca ctggtctaca gcgacggcaa cacctatctg 180

agctggctgc agcagcgacc aggacagcca cctagactgc tgatctacaa gatttccaat 240

aggttctctg gagtgcccga ccgctttagc ggatccggag ctggaactga tttcaccctg 300

aaaatctccc gcgtggaggc tgaagatgtg ggcgtctact attgcgtcca ggcaacccag 360

ttccctctga catttggcgg gggaactaag gtggagatca agggaggagg aggatctgga 420

ggaggaggaa gtggaggagg aggatccgaa gtgcagctgg tccagtctgg ggccgaggtg 480

aagaaacctg gagaaagtct gaagatctca tgtaaaggct ccgggtactc tttcacaagt 540

tattggattg gctgggtccg acagatgcca ggaaagggcc tggagtggat gggaatcatc 600

taccccggcg acagcgatac ccggtattct cctagttttc agggccaggt gacaatcagc 660

gcagacaagt ccattaccac agcctatctg cagtggtcaa gcctgaaagc ctctgatacc 720

gctatgtact attgtgccag gcaccctagc tacgggtcag gaagcccaaa ctttgactat 780

tggggccagg ggacactggt gactgtctcc tctgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 840

ccagcacctc ctgtggcagg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 900

ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 960

cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 1020

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caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 1140

cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 1200

ctgccaccat cacgagatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 1260

ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 1320

tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 1380

accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1440

gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctcccttttg ggtgctggtg 1500

gtggttggtg gagtcctggc ttgctatagc ttgctagtaa cagtggcctt tattattttc 1560

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ggccccactc agcagctgac ctggtctcgg gagtccccgc ttaaaccctt cttaaaactc 2280

agcctggggc tgccaggcct gggaatccac atgaggcccc tggccatctg gcttttcatc 2340

ttcaacgtct ctcaacagat ggggggcttc tacctgtgcc agccggggcc cccctctgag 2400

aaggcctggc agcctggctg gacagtcaat gtggagggca gcggggagct gttccggtgg 2460

aatgtttcgg acctaggtgg cctgggctgt ggcctgaaga acaggtcctc agagggcccc 2520

agctcccctt ccgggaagct catgagcccc aagctgtatg tgtgggccaa agaccgccct 2580

gagatctggg agggagagcc tccgtgtgtc ccaccgaggg acagcctgaa ccagagcctc 2640

agccaggacc tcaccatggc ccctggctcc acactctggc tgtcctgtgg ggtaccccct 2700

gactctgtgt ccaggggccc cctctcctgg acccatgtgc accccaaggg gcctaagtca 2760

ttgctgagcc tagagctgaa ggacgatcgc cctgccagag atatgtgggt aatggagacg 2820

ggtctgttgt tgccccgggc cacagctcaa gacgctggaa agtattattg tcaccgtggc 2880

aacctgacca tgtcattcca cctggagatc actgctcggc cagtactatg gcactggctg 2940

ctgaggactg gtggctggaa ggtctcagct gtgactttgg cttatctgat cttctgcctg 3000

tgttcccttg tgggcattct tcatcttcaa agagccctgg tcctgaggag gaaaaga 3057

<210> 56

<211> 2931

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 56

atgctgctgc tggtcacctc actgctgctg tgcgaactgc cccaccccgc cttcctgctg 60

attcccgaca ttgtgatgac tcagacacca ctgagctccc cagtgactct gggacagcca 120

gccagtatct catgcagatc tagtcagtca ctggtctaca gcgacggcaa cacctatctg 180

agctggctgc agcagcgacc aggacagcca cctagactgc tgatctacaa gatttccaat 240

aggttctctg gagtgcccga ccgctttagc ggatccggag ctggaactga tttcaccctg 300

aaaatctccc gcgtggaggc tgaagatgtg ggcgtctact attgcgtcca ggcaacccag 360

ttccctctga catttggcgg gggaactaag gtggagatca agggaggagg aggatctgga 420

ggaggaggaa gtggaggagg aggatccgaa gtgcagctgg tccagtctgg ggccgaggtg 480

aagaaacctg gagaaagtct gaagatctca tgtaaaggct ccgggtactc tttcacaagt 540

tattggattg gctgggtccg acagatgcca ggaaagggcc tggagtggat gggaatcatc 600

taccccggcg acagcgatac ccggtattct cctagttttc agggccaggt gacaatcagc 660

gcagacaagt ccattaccac agcctatctg cagtggtcaa gcctgaaagc ctctgatacc 720

gctatgtact attgtgccag gcaccctagc tacgggtcag gaagcccaaa ctttgactat 780

tggggccagg ggacactggt gactgtctcc tctgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 840

ccagcacctc ctgtggcagg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 900

ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 960

cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 1020

ccgcgggagg agcagtacca gagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 1080

caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 1140

cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 1200

ctgccaccat cacgagatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 1260

ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 1320

tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 1380

accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1440

gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctcccttttg ggtgctggtg 1500

gtggttggtg gagtcctggc ttgctatagc ttgctagtaa cagtggcctt tattattttc 1560

tgggtgagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac 1620

cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 1680

cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg 1740

tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc 1800

gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag 1860

gacacctacg acgcccttca catgcaggcc ctgccccctc gccagtgtac taattatgct 1920

ctcttgaaat tggctggaga tgttgagagc aaccccgggc cgatgccacc tcctcgcctc 1980

ctcttcttcc tcctcttcct cacccccatg gaagtcaggc ccgaggaacc tctagtggtg 2040

aaggtggaag agggagataa cgctgtgctg cagtgcctca aggggacctc agatggcccc 2100

actcagcagc tgacctggtc tcgggagtcc ccgcttaaac ccttcttaaa actcagcctg 2160

gggctgccag gcctgggaat ccacatgagg cccctggcca tctggctttt catcttcaac 2220

gtctctcaac agatgggggg cttctacctg tgccagccgg ggcccccctc tgagaaggcc 2280

tggcagcctg gctggacagt caatgtggag ggcagcgggg agctgttccg gtggaatgtt 2340

tcggacctag gtggcctggg ctgtggcctg aagaacaggt cctcagaggg ccccagctcc 2400

ccttccggga agctcatgag ccccaagctg tatgtgtggg ccaaagaccg ccctgagatc 2460

tgggagggag agcctccgtg tgtcccaccg agggacagcc tgaaccagag cctcagccag 2520

gacctcacca tggcccctgg ctccacactc tggctgtcct gtggggtacc ccctgactct 2580

gtgtccaggg gccccctctc ctggacccat gtgcacccca aggggcctaa gtcattgctg 2640

agcctagagc tgaaggacga tcgccctgcc agagatatgt gggtaatgga gacgggtctg 2700

ttgttgcccc gggccacagc tcaagacgct ggaaagtatt attgtcaccg tggcaacctg 2760

accatgtcat tccacctgga gatcactgct cggccagtac tatggcactg gctgctgagg 2820

actggtggct ggaaggtctc agctgtgact ttggcttatc tgatcttctg cctgtgttcc 2880

cttgtgggca ttcttcatct tcaaagagcc ctggtcctga ggaggaaaag a 2931

<210> 57

<211> 3306

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 57

atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ttccacaggt 60

gacattgtgc tgacccaatc tccagctatc ctgtctgcat ctccagggga gaaggtcaca 120

atgacttgca gggccagctc aagtgtaaat tacatggact ggtaccagaa gaagccagga 180

tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 240

ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 300

gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agttttaatc cacccacgtt cggagggggg 360

accaagctgg aaataaaagg cagtactagc ggtggtggct ccgggggcgg ttccggtggg 420

ggcggcagca gcgaggtgca gctgcagcag tctggggctg agctggtgaa gcctggggcc 480

tcagtgaaga tgtcctgcaa ggcttctggc tacacattta ccagttacaa tatgcactgg 540

gtaaagcaga cacctggaca gggcctggaa tggattggag ctatttatcc aggaaatggt 600

gatacttcct acaatcagaa gttcaaaggc aaggccacat tgactgcaga caaatcctcc 660

agcacagcct acatgcagct cagcagcctg acatctgagg actctgcgga ctattactgt 720

gcaagatcta attattacgg tagtagctac tggttcttcg atgtctgggg cgcagggacc 780

acggtcaccg tctcctcact cgacgaatct aagtacggac cgccctgccc cccttgccct 840

gcccccgagt tcctgggcgg acccagcgtg ttcctgttcc cccccaagcc caaggacacc 900

ctgatgatca gccggacccc cgaggtgacc tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagat 960

cccgaggtcc agttcaattg gtacgtggac ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag 1020

cccagagagg aacagttcaa cagcacctac cgggtggtgt ctgtgctgac cgtgctgcac 1080

caggactggc tgaacggcaa agaatacaag tgcaaggtgt ccaacaaggg cctgcccagc 1140

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accgtggaca agagccggtg gcaggaaggc aacgtcttta gctgcagcgt gatgcacgag 1440

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atcatctttt gggtgcggag caagcggagc agaggcggcc acagcgacta catgaacatg 1620

acccccagac ggcctggccc cacccggaag cactaccagc cctacgcccc acccagggac 1680

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tttatgagac cagtacaaac tactcaagag gaagatggct gtagctgccg atttccagaa 1800

gaagaagaag gaggatgtga actgcgggtg aagttcagca gaagcgccga cgcccctgcc 1860

taccagcagg gccagaatca gctgtacaac gagctgaacc tgggcagaag ggaagagtac 1920

gacgtcctgg ataagcggag aggccgggac cctgagatgg gcggcaagcc tcggcggaag 1980

aacccccagg aaggcctgta taacgaactg cagaaagaca agatggccga ggcctacagc 2040

gagatcggca tgaagggcga gcggaggcgg ggcaagggcc acgacggcct gtatcagggc 2100

ctgtccaccg ccaccaagga tacctacgac gccctgcaca tgcaggccct gcccccaagg 2160

ctcgagggcg gcggagaggg cagaggaagt cttctaacat gcggtgacgt ggaggagaat 2220

cccggcccta ggatgcttct cctggtgaca agccttctgc tctgtgagtt accacaccca 2280

gcattcctcc tgatcccacg caaagtgtgt aacggaatag gtattggtga atttaaagac 2340

tcactctcca taaatgctac gaatattaaa cacttcaaaa actgcacctc catcagtggc 2400

gatctccaca tcctgccggt ggcatttagg ggtgactcct tcacacatac tcctcctctg 2460

gatccacagg aactggatat tctgaaaacc gtaaaggaaa tcacagggtt tttgctgatt 2520

caggcttggc ctgaaaacag gacggacctc catgcctttg agaacctaga aatcatacgc 2580

ggcaggacca agcaacatgg tcagttttct cttgcagtcg tcagcctgaa cataacatcc 2640

ttgggattac gctccctcaa ggagataagt gatggagatg tgataatttc aggaaacaaa 2700

aatttgtgct atgcaaatac aataaactgg aaaaaactgt ttgggacctc cggtcagaaa 2760

accaaaatta taagcaacag aggtgaaaac agctgcaagg ccacaggcca ggtctgccat 2820

gccttgtgct cccccgaggg ctgctggggc ccggagccca gggactgcgt ctcttgccgg 2880

aatgtcagcc gaggcaggga atgcgtggac aagtgcaacc ttctggaggg tgagccaagg 2940

gagtttgtgg agaactctga gtgcatacag tgccacccag agtgcctgcc tcaggccatg 3000

aacatcacct gcacaggacg gggaccagac aactgtatcc agtgtgccca ctacattgac 3060

ggcccccact gcgtcaagac ctgcccggca ggagtcatgg gagaaaacaa caccctggtc 3120

tggaagtacg cagacgccgg ccatgtgtgc cacctgtgcc atccaaactg cacctacgga 3180

tgcactgggc caggtcttga aggctgtcca acgaatgggc ctaagatccc gtccatcgcc 3240

actgggatgg tgggggccct cctcttgctg ctggtggtgg ccctggggat cggcctcttc 3300

atgtga 3306

<210> 58

<211> 2034

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 58

atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ttccacaggt 60

gacattgtgc tgacccaatc tccagctatc ctgtctgcat ctccagggga gaaggtcaca 120

atgacttgca gggccagctc aagtgtaaat tacatggact ggtaccagaa gaagccagga 180

tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 240

ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 300

gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agttttaatc cacccacgtt cggagggggg 360

accaagctgg aaataaaagg cagtactagc ggtggtggct ccgggggcgg ttccggtggg 420

ggcggcagca gcgaggtgca gctgcagcag tctggggctg agctggtgaa gcctggggcc 480

tcagtgaaga tgtcctgcaa ggcttctggc tacacattta ccagttacaa tatgcactgg 540

gtaaagcaga cacctggaca gggcctggaa tggattggag ctatttatcc aggaaatggt 600

gatacttcct acaatcagaa gttcaaaggc aaggccacat tgactgcaga caaatcctcc 660

agcacagcct acatgcagct cagcagcctg acatctgagg actctgcgga ctattactgt 720

gcaagatcta attattacgg tagtagctac tggttcttcg atgtctgggg cgcagggacc 780

acggtcaccg tctcctcact cgacgaatct aagtacggac cgccctgccc cccttgccct 840

gcccccgagt tcctgggcgg acccagcgtg ttcctgttcc cccccaagcc caaggacacc 900

ctgatgatca gccggacccc cgaggtgacc tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagat 960

cccgaggtcc agttcaattg gtacgtggac ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag 1020

cccagagagg aacagttcaa cagcacctac cgggtggtgt ctgtgctgac cgtgctgcac 1080

caggactggc tgaacggcaa agaatacaag tgcaaggtgt ccaacaaggg cctgcccagc 1140

agcatcgaaa agaccatcag caaggccaag ggccagcctc gcgagcccca ggtgtacacc 1200

ctgcctccct cccaggaaga gatgaccaag aaccaggtgt ccctgacctg cctggtgaag 1260

ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca acggccagcc tgagaacaac 1320

tacaagacca cccctcccgt gctggacagc gacggcagct tcttcctgta cagccggctg 1380

accgtggaca agagccggtg gcaggaaggc aacgtcttta gctgcagcgt gatgcacgag 1440

gccctgcaca accactacac ccagaagagc ctgagcctgt ccctgggcaa gatgttctgg 1500

gtgctggtgg tggtgggcgg ggtgctggcc tgctacagcc tgctggtgac agtggccttc 1560

atcatctttt gggtgcggag caagcggagc agaggcggcc acagcgacta catgaacatg 1620

acccccagac ggcctggccc cacccggaag cactaccagc cctacgcccc acccagggac 1680

tttgccgcct acagaagccg ggtgaagttc agcagaagcg ccgacgcccc tgcctaccag 1740

cagggccaga atcagctgta caacgagctg aacctgggca gaagggaaga gtacgacgtc 1800

ctggataagc ggagaggccg ggaccctgag atgggcggca agcctcggcg gaagaacccc 1860

caggaaggcc tgtataacga actgcagaaa gacaagatgg ccgaggccta cagcgagatc 1920

ggcatgaagg gcgagcggag gcggggcaag ggccacgacg gcctgtatca gggcctgtcc 1980

accgccacca aggataccta cgacgccctg cacatgcagg ccctgccccc aagg 2034

<210> 59

<211> 3183

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 59

atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ttccacaggt 60

gacattgttc tctcccagtc tccagcaatc ctttctgcat ctccagggga gaaggtcaca 120

atgacttgca gggccagctc aagtttaagt ttcatgcact ggtaccagca gaagccagga 180

tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 240

ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 300

gatgctgcca cttatttctg ccatcagtgg agtagtaacc cgctcacgtt cggtgctggg 360

accaagctgg agctgaaggg cagtactagc ggtggtggct ccgggggcgg ttccggtggg 420

ggcggcagca gccaggtgca actgcggcag cctggggctg agctggtgaa gcctggggcc 480

tcagtgaaga tgtcctgcaa ggcttctggc tacacattta ccagttacaa tatgcactgg 540

gtaaagcaga cacctggaca gggcctggaa tggattggag ctatttatcc aggaaatggt 600

gatacttcct acaatcagaa gttcaaaggc aaggccacat tgactgcaga caaatcctcc 660

agcacagcct acatgcagct cagcagtctg acatctgagg actctgcggt ctattactgt 720

gcaagatcgc actacggtag taactacgta gactactttg actactgggg ccaaggcacc 780

actctcacag tctcctcact cgaccccaaa tcttctgaca aaactcacac atgcccaccg 840

tgcccagcac ctcctgtggc aggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 900

accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 960

gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 1020

aagccgcggg aggagcagta ccagagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 1080

caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 1140

gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 1200

accctgccac catcacgaga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 1260

aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 1320

aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 1380

ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 1440

gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccctt ttgggtgctg 1500

gtggtggttg gtggagtcct ggcttgctat agcttgctag taacagtggc ctttattatt 1560

ttctgggtga ggagtaagag gagcagggga ggtcacagtg actacatgaa catgactccc 1620

cgccgccccg ggcccacccg caagcattac cagccctatg ccccaccacg cgacttcgca 1680

gcctatcgct ccaaacgggg cagaaagaaa ctcctgtata tattcaaaca accatttatg 1740

agaccagtac aaactactca agaggaagat ggctgtagct gccgatttcc agaagaagaa 1800

gaaggaggat gtgaactgag agtgaagttc agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag 1860

cagggccaga accagctcta taacgagctc aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt 1920

ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag atggggggaa agccgagaag gaagaaccct 1980

caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa gataagatgg cggaggccta cagtgagatt 2040

gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt 2100

acagccacca aggacaccta cgacgccctt cacatgcagg ccctgccccc tcgccagtgt 2160

actaattatg ctctcttgaa attggctgga gatgttgaga gcaaccccgg gccgatgcca 2220

cctcctcgcc tcctcttctt cctcctcttc ctcaccccca tggaagtcag gcccgaggaa 2280

cctctagtgg tgaaggtgga agagggagat aacgctgtgc tgcagtgcct caaggggacc 2340

tcagatggcc ccactcagca gctgacctgg tctcgggagt ccccgcttaa acccttctta 2400

aaactcagcc tggggctgcc aggcctggga atccacatga ggcccctggc catctggctt 2460

ttcatcttca acgtctctca acagatgggg ggcttctacc tgtgccagcc ggggcccccc 2520

tctgagaagg cctggcagcc tggctggaca gtcaatgtgg agggcagcgg ggagctgttc 2580

cggtggaatg tttcggacct aggtggcctg ggctgtggcc tgaagaacag gtcctcagag 2640

ggccccagct ccccttccgg gaagctcatg agccccaagc tgtatgtgtg ggccaaagac 2700

cgccctgaga tctgggaggg agagcctccg tgtgtcccac cgagggacag cctgaaccag 2760

agcctcagcc aggacctcac catggcccct ggctccacac tctggctgtc ctgtggggta 2820

ccccctgact ctgtgtccag gggccccctc tcctggaccc atgtgcaccc caaggggcct 2880

aagtcattgc tgagcctaga gctgaaggac gatcgcccgg ccagagatat gtgggtaatg 2940

gagacgggtc tgttgttgcc ccgggccaca gctcaagacg ctggaaagta ttattgtcac 3000

cgtggcaacc tgaccatgtc attccacctg gagatcactg ctcggccagt actatggcac 3060

tggctgctga ggactggtgg ctggaaggtc tcagctgtga ctttggctta tctgatcttc 3120

tgcctgtgtt cccttgtggg cattcttcat cttcaaagag ccctggtcct gaggaggaaa 3180

aga 3183

<210> 60

<211> 3057

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 60

atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ttccacaggt 60

gacattgttc tctcccagtc tccagcaatc ctttctgcat ctccagggga gaaggtcaca 120

atgacttgca gggccagctc aagtttaagt ttcatgcact ggtaccagca gaagccagga 180

tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 240

ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 300

gatgctgcca cttatttctg ccatcagtgg agtagtaacc cgctcacgtt cggtgctggg 360

accaagctgg agctgaaggg cagtactagc ggtggtggct ccgggggcgg ttccggtggg 420

ggcggcagca gccaggtgca actgcggcag cctggggctg agctggtgaa gcctggggcc 480

tcagtgaaga tgtcctgcaa ggcttctggc tacacattta ccagttacaa tatgcactgg 540

gtaaagcaga cacctggaca gggcctggaa tggattggag ctatttatcc aggaaatggt 600

gatacttcct acaatcagaa gttcaaaggc aaggccacat tgactgcaga caaatcctcc 660

agcacagcct acatgcagct cagcagtctg acatctgagg actctgcggt ctattactgt 720

gcaagatcgc actacggtag taactacgta gactactttg actactgggg ccaaggcacc 780

actctcacag tctcctcact cgaccccaaa tcttctgaca aaactcacac atgcccaccg 840

tgcccagcac ctcctgtggc aggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 900

accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 960

gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 1020

aagccgcggg aggagcagta ccagagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 1080

caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 1140

gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 1200

accctgccac catcacgaga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 1260

aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 1320

aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 1380

ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 1440

gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccctt ttgggtgctg 1500

gtggtggttg gtggagtcct ggcttgctat agcttgctag taacagtggc ctttattatt 1560

ttctgggtga ggagtaagag gagcagggga ggtcacagtg actacatgaa catgactccc 1620

cgccgccccg ggcccacccg caagcattac cagccctatg ccccaccacg cgacttcgca 1680

gcctatcgct ccagagtgaa gttcagcagg agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc 1740

cagaaccagc tctataacga gctcaatcta ggacgaagag aggagtacga tgttttggac 1800

aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa 1860

ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag atggcggagg cctacagtga gattgggatg 1920

aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac gatggccttt accagggtct cagtacagcc 1980

accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg caggccctgc cccctcgcca gtgtactaat 2040

tatgctctct tgaaattggc tggagatgtt gagagcaacc ccgggccgat gccacctcct 2100

cgcctcctct tcttcctcct cttcctcacc cccatggaag tcaggcccga ggaacctcta 2160

gtggtgaagg tggaagaggg agataacgct gtgctgcagt gcctcaaggg gacctcagat 2220

ggccccactc agcagctgac ctggtctcgg gagtccccgc ttaaaccctt cttaaaactc 2280

agcctggggc tgccaggcct gggaatccac atgaggcccc tggccatctg gcttttcatc 2340

ttcaacgtct ctcaacagat ggggggcttc tacctgtgcc agccggggcc cccctctgag 2400

aaggcctggc agcctggctg gacagtcaat gtggagggca gcggggagct gttccggtgg 2460

aatgtttcgg acctaggtgg cctgggctgt ggcctgaaga acaggtcctc agagggcccc 2520

agctcccctt ccgggaagct catgagcccc aagctgtatg tgtgggccaa agaccgccct 2580

gagatctggg agggagagcc tccgtgtgtc ccaccgaggg acagcctgaa ccagagcctc 2640

agccaggacc tcaccatggc ccctggctcc acactctggc tgtcctgtgg ggtaccccct 2700

gactctgtgt ccaggggccc cctctcctgg acccatgtgc accccaaggg gcctaagtca 2760

ttgctgagcc tagagctgaa ggacgatcgc ccggccagag atatgtgggt aatggagacg 2820

ggtctgttgt tgccccgggc cacagctcaa gacgctggaa agtattattg tcaccgtggc 2880

aacctgacca tgtcattcca cctggagatc actgctcggc cagtactatg gcactggctg 2940

ctgaggactg gtggctggaa ggtctcagct gtgactttgg cttatctgat cttctgcctg 3000

tgttcccttg tgggcattct tcatcttcaa agagccctgg tcctgaggag gaaaaga 3057

<210> 61

<211> 3060

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 61

atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ttccacaggt 60

gacattgttc tctcccagtc tccagcaatc ctttctgcat ctccagggga gaaggtcaca 120

atgacttgca gggccagctc aagtttaagt ttcatgcact ggtaccagca gaagccagga 180

tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 240

ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 300

gatgctgcca cttatttctg ccatcagtgg agtagtaacc cgctcacgtt cggtgctggg 360

accaagctgg agctgaaggg cagtactagc ggtggtggct ccgggggcgg ttccggtggg 420

ggcggcagca gccaggtgca actgcggcag cctggggctg agctggtgaa gcctggggcc 480

tcagtgaaga tgtcctgcaa ggcttctggc tacacattta ccagttacaa tatgcactgg 540

gtaaagcaga cacctggaca gggcctggaa tggattggag ctatttatcc aggaaatggt 600

gatacttcct acaatcagaa gttcaaaggc aaggccacat tgactgcaga caaatcctcc 660

agcacagcct acatgcagct cagcagtctg acatctgagg actctgcggt ctattactgt 720

gcaagatcgc actacggtag taactacgta gactactttg actactgggg ccaaggcacc 780

actctcacag tctcctcact cgaccccaaa tcttctgaca aaactcacac atgcccaccg 840

tgcccagcac ctcctgtggc aggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 900

accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 960

gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 1020

aagccgcggg aggagcagta ccagagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 1080

caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 1140

gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 1200

accctgccac catcacgaga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 1260

aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 1320

aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 1380

ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 1440

gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccctt ttgggtgctg 1500

gtggtggttg gtggagtcct ggcttgctat agcttgctag taacagtggc ctttattatt 1560

ttctgggtga aacggggcag aaagaaactc ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga 1620

ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa 1680

ggaggatgtg aactgagagt gaagttcagc aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag 1740

ggccagaacc agctctataa cgagctcaat ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg 1800

gacaagagac gtggccggga ccctgagatg gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag 1860

gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat aagatggcgg aggcctacag tgagattggg 1920

atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca 1980

gccaccaagg acacctacga cgcccttcac atgcaggccc tgccccctcg ccagtgtact 2040

aattatgctc tcttgaaatt ggctggagat gttgagagca accccgggcc gatgccacct 2100

cctcgcctcc tcttcttcct cctcttcctc acccccatgg aagtcaggcc cgaggaacct 2160

ctagtggtga aggtggaaga gggagataac gctgtgctgc agtgcctcaa ggggacctca 2220

gatggcccca ctcagcagct gacctggtct cgggagtccc cgcttaaacc cttcttaaaa 2280

ctcagcctgg ggctgccagg cctgggaatc cacatgaggc ccctggccat ctggcttttc 2340

atcttcaacg tctctcaaca gatggggggc ttctacctgt gccagccggg gcccccctct 2400

gagaaggcct ggcagcctgg ctggacagtc aatgtggagg gcagcgggga gctgttccgg 2460

tggaatgttt cggacctagg tggcctgggc tgtggcctga agaacaggtc ctcagagggc 2520

cccagctccc cttccgggaa gctcatgagc cccaagctgt atgtgtgggc caaagaccgc 2580

cctgagatct gggagggaga gcctccgtgt gtcccaccga gggacagcct gaaccagagc 2640

ctcagccagg acctcaccat ggcccctggc tccacactct ggctgtcctg tggggtaccc 2700

cctgactctg tgtccagggg ccccctctcc tggacccatg tgcaccccaa ggggcctaag 2760

tcattgctga gcctagagct gaaggacgat cgcccggcca gagatatgtg ggtaatggag 2820

acgggtctgt tgttgccccg ggccacagct caagacgctg gaaagtatta ttgtcaccgt 2880

ggcaacctga ccatgtcatt ccacctggag atcactgctc ggccagtact atggcactgg 2940

ctgctgagga ctggtggctg gaaggtctca gctgtgactt tggcttatct gatcttctgc 3000

ctgtgttccc ttgtgggcat tcttcatctt caaagagccc tggtcctgag gaggaaaaga 3060

<210> 62

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 62

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

1 5

<210> 63

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 63

Trp Arg His Pro Gln Phe Gly Gly

1 5

<210> 64

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 64

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Ser Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser

20 25 30

Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Ala

85 90 95

Thr Gln Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

115 120 125

Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser

130 135 140

Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp

145 150 155 160

Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly

165 170 175

Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln

180 185 190

Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Thr Thr Ala Tyr Leu

195 200 205

Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

210 215 220

Arg His Pro Ser Tyr Gly Ser Gly Ser Pro Asn Phe Asp Tyr Trp Gly

225 230 235 240

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 65

<211> 252

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 65

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met

20 25 30

Asp Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Gly

100 105 110

Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Val Gln Leu

115 120 125

Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met

130 135 140

Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp

145 150 155 160

Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr

165 170 175

Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala

180 185 190

Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser

195 200 205

Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Asn

210 215 220

Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr

225 230 235 240

Thr Val Thr Val Ser Ser Leu Asp Glu Ser Lys Tyr

245 250

<210> 66

<211> 252

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 66

Asp Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Leu Ser Phe Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Ser Thr Ser Gly Gly

100 105 110

Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu

115 120 125

Arg Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met

130 135 140

Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp

145 150 155 160

Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr

165 170 175

Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala

180 185 190

Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser

195 200 205

Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser His

210 215 220

Tyr Gly Ser Asn Tyr Val Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

225 230 235 240

Thr Leu Thr Val Ser Ser Leu Asp Pro Lys Ser Ser

245 250

<210> 67

<211> 747

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 67

gacattgtga tgactcagac accactgagc tccccagtga ctctgggaca gccagccagt 60

atctcatgca gatctagtca gtcactggtc tacagcgacg gcaacaccta tctgagctgg 120

ctgcagcagc gaccaggaca gccacctaga ctgctgatct acaagatttc caataggttc 180

tctggagtgc ccgaccgctt tagcggatcc ggagctggaa ctgatttcac cctgaaaatc 240

tcccgcgtgg aggctgaaga tgtgggcgtc tactattgcg tccaggcaac ccagttccct 300

ctgacatttg gcgggggaac taaggtggag atcaagggag gaggaggatc tggaggagga 360

ggaagtggag gaggaggatc cgaagtgcag ctggtccagt ctggggccga ggtgaagaaa 420

cctggagaaa gtctgaagat ctcatgtaaa ggctccgggt actctttcac aagttattgg 480

attggctggg tccgacagat gccaggaaag ggcctggagt ggatgggaat catctacccc 540

ggcgacagcg atacccggta ttctcctagt tttcagggcc aggtgacaat cagcgcagac 600

aagtccatta ccacagccta tctgcagtgg tcaagcctga aagcctctga taccgctatg 660

tactattgtg ccaggcaccc tagctacggg tcaggaagcc caaactttga ctattggggc 720

caggggacac tggtgactgt ctcctct 747

<210> 68

<211> 756

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 68

gacattgtgc tgacccaatc tccagctatc ctgtctgcat ctccagggga gaaggtcaca 60

atgacttgca gggccagctc aagtgtaaat tacatggact ggtaccagaa gaagccagga 120

tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180

ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 240

gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agttttaatc cacccacgtt cggagggggg 300

accaagctgg aaataaaagg cagtactagc ggtggtggct ccgggggcgg ttccggtggg 360

ggcggcagca gcgaggtgca gctgcagcag tctggggctg agctggtgaa gcctggggcc 420

tcagtgaaga tgtcctgcaa ggcttctggc tacacattta ccagttacaa tatgcactgg 480

gtaaagcaga cacctggaca gggcctggaa tggattggag ctatttatcc aggaaatggt 540

gatacttcct acaatcagaa gttcaaaggc aaggccacat tgactgcaga caaatcctcc 600

agcacagcct acatgcagct cagcagcctg acatctgagg actctgcgga ctattactgt 660

gcaagatcta attattacgg tagtagctac tggttcttcg atgtctgggg cgcagggacc 720

acggtcaccg tctcctcact cgacgaatct aagtac 756

<210> 69

<211> 738

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 69

gacattgttc tctcccagtc tccagcaatc ctttctgcat ctccagggga gaaggtcaca 60

atgacttgca gggccagctc aagtttaagt ttcatgcact ggtaccagca gaagccagga 120

tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180

ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 240

gatgctgcca cttatttctg ccatcagtgg agtagtaacc cgctcacgtt cggtgctggg 300

accaagctgg agctgaaggg cagtactagc ggtggtggct ccgggggcgg ttccggtggg 360

ggcggcagca gccaggtgca actgcggcag cctggggctg agctggtgaa gcctggggcc 420

tcagtgaaga tgtcctgcaa ggcttctggc tacacattta ccagttacaa tatgcactgg 480

gtaaagcaga cacctggaca gggcctggaa tggattggag ctatttatcc aggaaatggt 540

gatacttcct acaatcagaa gttcaaaggc aaggccacat tgactgcaga caaatcctcc 600

agcacagcct acatgcagct cagcagtctg acatctgagg actctgcggt ctattactgt 660

gcaagatcgc actacggtag taactacgta gactactttg actactgggg ccaaggcacc 720

actctcacag tctcctca 738

<210> 70

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 70

gacattgtga tgactcagac accactgagc tccccagtga ctctgggaca gccagccagt 60

atctcatgca gatctagtca gtcactggtc tacagcgacg gcaacaccta tctgagctgg 120

ctgcagcagc gaccaggaca gccacctaga ctgctgatct acaagatttc caataggttc 180

tctggagtgc ccgaccgctt tagcggatcc ggagctggaa ctgatttcac cctgaaaatc 240

tcccgcgtgg aggctgaaga tgtgggcgtc tactattgcg tccaggcaac ccagttccct 300

ctgacatttg gcgggggaac taaggtggag atcaag 336

<210> 71

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 71

gacattgtgc tgacccaatc tccagctatc ctgtctgcat ctccagggga gaaggtcaca 60

atgacttgca gggccagctc aagtgtaaat tacatggact ggtaccagaa gaagccagga 120

tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180

ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 240

gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agttttaatc cacccacgtt cggagggggg 300

accaagctgg aaataaaa 318

<210> 72

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 72

gacattgttc tctcccagtc tccagcaatc ctttctgcat ctccagggga gaaggtcaca 60

atgacttgca gggccagctc aagtttaagt ttcatgcact ggtaccagca gaagccagga 120

tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180

ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 240

gatgctgcca cttatttctg ccatcagtgg agtagtaacc cgctcacgtt cggtgctggg 300

accaagctgg agctgaag 318

<210> 73

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 73

gaagtgcagc tggtccagtc tggggccgag gtgaagaaac ctggagaaag tctgaagatc 60

tcatgtaaag gctccgggta ctctttcaca agttattgga ttggctgggt ccgacagatg 120

ccaggaaagg gcctggagtg gatgggaatc atctaccccg gcgacagcga tacccggtat 180

tctcctagtt ttcagggcca ggtgacaatc agcgcagaca agtccattac cacagcctat 240

ctgcagtggt caagcctgaa agcctctgat accgctatgt actattgtgc caggcaccct 300

agctacgggt caggaagccc aaactttgac tattggggcc aggggacact ggtgactgtc 360

tcctct 366

<210> 74

<211> 384

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 74

gaggtgcagc tgcagcagtc tggggctgag ctggtgaagc ctggggcctc agtgaagatg 60

tcctgcaagg cttctggcta cacatttacc agttacaata tgcactgggt aaagcagaca 120

cctggacagg gcctggaatg gattggagct atttatccag gaaatggtga tacttcctac 180

aatcagaagt tcaaaggcaa ggccacattg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240

atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggact attactgtgc aagatctaat 300

tattacggta gtagctactg gttcttcgat gtctggggcg cagggaccac ggtcaccgtc 360

tcctcactcg acgaatctaa gtac 384

<210> 75

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 75

caggtgcaac tgcggcagcc tggggctgag ctggtgaagc ctggggcctc agtgaagatg 60

tcctgcaagg cttctggcta cacatttacc agttacaata tgcactgggt aaagcagaca 120

cctggacagg gcctggaatg gattggagct atttatccag gaaatggtga tacttcctac 180

aatcagaagt tcaaaggcaa ggccacattg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240

atgcagctca gcagtctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagatcgcac 300

tacggtagta actacgtaga ctactttgac tactggggcc aaggcaccac tctcacagtc 360

tcctca 366

<210> 76

<211> 36

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 76

gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacct 36

<210> 77

<211> 24

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 77

ggaccgccct gccccccttg ccct 24

<210> 78

<211> 18

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 78

cctgtggcag gaccgtca 18

<210> 79

<211> 303

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 79

gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 60

acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 120

gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta ccagagcacg 180

taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 240

aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 300

aaa 303

<210> 80

<211> 330

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 80

gcccccgagt tcctgggcgg acccagcgtg ttcctgttcc cccccaagcc caaggacacc 60

ctgatgatca gccggacccc cgaggtgacc tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagat 120

cccgaggtcc agttcaattg gtacgtggac ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag 180

cccagagagg aacagttcaa cagcacctac cgggtggtgt ctgtgctgac cgtgctgcac 240

caggactggc tgaacggcaa agaatacaag tgcaaggtgt ccaacaaggg cctgcccagc 300

agcatcgaaa agaccatcag caaggccaag 330

<210> 81

<211> 315

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 81

gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgccaccat cacgagatga gctgaccaag 60

aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 120

tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 180

gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 240

aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 300

ctctccctgt ctccc 315

<210> 82

<211> 321

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 82

ggccagcctc gcgagcccca ggtgtacacc ctgcctccct cccaggaaga gatgaccaag 60

aaccaggtgt ccctgacctg cctggtgaag ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 120

tgggagagca acggccagcc tgagaacaac tacaagacca cccctcccgt gctggacagc 180

gacggcagct tcttcctgta cagccggctg accgtggaca agagccggtg gcaggaaggc 240

aacgtcttta gctgcagcgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagagc 300

ctgagcctgt ccctgggcaa g 321

<210> 83

<211> 84

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 83

atgttctggg tgctggtggt ggtgggcggg gtgctggcct gctacagcct gctggtgaca 60

gtggccttca tcatcttttg ggtg 84

<210> 84

<211> 123

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 84

cggagcaagc ggagcagagg cggccacagc gactacatga acatgacccc cagacggcct 60

ggccccaccc ggaagcacta ccagccctac gccccaccca gggactttgc cgcctacaga 120

agc 123

<210> 85

<211> 126

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 85

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 86

<211> 336

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 86

cgggtgaagt tcagcagaag cgccgacgcc cctgcctacc agcagggcca gaatcagctg 60

tacaacgagc tgaacctggg cagaagggaa gagtacgacg tcctggataa gcggagaggc 120

cgggaccctg agatgggcgg caagcctcgg cggaagaacc cccaggaagg cctgtataac 180

gaactgcaga aagacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagcgg 240

aggcggggca agggccacga cggcctgtat cagggcctgt ccaccgccac caaggatacc 300

tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc ccaagg 336

<210> 87

<211> 66

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 87

atgctgctgc tggtcacctc actgctgctg tgcgaactgc cccaccccgc cttcctgctg 60

attccc 66

<210> 88

<211> 60

<212> DNA

<213> 小家鼠（Mus musculus）

<400> 88

atggagacag acacactcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ttccacaggt 60

<210> 89

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 89

ggaggaggag gatctggagg aggaggaagt ggaggaggag gatcc 45

<210> 90

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 90

ggcagtacta gcggtggtgg ctccgggggc ggttccggtg ggggcggcag cagc 54

<210> 91

<211> 60

<212> DNA

<213> 未知的（Unknown）

<220>

<223> E2A自切割肽（E2A self-cleaving peptide）

<400> 91

cagtgtacta attatgctct cttgaaattg gctggagatg ttgagagcaa ccccgggccg 60

<210> 92

<211> 71

<212> DNA

<213> 未知的（Unknown）

<220>

<223> T2A自切割肽（T2A self-cleaving peptide）

<400> 92

tcgagggcgg cggagagggc agaggaagtc ttctaacatg cggtgacgtg gaggagaatc 60

ccggccctag g 71

<210> 93

<211> 969

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 93

atgccacctc ctcgcctcct cttcttcctc ctcttcctca cccccatgga agtcaggccc 60

gaggaacctc tagtggtgaa ggtggaagag ggagataacg ctgtgctgca gtgcctcaag 120

gggacctcag atggccccac tcagcagctg acctggtctc gggagtcccc gcttaaaccc 180

ttcttaaaac tcagcctggg gctgccaggc ctgggaatcc acatgaggcc cctggccatc 240

tggcttttca tcttcaacgt ctctcaacag atggggggct tctacctgtg ccagccgggg 300

cccccctctg agaaggcctg gcagcctggc tggacagtca atgtggaggg cagcggggag 360

ctgttccggt ggaatgtttc ggacctaggt ggcctgggct gtggcctgaa gaacaggtcc 420

tcagagggcc ccagctcccc ttccgggaag ctcatgagcc ccaagctgta tgtgtgggcc 480

aaagaccgcc ctgagatctg ggagggagag cctccgtgtg tcccaccgag ggacagcctg 540

aaccagagcc tcagccagga cctcaccatg gcccctggct ccacactctg gctgtcctgt 600

ggggtacccc ctgactctgt gtccaggggc cccctctcct ggacccatgt gcaccccaag 660

gggcctaagt cattgctgag cctagagctg aaggacgatc gcccggccag agatatgtgg 720

gtaatggaga cgggtctgtt gttgccccgg gccacagctc aagacgctgg aaagtattat 780

tgtcaccgtg gcaacctgac catgtcattc cacctggaga tcactgctcg gccagtacta 840

tggcactggc tgctgaggac tggtggctgg aaggtctcag ctgtgacttt ggcttatctg 900

atcttctgcc tgtgttccct tgtgggcatt cttcatcttc aaagagccct ggtcctgagg 960

aggaaaaga 969

<210> 94

<211> 1074

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 94

atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60

atcccacgca aagtgtgtaa cggaataggt attggtgaat ttaaagactc actctccata 120

aatgctacga atattaaaca cttcaaaaac tgcacctcca tcagtggcga tctccacatc 180

ctgccggtgg catttagggg tgactccttc acacatactc ctcctctgga tccacaggaa 240

ctggatattc tgaaaaccgt aaaggaaatc acagggtttt tgctgattca ggcttggcct 300

gaaaacagga cggacctcca tgcctttgag aacctagaaa tcatacgcgg caggaccaag 360

caacatggtc agttttctct tgcagtcgtc agcctgaaca taacatcctt gggattacgc 420

tccctcaagg agataagtga tggagatgtg ataatttcag gaaacaaaaa tttgtgctat 480

gcaaatacaa taaactggaa aaaactgttt gggacctccg gtcagaaaac caaaattata 540

agcaacagag gtgaaaacag ctgcaaggcc acaggccagg tctgccatgc cttgtgctcc 600

cccgagggct gctggggccc ggagcccagg gactgcgtct cttgccggaa tgtcagccga 660

ggcagggaat gcgtggacaa gtgcaacctt ctggagggtg agccaaggga gtttgtggag 720

aactctgagt gcatacagtg ccacccagag tgcctgcctc aggccatgaa catcacctgc 780

acaggacggg gaccagacaa ctgtatccag tgtgcccact acattgacgg cccccactgc 840

gtcaagacct gcccggcagg agtcatggga gaaaacaaca ccctggtctg gaagtacgca 900

gacgccggcc atgtgtgcca cctgtgccat ccaaactgca cctacggatg cactgggcca 960

ggtcttgaag gctgtccaac gaatgggcct aagatcccgt ccatcgccac tgggatggtg 1020

ggggccctcc tcttgctgct ggtggtggcc ctggggatcg gcctcttcat gtga 1074

<210> 95

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 95

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 96

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 96

Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala

1 5 10 15

Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro

20 25

<210> 97

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 97

ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60

ggacct 66

<210> 98

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成的序列（Synthetic sequence）

<400> 98

ggaagcggag tgaaacagac tttgaatttt gaccttctca agttggcggg agacgtggag 60

tccaaccctg gacct 75

Claims (73)

1.一种编码能够特异性结合CD20的融合蛋白的单独的多核苷酸，其中所述多核苷酸为：

(a)如SEQ ID NO.:53所示的多核苷酸序列；或

(b)如SEQ ID NO.:44所示的多核苷酸序列。

2.一种融合蛋白，其由根据权利要求1所述的多核苷酸编码。

3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白：

(a)包含成熟融合蛋白，其中成熟融合蛋白由如SEQ ID NO.:35所示的氨基酸序列组成，其中tCD19转导标记物被移除；

(b)由成熟融合蛋白组成，其中成熟融合蛋白由如SEQ ID NO.:35所示的氨基酸序列组成，其中tCD19转导标记物被移除；或

(c)由如SEQ ID NO.:26所示的氨基酸序列组成。

4.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求1所述的多核苷酸并且能够表达所编码的融合蛋白。

5.根据权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述多核苷酸是密码子优化的。

6.根据权利要求4或5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是T细胞或与受试者自体的T细胞。

7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述T细胞是CD8⁺T细胞、CD4⁺T细胞或两者。

8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述T细胞是T细胞的多数群体或亚群。

9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述T细胞是中枢记忆T细胞，或中枢记忆T细胞以及幼稚T细胞的组合。

10.一种组合物，所述组合物包含多个根据权利要求4至9中任一项所述的宿主细胞，其中多个宿主细胞包括人CD4⁺T宿主细胞和人CD8⁺T宿主细胞。

11.一种组合物，其包含根据权利要求4至9中任意一项所述的宿主细胞以及CD20特异性结合分子。

12.根据权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述CD20特异性结合分子是抗体。

13.根据权利要求12所述的组合物，其特征在于，所述抗体是1.5.3、1F5、Leu16、利妥昔单抗、奥法木单抗、ocrelizumab、维妥珠单抗、ublituximab或其任意组合。

14.载体，所述载体包含根据权利要求1所述的多核苷酸。

15.根据权利要求14所述的载体，其中所述载体包含病毒载体。

16.根据权利要求15所述的载体，其中所述载体包含慢病毒载体或逆转录病毒载体。

17.融合蛋白，所述融合蛋白由如SEQ ID NO.:26所示的氨基酸序列组成。

18.融合蛋白，所述融合蛋白由如SEQ ID NO.:35所示的氨基酸序列组成。

19.融合蛋白，所述融合蛋白由如SEQ ID NO.:35所示的氨基酸序列组成，其中tCD19转导标记物被移除。

20.CD4⁺T细胞，所述CD4⁺T细胞包含权利要求17至19中任一项所述的融合蛋白。

21.人CD4⁺T细胞，所述人CD4⁺T细胞包含权利要求17至19中任一项所述的融合蛋白。

22.组合物，所述组合物包含多个根据权利要求20所述的CD4⁺T细胞。

23.根据权利要求22所述的组合物，还包括多个CD8⁺T细胞，所述CD8⁺T细胞包括融合蛋白，所述融合蛋白由如SEQ ID NO.:26所示的氨基酸序列组成。

24.组合物，所述组合物包含多个根据权利要求21所述的人CD4⁺T细胞。

25.根据权利要求24所述的组合物，还包括多个人CD8+T细胞，所述人CD8+T细胞包括融合蛋白，所述融合蛋白由如SEQ ID NO.:26所示的氨基酸序列组成。

26.根据权利要求22或24所述的组合物，还包含药学上可接受的载剂、赋形剂或稀释剂。

27.根据权利要求23或25所述的组合物，其中CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞以3:1至1:1的比例存在。

28.根据权利要求23或25所述的组合物，其中CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞以1:1至3:1的比例存在。

29.根据权利要求23或25所述的组合物，其中CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞以1:1的比例存在。

30.根据权利要求23或25所述的组合物，所述组合物包含最高达10⁶、最高达10⁷、最高达10⁸、最高达10⁹或超过10¹⁰的包含融合蛋白的T细胞。

31.根据权利要求30所述的组合物，所述组合物包含最高达10⁶、最高达10⁷或最高达10⁸的包含融合蛋白的T细胞。

32.根据权利要求23或25所述的组合物，其中使用病毒载体对多个CD4⁺T细胞、多个CD8⁺T细胞或两者进行离体修饰以编码融合蛋白。

33.根据权利要求23或25所述的组合物，所述组合物包含普通CD4⁺T细胞、普通CD8⁺T细胞、CD4⁺中枢记忆细胞、CD8⁺中枢记忆细胞，或CD4⁺中枢记忆细胞和CD4⁺幼稚T细胞的组合。

34.根据权利要求4所述的宿主细胞、根据权利要求10至13和22至25中任一项所述的组合物或根据权利要求20或21所述的CD4+T细胞，其中所述细胞协同表达截短的CD19和融合蛋白。

35.权利要求1所述的多核苷酸、权利要求2至3和17至19中任一项所述的融合蛋白、权利要求14至16中任一项所述的载体、权利要求4至9中任一项所述的宿主细胞、权利要求20或21所述的CD4+T细胞、或权利要求10至13和22至34中任一项所述的组合物在制备用于治疗受试者中与CD20表达相关的疾病或病症的药物组合物中的用途。

36.根据权利要求35所述的用途，其特征在于，所述宿主细胞是T细胞或与受试者自体、同源或同种异体的T细胞。

37.根据权利要求36所述的用途，其特征在于，所述T细胞是CD8⁺T细胞、CD4⁺T细胞或两者。

38.根据权利要求36所述的用途，其特征在于，所述T细胞是T细胞的多数群体或亚群。

39.根据权利要求38所述的用途，其特征在于，所述T细胞是中枢记忆T细胞，或中枢记忆T细胞以及幼稚T细胞的组合。

40.根据权利要求35所述的用途，其特征在于，所述宿主细胞、CD4+T细胞或组合物配制成与CD20特异性结合分子同时或依次施用。

41.根据权利要求35所述的用途，其特征在于，所述宿主细胞、CD4+T细胞或组合物配制成与CD20特异性结合分子一并施用。

42.根据权利要求40所述的用途，其特征在于，所述CD20特异性结合分子是抗体。

43.根据权利要求42所述的用途，其特征在于，所述抗体选自1.5.3、1F5、Leu16、利妥昔单抗、奥法木单抗、ocrelizumab、维妥珠单抗、ublituximab或其任意组合组成的组。

44.根据权利要求35所述的用途，其特征在于，所述宿主细胞或CD4⁺T细胞包含编码自杀转导标记物的异源性多核苷酸。

45.根据权利要求44所述的用途，其特征在于，所述自杀转导标记物包含截短的EGFR多肽。

46.根据权利要求45所述的用途，其特征在于，所述截短的EGFR多肽由如SEQ ID NO.:25所示的氨基酸序列组成。

47.根据权利要求44所述的用途，其特征在于，所述自杀转导标记物包含截短的CD19多肽。

48.根据权利要求47所述的用途，其特征在于，所述截短的CD19多肽由如SEQ ID NO.:24所示的氨基酸序列组成。

49.权利要求20所述的CD4+T细胞与多个人CD8+T细胞组合使用在制备用于治疗受试者中与CD20表达相关的疾病或病症的药物组合物中的用途，所述CD8+T细胞包含融合蛋白，所述融合蛋白由如SEQ ID NO.:26所示的氨基酸序列组成。

50.权利要求21所述的人CD4+T细胞与多个人CD8+T细胞组合使用在制备用于治疗受试者中与CD20表达相关的疾病或病症的药物组合物中的用途，所述人CD8+T细胞包含融合蛋白，所述融合蛋白由如SEQ ID NO.:26所示的氨基酸序列组成。

51.根据权利要求35至50中任一项所述的用途，其特征在于，治疗与CD20相关的所述疾病或病症减少了B细胞的数量或治疗与异常B细胞活性相关的疾病或病症。

52.根据权利要求35至50中任一项所述的用途，其特征在于，与CD20表达相关的病症或疾病是B细胞淋巴瘤或白血病；以自身抗体生成为特征的疾病；以与B细胞途径相关的不适当的T细胞刺激为特征的疾病；多发性骨髓瘤；或黑色素瘤。

53.根据权利要求52所述的用途，其中所述B细胞淋巴瘤或白血病包括B细胞非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、小淋巴细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、

巨球蛋白血症、B细胞前淋巴细胞白血病、CD37⁺树突状细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织的淋巴结外边缘区B细胞淋巴瘤、淋巴结边缘区B细胞淋巴瘤、胸腺纵膈大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤和原发性积液淋巴瘤。

54.根据权利要求35至50中任一项所述的用途，其中与CD20表达相关的所述疾病或病症是癌症。

55.根据权利要求35至50中任一项所述的用途，其中与CD20表达相关的所述疾病或病症是：

(i)B细胞相关的癌症；

(ii)白血病；或

(iii)淋巴瘤。

56.根据权利要求35至50中任一项所述的用途，其中与CD20表达相关的所述疾病或病症是：

(i)非霍奇金淋巴瘤；

(ii)慢性淋巴细胞白血病；

(iii)弥漫性大B细胞淋巴瘤；

(iv)滤泡性淋巴瘤；

(v)套细胞淋巴瘤；

(vi)

巨球蛋白血症；或

(vii)与异常B细胞活性相关的癌症。

57.根据权利要求35至50中任一项所述的用途，其中与CD20表达相关的所述疾病或病症对至少一种现有治疗方案而言是复发的或难治的。

58.根据权利要求35至50中任一项所述的用途，其中所述组合物包含以1:1的比例的CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞，其中所述组合物包含或由每千克受试者的体重1×10⁵T细胞组成。

59.根据权利要求35至50中任一项所述的用途，其中所述组合物包含以1:1的比例的CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞，其中所述组合物包含或由每千克受试者的体重3.3×10⁵T细胞组成。

60.根据权利要求35至50中任一项所述的用途，其中所述组合物包含以1:1的比例的CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞，其中所述组合物包含或由每千克受试者的体重1×10⁶T细胞组成。

61.根据权利要求35至50中任一项所述的用途，其中所述组合物包含以1:1的比例的CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞，其中所述组合物包含或由每千克受试者的体重3.3×10⁶T细胞组成。

62.根据权利要求35至50中任一项所述的用途，其中所述组合物包含以1:1的比例的CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞，其中所述组合物包含或由每千克受试者的体重1×10⁷T细胞组成。

63.根据权利要求35至50中任一项所述的用途，其中所述受试者已用以下进行预治疗：(a)CD20特异性抗体；或(b)化学治疗剂。

64.根据权利要求63所述的用途，其中所述CD20特异性抗体包含1.5.3、1F5、Leu16、利妥昔单抗、奥法木单抗、ocrelizumab、ublituximab、维妥珠单抗，或前述两种或多种的任意组合。

65.根据权利要求63所述的用途，其中所述化学治疗剂包含环磷酰胺、氟达拉滨、环磷酰胺和氟达拉滨、CHOP、CHOP-R、CHOEP或CHOEP-R，其中CHOP为环磷酰胺-羟基柔红霉素-长春新碱-泼尼松，R为利妥昔单抗，E是依托泊苷。

66.一种体外或离体方法，所述方法包括将编码权利要求17至19中任一项所述融合蛋白的多核苷酸引入到目标宿主细胞中。

67.根据权利要求66所述的方法，其中所述多核苷酸包含于载体中。

68.根据权利要求67所述的方法，其中所述载体包含病毒载体。

69.根据权利要求68所述的方法，其中所述病毒载体包含慢病毒载体或逆转录病毒载体。

70.根据权利要求67至69中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸由如SEQ IDNO.:44或SEQ ID NO.:53所示的多核苷酸序列组成。

71.根据权利要求66所述的方法，其中所述宿主细胞包含免疫细胞。

72.根据权利要求71所述的方法，其中所述免疫细胞包含T细胞。

73.根据权利要求72所述的方法，其中所述T细胞包含CD4+T细胞、CD8+T细胞、幼稚T细胞、记忆干细胞T细胞或中枢记忆T细胞或其任意组合。

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