JP2024514556A - 融合タンパク質及びその使用法 - Google Patents

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Abstract

本出願は、細胞外ドメインと細胞内ドメインとを各々が有する２つのポリペプチドを有する融合タンパク質を提供し、２つの前記細胞外ドメインは、ＴＧＦβに対する結合部位を形成し、２つの前記細胞内ドメインは、ＩＬ－２３受容体複合体の細胞内ドメインを形成する。本出願は、前記融合タンパク質をコードする核酸、前記核酸を含むベクター、及び前記融合タンパク質を発現する操作された細胞も提供する。前記操作された細胞を産生する方法、及び、操作された細胞を投与することを含む、治療の方法も提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年４月１５日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＣＮ２０２１／０８７４７５の優先権を主張し、その内容は、すべての目的のために参照することによってその全体が本明細書に援用される。
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出内容：配列表のコンピューター可読形態（ＣＲＦ）（ファイル名：Ｐ１１１２８－ＰＣＴ．２２０４１５．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ．ＴＸＴ、記録した日付：２０２２年４月１４日、サイズ：２０５，３１８バイト）は、参照することによってその全体が本明細書に援用される。
本出願の分野
本出願は、ＴＧＦβへ結合し、炎症促進性シグナルを媒介することが可能な融合タンパク質に関連する。
本出願の背景
形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）は、免疫抑制性シグナリング分子として腫瘍微小環境において関与する多面的なサイトカインである。ＴＧＦβは、ＴＧＦβＲ１及びＴＧＦβＲ２セリン／スレオニンキナーゼ受容体複合体へ結合し、下流の転写因子Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３の受容体媒介性リン酸化をもたらす。多くの腫瘍は、ＴＧＦβ受容体及び／または下流のＳｍａｄシグナリングタンパク質における突然変異の獲得によって、ＴＧＦβの細胞静止性及び抗増殖性の効果を回避する。ＴＧＦβは、インビトロのＴ細胞のエフェクター及び細胞溶解活性に関与する重要な分子（ＩＦＮγ分泌が挙げられる）を抑制する。
本明細書において参照されるすべての出版物、特許、特許出願、及び出版された特許出願の開示は、本明細書に参照することによってそれらの全体が本明細書に援用される。
本出願の概要
本出願は、一態様において、ａ）ｉ）ＴＧＦβＲ１またはＴＧＦβＲ２のうちの一方の細胞外ドメインを含む第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）第１の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）ＩＬ－１２Ｒβ１またはＩＬ－２３Ｒのうちの一方の細胞内ドメインを含む第１の細胞内ドメイン、を含む、第１のポリペプチドと；ｂ）ｉ）ＴＧＦβＲ１またはＴＧＦβＲ２のうちの他方の細胞外ドメインを含む第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）第２の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）ＩＬ－１２Ｒβ１またはＩＬ－２３Ｒのうちの他方の細胞内ドメインを含む第２の細胞内ドメイン、を含む、第２のポリペプチドとを含む、融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態において、第１の膜貫通ドメイン及び第２の膜貫通ドメインは各々、ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２、ＩＬ－１２Ｒβ１、及びＩＬ－２３Ｒのうちの１つの膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第１の膜貫通ドメイン及び第２の膜貫通ドメインは各々、ＩＬ－１２Ｒβ１またはＩＬ－２３Ｒのうちの一方の膜貫通ドメインを含む。
上で記載される融合タンパク質のうちの任意のものによるいくつかの実施形態において、融合タンパク質は、
ａ）第１の細胞外ドメインがＴＧＦβＲ１の細胞外ドメインを含み、第１の膜貫通ドメインがＴＧＦβＲ１の膜貫通ドメインを含み、第１の細胞内ドメインがＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインを含み、第２の細胞外ドメインがＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインを含み、第２の膜貫通ドメインがＴＧＦβＲ２の膜貫通ドメインを含み、第２の細胞内ドメインがＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメインを含むもの；
ｂ）第１の細胞外ドメインがＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインを含み、第１の膜貫通ドメインがＴＧＦβＲ２の膜貫通ドメインを含み、第１の細胞内ドメインがＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインを含み、第２の細胞外ドメインがＴＧＦβＲ１の細胞外ドメインを含み、第２の膜貫通ドメインがＴＧＦβＲ１の膜貫通ドメインを含み、第２の細胞内ドメインがＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメインを含むもの；
ｃ）第１の細胞外ドメインがＴＧＦβＲ１の細胞外ドメインを含み、第１の膜貫通ドメインがＩＬ－２３Ｒの膜貫通ドメインを含み、第１の細胞内ドメインがＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインを含み、第２の細胞外ドメインがＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインを含み、第２の膜貫通ドメインがＩＬ－１２Ｒβ１の膜貫通ドメインを含み、第２の細胞内ドメインがＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメインを含むもの；または、
ｄ）第１の細胞外ドメインがＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインを含み、第１の膜貫通ドメインがＩＬ－２３Ｒの膜貫通ドメインを含み、第１の細胞内ドメインがＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインを含み、第２の細胞外ドメインがＴＧＦβＲ１の細胞外ドメインを含み、第２の膜貫通ドメインがＩＬ－１２Ｒβ１の膜貫通ドメインを含み、第２の細胞内ドメインがＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメインを含むもの
を含む。
上で記載される融合タンパク質のうちの任意のものによるいくつかの実施形態において、第１のポリペプチド及び／または第２のポリペプチドは、ポリペプチドのＮ末端においてシグナルペプチドをさらに含む。
上で記載される融合タンパク質のうちの任意のものによるいくつかの実施形態において、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは単一ポリペプチドの状態であり、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドはマルチシストロン性エレメントによって分離されている。いくつかの実施形態において、マルチシストロン性エレメントは、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａからなる群から選択される２Ａ自己切断ペプチドを含む。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドは、第２のポリペプチドにとってＮ末端側である。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドは第２のポリペプチドにとってＣ末端側である。いくつかの実施形態において、単一ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の方向へ、
ａ）ＴＧＦβＲ１の細胞外ドメインを含む第１の細胞外ドメイン、ＴＧＦβＲ１の膜貫通ドメインを含む第１の膜貫通ドメイン、ＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインを含む第１の細胞内ドメイン、２Ａ自己切断ペプチド、ＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインを含む第２の細胞外ドメイン、ＴＧＦβＲ２の膜貫通ドメインを含む第２の膜貫通ドメイン、及びＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメインを含む第２の細胞内ドメイン；
ｂ）ＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインを含む第１の細胞外ドメイン、ＴＧＦβＲ２の膜貫通ドメインを含む第１の膜貫通ドメイン、ＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインを含む第１の細胞内ドメイン、２Ａ自己切断ペプチド、ＴＧＦβＲ１の細胞外ドメインを含む第２の細胞外ドメイン、ＴＧＦβＲ１の膜貫通ドメインを含む第２の膜貫通ドメイン、及びＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメインを含む第２の細胞内ドメイン；
ｃ）ＴＧＦβＲ１の細胞外ドメインを含む第１の細胞外ドメイン、ＴＧＦβＲ１の膜貫通ドメインを含む第１の膜貫通ドメイン、ＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメインを含む第１の細胞内ドメイン、２Ａ自己切断ペプチド、ＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインを含む第２の細胞外ドメイン、ＴＧＦβＲ２の膜貫通ドメインを含む第２の膜貫通ドメイン、及びＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインを含む第２の細胞内ドメイン；
ｄ）ＴＧＦβＲ１の細胞外ドメインを含む第１の細胞外ドメイン、ＩＬ－２３Ｒの膜貫通ドメインを含む第１の膜貫通ドメイン、ＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインを含む第１の細胞内ドメイン、２Ａ自己切断ペプチド、ＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインを含む第２の細胞外ドメイン、ＩＬ－１２Ｒβ１の膜貫通ドメインを含む第２の膜貫通ドメイン、及びＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメインを含む第２の細胞内ドメイン；
ｅ）ＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインを含む第１の細胞外ドメイン、ＩＬ－２３Ｒの膜貫通ドメインを含む第１の膜貫通ドメイン、ＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインを含む第１の細胞内ドメイン、２Ａ自己切断ペプチド、ＴＧＦβＲ１の細胞外ドメインを含む第２の細胞外ドメイン、ＩＬ－１２Ｒβ１の膜貫通ドメインを含む第２の膜貫通ドメイン、及びＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメインを含む第２の細胞内ドメイン；または
ｆ）ＴＧＦβＲ１の細胞外ドメインを含む第１の細胞外ドメイン、ＩＬ－１２Ｒβ１の膜貫通ドメインを含む第１の膜貫通ドメイン、ＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメインを含む第１の細胞内ドメイン、２Ａ自己切断ペプチド、ＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインを含む第２の細胞外ドメイン、ＩＬ－２３Ｒの膜貫通ドメインを含む第２の膜貫通ドメイン、及びＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインを含む第２の細胞内ドメイン
を含む。
上で記載される融合タンパク質のうちの任意のものによるいくつかの実施形態において、第１の細胞外ドメイン及び第２の細胞外ドメインは、ＴＧＦβに対する結合部位を形成し、第１の細胞内ドメイン及び第２の細胞内ドメインは、ＩＬ－２３受容体複合体の細胞内ドメインを形成し、ＴＧＦβへの融合タンパク質の結合によりＩＬ－２３受容体複合体を介するシグナリングが伝達される。
上で記載される融合タンパク質のうちの任意のものによるいくつかの実施形態において、ＴＧＦβＲ１の膜貫通ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列、もしくは少なくとも約９０％の配列同一性を有する機能的バリアントを含む；及び／またはＴＧＦβＲ２の膜貫通ドメインは、配列番号６のアミノ酸配列、もしくは少なくとも約９０％の配列同一性を有する機能的バリアントを含む。
上で記載される融合タンパク質のうちの任意のものによるいくつかの実施形態において、ＩＬ－２３Ｒの膜貫通ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列、もしくは少なくとも約９０％の配列同一性を有する機能的バリアントを含む；及び／またはＩＬ－１２Ｒβ１の膜貫通ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列、もしくは少なくとも約９０％の配列同一性を有する機能的バリアントを含む。
上で記載される融合タンパク質のうちの任意のものによるいくつかの実施形態において、ＴＧＦβＲ１の細胞外ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列、または少なくとも約９０％の配列同一性を有する機能的バリアントを含む。
上で記載される融合タンパク質のうちの任意のものによるいくつかの実施形態において、ＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインは、配列番号４のアミノ酸配列、または少なくとも約９０％の配列同一性を有する機能的バリアントを含む。
上で記載される融合タンパク質のうちの任意のものによるいくつかの実施形態において、ＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列、または少なくとも約９０％の配列同一性を有する機能的バリアントを含む。
上で記載される融合タンパク質のうちの任意のものによるいくつかの実施形態において、ＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列、または少なくとも約９０％の配列同一性を有する機能的バリアントを含む。
上で記載される融合タンパク質のうちの任意のものによるいくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ａ）ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む第１の膜貫通ドメイン、ｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む第１の細胞内ドメイン、を含む、第１のポリペプチドと；ｂ）ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含む第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含む第２の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）配列番号１６を含む第２の細胞内ドメイン、を含む、第２のポリペプチドとを含む。
上で記載される融合タンパク質のうちの任意のものによるいくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ａ）ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含む第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含む第１の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む第１の細胞内ドメイン、を含む、第１のポリペプチドと；ｂ）ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む第２の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む第２の細胞内ドメイン、を含む、第２のポリペプチドとを含む。
上で記載される融合タンパク質のうちの任意のものによるいくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ａ）ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含む第１の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む第１の細胞内ドメイン、を含む、第１のポリペプチドと；ｂ）ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含む第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含む第２の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む第２の細胞内ドメイン、を含む、第２のポリペプチドとを含む。
上で記載される融合タンパク質のうちの任意のものによるいくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ａ）ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含む第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含む第１の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む第１の細胞内ドメイン、を含む、第１のポリペプチドと；ｂ）ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含む第２の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む第２の細胞内ドメイン、を含む、第２のポリペプチドとを含む。
上で記載される融合タンパク質のうちの任意のものによるいくつかの実施形態において、第１のポリペプチド及び／または第２のポリペプチドは、２つのドメインの間にリンカーをさらに含み、２つのドメインのうちの一方は膜貫通ドメインであり、他方のドメインは細胞外ドメインまたは細胞内ドメインである。いくつかの実施形態において、リンカーは膜近傍配列を含み、膜近傍配列及び膜貫通ドメインは、同じ分子に由来する。いくつかの実施形態において、膜近傍領域は、配列番号９～１２のうちの任意のものにおいて示されるアミノ酸配列を含む。
上で記載される融合タンパク質のうちの任意のものによるいくつかの実施形態において、第１のポリペプチドは、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドは、配列番号５０のアミノ酸配列を含む。
上で記載される融合タンパク質のうちの任意のものによるいくつかの実施形態において、第１のポリペプチドは、配列番号５１のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドは、配列番号５２のアミノ酸配列を含む。
上で記載される融合タンパク質のうちの任意のものによるいくつかの実施形態において、第１のポリペプチドは、配列番号５３のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドは、配列番号５４のアミノ酸配列を含む。
上で記載される融合タンパク質のうちの任意のものによるいくつかの実施形態において、第１のポリペプチドは、配列番号５５のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドは、配列番号５６のアミノ酸配列を含む。
上で記載される融合タンパク質のうちの任意のものによるいくつかの実施形態において、融合タンパク質は、配列番号２０～２５のうちの任意のものにおいて示されるアミノ酸配列を含む。
本出願は、別の態様において、上で記載される融合タンパク質またはその一部のうちの任意のものをコードする１つまたは複数の核酸配列を含む核酸を提供する。
本出願は、別の態様において、配列番号２８～３３のうちの任意のものにおいて示される核酸配列を含む核酸を提供する。
上で記載される核酸のうちの任意のものによるいくつかの実施形態において、核酸は、機能的外来性受容体をコードする第２の核酸配列をさらに含み、機能的外来性受容体は、細胞外リガンド結合ドメイン及び任意選択で細胞内シグナリングドメインを含む。いくつかの実施形態において、機能的外来性受容体は、操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞抗原カプラー（Ｔ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｃｏｕｐｌｅｒ）（ＴＡＣ）、またはそれらの一部からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、機能的外来性受容体は、腫瘍抗原を特異的に認識する。いくつかの実施形態において、機能的外来性受容体をコードする核酸配列は、融合タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸配列（「融合タンパク質核酸配列」）のうちの少なくとも１つに対して上流であり、任意選択で、機能的外来性受容体核酸配列及び融合タンパク質核酸配列は、第２のマルチシストロン性エレメントをコードする第３の核酸配列によって分離されている。いくつかの実施形態において、第２のマルチシストロン性エレメントは、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａからなる群から選択される２Ａ自己切断ペプチドを含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質をコードする核酸配列及び機能的外来性受容体をコードする核酸配列は、第２のマルチシストロン性エレメントによって分離されている。
本出願は、別の態様において、上で記載される核酸のうちの任意のものを含むベクターを提供する。
本出願は、別の態様において、上で記載される、融合タンパク質、核酸、またはベクターのうちの任意のものを含む、操作された細胞を提供する。いくつかの実施形態において、操作された細胞は機能的外来性受容体をさらに含み、機能的外来性受容体は、細胞外リガンド結合ドメイン及び任意選択で細胞内シグナリングドメインを含む。いくつかの実施形態において、機能的外来性受容体は、操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞抗原カプラー（ＴＡＣ）、またはそれらの一部からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、機能的外来性受容体は、腫瘍抗原を特異的に認識する。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、免疫細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、末梢性血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、造血幹細胞、多能性幹細胞、胚性幹細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
本出願は、別の態様において、上で記載される操作された細胞のうちの任意のものを含む医薬組成物を提供する。
本出願は、別の態様において、融合タンパク質または本明細書において記載される医薬組成物のうちの任意のものを個体へ投与することを含む、個体における疾患または病態を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態において、疾患または病態は免疫抑制を伴う。いくつかの実施形態において、疾患のある組織は、疾患または病態の無い個体中の対応する組織よりも高い発現レベルのＴＧＦβを有する。いくつかの実施形態において、疾患または病態は、がんである。いくつかの実施形態において、がんは、固形腫瘍である。いくつかの実施形態において、疾患または病態は、感染性疾患、または感染症と関連する病態である。いくつかの実施形態において、医薬組成物中の操作された細胞は、個体に対して同種異系である。いくつかの実施形態において、医薬組成物中の操作された細胞は、個体に対して自己由来である。いくつかの実施形態において、方法は、第２の治療法、または、第２の作用物質を投与することをさらに含む。
本出願は、別の態様において、融合タンパク質または本明細書において記載される医薬組成物のうちの任意のものを個体へ投与することを含む、個体における疾患のある組織における免疫抑制シグナルを低減する方法を提供する。いくつかの実施形態において、免疫抑制シグナルを低減することは、ＴＧＦβＲを介してシグナリングを減少させることを含む。いくつかの実施形態において、疾患のある組織は、疾患または病態の無い個体中の対応する組織よりも高い発現レベルのＴＧＦβを有する。いくつかの実施形態において、疾患または病態は、がんである。いくつかの実施形態において、がんは、固形腫瘍である。いくつかの実施形態において、疾患または病態は、感染性疾患、または感染症と関連する病態である。いくつかの実施形態において、医薬組成物中の操作された細胞は、個体に対して同種異系である。いくつかの実施形態において、医薬組成物中の操作された細胞は、個体に対して自己由来である。いくつかの実施形態において、方法は、第２の治療法、または、第２の作用物質を投与することをさらに含む。
ＴＧＢ２３融合タンパク質の線画構造を示す。 ＴＧＢ２３融合タンパク質をコードするポリペプチドを示す。ＳＰは、シグナルペプチドを指す。ＴＭは、膜貫通ドメインを指す。 融合タンパク質のＴＧＢ２３－１、ＴＧＢ２３－２、ＴＧＢ２３－３、ＴＧＢ２３－４、ＴＧＢ２３－５、ＴＧＢ２３－６、ｗｔＴＧＦβＲ、ＴＧＢ２３－１４、及びＴＧＢ２３－１５の発現レベルを示す。ＵｎＴは、融合タンパク質のうちの任意のものにより形質導入されていないＴ細胞を指し、ｗｔＴＧＦβＲは野生型ＴＧＦβ受容体を指す。 図３Ａ～３Ｂは、２０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１により処理した、ＴＧＢ２３－１、ＴＧＢ２３－２、ＴＧＢ２３－３、ＴＧＢ２３－４、ＴＧＢ２３－５、ＴＧＢ２３－６、ｗｔＴＧＦβＲ、ＴＧＢ２３－１４、またはＴＧＢ２３－１５を発現するＴ細胞の細胞生存率（Ａ）及び細胞数（Ｂ）を示す。ＵｎＴは、融合タンパク質のうちの任意のものにより形質導入されていないＴ細胞を指す。 ＵｎＴ、ｈｕＬＩＣ１９３０９ｂ ＣＡＲ－Ｔ細胞、及びｈｕＬＩＣ１９３０９ｂＴ ＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＡＲ陽性細胞における抗ＧＰＣ３ ＣＡＲ発現レベル及びＴＧＦβＲ２発現レベルを示す。ＵｎＴは、ＣＡＲにより形質導入されていないＴ細胞を指す。 ２０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１有りまたは無しで４時間処理した、ＵｎＴ、ｈｕＬＩＣ１９３０９ｂ ＣＡＲ－Ｔ細胞、及びｈｕＬＩＣ１９３０９ｂＴ ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるｐＳｍａｄ２の発現レベルを示す。ＵｎＴは、ＣＡＲにより形質導入されていないＴ細胞を指す。 ２０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１有りまたは無しで４時間処理した、ＵｎＴ、ｈｕＬＩＣ１９３０９ｂ ＣＡＲ－Ｔ細胞、及びｈｕＬＩＣ１９３０９ｂＴ ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるｐＳｔａｔ３の発現レベルを示す。ＵｎＴは、ＣＡＲにより形質導入されていないＴ細胞を指す。 ２０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１有りまたは無しで４時間処理した、ＵｎＴ、ｈｕＬＩＣ１９３０９ｂ ＣＡＲ－Ｔ細胞、及びｈｕＬＩＣ１９３０９ｂＴ ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるｐＳｔａｔ４の発現レベルを示す。ＵｎＴは、ＣＡＲにより形質導入されていないＴ細胞を指す。 図７Ａ～７Ｂは、２０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１により処理した、ＵｎＴ、ｈｕＬＩＣ１９３０９ｂ ＣＡＲ－Ｔ細胞、及びｈｕＬＩＣ１９３０９ｂＴ ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞生存率（Ａ）及び細胞数（Ｂ）を示す。ＵｎＴは、ＣＡＲにより形質導入されていないＴ細胞を指す。 図８Ａ～８Ｂは、再チャレンジアッセイにおける、ＰＬＣＰＲＦ５及び５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１との共培養後の２つの処理群（ｈｕＬＩＣ１９３０９ｂ ＣＡＲ－Ｔ群及びｈｕＬＩＣ１９３０９ｂＴ ＣＡＲ－Ｔ群）のＣＤ４＋ＣＡＲ＋ Ｔ細胞（Ａ）及びＣＤ８＋ＣＡＲ＋ Ｔ細胞（Ｂ）におけるＰＤ１の発現レベルを示す。 再チャレンジアッセイにおける、ＰＬＣＰＲＦ５との共培養後のＣＡＲ陽性率を示す。 再チャレンジアッセイにおける、ＰＬＣＰＲＦ５との共培養後のＣＡＲ陽性率を示す。 再チャレンジアッセイにおける、ＰＬＣＰＲＦ５との共培養後の細胞数を示す。 再チャレンジアッセイにおける、ＰＬＣＰＲＦ５との共培養後の細胞数を示す。 図１０Ａ～１０Ｂは、再チャレンジアッセイにおける、１：１のＥ／Ｔ比による、ＰＬＣＰＲＦ５細胞（Ａ）及びＨｅｐ３Ｂ２．１－７細胞（Ｂ）に対する、ｈｕＬＩＣ１９３０９ｂ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びｈｕＬＩＣ１９３０９ｂＴ ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロの細胞傷害性を示す。Ｅ／Ｔは、エフェクティブ細胞（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｃｅｌｌ）対標的細胞比を指す。 １：２０のＥ／Ｔ比による、Ｈｅｐ３Ｂ２．１－７細胞に対する、ｈｕＬＩＣ１９３０９ｂ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びｈｕＬＩＣ１９３０９ｂＴ ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロのリアルタイム細胞傷害性を示す。Ｅ／Ｔは、エフェクティブ細胞対標的細胞比を指す。 図１２Ａ～１２Ｃは、ＮＣＧマウス異種移植片モデルにおけるＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍性効果を示す。ＮＣＧマウスにＨｅｐ３Ｂ２．１－７細胞を皮下に接種し、０．３Ｍの投与量及び０．８Ｍの投与量（静脈注射）のＣＡＲ－Ｔ細胞により処理した。マウスの体重（Ａ）、腫瘍の体積（Ｂ）、及び末梢血中のヒトＣＤ３＋ Ｔ細胞のパーセンテージ（Ｃ）を査定した。 図１３Ａ～１３Ｃは、フローサイトメトリーによる、ＵｎＴ、ＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ Ｔ細胞、及びＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ＋ＴＧＢ２３－６ Ｔ細胞のＴＣＲαβ（Ａ）、ＣＤ２０ ＣＡＲ（Ｂ）、及びＴＧＢ２３－６（Ｃ）の発現を示す。形質導入されていないＴ細胞（ＵｎＴ）を、陰性対照として使用した。 異なるエフェクター－標的比による、Ｒａｊｉ細胞に対する、ＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ Ｔ細胞及びＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ＋ＴＧＢ２３－６ Ｔ細胞のインビトロの細胞傷害性を示す。Ｅ／Ｔは、エフェクティブ細胞対標的細胞比を指す。 Ｒａｊｉ刺激の複数のラウンド後のＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ Ｔ細胞及びＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ＋ＴＧＢ２３－６ Ｔ細胞の増殖を示す。細胞を０日目、４日目、７日目、１１日目で収集し、ＣＤ５の発現をフローサイトメトリーによって検出した。
本出願の詳細な説明
本出願は、ａ）ｉ）ＴＧＦβＲ１またはＴＧＦβＲ２のうちの一方の細胞外ドメインを含む第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）第１の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）ＩＬ－１２Ｒβ１またはＩＬ－２３Ｒのうちの一方の細胞内ドメインを含む第１の細胞内ドメイン、を含む、第１のポリペプチドと；ｂ）ｉ）ＴＧＦβＲ１またはＴＧＦβＲ２のうちの他方の細胞外ドメインを含む第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）第２の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）ＩＬ－１２Ｒβ１またはＩＬ－２３Ｒのうちの他方の細胞内ドメインを含む第２の細胞内ドメイン、を含む、第２のポリペプチドとの、融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態において、第１の細胞外ドメイン及び第２の細胞外ドメインは、ＴＧＦβに対する結合部位を形成し、第１の細胞内ドメイン及び第２の細胞内ドメインは、ＩＬ－２３受容体複合体を形成し、ＴＧＦβへの融合タンパク質の結合によりＩＬ－２３受容体複合体を介するシグナリングが伝達される。本出願は、かかる融合タンパク質、またはかかる融合タンパク質をコードする核酸を含む操作された細胞も提供し、任意選択で、操作された細胞は機能的外来性受容体（例えばＣＡＲまたは操作されたＴＣＲ）も含む。かかる操作された細胞を産生または使用する方法も提供される。
本出願は、ＴＧＦβシグナルをＩＬ－２３Ｒ媒介性シグナルへ転換することが可能な本明細書において記載される融合タンパク質を含む、操作された細胞を提供する。実施例においてより詳細に示されるように、かかる融合タンパク質を有する操作されたＴ細胞は、ＴＧＦβへの曝露により、融合タンパク質無しの対応するＴ細胞よりも高い生存率及び増殖を呈する。さらに、融合タンパク質及び腫瘍抗原を標的とするＣＡＲの両方を発現する操作されたＴ細胞は、腫瘍細胞に対するより高い細胞傷害性を、インビトロ及び動物腫瘍モデルの両方で呈する。操作されたＴ細胞の増殖及び細胞傷害性の増加は、合計で３００時間を超える持続するＴＧＦβへの連続的な曝露全体に関連することも示されている。これらの結果は、融合タンパク質及びこれらの融合タンパク質を含む操作された細胞が、疾患または免疫抑制と関連する病態（がん等）を効果的に治療し得るという強力な証拠を提供する。これらの高度に有利な効果は、がん生物学におけるＩＬ－２３シグナリングの現在の限定的且つ矛盾した理解を考慮すれば、特に印象的である。
Ｉ．定義
「抗体」という用語は、モノクローナル抗体（免疫グロブリンＦｃ領域を有する全長の４つの鎖の抗体または全長の重鎖のみの抗体が挙げられる）、ポリエピトープ特異性を備えた抗体組成物、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体、ダイアボディ、及び一本鎖分子）、そして抗体断片（例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ）を包含する。「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、本明細書において「抗体」と互換的に使用される。本明細書において企図される抗体は、単一ドメイン抗体（重鎖のみの抗体等）を包含する。
「単一ドメイン抗体」または「ｓｄＡｂ」という用語は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する単一抗原結合ポリペプチドを指す。ｓｄＡｂ単独は、対応するＣＤＲ含有ポリペプチドと対合せずに、抗原へ結合することが可能である。いくつかの事例において、単一ドメイン抗体はラクダ科の動物のＨＣＡｂから操作され、それらの重鎖可変ドメインは本明細書において「ＶＨＨ」と称される。「重鎖のみの抗体」または「ＨＣＡｂ」という用語は、重鎖を含むが４つの鎖の抗体中で通常見出される軽鎖を欠如する、機能的抗体を指す。ラクダ科の動物（ラクダ、ラマ、またはアルパカ等）は、ＨＣＡｂを産生することが公知である。いくつかのＶＨＨは、ナノボディとしても公知であり得る。ラクダ科の動物のｓｄＡｂは、最も小さな公知の抗原結合抗体断片のうちの１つである（例えばＨａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４６－８（１９９３）；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３７４：１６８－７３（１９９５）；Ｈａｓｓａｎｚａｄｅｈ－Ｇｈａｓｓａｂｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｌｏｎｄ），８：１０１３－２６（２０１３）を参照）。基本的なＶＨＨは、Ｎ末端からＣ末端まで以下の構造：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４を有し、ＦＲ１～ＦＲ４はフレームワーク領域１～４をそれぞれ指し、ＣＤＲ１～ＣＤＲ３は相補性決定領域１～３を指す。
抗体の「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ「ＶＨ」及び「ＶＬ」と称され得る。これらのドメインは、概して抗体の最も可変的な部分（同じクラスの他の抗体に比べて）であり、抗原結合部位を含有する。ラクダ科の動物の種からの重鎖のみの抗体は単一重鎖可変領域を有し、これは「ＶＨＨ」と称される。
「可変」という用語は、可変ドメインのある特定のセグメントが、抗体間で大幅に配列が異なるという事実を指す。Ｖドメインは抗原結合を媒介し、特定の抗体の、その特定の抗原についての特異性を定義する。しかしながら、可変性は、可変ドメインの全体のスパンにわたって一様に分布していない。むしろ、可変性は、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインの両方中の超可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる３つのセグメントにおいて濃縮される。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。ネイティブ重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、４つのＦＲ領域を含み、当該領域の大部分はβシート立体配置を取り入れ、３つのＨＶＲによって接続され、当該ＨＶＲは、βシート構造を接続し、いくつかの事例においてβシート構造の一部を形成するループを形成する。各々の鎖中のＨＶＲはＦＲ領域によって非常に接近して一緒に保持され、他の鎖からのＨＶＲと共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照）。定常ドメインは、抗原への抗体の結合を直接的に関与しないが、様々なエフェクター機能（抗体依存性細胞毒性における抗体の参加等）を呈する。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含有する最小の抗体断片である。この断片は、１つ重鎖可変領域ドメイン及び１つ軽鎖可変領域ドメインが緊密な非共有結合で会合した二量体からなる。これらの２つのドメインの折り畳みから、抗原結合のためのアミノ酸残基を与え、抗原結合特異性を抗体へ付与する、６つの超可変ループ（Ｈ鎖及びＬ鎖から各々の３つのループ）が生じる。しかしながら、結合部位全体よりも低い親和性であるが、単一可変ドメイン（または抗原について特異的な３つのＨＶＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、抗原を認識し結合する能力を有する。
「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」としても省略される「一本鎖Ｆｖ」は、単一ポリペプチド鎖へと接続されるＶＨ抗体ドメイン及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含み、それによって、ｓＦｖは、抗原結合のために所望される構造を形成することが可能である。
本明細書において使用される時、「特異的に結合する」、「特異的に認識する」、または「について特異的である」という用語は、測定可能且つ再現性のある相互作用（標的と抗原結合タンパク質（抗原結合ドメイン、リガンド、操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ、またはキメラ受容体等）との間の結合等）を指し、当該相互作用は、生物学的分子を含む分子の不均一集団の存在下における標的の存在の決定要因である。例えば、標的（それはエピトープであり得る）に特異的に結合する抗原結合タンパク質は、当該抗原結合タンパク質が他の標的に結合するよりも高い親和性、アビディティーで、より容易に、及び／またはより長い継続期間で、この標的に結合する抗原結合タンパク質である。いくつかの実施形態において、関連しない標的への抗原結合タンパク質の結合の程度は、例えば放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）によって測定される時、標的への抗原結合タンパク質の結合の約１０％未満である。いくつかの実施形態において、特異的に標的を結合する抗原結合タンパク質は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、または≦０．１ｎＭの解離定数（Ｋｄ）を有する。いくつかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、異なる種からのタンパク質の中でも保存されたタンパク質上のエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、特異的な結合は排他的な結合を含み得るが、これを要求しない。
「特異性」という用語は、抗原の特定のエピトープについての抗原結合タンパク質（ＣＡＲまたは抗体等）の選択的認識を指す。天然の抗体は、例えば単一特異性である。「多重特異性」という用語は、本明細書において使用される時、抗原結合タンパク質（ＣＡＲまたは抗体等）が、２つ以上の抗原結合部位を有し、そのうちの少なくとも２つが異なる抗原を結合することを示す。「二重特異性」は、本明細書において使用される時、抗原結合タンパク質（ＣＡＲまたは抗体等）が２つの異なる抗原結合特異性を有することを示す。「単一特異性」という用語は、本明細書において使用される時、１つまたは複数の結合部位を有し、その各々が、同じ抗原を結合する、抗原結合タンパク質（ＣＡＲまたは抗体等）を示す。
「価」という用語は、本明細書において使用される時、抗原結合タンパク質（ＣＡＲまたは抗体等）中の結合部位の規定された数の存在を示す。例えば天然の抗体、または全長の抗体は、２つの結合部位を有し、二価である。それゆえ、「三価」、「四価で」、「五価」、及び「六価」という用語は、それぞれ抗原結合タンパク質（ＣＡＲまたは抗体等）中の２つの結合部位、３つの結合部位、４つの結合部位、５つの結合部位、及び６つの結合部位の存在を示す。
「細胞外ドメイン」という用語は、細胞の外側上の膜受容体の断片または部分を指す。細胞外ドメインは、リガンド結合ドメインまたは認識ドメイン（例えば本出願におけるＴＧＦβＲ１及びＴＧＦβＲ２のＴＧＦβ結合ドメイン）であるか、またはそれらを含む。
「細胞内ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、特殊化された機能を遂行するように細胞に指令するタンパク質の部分を指す。通常、細胞内ドメイン全体が用いられ得るが、いくつかの事例において、ドメイン全体を使用することは必要ではない。細胞内ドメインの短縮部分が使用される場合においては、かかる短縮部分は、エフェクター機能シグナルを伝達する限り、ドメイン全体の代わりに使用され得る。細胞内ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナリングドメインの任意の短縮部分を包含することを意味する。
「膜貫通ドメイン」または「ＴＭドメイン」という用語は、ポリペプチドを細胞の原形質膜へアンカーするドメインである。ＴＭドメインは、天然、合成、半合成、または組み換えの供給源に由来し得る。膜貫通ドメインは、細胞外ドメインまたは細胞内ドメインのいずれかと同じ受容体分子からであり得る。
「Ｆｃ領域」という用語は、本明細書において、ネイティブ配列Ｆｃ領域及びバリアントＦｃ領域を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するように使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、位置Ｃｙｓ２２６のアミノ酸残基から、またはＰｒｏ２３０から、そのカルボキシル末端まで伸びると定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵナンバリングシステムに従って残基４４７）は、例えば抗体の産生もしくは精製の間に、または抗体の重鎖をコードする核酸を組み換え操作することによって、除去され得る。したがって、インタクトな抗体の組成物は、すべてのＫ４４７残基が除去された抗体の集団、除去されたＫ４４７残基の無い抗体の集団、及びＫ４４７残基有り及び無しの抗体の混合物を有する抗体の集団を含み得る。本明細書において記載される抗体における使用に好適なネイティブ配列Ｆｃ領域としては、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２（ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ）、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４が挙げられる。
「結合親和性」は概して、分子（例えば抗体、ＣＡＲ）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば抗原）との間の非共有結合性相互作用の合計の強度を指す。別段の指摘のない限り、本明細書において使用される時、「結合親和性」は、結合ペアのメンバー（例えば抗体及び抗原、またはＣＡＲ及び抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹについての親和性は概して、解離定数（Ｋｄ）によって表わされ得る。親和性は、本明細書において記載されるものを包含する当技術分野において公知の一般的な方法によって測定され得る。低親和性抗体は概して、ゆっくり抗原に結合し、容易に解離する傾向があり、高度親和性抗体は概して、より迅速に抗原に結合し、より長く結合されたままである傾向がある。結合親和性を測定する様々な方法は当技術分野において公知であり、そのうちの任意のものは本出願の目的のために使用され得る。結合親和性の測定のための具体的な例証的且つ例示的な実施形態は、以下において記載される。
ペプチド、ポリペプチド、または核酸に関する「パーセント（％）配列同一性」及び「相同性」は、配列をアライメントさせ、必要であるならばギャップを導入して最大パーセント配列同一性を達成した後に、配列同一性の一部として任意の保存的置換を考慮せずに、特定のペプチド、ポリペプチド、または核酸配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドと同一である、候補配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドのパーセンテージとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアライメントは、例えば公的に利用可能なコンピューターソフトウェア（ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（商標）（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等）を使用して、当業者の範囲内の様々な手法で達成され得る。当業者であれば、比較されている配列の完全長にわたる最大のアライメントを達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを包含する、アライメントを測定するための適切なパラメーターを決定し得る。
「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」は、本明細書において使用される時、免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞等）の上に１つまたは複数の抗原特異性をグラフトするために使用され得る、遺伝子操作受容体を指す。いくつかのＣＡＲは、「人工Ｔ細胞受容体」、「キメラＴ細胞受容体」、または「キメラ免疫受容体」としても公知である。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、１つまたは複数の抗原（腫瘍抗原等）について特異的な細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及びＴ細胞の細胞内シグナリングドメイン、及び／または他の受容体を含む。「ＣＡＲ－Ｔ」は、ＣＡＲを発現するＴ細胞を指す。「ＧＰＣ３ ＣＡＲ」は、ＧＰＣ３について特異的な細胞外結合ドメインを有するＣＡＲを指す。「バイエピトープＣＡＲ」は、２つの異なるエピトープについて特異的な細胞外結合ドメインを有するＣＡＲを指す。
本明細書において記載される「単離された」核酸分子（例えば融合タンパク質、ＣＡＲ、または操作されたＴＣＲをコードする）は、それが産生された環境において通常会合する少なくとも１つの混入核酸分子から同定及び分離された核酸分子である。好ましくは、単離された核酸は、産生環境と関連するすべての構成要素との会合が無い。本明細書におけるポリペプチド及び抗体をコードする単離された核酸分子は、天然で見出される形態または設定以外の形態である。したがって、単離された核酸分子は、細胞中に天然に存在する本明細書のポリペプチド及び抗体をコードする核酸とは区別される。
核酸は、別の核酸配列と機能的関係性に配置される場合に、「作動可能に連結」されている。例えば、プレ配列もしくは分泌リーダーのためのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されるならば、ポリペプチドについてのＤＮＡへ作動可能に連結されている；またはプロモーターもしくはエンハンサーは、配列の転写に影響するならば、コーディング配列へ作動可能に連結される；またはリボソーム結合部位は、翻訳を促進するように位置するならば、コーディング配列へ作動可能に連結される。概して、「作動可能に連結される」は、連結されているＤＮＡ配列が連続していること、及び分泌リーダーの事例において、連続しており読み取り相であることを意味する。しかしながら、エンハンサーは連続する必要はない。連結は、好都合な制限部位でのライゲーションによって達成される。かかる部位が存在しないならば、合成オリゴヌクレオチドのアダプターまたはリンカーが慣習的な実践に従って使用される。
別段の定めのない限り、「アミノ酸配列をコードする核酸配列」は、互いの縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を包含する。タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という語句は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列がいくつかのバージョンにおいてイントロン（複数可）を含有し得る場合においては、イントロンも含み得る。
「ベクター」という用語は、本明細書において使用される時、それが連結される別の核酸を伝播することが可能な核酸分子を指す。当該用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、そしてそれが導入された宿主細胞のゲノムの中へ取り込まれたベクターを包含する。ある特定のベクターは、作動可能に連結された核酸の発現を指令することが可能ある。かかるベクターは、本明細書において「発現ベクター」として参照される。
「トランスフェクションされた」または「形質転換された」または「形質導入された」という用語は、本明細書において使用される時、外来性核酸が宿主細胞の中への移行または導入されるプロセスを指す。「トランスフェクションされた」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞は、外来性核酸によりトランスフェクション、形質転換、または形質導入されたものである。当該細胞は、初代対象細胞及びその子孫を包含する。
本明細書において使用される時、「治療」または「治療すること」は、有益なまたは所望される結果（臨床結果を包含する）を得るためのアプローチである。本発明の目的のために、有益なまたは所望される臨床結果としては、以下の：疾患からもたらされる１つまたは複数の症状の緩和、疾患の程度の減退、疾患の安定化（例えば疾患の悪化の予防または遅延）、疾患の蔓延（例えば転移）の予防または遅延、疾患の再発を予防または遅延、疾患の進行の遅延または減速、疾患状態の軽快疾患の寛解（部分または完全）の提供、疾患の治療に要求される１つまたは複数の他の医薬物の用量の減少、疾患の進行の遅延、生活の質の増加、及び／または生存の延長のうちの１つまたは複数が挙げられるがこれらに限定されない。がんの病理的帰結の低減も「治療」によって網羅される。本出願の方法は、治療のこれらの態様のうちの任意の１つまたは複数を企図する。
本明細書において使用される時、「個体」または「対象」は哺乳動物を指し、ヒト、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、齧歯動物、または霊長動物が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、個体はヒトである。
本明細書において使用される「有効量」という用語は、規定された障害、病態、または疾患を治療する（症状のうちの１つまたは複数（例えばがんまたは感染性疾患）を軽快、緩和、軽減、及び／または遅延させる等）のに十分な作用物質（本明細書において記載される操作されたＴ細胞、またはその医薬組成物等）の量を指す。がんに関して、有効量は、腫瘍の縮小、及び／または腫瘍の増殖速度の減少（腫瘍増殖の抑制等）、あるいは他の望まれない細胞増殖の予防または遅延を引き起こすのに十分な量を含む。いくつかの実施形態において、有効量は、発症を遅延させるのに十分な量である。いくつかの実施形態において、有効量は、再発を予防または遅延させるのに十分な量である。有効量は、１つまたは複数の投与で投与され得る。有効量の作用物質（例えば操作されたＴ細胞）または組成物は、（ｉ）がん細胞の数を低減し得る；（ｉｉ）腫瘍サイズを低減し得る；（ｉｉｉ）末梢器官の中へのがん細胞浸潤を、ある程度まで阻害、遅滞、減速、及び好ましくは停止し得る；（ｉｖ）腫瘍転移を阻害し得る（すなわちある程度まで減速、及び好ましくは停止し得る）；（ｖ）腫瘍増殖を阻害し得る；（ｖｉ）腫瘍の出現及び／または再発を予防または遅延し得る；及び／または（ｖｉｉ）がんと関連する症状のうちの１つもしくは複数をある程度まで救済し得る。感染性疾患（ウイルス感染症等）の事例において、治療有効量の本明細書において記載される操作されたＴ細胞またはその組成物は、病原体に感染した細胞の数を低減し得る；病原体に由来する抗原の産生もしくは放出を低減し得る；非感染細胞への病原体の蔓延を阻害し得る（すなわちある程度まで減速、及び好ましくは停止し得る）；及び／または感染症と関連する１つもしくは複数の症状をある程度まで救済し得る。いくつかの実施形態において、治療有効量は、患者の生存を延長する量である。
本明細書において使用される時、疾患の発症を「遅延させること」は、疾患（例えばがんまたは感染性疾患）の発症を、猶予、妨害、減速する、遅滞、安定化、及び／または延期することを意味する。この遅延は、疾患の履歴及び／または治療されている個体に依存して変動する時間長であり得る。当業者に明白であるように、十分なまたは有意な遅延は、個体が疾患を発症しないという点で、事実上、予防を網羅し得る。がんの発症を「遅延させる」方法は、方法を使用しないことに比較した場合に、所与の時間枠における疾患の発症の確率を低減する、及び／または所与の時間枠における疾患の程度を低減する方法である。かかる比較は、典型的には、統計的に有意な数の個体を使用する臨床試験に基づく。がんの発症は、コンピューター体軸断層撮影法（ＣＡＴスキャン）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、腹部超音波検査、凝固試験、動脈造影法、または生検が挙げられるがこれらに限定されない標準方法を使用して検出可能であり得る。発症は、最初に検出不可能であり得るがん進行も指すことがあり、出現、再発、及び開始が挙げられる。
本明細書において使用される時、「自己由来」という用語は、同じ個体に由来する任意の材料であって、それは後に当該個体の中へ再導入されるものを指すことを意味する。
「同種異系」は、同じ種の異なる個体に由来する移植片を指す。「同種異系Ｔ細胞」は、レシピエントに一致する組織ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）型を有するドナーからのＴ細胞を指す。典型的には、マッチングは、ＨＬＡ遺伝子の３つ以上遺伝子座での変動に基づいて遂行され、これらの遺伝子座で完全な一致が好ましい。いくつかの実例において、同種異系移植ドナーは、血縁者（通常非常によくＨＬＡが一致した兄弟）、同種同系（患者の一卵性「同一」双生児）、または非血縁者（血縁関係がなく、ＨＬＡ一致が非常に近い程度を有することが見出されたドナー）であり得る。ＨＬＡ遺伝子は、２つのカテゴリー（Ｉ型及びＩＩ型）に分類される。概して、Ｉ型遺伝子（すなわちＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、またはＨＬＡ－Ｃ）の不一致は、移植片拒絶のリスクを増加させる。ＨＬＡ ＩＩ型遺伝子（すなわちＨＬＡ－ＤＲまたはＨＬＡ－ＤＱＢ１）の不一致は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）のリスクを増加させる。
「患者」は、本明細書において使用される時、疾患（例えばがん、ウイルス感染症）に罹患する任意のヒトを包含する。「対象」、「個体」、及び「患者」という用語は、本明細書において、互換的に使用される。「ドナー対象」または「ドナー」という用語は、本明細書において、その細胞がさらなるインビトロの操作のために得られている対象を指す。ドナー対象は、本明細書において記載される方法によって生成された細胞集団により治療される予定の患者（すなわち自己由来ドナー）であり得るか、または異なる個体もしくは患者を治療するために使用される血液サンプル（例えばリンパ球サンプル）を、本明細書において記載される方法によって生成された細胞集団の生成に際して、供与する個体（すなわち同種異系ドナー）であり得る。本方法によって調製された細胞を受け取る対象は、「レシピエント」または「レシピエント対象」と称され得る。
「Ｔ細胞受容体」（または「ＴＣＲ」）という用語は、Ｔ細胞の表面上でペアになるαβ鎖またはγδ鎖から構成されるヘテロ二量体受容体を指す。各々のα鎖、β鎖、γ鎖、及びδ鎖は、２つのＩｇ様ドメイン：相補性決定領域（ＣＤＲ）を介して抗原認識を付与する可変ドメイン（Ｖ）、続いて、接続ペプチド及び膜貫通（ＴＭ）領域によって細胞膜へアンカーされる定常ドメイン（Ｃ）から構成される。ＴＭ領域は、ＣＤ３シグナリング装置の非可変サブユニットと会合する。Ｖドメインの各々は、３つのＣＤＲを有する。これらのＣＤＲは、主要組織適合性複合体によってコードされるタンパク質へ結合された抗原性ペプチド間の複合体（ｐＭＨＣ）と相互作用する（Ｄａｖｉｓ ａｎｄ Ｂｊｏｒｋｍａｎ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ，３３４，３９５－４０２；Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６，５２３－５４４；Ｍｕｒｐｈｙ（２０１２），ｘｉｘ，８６８ｐ．）。
「刺激」という用語は、本明細書において使用される時、細胞表面部分のライゲーションによって誘導される一次応答を指す。例えば、受容体の文脈において、かかる刺激は、受容体のライゲーション及び後続するシグナル伝達事象を伴う。Ｔ細胞の刺激に関して、かかる刺激は、Ｔ細胞表面部分のライゲーション（ＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合等）が、一実施形態において、後続するシグナル伝達事象を誘導することを指す。さらに、刺激事象は細胞を活性化し、分子の発現または分泌をアップレギュレートまたはダウンレギュレートし得る（ＴＧＦ－βのダウンレギュレーション等）。したがって、細胞表面部分のライゲーションは、直接的なシグナル伝達事象の非存在下においてでさえ、細胞骨格構造の再編成または細胞表面部分の合体をもたらし、その各々は、後続する細胞応答を促進、修飾、または変更を供し得る。
「活性化」という用語は、本明細書において使用される時、顕著な生化学的または形態学的変化を誘導するのに十分な細胞表面部分ライゲーション後の細胞の状態を指す。Ｔ細胞の文脈内で、かかる活性化は、細胞増殖を誘導するのに十分に刺激されたＴ細胞の状態を指す。Ｔ細胞の活性化は、サイトカイン産生、及び調節性または細胞溶解性のエフェクター機能のパフォーマンスも誘導し得る。他の細胞の文脈内で、この用語は、特定の物理化学的プロセスのアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションのいずれかを暗示する。「活性化されたＴ細胞」という用語は、細胞分裂、サイトカイン産生、調節性もしくは細胞溶解性のエフェクター機能パフォーマンスを現在経験している及び／または最近「活性化」のプロセスを経験したＴ細胞を指す。
「機能的外来性受容体」という用語は、本明細書において使用される時、Ｔ細胞、または本明細書において記載される融合タンパク質発現Ｔ細胞の中へ導入された後に、その生物学的活性を保持する外来性受容体（例えばＣＡＲ、操作された受容体、操作されたＴＣＲ、または抗体とカップルされるＴＣＲ（ＡＣＴＲ））を指す。生物学的活性としては、分子（例えばがん抗原、またはＡＣＴＲについての抗体）へ特異的に結合し、下流シグナル（細胞増殖、サイトカイン産生、及び／または調節性もしくは細胞溶解性のエフェクター機能のパフォーマンスの誘導等）を適切に伝達することにおける外来性受容体の能力が挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書において記載される本出願の実施形態は、「からなる」実施形態及び／または「から本質的になる」実施形態を包含することが理解される。
本明細書における値またはパラメーターの「約」への参照は、その値またはパラメーターそれ自体に関する変動を包含する（及び記載する）。例えば、「約Ｘ」を参照する記載は、「Ｘ」の記載を包含する。
本明細書において使用される時、値またはパラメーターの「ではない」への参照は、概して、値またはパラメーターの「以外」を意味及び記載する。例えば、方法がＸ型のがんを治療するために使用されないとは、方法がＸ型以外のがんを治療するために使用されることを意味する。
本明細書において使用される「約Ｘ～Ｙ」という用語は、「約Ｘ～約Ｙ」と同じ意味を有する。
本明細書及び添付の請求項において使用される時、単数形「１つの（ａ）」、「または（ｏｒ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別段明らかに指示しない限り、複数の指示対象を包含する。
ＩＩ．本発明の融合タンパク質
本出願は、一態様において、ａ）ｉ）ＴＧＦβＲ１またはＴＧＦβＲ２のうちの一方の細胞外ドメインを含む第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）第１の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）ＩＬ－１２Ｒβ１またはＩＬ－２３Ｒのうちの一方の細胞内ドメインを含む第１の細胞内ドメイン、を含む、第１のポリペプチドと；ｂ）ｉ）ＴＧＦβＲ１またはＴＧＦβＲ２のうちの他方の細胞外ドメインを含む第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）第２の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）ＩＬ－１２Ｒβ１またはＩＬ－２３Ｒのうちの他方の細胞内ドメインを含む第２の細胞内ドメイン、を含む、第２のポリペプチドとを含む融合タンパク質を提供する。
いくつかの実施形態において、ａ）ｉ）ＴＧＦβＲ１の細胞外ドメインを含む第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）ＴＧＦβＲ１の膜貫通ドメインを含む第１の膜貫通ドメイン、ｉｉｉ）ＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインを含む第１の細胞内ドメイン、を含む、第１のポリペプチドと；ｂ）ｉ）ＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインを含む第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）ＴＧＦβＲ２の膜貫通ドメインを含む第２の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）ＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメインを含む第２の細胞内ドメイン、を含む、第２のポリペプチドとを含む融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態において、ＴＧＦβＲ１の細胞外ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態において、ＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインは、配列番号４のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態において、ＴＧＦβＲ１の膜貫通ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態において、ＴＧＦβＲ２の膜貫通ドメインは、配列番号６のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態において、ＴＧＦβＲ１またはＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインは、ＴＧＦβＲ１またはＴＧＦβＲ２の突然変異細胞外ドメインまたは短縮された細胞外ドメインである。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２Ｒβ１またはＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインは、ＩＬ－１２Ｒβ１またはＩＬ－２３Ｒの突然変異細胞内ドメインまたは短縮された細胞内ドメインである。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３Ｒの突然変異細胞内ドメインまたは短縮された細胞内ドメインは、配列番号１７もしくは１８のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを有する。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２Ｒβ１の短縮された細胞内ドメインは、配列番号１９のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有するバリアントを有する。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド及び／または第２のポリペプチドは、ポリペプチドのＮ末端においてシグナルペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドはＴＧＦβＲ１またはＴＧＦβＲ２からのシグナルペプチドであり、任意選択で、ポリペプチド中のシグナルペプチド及び細胞外ドメインは同じ分子に由来する。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは配列番号１または２のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、第１の細胞外ドメイン及び第２の細胞外ドメインは、ＴＧＦβに対する結合部位を形成し、第１の細胞内ドメイン及び第２の細胞内ドメインは、ＩＬ－２３受容体複合体を形成し、ＴＧＦβへの融合タンパク質の結合によりＩＬ－２３受容体複合体を介するシグナリングが伝達される。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド及び／または第２のポリペプチドは、膜貫通ドメインと細胞内ドメインとの間に膜近傍ペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、膜近傍ペプチドは約３～約４０アミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態において、膜近傍ペプチドは、ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２、ＩＬ－２３Ｒ、またはＩＬ－１２Ｒβ１の膜近傍領域に由来する。いくつかの実施形態において、膜近傍ペプチドは、配列番号９～１２のうちの任意のものにおいて示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３受容体複合体細胞内ドメインを介して媒介されたシグナルは、ＴＧＦβの結合により細胞外ドメインから融合タンパク質の細胞内ドメインへ伝達される。
いくつかの実施形態において、ａ）ｉ）ＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインを含む第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）ＴＧＦβＲ２の膜貫通ドメインを含む第１の膜貫通ドメイン、ｉｉｉ）ＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインを含む第１の細胞内ドメイン、を含む、第１のポリペプチドと；ｂ）ｉ）ＴＧＦβＲ１の細胞外ドメインを含む第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）ＴＧＦβＲ１の膜貫通ドメインを含む第２の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）ＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメインを含む第２の細胞内ドメイン、を含む、第２のポリペプチドとを含む融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態において、ＴＧＦβＲ１の細胞外ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態において、ＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインは、配列番号４のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態において、ＴＧＦβＲ１の膜貫通ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態において、ＴＧＦβＲ２の膜貫通ドメインは、配列番号６のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態において、ＴＧＦβＲ１またはＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインは、ＴＧＦβＲ１またはＴＧＦβＲ２の突然変異細胞外ドメインまたは短縮された細胞外ドメインである。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２Ｒβ１またはＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインは、ＩＬ－１２Ｒβ１またはＩＬ－２３Ｒの突然変異細胞内ドメインまたは短縮された細胞内ドメインである。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３Ｒの突然変異細胞内ドメインまたは短縮された細胞内ドメインは、配列番号１７もしくは１８のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを有する。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２Ｒβ１の短縮された細胞内ドメインは、配列番号１９のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有するバリアントを有する。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド及び／または第２のポリペプチドは、ポリペプチドのＮ末端においてシグナルペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドはＴＧＦβＲ１またはＴＧＦβＲ２からのシグナルペプチドであり、任意選択で、ポリペプチド中のシグナルペプチド及び細胞外ドメインは同じ分子に由来する。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは配列番号１または２のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、第１の細胞外ドメイン及び第２の細胞外ドメインは、ＴＧＦβに対する結合部位を形成し、第１の細胞内ドメイン及び第２の細胞内ドメインは、ＩＬ－２３受容体複合体を形成し、ＴＧＦβへの融合タンパク質の結合によりＩＬ－２３受容体複合体を介するシグナリングが伝達される。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド及び／または第２のポリペプチドは、膜貫通ドメインと細胞内ドメインとの間に膜近傍ペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、膜近傍ペプチドは約３～約４０アミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態において、膜近傍ペプチドは、ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２、ＩＬ－２３Ｒ、またはＩＬ－１２Ｒβ１の膜近傍領域に由来する。いくつかの実施形態において、膜近傍ペプチドは、配列番号９～１２のうちの任意のものにおいて示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３受容体複合体細胞内ドメインを介して媒介されたシグナルは、ＴＧＦβの結合により細胞外ドメインから融合タンパク質の細胞内ドメインへ伝達される。
いくつかの実施形態において、ａ）ｉ）ＴＧＦβＲ１の細胞外ドメインを含む第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）ＩＬ－２３Ｒの膜貫通ドメインを含む第１の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）ＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインを含む第１の細胞内ドメイン、を含む、第１のポリペプチドと；ｂ）ｉ）ＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインを含む第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）ＩＬ－１２Ｒβ１の膜貫通ドメインを含む第２の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）ＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメインを含む第２の細胞内ドメイン、を含む、第２のポリペプチドとを含む融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態において、ＴＧＦβＲ１の細胞外ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態において、ＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインは、配列番号４のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３Ｒの膜貫通ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２Ｒβ１の膜貫通ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態において、ＴＧＦβＲ１またはＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインは、ＴＧＦβＲ１またはＴＧＦβＲ２の突然変異細胞外ドメインまたは短縮された細胞外ドメインである。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２Ｒβ１またはＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインは、ＩＬ－１２Ｒβ１またはＩＬ－２３Ｒの突然変異細胞内ドメインまたは短縮された細胞内ドメインである。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３Ｒの突然変異細胞内ドメインまたは短縮された細胞内ドメインは、配列番号１７もしくは１８のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを有する。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２Ｒβ１の短縮された細胞内ドメインは、配列番号１９のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有するバリアントを有する。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド及び／または第２のポリペプチドは、ポリペプチドのＮ末端においてシグナルペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドはＴＧＦβＲ１またはＴＧＦβＲ２からのシグナルペプチドであり、任意選択で、ポリペプチド中のシグナルペプチド及び細胞外ドメインは同じ分子に由来する。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは配列番号１または２のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、第１の細胞外ドメイン及び第２の細胞外ドメインは、ＴＧＦβに対する結合部位を形成し、第１の細胞内ドメイン及び第２の細胞内ドメインは、ＩＬ－２３受容体複合体を形成し、ＴＧＦβへの融合タンパク質の結合によりＩＬ－２３受容体複合体を介するシグナリングが伝達される。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド及び／または第２のポリペプチドは、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間に膜近傍ペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、膜近傍ペプチドは約３～約４０アミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態において、膜近傍ペプチドは、ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２、ＩＬ－２３Ｒ、またはＩＬ－１２Ｒβ１の膜近傍領域に由来する。いくつかの実施形態において、膜近傍ペプチドは、配列番号９～１２のうちの任意のものにおいて示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３受容体複合体細胞内ドメインを介して媒介されたシグナルは、ＴＧＦβの結合により細胞外ドメインから融合タンパク質の細胞内ドメインへ伝達される。
いくつかの実施形態において、ａ）ｉ）ＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインを含む第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）ＩＬ－２３Ｒの膜貫通ドメインを含む第１の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）ＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインを含む第１の細胞内ドメイン、を含む、第１のポリペプチドと；ｂ）ｉ）ＴＧＦβＲ１の細胞外ドメインを含む第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）ＩＬ－１２Ｒβ１の膜貫通ドメインを含む第２の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）ＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメインを含む第２の細胞内ドメイン、を含む、第２のポリペプチドとを含む融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態において、ＴＧＦβＲ１の細胞外ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態において、ＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインは、配列番号４のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３Ｒの膜貫通ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２Ｒβ１の膜貫通ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態において、ＴＧＦβＲ１またはＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインは、ＴＧＦβＲ１またはＴＧＦβＲ２の突然変異細胞外ドメインまたは短縮された細胞外ドメインである。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２Ｒβ１またはＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインは、ＩＬ－１２Ｒβ１またはＩＬ－２３Ｒの突然変異細胞内ドメインまたは短縮された細胞内ドメインである。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３Ｒの突然変異細胞内ドメインまたは短縮された細胞内ドメインは、配列番号１７もしくは１８のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを有する。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２Ｒβ１の短縮された細胞内ドメインは、配列番号１９のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有するバリアントを有する。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド及び／または第２のポリペプチドは、ポリペプチドのＮ末端においてシグナルペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドはＴＧＦβＲ１またはＴＧＦβＲ２からのシグナルペプチドであり、任意選択で、ポリペプチド中のシグナルペプチド及び細胞外ドメインは同じ分子に由来する。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは配列番号１または２のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、第１の細胞外ドメイン及び第２の細胞外ドメインは、ＴＧＦβに対する結合部位を形成し、第１の細胞内ドメイン及び第２の細胞内ドメインは、ＩＬ－２３受容体複合体を形成し、ＴＧＦβへの融合タンパク質の結合によりＩＬ－２３受容体複合体を介するシグナリングが伝達される。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドは、第１の細胞外ドメインと第１の膜貫通ドメインとの間に第１の膜近傍配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドは、第２の細胞外ドメインと第２の膜貫通ドメインとの間に第２の膜近傍配列をさらに含む。膜近傍配列は、柔軟性を提供するため、及び／または融合タンパク質もしくはシグナル伝達の寿命を促進するために、２つの機能ドメインの間の移行として働き得る。いくつかの実施形態において、第１及び／または第２のポリペプチド中の第１または第２の膜近傍ドメイン及び第１または第２の膜貫通ドメインは、同じ分子に由来する。いくつかの実施形態において、第１及び／または第２の膜近傍ペプチドは、ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２、ＩＬ－２３Ｒ、またはＩＬ－１２Ｒβ１の膜近傍領域に由来する。いくつかの実施形態において、第１及び／または第２の膜近傍ドメインは約３～約４０アミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態において、膜近傍ペプチドは、配列番号９～１２のうちの任意のものにおいて示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の膜近傍ペプチドは、ＩＬ－２３Ｒ（例えば配列番号１１）に由来し、及び／または第２の近位ペプチドはＩＬ－１２Ｒβ１（例えば配列番号１２）に由来する。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３受容体複合体細胞内ドメインを介して媒介されたシグナルは、ＴＧＦβの結合により細胞外ドメインから融合タンパク質の細胞内ドメインへ伝達される。
いくつかの実施形態において、ａ）ｉ）配列番号３のアミノ酸配列または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む、第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有するバリアントを含む、第１の膜貫通ドメイン、ｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む、第１の細胞内ドメインを含む、第１のポリペプチドと；ｂ）ｉ）配列番号４のアミノ酸配列または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む、第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有するバリアントを含む、第２の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）配列番号１６、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む第２の細胞内ドメインを含む、第２のポリペプチドとを含む融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドは、第１の膜貫通ドメインと第１の細胞内ドメインとの間にリンカー（例えば膜近傍配列）をさらに含み、任意選択で、リンカーは、配列番号９のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有するバリアントを含む。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドは、第２の膜貫通ドメインと第２の細胞内ドメインとの間にリンカー（例えば膜近傍配列）をさらに含み、任意選択で、リンカーは、配列番号１０のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有するバリアントを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３受容体複合体細胞内ドメインを介して媒介されたシグナルは、ＴＧＦβの結合により細胞外ドメインから融合タンパク質の細胞内ドメインへ伝達される。
いくつかの実施形態において、ａ）ｉ）配列番号４のアミノ酸配列または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む、第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有するバリアントを含む、第１の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む、第１の細胞内ドメインを含む、第１のポリペプチドと；ｂ）ｉ）配列番号３のアミノ酸配列または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む、第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有するバリアントを含む、第２の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む、第２の細胞内ドメインを含む、第２のポリペプチドとを含む融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドは、第１の膜貫通ドメインと第１の細胞内ドメインとの間にリンカー（例えば膜近傍配列）をさらに含み、任意選択で、リンカーは、配列番号１０のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有するバリアントを含む。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドは、第２の膜貫通ドメインと第２の細胞内ドメインとの間にリンカー（例えば膜近傍配列）をさらに含み、任意選択で、リンカーは、配列番号９のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有するバリアントを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３受容体複合体細胞内ドメインを介して媒介されたシグナルは、ＴＧＦβの結合により細胞外ドメインから融合タンパク質の細胞内ドメインへ伝達される。
いくつかの実施形態において、ａ）ｉ）配列番号３のアミノ酸配列または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む、第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有するバリアントを含む、第１の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む、第１の細胞内ドメインを含む、第１のポリペプチドと；ｂ）ｉ）配列番号４のアミノ酸配列または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む、第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有するバリアントを含む、第２の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む、第２の細胞内ドメインを含む、第２のポリペプチドとを含む融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドは、第１の細胞外ドメインと第１の膜貫通ドメインとの間にリンカー（例えば膜近傍配列）をさらに含み、任意選択で、リンカーは、配列番号１１のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有するバリアントを含む。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドは、第２の細胞外ドメインと第２の膜貫通ドメインとの間にリンカー（例えば膜近傍配列）をさらに含み、任意選択で、リンカーは、配列番号１２のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有するバリアントを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３受容体複合体細胞内ドメインを介して媒介されたシグナルは、ＴＧＦβの結合により細胞外ドメインから融合タンパク質の細胞内ドメインへ伝達される。
いくつかの実施形態において、ａ）ｉ）配列番号４のアミノ酸配列または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む、第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有するバリアントを含む、第１の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む、第１の細胞内ドメインを含む、第１のポリペプチドと；ｂ）ｉ）配列番号３のアミノ酸配列または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む、第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有するバリアントを含む、第２の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む、第２の細胞内ドメインを含む、第２のポリペプチドとを含む融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドは、第１の細胞外ドメインと第１の膜貫通ドメインとの間にリンカー（例えば膜近傍配列）をさらに含み、任意選択で、リンカーは、配列番号１１のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有するバリアントを含む。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドは、第２の細胞外ドメインと第２の膜貫通ドメインとの間にリンカー（例えば膜近傍配列）をさらに含み、任意選択で、リンカーは、配列番号１２のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有するバリアントを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３受容体複合体細胞内ドメインを介して媒介されたシグナルは、ＴＧＦβの結合により細胞外ドメインから融合タンパク質の細胞内ドメインへ伝達される。
いくつかの実施形態において、ａ）ｉ）配列番号３のアミノ酸配列または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む、第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有するバリアントを含む、第１の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有するバリアントを含む、第１の細胞内ドメインを含む、第１のポリペプチドと；ｂ）ｉ）配列番号４のアミノ酸配列または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む、第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有するバリアントを含む、第２の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む、第２の細胞内ドメインを含む、第２のポリペプチドとを含む融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドは、第１の細胞外ドメインと第１の膜貫通ドメインとの間にリンカー（例えば膜近傍配列）をさらに含み、任意選択で、リンカーは、配列番号１１のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有するバリアントを含む。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドは、第２の細胞外ドメインと第２の膜貫通ドメインとの間にリンカー（例えば膜近傍配列）をさらに含み、任意選択で、リンカーは、配列番号１２のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有するバリアントを含む。
いくつかの実施形態において、ａ）ｉ）配列番号３のアミノ酸配列または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む、第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有するバリアントを含む、第１の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有するバリアントを含む、第１の細胞内ドメインを含む、第１のポリペプチドと；ｂ）ｉ）配列番号４のアミノ酸配列または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む、第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有するバリアントを含む、第２の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有するバリアントを含む、第２の細胞内ドメインを含む、第２のポリペプチドとを含む融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドは、第１の細胞外ドメインと第１の膜貫通ドメインとの間にリンカー（例えば膜近傍配列）をさらに含み、任意選択で、リンカーは、配列番号１１のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有するバリアントを含む。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドは、第２の細胞外ドメインと第２の膜貫通ドメインとの間にリンカー（例えば膜近傍配列）をさらに含み、任意選択で、リンカーは、配列番号１２のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有するバリアントを含む。
いくつかの実施形態において、ａ）Ｎ末端からＣ末端の方向へ、ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む第１の膜貫通ドメイン、ｉｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含む第１のリンカー、及びｉｖ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む第１の細胞内ドメイン、を含む、第１のポリペプチドと；ｂ）Ｎ末端からＣ末端の方向へ、ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含む第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含む第２の膜貫通ドメイン、ｉｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む第２のリンカー、及びｉｖ）配列番号１６を含む第２の細胞内ドメイン、を含む、第２のポリペプチドとを含む融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３受容体複合体細胞内ドメインを介して媒介されたシグナルは、ＴＧＦβの結合により細胞外ドメインから融合タンパク質の細胞内ドメインへ伝達される。
いくつかの実施形態において、ａ）Ｎ末端からＣ末端の方向へ、ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含む第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含む第１の膜貫通ドメイン、ｉｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含む第１のリンカー、及びｉｖ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む第１の細胞内ドメイン、を含む、第１のポリペプチドと；ｂ）Ｎ末端からＣ末端の方向へ、ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む第２の膜貫通ドメイン、ｉｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含む第２のリンカー、及びｉｖ）配列番号１６を含む第２の細胞内ドメイン、を含む、第２のポリペプチドとを含む融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３受容体複合体細胞内ドメインを介して媒介されたシグナルは、ＴＧＦβの結合により細胞外ドメインから融合タンパク質の細胞内ドメインへ伝達される。
いくつかの実施形態において、ａ）Ｎ末端からＣ末端の方向へ、ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む第１のリンカー、ｉｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含む第１の膜貫通ドメイン、及びｉｖ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む第１の細胞内ドメイン、を含む、第１のポリペプチドと；ｂ）Ｎ末端からＣ末端の方向へ、ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含む第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含む第２のリンカー、ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含む第２の膜貫通ドメイン、及びｉｖ）配列番号１６を含む第２の細胞内ドメイン、を含む、第２のポリペプチドとを含む融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３受容体複合体細胞内ドメインを介して媒介されたシグナルは、ＴＧＦβの結合により細胞外ドメインから融合タンパク質の細胞内ドメインへ伝達される。
いくつかの実施形態において、ａ）Ｎ末端からＣ末端の方向へ、ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含む第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む第１のリンカー、ｉｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含む第１の膜貫通ドメイン、及びｉｖ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む第１の細胞内ドメイン、を含む、第１のポリペプチドと；ｂ）Ｎ末端からＣ末端の方向へ、ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含む第２のリンカー、ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含む第２の膜貫通ドメイン、及びｉｖ）配列番号１６を含む第２の細胞内ドメイン、を含む、第２のポリペプチドとを含む融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３受容体複合体細胞内ドメインを介して媒介されたシグナルは、ＴＧＦβの結合により細胞外ドメインから融合タンパク質の細胞内ドメインへ伝達される。
いくつかの実施形態において、ａ）Ｎ末端からＣ末端の方向へ、ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む第１のリンカー、ｉｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含む第１の膜貫通ドメイン、及びｉｖ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む第１の細胞内ドメイン、を含む、第１のポリペプチドと；ｂ）Ｎ末端からＣ末端の方向へ、ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含む第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含む第２のリンカー、ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含む第２の膜貫通ドメイン、及びｉｖ）配列番号１６を含む第２の細胞内ドメイン、を含む、第２のポリペプチドとを含む融合タンパク質が提供される。
いくつかの実施形態において、ａ）Ｎ末端からＣ末端の方向へ、ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む第１のリンカー、ｉｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含む第１の膜貫通ドメイン、及びｉｖ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む第１の細胞内ドメイン、を含む、第１のポリペプチドと；ｂ）Ｎ末端からＣ末端の方向へ、ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含む第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含む第２のリンカー、ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含む第２の膜貫通ドメイン、及びｉｖ）配列番号１９を含む第２の細胞内ドメイン、を含む、第２のポリペプチドとを含む融合タンパク質が提供される。
いくつかの実施形態において、ａ）配列番号４９のアミノ酸配列または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む、第１のポリペプチドと、ｂ）配列番号５０のアミノ酸配列または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む、第２のポリペプチドとを含む融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３受容体複合体細胞内ドメインを介して媒介されたシグナルは、ＴＧＦβの結合により細胞外ドメインから融合タンパク質の細胞内ドメインへ伝達される。
いくつかの実施形態において、ａ）配列番号５０のアミノ酸配列または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む、第１のポリペプチドと、ｂ）配列番号４９のアミノ酸配列または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む、第２のポリペプチドとを含む融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３受容体複合体細胞内ドメインを介して媒介されたシグナルは、ＴＧＦβの結合により細胞外ドメインから融合タンパク質の細胞内ドメインへ伝達される。
いくつかの実施形態において、ａ）配列番号５１のアミノ酸配列または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む、第１のポリペプチドと、ｂ）配列番号５２のアミノ酸配列または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む、第２のポリペプチドとを含む融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３受容体複合体細胞内ドメインを介して媒介されたシグナルは、ＴＧＦβの結合により細胞外ドメインから融合タンパク質の細胞内ドメインへ伝達される。
いくつかの実施形態において、ａ）配列番号５３のアミノ酸配列または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む、第１のポリペプチドと、ｂ）配列番号５４のアミノ酸配列または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む、第２のポリペプチドとを含む融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３受容体複合体細胞内ドメインを介して媒介されたシグナルは、ＴＧＦβの結合により細胞外ドメインから融合タンパク質の細胞内ドメインへ伝達される。
いくつかの実施形態において、ａ）配列番号５５のアミノ酸配列または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む、第１のポリペプチドと、ｂ）配列番号５６のアミノ酸配列または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む、第２のポリペプチドとを含む融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３受容体複合体細胞内ドメインを介して媒介されたシグナルは、ＴＧＦβの結合により細胞外ドメインから融合タンパク質の細胞内ドメインへ伝達される。
いくつかの実施形態において、ａ）配列番号５６のアミノ酸配列または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む、第１のポリペプチドと、ｂ）配列番号５５のアミノ酸配列または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む、第２のポリペプチドとを含む融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３受容体複合体細胞内ドメインを介して媒介されたシグナルは、ＴＧＦβの結合により細胞外ドメインから融合タンパク質の細胞内ドメインへ伝達される。
いくつかの実施形態において、配列番号２０～２７（例えば配列番号２０～２５）のうちの任意のものにおいて示されるアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む、融合タンパク質が提供される。
いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド及び／または第２のポリペプチドは、ポリペプチドのＮ末端においてシグナルペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドはＴＧＦβＲ１またはＴＧＦβＲ２からのシグナルペプチドであり、任意選択で、ポリペプチド中のシグナルペプチド及び細胞外ドメインは同じ分子に由来する。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは配列番号１または２のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、第１の細胞外ドメイン及び第２の細胞外ドメインは、ＴＧＦβに対する結合部位を形成し、第１の細胞内ドメイン及び第２の細胞内ドメインは、ＩＬ－２３受容体複合体を形成し、ＴＧＦβへの融合タンパク質の結合によりＩＬ－２３受容体複合体を介するシグナリングが伝達される。
いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは単一ポリペプチドの状態であり、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドはマルチシストロン性エレメントによって分離されている。いくつかの実施形態において、マルチシストロン性エレメントは、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａからなる群から選択される２Ａ自己切断ペプチドを含む。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドは、第２のポリペプチドにとってＮ末端側である。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドは第２のポリペプチドにとってＣ末端側である。
いくつかの実施形態において、Ｎ末端からＣ末端の方向へ、以下：ＴＧＦβＲ１の細胞外ドメインを含む第１の細胞外ドメイン、ＴＧＦβＲ１の膜貫通ドメインを含む第１の膜貫通ドメイン、ＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインを含む第１の細胞内ドメイン、２Ａ自己切断ペプチド、ＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインを含む第２の細胞外ドメイン、ＴＧＦβＲ２の膜貫通ドメインを含む第２の膜貫通ドメイン、及びＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメインを含む第２の細胞内ドメイン、を含む、単一ポリペプチドを含む、融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３受容体複合体細胞内ドメインを介して媒介されたシグナルは、ＴＧＦβの結合により細胞外ドメインから融合タンパク質の細胞内ドメインへ伝達される。
いくつかの実施形態において、Ｎ末端からＣ末端の方向へ、以下：ＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインを含む第１の細胞外ドメイン、ＴＧＦβＲ２の膜貫通ドメインを含む第１の膜貫通ドメイン、ＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインを含む第１の細胞内ドメイン、２Ａ自己切断ペプチド、ＴＧＦβＲ１の細胞外ドメインを含む第２の細胞外ドメイン、ＴＧＦβＲ１の膜貫通ドメインを含む第２の膜貫通ドメイン、及びＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメインを含む第２の細胞内ドメイン、を含む、単一ポリペプチドを含む、融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３受容体複合体細胞内ドメインを介して媒介されたシグナルは、ＴＧＦβの結合により細胞外ドメインから融合タンパク質の細胞内ドメインへ伝達される。
いくつかの実施形態において、Ｎ末端からＣ末端の方向へ、以下：ＴＧＦβＲ１の細胞外ドメインを含む第１の細胞外ドメイン、ＴＧＦβＲ１の膜貫通ドメインを含む第１の膜貫通ドメイン、ＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメインを含む第１の細胞内ドメイン、２Ａ自己切断ペプチド、ＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインを含む第２の細胞外ドメイン、ＴＧＦβＲ２の膜貫通ドメインを含む第２の膜貫通ドメイン、及びＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインを含む第２の細胞内ドメイン、を含む、単一ポリペプチドを含む、融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３受容体複合体細胞内ドメインを介して媒介されたシグナルは、ＴＧＦβの結合により細胞外ドメインから融合タンパク質の細胞内ドメインへ伝達される。
いくつかの実施形態において、Ｎ末端からＣ末端の方向へ、以下：ＴＧＦβＲ１の細胞外ドメインを含む第１の細胞外ドメイン、ＩＬ－２３Ｒの膜貫通ドメインを含む第１の膜貫通ドメイン、ＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインを含む第１の細胞内ドメイン、２Ａ自己切断ペプチド、ＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインを含む第２の細胞外ドメイン、ＩＬ－１２Ｒβ１の膜貫通ドメインを含む第２の膜貫通ドメイン、及びＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメインを含む第２の細胞内ドメイン、を含む、単一ポリペプチドを含む、融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３受容体複合体細胞内ドメインを介して媒介されたシグナルは、ＴＧＦβの結合により細胞外ドメインから融合タンパク質の細胞内ドメインへ伝達される。
いくつかの実施形態において、Ｎ末端からＣ末端の方向へ、以下：ＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインを含む第１の細胞外ドメイン、ＩＬ－２３Ｒの膜貫通ドメインを含む第１の膜貫通ドメイン、ＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインを含む第１の細胞内ドメイン、２Ａ自己切断ペプチド、ＴＧＦβＲ１の細胞外ドメインを含む第２の細胞外ドメイン、ＩＬ－１２Ｒβ１の膜貫通ドメインを含む第２の膜貫通ドメイン、及びＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメインを含む第２の細胞内ドメイン、を含む、単一ポリペプチドを含む、融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３受容体複合体細胞内ドメインを介して媒介されたシグナルは、ＴＧＦβの結合により細胞外ドメインから融合タンパク質の細胞内ドメインへ伝達される。
いくつかの実施形態において、Ｎ末端からＣ末端の方向へ、以下：ＴＧＦβＲ１の細胞外ドメインを含む第１の細胞外ドメイン、ＩＬ－１２Ｒβ１の膜貫通ドメインを含む第１の膜貫通ドメイン、ＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメインを含む第１の細胞内ドメイン、２Ａ自己切断ペプチド、ＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインを含む第２の細胞外ドメイン、ＩＬ－２３Ｒの膜貫通ドメインを含む第２の膜貫通ドメイン、及びＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインを含む第２の細胞内ドメイン、を含む、単一ポリペプチドを含む、融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３受容体複合体細胞内ドメインを介して媒介されたシグナルは、ＴＧＦβの結合により細胞外ドメインから融合タンパク質の細胞内ドメインへ伝達される。
いくつかの実施形態において、配列番号２８～３５のうちの任意のもの（例えば配列番号２８～３３）において示される核酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む核酸によってコードされた融合タンパク質が提供される。
ＴＧＦβシグナリング、ＴＧＦβＲ１及びＴＧＦβＲ２
ＴＧＦ－β（３つのアイソフォームを包含する）は、ほぼすべての細胞型及び組織において哺乳動物の発生、分化、及び恒常性を調節する強力な多面的なサイトカインである。３つのＴＧＦ－βアイソフォーム（ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、及びＴＧＦ－β３）の各々は、最初にプロＴＧＦ－βとして公知の７５ｋＤａのホモ二量体として合成される。次いでプロＴＧＦ－βはゴルジ中で切断されて、成熟ＴＧＦ－βホモ二量体を形成する。これらの２５ｋＤａのホモ二量体は潜伏関連タンパク質と相互作用して、小潜伏複合体を形成する。小胞体において、単一潜伏ＴＧＦ－β結合タンパク質は、ＴＧＦ－βホモ二量体とジスルフィド結合を形成して、大潜伏複合体を形成し、細胞外マトリックスへの標的輸送を可能にする。輸送後に、大潜伏複合体は、細胞膜上のフィブロネクチン線維及びヘパリン硫酸プロテオグリカンと相互作用する。最終的には、大潜伏複合体は、細胞外マトリックス中のフィブリリンリッチ微小線維へ局在し、活性化されるまでそこで保管される。そこで、潜伏ＴＧＦ－βは保管され、活性化されるまで生物学的に利用不可能なままである。潜伏ＴＧＦ－βは、複数の因子（プロテアーゼ、トロンボスポンジン１、活性酸素種、及びインテグリンが挙げられる）によって活性化される。これらの因子は、微小線維結合大潜伏複合体から成熟ＴＧＦ－βを遊離することによって、成熟ＴＧＦ－βを放出する。これは、潜伏関連タンパク質からの遊離、潜伏ＴＧＦ－β結合タンパク質の分解、または潜伏複合体立体配座の修飾を介して起こる。
一旦リガンドが活性化されたならば、ＴＧＦ－βシグナリングはＳＭＡＤ経路及び非ＳＭＡＤ経路を介して媒介されて、転写、翻訳、マイクロＲＮＡ生合成、タンパク質合成、及び翻訳後修飾を調節する。ＴＧＦ－βの下流の効果は状況に非常に依存するが、そのシグナリングは、多くの細胞型において少なくとも部分的に保存される。カノニカルな経路において、ＴＧＦ－βリガンドは、２型ＴＧＦ－β受容体（ＴＧＦβＲ２）へ結合し、それは１型ＴＧＦ－β受容体（ＴＧＦβＲ１）を動員する。これらの受容体は二量体化し、セリン残基／スレオニン残基を自己リン酸化し、ＴＧＦβＲ１によるＳＭＡＤ２及びＳＭＡＤ３のリン酸化を可能にする。ここで活性化されたＳＭＡＤタンパク質は、受容体活性化のためのＳＭＡＤアンカー（ＳＡＲＡ）タンパク質から解離し、ＳＭＡＤ４とヘテロオリゴマー化し、核へ移行し、無数の転写コレギュレーター及び他の因子と相互作用して、標的遺伝子の発現または抑制を媒介する。
ヒトのＴＧＦβＲ１タンパク質またはＴＧＦβＲ２タンパク質の複数の天然のアイソフォームが公知である。本明細書において記載されるＴＧＦβＲ１またはＴＧＦβＲ２のドメインまたは領域（ＴＧＦβＲ１またはＴＧＦβＲ２の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、または膜近傍領域等）は、ＴＧＦβＲ１またはＴＧＦβＲ２の天然のアイソフォームに由来する対応するドメインまたは領域を網羅する。いくつかの実施形態において、ＴＧＦβＲ１またはＴＧＦβＲ２の天然のアイソフォームに由来する対応するドメインまたは領域は、ＴＧＢ２３－１、ＴＧＢ２３－２、ＴＧＢ２３－３、ＴＧＢ２３－４、ＴＧＢ２３－５、及びＴＧＢ２３－６のうちの任意のものに相当する意図された効果を有する。例示的なＴＧＦβＲ１の天然アイソフォーム配列については、ＮＣＢＩアクセッション番号Ｐ３６８９７．１（配列番号６６）、ＣＡＦ０２０９６．２（配列番号６７）、ＣＡＦ０２０９７．１（配列番号６８）、及びＡＡＨ７１１８１．１（配列番号６９）を参照されたい。例示的なＴＧＦβＲ２の天然アイソフォーム配列については、ＮＣＢＩアクセッション番号Ｐ３７１７３．２（配列番号７０）、Ｑ６２３１２．１（配列番号７１）、配列番号７２のアミノ酸配列、及びＡＢＫ４２３７８．１（配列番号８８）を参照されたい。
いくつかの実施形態において、本明細書において記載されるＴＧＦβＲ１は、配列番号６６～６９のうちの任意のものにおいて示されるアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有するバリアント（例えば機能的バリアント）を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書において記載されるＴＧＦβＲ２は、配列番号７０～７２及び８８のうちの任意のものおいて示されるアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有するバリアント（例えば機能的バリアント）にを含む。
本明細書において網羅されるものとしては、ＴＧＦβＲ１またはＴＧＦβＲ２のバリアントまたはその部分（例えばドメイン、例えば細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン）も挙げられる。いくつかの実施形態において、ＴＧＦβＲ１及び／またはＴＧＦβＲ２は、細胞外ドメイン及び／または膜貫通ドメイン中で、任意の１つまたは複数の（例えば２、３、４、５、またはそれ以上の）修飾（例えば置換、短縮、欠失、追加（本明細書において記載される修飾のうちの任意もの等））も有する。いくつかの実施形態において、バリアントまたは修飾されたＴＧＦβＲ１及び／またはＴＧＦβＲ２は、ＴＧＦβＲ１及び／またはＴＧＦβＲ２の天然アイソフォーム（例えばＴＧＦβＲ１及び／またはＴＧＦβＲ２のカノニカルな配列（例えば配列番号６６または７０））と同等またはそれよりも増加した様式で、ＴＧＦβへ結合する。いくつかの実施形態において、バリアントまたは修飾されたＴＧＦβＲ１及び／またはＴＧＦβＲ２は、ＴＧＦβＲ１及び／またはＴＧＦβＲ２の天然アイソフォーム（例えばＴＧＦβＲ１及び／またはＴＧＦβＲ２のカノニカルな配列（例えば配列番号６６または７０））と同等またはそれよりも増加した様式で、ＴＧＦβシグナリングを伝達する。
いくつかの実施形態において、ＴＧＦβＲ１は、配列番号６６において示されるナンバリングに従って、位置２４～２６でアミノ酸の欠失を有する。いくつかの実施形態において、ＴＧＦβＲ１は、配列番号６６において示されるナンバリングに従って、位置２６でアラニンの挿入を有する。いくつかの実施形態において、ＴＧＦβＲ１は、配列番号６６において示されるナンバリングに従って、Ｉ１３９Ｖ置換を有する。いくつかの実施形態において、ＴＧＦβＲ１は、配列番号６６において示されるナンバリングに従って、Ｖ１５３Ｉ置換を有する。
いくつかの実施形態において、ＴＧＦβＲ２は、配列番号７０において示されるナンバリングに従って、Ｍ３６Ｖ置換を有する。いくつかの実施形態において、ＴＧＦβＲ２は、配列番号７０において示されるナンバリングに従って、Ｃ６１Ｒ置換を有する。いくつかの実施形態において、ＴＧＦβＲ２は、配列番号７０において示されるナンバリングに従って、Ｉ７３Ｖ置換を有する。いくつかの実施形態において、ＴＧＦβＲ２は、配列番号７０において示されるナンバリングに従って、Ｒ１９０Ｈ置換を有する。いくつかの実施形態において、ＴＧＦβＲ２は、配列番号７０において示されるナンバリングに従って、Ｖ１９１Ｉ置換を有する。
ＩＬ－２３シグナリング、ＩＬ２３Ｒ及びＩＬ－１２Ｒβ１
インターロイキン２３（ＩＬ－２３）は、特定の細胞外病原体によって引き起こされる感染症の解消に関与する炎症促進性サイトカインである。加えて、複数の報告から、過剰なＩＬ－２３の産生と実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、乾癬、及び炎症性大腸疾患のマウスモデルにおける炎症性疾患の発症との間に確実な結び付きが確立されている。例えばＣｕａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．２００３；４２１：７４４－７４８を参照されたい。さらに、ＩＬ－２３のレベルの増加は、クローン病、潰瘍性大腸炎、及び乾癬の有る患者からの生検において見出されている。
腫瘍生物学におけるＩＬ－２３の役割は、依然として困惑するようなものである。例えばＹａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｂｉｏｌ．２０１８ Ｊｕｌ ２；１０（７）：ａ０２８５３０を参照されたい。その一方で、様々な研究から、ＩＬ－２３が腫瘍の増殖及び転移を促進することを示唆されるように思われる。Ｌａｎｇｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ４４２：４６１－４６５，２００６）による発展性のある論文から、ＩＬ－２３ｐ１９を欠損するマウスは、ＤＭＢＡ／ＴＰＡ誘導性皮膚パピローマへの耐性があり、この耐性は、皮膚浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞の有意な増加、及びＩＬ－１７Ａ、マトリックスメタロペプチダーゼ９（ＭＭＰ９）、ＣＤ３１、顆粒球（Ｇｒ－１＋）及びマクロファージ（ＣＤ１１ｂ＋、Ｆ４／８０＋）の低減と相関していたという最初の実証が提供された。Ｔｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １０７：８３２８－８３３３，２０１０）による研究から、ＤＭＢＡ／ＴＰＡ誘導性皮膚パピローマへのこれらのマウスの耐性表現型がさらに確認され、ＭＣＡ誘導性線維肉腫への耐性も強調された。さらに、この研究から、Ｌａｎｇｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌによって最初に明らかにされたように、ＩＬ－２３は、Ｔ細胞の抗腫瘍機能を抑制しただけではなく、ＮＫ細胞の抗転移機能も抑制したことも示された（Ｔｅｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１０）。結腸の発がんの２つの他のデノボマウスモデル（ＣＰＣ－ＡＰＣ、ＡｐｃＭｉｎ／＋）において、ＩＬ－２３／ＩＬ－２３Ｒ／ＩＬ－１７Ｒの喪失またはＩＬ－２３Ｒ／ＩＬ－１７Ａ遮断が、腫瘍量の低減をもたらすので、ＩＬ－２３及びＩＬ－１７Ａの両方は腫瘍促進性効果を有していた（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｄ １５：１０１６－１０２２，２００９；Ｇｒｉｖｅｎｎｉｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４９１：２５４－２５８，２０１２）。その一方で、研究から、ＩＬ－２３は、異なる腫瘍細胞株において過剰発現され、マウスの中へ移植される場合に、腫瘍抑制作用を有し得ることも示唆される（例えばＮｇｉｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３４：５４８－５５５，２０１３）。
ＩＬ－２３は、ｐ４０と呼ばれるサブユニット（インターロイキン１２サブユニットβ、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｐ２９４６０）、及びｐ１９と呼ばれるサブユニット（インターロイキン２３サブユニットα、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ９ＮＰＦ７）からなる（Ｏｐｐｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３：７１５－７２５（２０００））。サブユニットｐ４０は、インターロイキン１２（すなわちＩＬ－１２）により共有される共通のサブユニットである。ＩＬ－１２及びＩＬ－２３は、がんにおいて矛盾する役割を果たすことが示唆された。例えばＹａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｂｉｏｌ．２０１８ Ｊｕｌ ２；１０（７）：ａ０２８５３０を参照されたい。ＩＬ－１２の抗腫瘍作用及び抗転移作用は、ＩＦＮ－γのＳＴＡＴ４活性化によって媒介されると考えられるが、ＩＬ－２３の作用機序は、完全には解明されていない。
ＩＬ－２３は、ＩＬ－１２Ｒβ１及びＩＬ－２３Ｒ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｑ５ＶＷＫ５）サブユニットから構成されるヘテロ二量体受容体複合体（すなわちＩＬ－２３受容体）へ結合し、それを介してシグナル伝達する。ＩＬ－１２Ｒβ１は、ＩＬ－１２受容体（それはＩＬ－１２Ｒβ１（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｐ４２７０１）及びＩＬ－１２Ｒβ２（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｑ９９６６５）によって形成されたヘテロ二量体受容体である）の一部でもあるが、ＩＬ－２３Ｒは、ＩＬ－２３受容体複合体に特有である。ＩＬ－２３ＲはＩＬ－１２Ｒβ１とペアになって、両方のサブユニットを発現する細胞に対してＩＬ－２３応答性を付与する。ＩＬ－１２Ｒβ１の阻害またはＩＬ－２３Ｒのいずれかは、２つの受容体鎖を発現する細胞のＩＬ－２３応答の遮断をもたらすだろう（Ｐａｒｈａｍ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６８：５６９９－５７０８（２００２））。
ＩＬ－２３Ｒは、ＪＡＫ２と会合し、リガンド依存性様式でＳＴＡＴ３と会合する。ＩＬ－１２Ｒβ１は、Ｔｙｋ２と直接的に相互作用する。ＩＬ－２３受容体へのＩＬ－２３結合は、ＪＡＫ－ＳＴＡＴシグナリング分子：ＪＡＫ２、Ｔｙｋ２、及びＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５のリン酸化及び活性化を引き起こす。ＩＬ－２３によって誘導される最も重要なＳＴＡＴは、ＳＴＡＴ３である。ＳＴＡＴ３のＩＬ－２３誘導性活性化は、ＩＬ－１７及びＩＬ－１７Ｆプロモーターへのリン酸化ＳＴＡＴ３の直接結合を導く。ＳＴＡＴ３は、ＲＯＲγ（インターロイキン－１７ファミリーの２つのメンバー（ＩＬ－１７及びＩＬ－１７Ｆ）の発現のために重要なＴｈ１７特異的転写調節因子）の発現もアップレギュレートする。ＩＬ－２３誘導性ＪＡＫ２活性化は、ＩＬ－１７産生のために要求されるＰＩ３Ｋ ｃａｔクラスＩＡ／ＡＫＴ（ＰＫＢ）及びＮＦ－ｋＢ ｐ５０／ｐ６５経路を誘発する。ＡＫＴ（ＰＫＢ）は、ＮＦ－ｋＢ ｐ５０／ｐ６５（ＩＫＫα／ＩＫＫ／Ｉ－ｋＢ（ｃａｔ）経路）及びＳＴＡＴ３（決定されてないメカニズムを介する）の両方を活性化し得る。
ヒトのＩＬ－２３ＲまたはＩＬ－１２Ｒβ１タンパク質の複数の天然アイソフォームが公知である。本明細書において記載されるＩＬ－２３ＲまたはＩＬ－１２Ｒβ１のドメインまたは領域（ＩＬ－２３ＲまたはＩＬ－１２Ｒβ１の膜貫通ドメイン、膜近傍領域、または細胞内ドメイン等）は、ＩＬ－２３ＲまたはＩＬ－１２Ｒβ１の様々な天然アイソフォームに由来する対応するドメインまたは領域を網羅する。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３ＲまたはＩＬ－１２Ｒβ１の天然のアイソフォームに由来する対応するドメインまたは領域は、ＴＧＢ２３－１、ＴＧＢ２３－２、ＴＧＢ２３－３、ＴＧＢ２３－４、ＴＧＢ２３－５、及びＴＧＢ２３－６のうちの任意のものに相当する意図された効果を有する。例示的なＩＬ－２３Ｒ天然アイソフォーム配列については、ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＭ４４２２９．１（配列番号７３）、ＡＡＹ１８３４７．１（配列番号７４）、ＡＡＹ１８３４９．１（配列番号７５）、ならびに配列番号７６及び７７において示されるアミノ酸配列）を参照されたい。例示的なＩＬ－１２Ｒβ１天然アイソフォーム配列については、ＮＣＢＩアクセッション番号ＣＡＣ１０４４６．１（配列番号７８）及びＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ４２７０１－２（配列番号７９）を参照されたい。
いくつかの実施形態において、本明細書において記載されるＩＬ－２３Ｒは、配列番号７３～７７のうちの任意のものにおいて示されるアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有するバリアント（例えば機能的バリアント）を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書において記載されるＩＬ－１２Ｒβ１は、配列番号７８～７９のうちの任意のものにおいて示されるアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有するバリアント（例えば機能的バリアント）を含む。
本明細書において網羅されるものとしては、ＩＬ－２３ＲまたはＩＬ－１２Ｒβ１のバリアントまたはその部分（例えばドメイン、例えば膜貫通ドメインまたは細胞内ドメイン）も挙げられる。いくつかの実施形態において、Ｉｌ－２３Ｒ及び／またはＩＬ－１２Ｒβ１は、膜貫通ドメイン及び／または細胞内ドメイン中で、任意の１つまたは複数の（例えば２、３、４、５、またはそれ以上の）修飾（例えば置換、短縮、欠失、追加（本明細書において記載される修飾のうちの任意もの等））も有する。いくつかの実施形態において、バリアントまたは修飾されたＩＬ－２３Ｒ及び／またはＩＬ－１２Ｒβ１は、ＩＬ－２３Ｒ及び／またはＩＬ－１２Ｒβ１の天然アイソフォーム（例えばＩＬ－２３Ｒ及び／またはＩＬ－１２Ｒβ１のカノニカルな配列（例えば配列番号７３または７８））と同等またはそれよりも増加した様式で、ＩＬ－２３Ｒ／ＩＬ－１２Ｒβ１を介してシグナリングを伝達する。
いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３Ｒは、配列番号７３において示されるナンバリングに従って、Ｒ３８１Ｑ、Ｖ４７５Ａ、Ｎ４８１Ｄ、及びＳ５８１Ｒ置換からなる群から選択される任意の１つまたは複数の置換を有する。
いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３Ｒをコードするヌクレオチドは、Ｚｗｉｅｒｓ ｅｔ ａｌ．中で記載されるようなＩＬ－２３Ｒ遺伝子の３’非翻訳領域中での修飾を有する。例えばＺｗｉｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１２；１８８：１５７３－１５７７中で考察されるｒｓ１０８８９６７７バリアントを参照されたい。
膜貫通ドメイン
いくつかの実施形態において、第１の膜貫通ドメイン及び第２の膜貫通ドメインは各々、ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２、ＩＬ－１２Ｒβ１、及びＩＬ－２３Ｒのうちの１つの膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第１の膜貫通ドメイン及び第２の膜貫通は各々、ＩＬ－１２Ｒβ１またはＩＬ－２３Ｒのうちの一方の膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第１及び／または第２のポリペプチド中の膜貫通ドメイン及び細胞外ドメインは、同じ分子に由来する。いくつかの実施形態において、第１及び／または第２のポリペプチド中の膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインは、同じ分子に由来する。
いくつかの実施形態において、ＴＧＦβＲ１の膜貫通ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態において、ＴＧＦβＲ２の膜貫通ドメインは、配列番号６のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３Ｒの膜貫通ドメインは、配列番号７のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２Ｒβ１の膜貫通ドメインは、配列番号８のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有する機能的バリアントを含む。
リンカー（例えば膜近傍配列）
いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドは、２つのドメインの間にリンカー（例えば膜近傍配列）をさらに含み、ドメインのうちの一方は膜貫通ドメインであり、他方のドメインは細胞外ドメインまたは細胞内ドメインである。理論に束縛されるものではないが、リンカー（例えば膜近傍配列）は、柔軟性を提供するため、及び／または融合タンパク質もしくはシグナル伝達の寿命を促進するために、２つの機能ドメインの間の移行として働き得る。いくつかの実施形態において、リンカー（例えば膜近傍配列）は、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間である。いくつかの実施形態において、リンカー（例えば膜近傍配列）は、膜貫通ドメインと細胞内ドメインとの間である。
例示的な膜近傍配列
いくつかの実施形態において、リンカーは、膜貫通分子からの膜近傍領域に由来する膜近傍配列である。いくつかの実施形態において、膜近傍配列及び膜貫通ドメインは、同じ分子に由来する。
いくつかの実施形態において、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間にある膜近傍配列は、膜貫通ドメインと同じ分子に由来する細胞外ドメインの短縮されたＣ末端配列である。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインと細胞内ドメインとの間にある膜近傍配列は、膜貫通ドメインと同じ分子に由来する細胞内ドメインの短縮されたＮ末端配列である。いくつかの実施形態において、膜近傍配列は約２アミノ酸～約５０アミノ酸（約３アミノ酸～約４０アミノ酸等）の長さを有する。いくつかの実施形態において、膜近傍配列は、配列番号９～１２のうちの任意のものにおいて示されるアミノ酸配列を含む。「膜付近のＩＬ－２３Ｒ細胞外ドメインの配列」、「膜付近のＩＬ－１２Ｒβ１細胞外ドメインの配列」、「膜付近のＴＧＦβＲ１細胞内ドメインの配列」、及び「膜付近のＴＧＦβＲ２細胞内ドメインの配列」は、例示的な実施形態において使用される異なる膜近傍配列を指す。
他の例示的なリンカー
例示的なリンカーは、下で記載されるペプチドリンカーまたは非ペプチドリンカーのうちの任意のものも包含する。いくつかの実施形態において、隣接ドメインが互いと比べて自由に移動することができるように、リンカー（ペプチドリンカー等）は柔軟な残基（グリシン及びセリン等）を含む。
例示的なリンカーは、下で記載されるペプチドリンカーまたは非ペプチドリンカーのうちの任意のものも包含する。いくつかの実施形態において、隣接ドメインが互いと比べて自由に移動することができるように、リンカー（ペプチドリンカー等）は柔軟な残基（グリシン及びセリン等）を含む。
ペプチドリンカー
いくつかの実施形態において、リンカーは、ペプチドリンカーである。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、約１～約５０、約２～約４０、約３～約３０、または約４～約２０のアミノ酸の長さを有する。いくつかの実施形態において、リンカーはＧＳリンカーである。
かかるペプチドリンカーの必須の技術的特色は、前記ペプチドリンカーが任意の重合活性を含まないということである。二次構造の促進が存在しないことを含むペプチドリンカーの特徴は、当技術分野において公知であり、例えばＤａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８）３７，９２６６－９２７３）、Ｃｈｅａｄｌｅ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９２）２９，２１－３０）、及びＲａａｇ ａｎｄ Ｗｈｉｔｌｏｗ（ＦＡＳＥＢ（１９９５）９（１），７３－８０）中で記載される。「ペプチドリンカー」の文脈において特に好ましいアミノ酸は、Ｇｌｙである。さらに、任意の二次構造を促進しないペプチドリンカーも好ましい。互いへのドメインのリンケージは、例えば遺伝子操作によって提供され得る。融合され作動可能に連結される二重特異性一本鎖コンストラクトを調製し、哺乳動物細胞または細菌中でそれらを発現する方法は、当技術分野において周知である（例えばＷＯ９９／５４４４０、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．１９８９及び１９９４、またはＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２００１）。
ペプチドリンカーは安定的なリンカーであり得、それはプロテアーゼ（特にマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）による）によって切断可能ではない。
リンカーは柔軟なリンカーでもあり得る。例示的な柔軟なリンカーとしては、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ（配列番号６１）、グリシン－セリンポリマー（例えば（ＧＳ）ｎ（配列番号６２）、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号６３）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号６４）、及び（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号６５）を包含する）、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、及び当技術分野において公知の他の柔軟なリンカーが挙げられる。グリシンポリマー及びグリシン－セリンポリマーは比較的構造化されておらず、したがって構成要素の間の中立的なテザーとして働くことが可能であり得る。グリシンはアラニンよりもさらに有意にφψ空間にアクセスし、より長い側鎖を有する残基よりもはるかに拘束性ではない（Ｓｃｈｅｒａｇａ，Ｒｅｖ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍ．１１ １７３－１４２（１９９２）を参照）。当業者は、融合タンパク質のデザインが、リンカーがすべてまたは部分的に柔軟なリンカーを含み、その結果、リンカーが柔軟なリンカー部分、そしてそれほど柔軟でない構造を付与する１つまたは複数の部分を含んで、所望される融合タンパク質構造を提供し得ることを認識するだろう。いくつかの実施形態において、リンカーはＧＳリンカーである。
いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、配列番号５７において示されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、ＩｇＧのヒンジ領域（ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域等）を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、ＩｇＧのヒンジ領域（ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域等）を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、ＩｇＧのヒンジ領域に由来する修飾された配列（ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域等）を含む。
ＩＩＩ．核酸及びベクター
本出願は、本明細書において記載される融合タンパク質のうちの任意のものをコードする核酸、またはその一部も提供する。
いくつかの実施形態において、核酸は、配列番号２８～３５のうちの任意のものにおいて示される核酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有するバリアントを含む。いくつかの実施形態において、核酸は、配列番号２８～３３のうちの任意のものにおいて示される核酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有するバリアントを含む。
いくつかの実施形態において、核酸は、機能的外来性受容体（「機能的外来性受容体」セクション中で記載される機能的外来性受容体のうちの任意のもの等）をコードする第２の核酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、機能的外来性受容体は、細胞外リガンド結合ドメイン及び任意選択で細胞内シグナリングドメインを含む。いくつかの実施形態において、機能的外来性受容体は、操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞抗原カプラー（ＴＡＣ）、またはそれらの一部からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、機能的外来性受容体は、腫瘍抗原を特異的に認識する。いくつかの実施形態において、機能的外来性受容体はＣＡＲを含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、配列番号３６のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有するバリアントを含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、配列番号８９のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有するバリアントを含む。
いくつかの実施形態において、核酸は、配列番号３７のアミノ酸配列または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有するバリアントを含むポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態において、核酸は、配列番号３８において示される核酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有するバリアントを含む。
いくつかの実施形態において、核酸は、配列番号９０のアミノ酸配列または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有するバリアントを含むポリペプチドをコードする。
いくつかの実施形態において、機能的外来性受容体をコードする核酸配列は、融合タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸配列（「融合タンパク質核酸配列」）のうちの少なくとも１つに対して上流であり、任意選択で、機能的外来性受容体核酸配列及び融合タンパク質核酸配列は、第２のマルチシストロン性エレメントをコードする第３の核酸配列によって分離されている。
いくつかの実施形態において、機能的外来性受容体をコードする核酸配列は、融合タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸配列（「融合タンパク質核酸配列」）のうちの少なくとも１つに対して下流であり、任意選択で、機能的外来性受容体核酸配列及び融合タンパク質核酸配列は、第２のマルチシストロン性エレメントをコードする第３の核酸配列によって分離されている。
いくつかの実施形態において、第２のマルチシストロン性エレメントは、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａからなる群から選択される２Ａ自己切断ペプチドを含む。
ベクター
本出願は、本明細書において記載される融合タンパク質及び／または機能的外来性受容体（例えば操作されたＴＣＲまたはＣＡＲ）のうちの任意の１つをクローニング及び発現するためのベクターを提供する。いくつかの実施形態において、ベクターは、真核生物細胞（哺乳動物細胞等）における複製及び組み込みに好適である。いくつかの実施形態において、ベクターは、ウイルスベクターである。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、及びそれらの誘導体が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、ベクターはレンチウイルスベクターである。例えば実施例２を参照されたい。ウイルスベクター技術は当技術分野において周知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、ならびに他のウイルス学及び分子生物学のマニュアル中で記載される。
多数のウイルスベースの系が、哺乳動物細胞の中への遺伝子移行のために開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系のための好都合なプラットフォームを提供する。異種核酸は、当技術分野において公知の技法を使用して、ベクターの中へ挿入され、レトロウイルス粒子中でパッケージングされ得る。次いで、組み換えウイルスは単離され、操作された哺乳動物細胞へインビトロまたはエクスビボで送達され得る。多数のレトロウイルス系が、当技術分野において公知である。いくつかの実施形態において、アデノウイルスベクターが使用される。多数のアデノウイルスベクターが、当技術分野において公知である。いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクターが使用される。いくつかの実施形態において、自己不活性化レンチウイルスベクターが使用される。例えば、融合タンパク質コーディング配列を保有する自己不活性化レンチウイルスベクター及び／または外来性受容体（例えば操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ）を保有する自己不活性化レンチウイルスベクターは、当技術分野において公知のプロトコルによりパッケージングされ得る。もたらされたレンチウイルスベクターは、当技術分野において公知の方法を使用して、哺乳動物細胞（初代ヒトＴ細胞等）を形質導入するために使用され得る。レトロウイルス（レンチウイルス等）に由来するベクターは、子孫細胞中での導入遺伝子の長期間で安定的な組み込み及びその伝播を可能にするので、長期間の遺伝子移行を達成するのに好適なツールである。レンチウイルスベクターは低免疫原性も有し、非増殖細胞を形質導入することができる。
いくつかの実施形態において、ベクターは、非ウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターは、トランスポゾン（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）トランスポゾン系、またはＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン系等）である。いくつかの実施形態において、ベクターは、ポリマーベースの非ウイルスベクターであり、例えばポリ（乳酸－コ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）及びポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）、ならびにデンドリマーが挙げられる。いくつかの実施形態において、ベクターは、陽イオン性脂質ベースの非ウイルスベクター（カチオン性リポソーム、脂質ナノエマルション、及び固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）等）である。いくつかの実施形態において、ベクターは、ペプチドベースの遺伝子非ウイルスベクター（ポリＬ－リジン等）である。ゲノム編集に好適な公知の非ウイルスベクターのうちの任意のものは、融合タンパク質をコードする核酸及び／または外来性受容体（例えば操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ）をコードする核酸を、操作された免疫エフェクター細胞（例えばＴ細胞）へ導入するために使用され得る。例えばＹｉｎ Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１４）１５：５２１－５５５；Ａｒｏｎｏｖｉｃｈ ＥＬ ｅｔ ａｌ．“Ｔｈｅ Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｓｙｓｔｅｍ：ａ ｎｏｎ－ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．”Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．（２０１１）Ｒ１：Ｒ１４－２０；及びＺｈａｏ Ｓ．ｅｔ ａｌ．“ＰｉｇｇｙＢａｃ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ：ｔｈｅ ｔｏｏｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ．”Ｔｒａｎｓｌ．Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２０１６）５（１）：１２０－１２５（それらは参照することによって本明細書に援用される）を参照されたい。いくつかの実施形態において、融合タンパク質及び／または本明細書において記載される外来性受容体（例えば操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ）をコードする核酸のうちの任意の１つまたは複数は、操作された免疫エフェクター細胞（例えばＴ細胞）へ物理的方法によって導入され、当該物理的方法としては、エレクトロポレーション、ソノポレーション、フォトポレーション、マグネトフェクション、ハイドロポレーションが挙げられるがこれらに限定されない。
いくつかの実施形態において、ベクター（例えばレンチウイルスベクター等のウイルスベクターは、融合タンパク質及び／または本明細書において記載される外来性受容体（例えば操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ）をコードする核酸のうちの任意の１つを含む。核酸は、当技術分野において任意の公知の分子クローニング方法を使用して（例えば制限エンドヌクレアーゼ部位及び１つまたは複数選択マーカーを使用することが挙げられる）、ベクターの中へクローニングされ得る。いくつかの実施形態において、核酸は、プロモーターへ作動可能に連結される。プロモーターの多様性は哺乳動物細胞における遺伝子発現のために調査されており、当技術分野において公知のプロモーターのうちの任意のものが本発明において使用され得る。プロモーターは、構成的プロモーターまたは調節性プロモーター（誘導可能プロモーター等）として大まかに分類され得る。
プロモーター
いくつかの実施形態において、融合タンパク質及び／または本明細書において記載される外来性受容体（例えば操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ）をコードする核酸は、構成的プロモーターへ作動可能に連結される。構成的プロモーターは、異種遺伝子（導入遺伝子とも称される）が、宿主細胞において構成的に発現されることを可能にする。本明細書において企図される例示的なプロモーターとしては、サイトメガロウイルス最初期プロモーター（ＣＭＶ）、ヒト延長因子１α（ｈＥＦ１α）、ユビキチンＣプロモーター（ＵｂｉＣ）、ホスホグリセロキナーゼプロモーター（ＰＧＫ）、シミアンウイルス４０初期プロモーター（ＳＶ４０）、ＣＭＶ初期エンハンサーとカップルされたニワトリβ－アクチンプロモーター（ＣＡＧＧ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ポリオーマエンハンサー／単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ＭＣ１）プロモーター、βアクチン（β－ＡＣＴ）プロモーター、「骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）」プロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。導入遺伝子発現の駆動に対するかかる構成的プロモーターの効率は、膨大な数の研究において広く比較された。例えば、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｃ．Ｍｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．は、初代ヒトＴ細胞においてＣＡＲ発現を駆動する、ＣＭＶ、ｈＥＦ１α、ＵｂｉＣ、及びＰＧＫの効率を比較し、ｈＥＦ１αプロモーターは、最高レベルの導入遺伝子発現を誘導しただけでなく、ＣＤ４ヒトＴ細胞及びＣＤ８ヒトＴ細胞中で最適に維持もされると結論した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，１７（８）：１４５３－１４６４（２００９））。いくつかの実施形態において、融合タンパク質及び／または本明細書において記載される外来性受容体（例えば操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ））をコードする核酸は、ｈＥＦ１αプロモーターまたはＰＧＫプロモーターへ作動可能に連結される。
いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＥＦ－１プロモーター、ＣＭＶ ＩＥ遺伝子プロモーター、ＥＦ－ｌａプロモーター、ユビキチンＣプロモーター、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、サイトメガロウイルス最初期遺伝子プロモーター（ＣＭＶ）、延長因子１αプロモーター（ＥＦ１－α）、ホスホグリセレートキナーゼ－１プロモーター（ＰＧＫ）、ユビキチン－Ｃプロモーター（ＵＢＱ－Ｃ）、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ－アクチンプロモーター（ＣＡＧ）、ポリオーマエンハンサー／単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（ＭＣ１）、βアクチンプロモーター（β－ＡＣＴ）、シミアンウイルス４０プロモーター（ＳＶ４０）、及び骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーター、ＮＦＡＴプロモーター、ＴＥＴＯＮ（登録商標）プロモーター、ならびにＮＦκＢプロモーターからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質及び／または本明細書において記載される外来性受容体（例えば操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ）をコードする核酸は、誘導可能プロモーターへ作動可能に連結される。誘導可能プロモーターは、調節性プロモーターのカテゴリーに属する。誘導可能プロモーターは、１つまたは複数の条件（物理的条件、操作された免疫エフェクター細胞（例えばＴ細胞）の微小環境、または操作された免疫エフェクター細胞、誘導物質（すなわち誘導剤）、もしくはそれらの組み合わせの生理学的状態等）によって誘導され得る。いくつかの実施形態において、誘導条件は、操作された哺乳動物細胞における、及び／または医薬組成物を受け取る対象における内在性遺伝子の発現を誘導しない。いくつかの実施形態において、誘導条件は、誘導物質、照射（イオン化放射、光等）、温度（熱等）、レドックス状態、腫瘍環境、及び操作された哺乳動物細胞の活性化状態からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、誘導可能プロモーターは、ＮＦＡＴプロモーター、ＴＥＴＯＮ（登録商標）プロモーター、またはＮＦκＢプロモーターであり得る。
いくつかの実施形態において、ベクターは、ベクター（例えばレンチウイルスベクター）を介してトランスフェクションされた宿主細胞の集団から、融合タンパク質及び／または本明細書において記載される外来性受容体（例えば操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ）を発現する細胞を選択するために選択可能マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子も含有する。選択マーカー及びレポーター遺伝子の両方は適切な調節配列に隣接して、宿主細胞における発現を可能にし得る。例えば、ベクターは、核酸配列の発現の調節に有用な転写及び翻訳のターミネーター、開始配列、及びプロモーターを含有し得る。
マルチシストロン性エレメント
いくつかの実施形態において、ベクターは、融合タンパク質及び／または本明細書において記載される外来性受容体（例えば操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ）をコードする１を超える核酸を含む。いくつかの実施形態において、ベクター（例えばレンチウイルスベクター等のウイルスベクター）は、融合タンパク質をコードする第１の核酸、ならびに細胞外リガンド結合ドメイン及び任意選択の細胞内シグナリングドメインを含む機能的外来性受容体（例えば操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ）をコードする第２の核酸を含み、第１の核酸は、マルチシストロン性エレメントをコードする第３の核酸を介して第２の核酸へ作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、マルチシストロン性エレメントをコードする第３の核酸は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）である。ＩＲＥＳは、ｃａｐ非依存性様式で翻訳開始を可能にするＲＮＡエレメントである。いくつかの実施形態において、マルチシストロン性エレメントは、自己切断２Ａペプチド（Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａ、ＢｍＣＰＶ ２Ａ、ＢｍＩＦＶ ２Ａ等）を含む（例えばそれらである）。いくつかの実施形態において、マルチシストロン性エレメントは、配列番号４８または６０のアミノ酸配列を含むＰ２Ａペプチドである。いくつかの実施形態において、マルチシストロン性エレメントは、「ＩＩ．融合タンパク質」の上記の「ペプチドリンカー」セクション中で記載されるペプチドリンカー（柔軟なリンカー等）を含む。いくつかの実施形態において、柔軟な連結配列は、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＳ）ｎ、及び（ＧＧＧＧＳ）ｎからなる群から選択され、配列中、ｎは少なくとも１の整数である。いくつかの実施形態において、第３の核酸は、選択可能マーカー（ＬＮＧＦＲ等）をコードする。いくつかの実施形態において、マルチシストロン性エレメントをコードする第３の核酸は、本明細書において記載される１つまたは複数の型の連結配列（自己切断２Ａペプチド（例えばＰ２Ａ）に続くＧｌｙ－Ｓｅｒの柔軟なリンカー（例えば（ＧＧＧＳ）３）、または自己切断２Ａペプチド（例えばＰ２Ａ）に続く選択可能マーカー（例えばＬＮＧＦＲ）等）を含む。
したがっていくつかの実施形態において、融合タンパク質（本明細書において記載される融合タンパク質のもののうちの任意の等）をコードする第１の核酸を含むベクター（例えばレンチウイルスベクター等のウイルスベクター）が提供される。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ａ）ｉ）ＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインを含む第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）ＩＬ－２３Ｒの膜貫通ドメインを含む第１の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）ＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインを含む第１の細胞内ドメイン、を含む、第１のポリペプチドと；ｂ）ｉ）ＴＧＦβＲ１の細胞外ドメインを含む第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）ＩＬ－１２Ｒβ１の膜貫通ドメインを含む第２の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）ＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメインを含む第２の細胞内ドメイン、を含む、第２のポリペプチドとを含む。
いくつかの実施形態において、ベクター（例えばレンチウイルスベクター等のウイルスベクター）は、細胞外リガンド結合ドメイン及び任意選択の細胞内シグナリングドメインを含む機能的外来性受容体（例えば操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ）をコードする第２の核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、第１の核酸及び第２の核酸は、同じプロモーターへ作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、第１の核酸及び第２の核酸は、異なるプロモーターへ作動可能に連結される。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質（本明細書において記載される融合タンパク質のうちの任意のもの等）をコードする第１の核酸、ならびに細胞外リガンド結合ドメイン及び細胞内シグナリングドメインを含む機能的外来性受容体（例えば操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ）をコードする第２の核酸を含み、第１の核酸及び第２の核酸が、異なるプロモーター（例えばＥＦ１－α、及びＥＦ１－αとは異なるプロモーター）へ作動可能に連結される、ベクター（例えばレンチウイルスベクター等のウイルスベクター）が提供される。いくつかの実施形態において、第１の核酸は第２の核酸の上流である。いくつかの実施形態において、第１の核酸は第２の核酸の下流である。
いくつかの実施形態において、上流から下流へ、プロモーター（例えばＥＦ１－α）、細胞外リガンド結合ドメイン及び細胞内シグナリングドメインを含む機能的外来性受容体（例えば操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ）をコードする第１の核酸、任意選択で第２のプロモーター、ならびに融合タンパク質をコードする第２の核酸である、ベクター（例えばレンチウイルスベクター等のウイルスベクター）が提供される。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ａ）ｉ）ＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインを含む第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）ＩＬ－２３Ｒの膜貫通ドメインを含む第１の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）ＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインを含む第１の細胞内ドメイン、を含む、第１のポリペプチドと；ｂ）ｉ）ＴＧＦβＲ１の細胞外ドメインを含む第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）ＩＬ－１２Ｒβ１の膜貫通ドメインを含む第２の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）ＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメインを含む第２の細胞内ドメイン、を含む、第２のポリペプチドとを含む。
機能的外来性受容体
本明細書において記載される例示的な機能的外来性受容体は、細胞外リガンド結合ドメイン及び任意選択で細胞内シグナリングドメインを含み得る。いくつかの実施形態において、機能的外来性受容体は、操作されたＴＣＲ（例えば特異的に腫瘍抗原を認識する操作されたＴＣＲ）である。いくつかの実施形態において、機能的外来性受容体は、非ＴＣＲ受容体である。いくつかの実施形態において、非ＴＣＲ受容体は、（ａ）抗原（例えば腫瘍抗原）を特異的に認識する１つまたは複数（１、２、３、４、５、６、またはそれ以上のうちの任意の１つ等）の結合部分を含む、細胞外リガンド結合ドメインと；（ｂ）膜貫通ドメインと；（ｃ）細胞内シグナリングドメインとを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。いくつかの実施形態において、ＣＡＲの細胞外リガンド結合ドメインは、抗原結合断片を含む１つまたは複数（１、２、３、４、５、６、またはそれ以上のうちの任意の１つ等）の結合部分（ｓｄＡｂ（例えば腫瘍抗原を標的とするｓｄＡｂ）等）を含む（以後「抗抗原ＣＡＲ」と称される）。いくつかの実施形態において、ＣＡＲの細胞外リガンド結合ドメインは、リガンドまたは受容体の細胞外ドメインに由来する少なくとも１つのドメインを含む１つまたは複数の結合部分（以後「リガンド／受容体ＣＡＲ」とも称される）を含み、リガンドまたは受容体は細胞表面抗原である。いくつかの実施形態において、受容体は、Ｆｃ結合ドメイン（Ｆｃ受容体（例えばＦｃγＲ）の細胞外ドメイン等）に由来する。Ｆｃ結合ドメインを含む１つまたは複数の結合部分を含む細胞外リガンド結合ドメインを含むＣＡＲは、以後「抗体とカップルされるＴ細胞受容体」（ＡＣＴＲ）とも称される。いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有タンパク質がＡＣＴＲ－Ｔ細胞へ投与されるか、またはＴ細胞中で共発現される場合に、Ｆｃ含有タンパク質は、本明細書において記載される抗原へのＡＣＴＲ発現Ｔ細胞の結合特異性を付与する。いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有タンパク質は、Ｆｃ含有抗体（例えば全長の抗体）またはＦｃ融合タンパク質（抗原結合断片－Ｆｃ融合タンパク質、Ｆｃ受容体／リガンド融合タンパク質、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃ領域へ融合されたＴＣＲの可変領域を含むＦｃ融合タンパク質（「ＴＣＲ－Ｆｃ融合タンパク質」）等）である。ＡＣＴＲ／Ｆｃ含有タンパク質系は、以後「抗抗原ＡＣＴＲ」と称される。
抗原
本明細書において記載される機能的外来性受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、標的細胞上の任意の抗原を特異的に認識し得る。いくつかの実施形態において、抗原は細胞表面分子である。いくつかの実施形態において、抗原は、特定の疾患状態と関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用する。いくつかの実施形態において、抗原は腫瘍抗原である。いくつかの実施形態において、細胞外リガンド結合ドメインは、単一腫瘍抗原を特異的に認識する。いくつかの実施形態において、細胞外リガンド結合ドメインは、単一腫瘍抗原の１つまたは複数のエピトープを特異的に認識する。いくつかの実施形態において、細胞外リガンド結合ドメインは、２つ以上の腫瘍抗原を特異的に認識する。腫瘍は、免疫応答（特にＴ細胞媒介性免疫応答）のための標的抗原として働き得る多数のタンパク質を発現する。細胞外リガンド結合ドメインによって特異的に認識される抗原は、単一の疾患細胞上の抗原、または当該疾患に各々が寄与する異なる細胞上に発現される抗原であり得る。細胞外リガンド結合ドメインによって特異的に認識される抗原は、直接的または間接的に疾患に関与して得る。
腫瘍抗原は、免疫応答（特にＴ細胞媒介性免疫応答）を惹起し得る腫瘍細胞によって産生されるタンパク質である。本発明の標的とされた抗原の選択は、治療される特定の型のがんに依存するだろう。例示的な腫瘍抗原としては、例えば神経膠腫関連抗原、ＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、β－ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、チログロブリン、ＲＡＧＥ－１、ＭＮ－ＣＡＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、Ｍ－ＣＳＦ、プロスターゼ（ｐｒｏｓｔａｓｅ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、グリピカン３（ＧＰＣ３）、クローディン１８．２、ＰＡＰ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－ｌａ、ｐ５３、プロステイン（ｐｒｏｓｔｅｉｎ）、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、サバイビン及びテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）－Ｉ、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＦ－Ｉ受容体、及びメソテリンが挙げられる。
いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、悪性腫瘍と関連する１つまたは複数の抗原性がんエピトープを含む。悪性腫瘍は、免疫攻撃のための標的抗原として働き得る多数のタンパク質を発現する。これらの分子としては、組織特異的抗原（黒色腫におけるＭＡＲＴ－１、チロシナーゼ、及びｇｐ１００、ならびに前立腺癌における前立腺酸性フォスファターゼ（ＰＡＰ）及び前立腺特異抗原（ＰＳＡ）等）が挙げられるがこれらに限定されない。他の標的分子は、形質転換関連分子（がん遺伝子ＨＥＲ２／神経鞘／ＥｒｂＢ－２等）の群に属する。標的抗原のさらに別の群は、がん胎児性抗原（ｏｎｃｏ－ｆｅｔａｌ ａｎｔｉｇｅｎ）（がん胎児性抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）（ＣＥＡ）等）である。Ｂ細胞リンパ腫において、腫瘍特異的イディオタイプ免疫グロブリンは、個別の腫瘍にユニークな真に腫瘍特異的な免疫グロブリン抗原を構成する。Ｂ細胞分化抗原（ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ３７等）は、Ｂ細胞リンパ腫における標的抗原についての他の候補である。
いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。ＴＳＡは腫瘍細胞にユニークであり、身体の他の細胞で生じない。ＴＡＡ関連抗原は、腫瘍細胞にユニークではなく、代わりに、抗原に対して免疫寛容の状態を誘導することが成功しない条件下の正常細胞でも発現される。腫瘍での抗原の発現は、免疫系が抗原へ応答することを可能にする条件下で起こり得る。ＴＡＡは、免疫系が未成熟であり応答することが可能でない場合に胎児発生の間に正常細胞で発現される抗原であり得るか、またはＴＡＡは、正常細胞で超低レベルで通常は存在するが、腫瘍細胞ではるかに高いレベルで発現される抗原であり得る。
ＴＳＡ抗原またはＴＡＡ抗原の非限定的例としては、以下の：分化抗原（ＭＡＲＴ－１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ－Ｉ）、ｇｐ １００（Ｐｍｅｌ １７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２等）及び腫瘍特異的多系譜抗原（ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ｐｌ５等）；過剰発現された胎児抗原（ＣＥＡ等）；過剰発現されたがん遺伝子及び突然変異した腫瘍抑制遺伝子（ｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ等）；染色体転座からもたらされるユニークな腫瘍抗原；ＢＣＲ－ＡＢＬ、Ｅ２Ａ－ＰＲＬ、Ｈ４－ＲＥＴ、ＩＧＨ－ＩＧＫ、ＭＹＬ－ＲＡＲ等；ならびにウイルス抗原（エプスタイン－バーウイルス抗原ＥＢＶＡならびにヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６及びＥ７等）が挙げられる。他の高分子タンパク質ベースの抗原としては、ＴＳＰ－１８０、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－５、ＭＡＧＥ－６、ＲＡＧＥ、ＮＹ－ＥＳＯ、ｐｌ８５ｅｒｂＢ２、ｐｌ８０ｅｒｂＢ－３、ｃ－ｍｅｔ、ｎｍ－２３ＨＩ、ＰＳＡ、ＴＡＧ－７２、ＣＡ１９－９、ＣＡ７２－４、ＣＡＭ １７．１、ＮｕＭａ、Ｋ－ｒａｓ、β－カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ－１、ｐ１５、ｐ１６、４３－９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、α－フェトプロテイン、β－ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ １５－３＼ＣＡ ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ－５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼Ｐ１、ＣＯ－０２９、ＦＧＦ－５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３＼ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ－１７５、Ｍ３４４、ＭＡ－５０、ＭＧ７－Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ－ＣＯ－１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ－９０＼Ｍａｃ－２結合タンパク質＼シクロフィリンＣ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、及びＴＰＳが挙げられる。
いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＣＤ１３８、ＣＤ１２３／ＩＬ３Ｒα、ｃ－Ｍｅｔ、ｇｐ１００、ＭＵＣ１、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ／ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ２、ＩＧＦ１Ｒ、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＷＴ１、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、ＧＤ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＧＥ Ａ３、ＧＰＣ３、クローディン１８．２、糖脂質Ｆ７７、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、及び任意のそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、抗原はＧＰＣ３である。いくつかの実施形態において、抗原はＣＤ２０である。
いくつかの実施形態において、抗原は、病原体抗原（真菌抗原、ウイルス抗原、または細菌抗原等）である。いくつかの実施形態において、真菌抗原は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属またはＣａｎｄｉｄａ属からのものである。いくつかの実施形態において、ウイルス抗原は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、メタ肺炎ウイルス（ｈＭＰＶ）、ライノウイルス、パラインフルエンザ（ＰＩＶ）、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＪＣウイルス（ジョン・カニンガムウイルス）、ＢＫウイルス、ＨＩＶ、ジカウイルス、ヒトコロナウイルス、ノロウイルス、脳炎ウイルス、またはエボラからのものである。
いくつかの実施形態において、細胞表面抗原は、リガンドまたは受容体である。いくつかの実施形態において、細胞外リガンド結合ドメインは、リガンドまたは受容体の細胞外ドメインに由来する少なくとも１つのドメインを含む１つまたは複数の結合部分を含み、リガンドまたは受容体は本明細書において記載される細胞表面抗原である。いくつかの実施形態において、リガンドまたは受容体は、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｆ、ＮＫＧ２Ｄ、ＢＣＭＡ、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＩＬ－３、ＩＬ－１３、ＬＬＴ１、ＡＩＣＬ、ＤＮＡＭ－１、及びＮＫｐ８０からなる群から選択される分子に由来する。いくつかの実施形態において、リガンドは、ＢＣＭＡへ結合し得るＡＰＲＩＬまたはＢＡＦＦに由来する。いくつかの実施形態において、受容体は、Ｆｃ結合ドメイン（Ｆｃ受容体の細胞外ドメイン等）に由来する。いくつかの実施形態において、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）である。いくつかの実施形態において、ＦｃγＲは、ＣＤ１６Ａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）、ＣＤ１６Ｂ（ＦｃγＲＩＩＩｂ）、ＣＤ６４Ａ、ＣＤ６４Ｂ、ＣＤ６４Ｃ、ＣＤ３２Ａ、及びＣＤ３２Ｂからなる群から選択される。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
いくつかの実施形態において、機能的外来性受容体は、（ａ）抗原（上で記載される抗原（例えばＧＰＣ３）のうちの任意のもの等）を特異的に認識する１つまたは複数（１、２、３、４、５、６、またはそれ以上のうちの任意の１つ等）の結合部分を含む、細胞外リガンド結合ドメインと；（ｂ）膜貫通ドメインと；（ｃ）細胞内シグナリングドメインとを含むＣＡＲである。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の結合部分は、抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の結合部分は、１つまたは複数の抗体（例えば全長抗体）に由来する。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の結合部分は、ラクダ科の動物の抗体に由来する。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の結合部分は、ヒト抗体に由来する。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の結合部分は、ラクダＩｇ、Ｉｇ ＮＡＲ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、Ｆ（ａｂ）’３断片、Ｆｖ、単一鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）、ｂｉｓ－ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（ｄｓＦｖ）、及び単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の結合部分は、ｓｄＡｂ（例えば抗ＧＰＣ３ ｓｄＡｂ、抗ＢＣＭＡ ｓｄＡｂ）である。いくつかの実施形態において、細胞外リガンド結合ドメインは、一緒に連結された２つ以上のｓｄＡｂを含む。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の結合部分は、非抗体結合タンパク質（ポリペプチドリガンド、または抗原へ結合する操作されたタンパク質等）である。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の結合部分は、リガンドまたは受容体の細胞外ドメインに由来する少なくとも１つのドメインを含み、リガンドまたは受容体は細胞表面抗原である。いくつかの実施形態において、リガンドまたは受容体は、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｆ、ＮＫＧ２Ｄ、ＢＣＭＡ、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＩＬ－３、ＩＬ－１３、ＬＬＴ１、ＡＩＣＬ、ＤＮＡＭ－１、及びＮＫｐ８０からなる群から選択される分子に由来する。いくつかの実施形態において、リガンドは、ＢＣＭＡへ結合し得るＡＰＲＩＬまたはＢＡＦＦに由来する。いくつかの実施形態において、受容体は、Ｆｃ結合ドメイン（Ｆｃ受容体の細胞外ドメイン等）に由来する。いくつかの実施形態において、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）である。いくつかの実施形態において、ＦｃγＲは、ＣＤ１６Ａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）、ＣＤ１６Ｂ（ＦｃγＲＩＩＩｂ）、ＣＤ６４Ａ、ＣＤ６４Ｂ、ＣＤ６４Ｃ、ＣＤ３２Ａ、及びＣＤ３２Ｂからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、一価且つ単一特異性である。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、多価（例えば二重特異性）且つ単一特異性である。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、多価（例えば二価）且つ多重特異性（例えば二重特異性）である。いくつかの実施形態において、抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＣＤ１３８、ＣＤ１２３／ＩＬ３Ｒα、ｃ－Ｍｅｔ、ｇｐ１００、ＭＵＣ１、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ／ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ２、ＩＧＦ１Ｒ、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＷＴ１、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、ＧＤ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＧＥ Ａ３、ＧＰＣ３、クローディン１８．２、糖脂質Ｆ７７、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、及び任意のそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、抗原はＧＰＣ３である。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のα鎖、β鎖、またはζ鎖、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、及びＰＤ－１からなる群から選択される分子に由来する。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ８αに由来する。いくつかの実施形態において、細胞内シグナリングドメインは、免疫エフェクター細胞の一次細胞内シグナリングドメインを含む。いくつかの実施形態において、一次細胞内シグナリングドメインは、ＣＤ３ζ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＦｃＲγ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃＲβ（ＦｃεＲＩｂ）、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ６６ｄ、ＦｃγＲＩＩａ、ＤＡＰ１０、及びＤＡＰ１２に由来する。いくつかの実施形態において、一次細胞内シグナリングドメインは、ＣＤ３ζに由来する。いくつかの実施形態において、細胞内シグナリングドメインは、共刺激シグナリングドメインを含む。いくつかの実施形態において、共刺激シグナリングドメインは、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２（ＬＦＡ－２）、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ－１）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１６２（ＳＥＬＰＬＧ）、ＣＤ２５８（ＬＩＧＨＴ）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴＲ）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７９（ＰＤ－１）、ＣＤ３１９（ＳＬＡＭＦ７）、ＬＦＡ－１（リンパ球機能関連抗原－１）、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤＳ、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＩＰＯ－３、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ８３、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ－４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７３（ＰＤ－Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ－Ｌ１）、ＤＡＰ１０、ＴＲＩＭ、ＺＡＰ７０、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、及び任意のそれらの組み合わせからなる群から選択される共刺激分子に由来する。いくつかの実施形態において、共刺激シグナリングドメインは、ＣＤ１３７の細胞質ドメインを含む。いくつかの実施形態において、本明細書において記載されるＣＡＲは、細胞外リガンド結合ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間に所在するヒンジドメインをさらに含む。いくつかの実施形態において、ヒンジドメインは、ＣＤ８αに由来する。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、ポリペプチドのＮ末端に所在するシグナルペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、ＣＤ８αに由来する。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端の方向へ、ＣＤ８αシグナルペプチド、細胞外リガンド結合ドメイン（例えば腫瘍抗原を特異的に認識する１つまたは複数のｓｄＡｂ）、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７に由来する共刺激シグナリングドメイン、及びＣＤ３ζに由来する一次細胞内シグナリングドメインを含むポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端の方向へ、ＣＤ８αシグナルペプチド、腫瘍抗原を標的とする１つまたは複数の結合部分を含む細胞外リガンド結合ドメイン（例えば抗ＧＰＣ３ ｓｖＦｖまたは抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖ）、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７に由来する共刺激シグナリングドメイン、及びＣＤ３ζに由来する一次細胞内シグナリングドメインを含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端の方向へ、ＣＤ８αシグナルペプチド、腫瘍抗原を標的とするｓｃＦｖを含む細胞外リガンド結合ドメイン（例えば抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖまたは抗ＣＤ２０ ｓｃＦｖ）、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７に由来する共刺激シグナリングドメイン、及びＣＤ３ζに由来する一次細胞内シグナリングドメインを含むポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態において、本出願のＣＡＲは、「ＢＣＭＡ－リガンドＣＡＲ」である。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端の方向へ、ＣＤ８αシグナルペプチド、ＡＰＲＩＬまたはＢＡＦＦに由来する少なくとも１つのドメインを含む１つまたは複数の結合部分を含む細胞外リガンド結合ドメイン、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７に由来する共刺激シグナリングドメイン、及びＣＤ３ζに由来する一次細胞内シグナリングドメインを含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、細胞外リガンド結合ドメインは、ＡＰＲＩＬドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞外リガンド結合ドメインは、ＢＡＦＦドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞外リガンド結合ドメインは、ＡＰＲＩＬドメイン及びＢＡＦＦドメインを含む。
いくつかの実施形態において、本出願のＣＡＲは、ＡＣＴＲである。ＡＣＴＲを持つ操作されたＴ細胞は、Ｆｃ含有タンパク質（モノクローナル抗体等、例えば抗ＢＣＭＡ抗体）へ結合することができ、次いで当該Ｆｃ含有タンパク質は腫瘍細胞への橋として作用する。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端の方向へ、ＣＤ８αシグナルペプチド、Ｆｃ結合ドメイン（Ｆｃ受容体、例えばＦｃγＲ等）を含む１つまたは複数の結合部分を含む細胞外リガンド結合ドメイン、ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ１３７に由来する共刺激シグナリングドメイン、及びＣＤ３ζに由来する一次細胞内シグナリングドメインを含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ＦｃγＲは、ＣＤ１６Ａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）、ＣＤ１６Ｂ（ＦｃγＲＩＩＩｂ）、ＣＤ６４Ａ、ＣＤ６４Ｂ、ＣＤ６４Ｃ、ＣＤ３２Ａ、及びＣＤ３２Ｂからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、配列番号３６のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、配列番号８９のアミノ酸配列を含む。
ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／１１２１８１、ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／１１２１８２、ＰＣＴ／ＣＮ２０１７／０９６９３８及びＰＣＴ／ＣＮ２０１６／０９４４０８（それらの内容は、参照することによってそれらの全体が本明細書に援用される）中で記載されるＣＡＲを包含する、当技術分野において公知であるかまたは本発明者らによって開発された任意のＣＡＲを使用して、本明細書において記載されるＣＡＲを構築することができる。ＣＡＲの例示的な構造は、ＰＣＴ／ＣＮ２０１７／０９６９３８の図１５Ａ～１５Ｄ中で示される。
多価ＣＡＲ及び／または多重特異性ＣＡＲ
いくつかの実施形態において、本明細書において記載されるＣＡＲは、（ａ）抗原（例えば本明細書において記載される抗原のうちの任意のもの）を特異的に認識する１つまたは複数（２、３、４、５、６、またはそれ以上のうちの任意の１つ等）の結合部分を含む、細胞外リガンド結合ドメインと；（ｂ）膜貫通ドメインと；（ｃ）細胞内シグナリングドメインとを含む多価ＣＡＲである。いくつかの実施形態において、結合部分のうちの１つまたは複数は、抗原結合断片である。いくつかの実施形態において、結合部分のうちの１つまたは複数は、単一ドメイン抗体（例えば抗ＧＰＣ３ ｓｄＡｂ）を含む。いくつかの実施形態において、結合部分のうちの１つまたは複数は、ラクダ科の動物の抗体に由来する。いくつかの実施形態において、結合部分のうちの１つまたは複数は、４鎖抗体に由来する。いくつかの実施形態において、結合部分のうちの１つまたは複数は、ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態において、結合部分のうちの１つまたは複数は、ヒト抗体に由来する。いくつかの実施形態において、結合部分のうちの１つまたは複数は、ポリペプチドリガンド、または抗原へ特異的に結合する他の非抗体ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、多価ＣＡＲは単一特異性であり、すなわち多価ＣＡＲは単一抗原を標的とし、単一抗原に対する２つ以上の結合部位を含む。いくつかの実施形態において、多価ＣＡＲは多重特異性であり、すなわち多価ＣＡＲは１を超える抗原を標的とし、多価ＣＡＲは少なくとも１つの抗原に対する２つ以上の結合部位を含む。同じ抗原について特異的な結合部分は、抗原の同じエピトープ（すなわち「モノエピトープＣＡＲ」）へ結合するか、または抗原の異なるエピトープ（すなわちバイエピトープＣＡＲまたはトリエピトープＣＡＲ等の「マルチエピトープＣＡＲ」）へ結合し得る。同じ抗原に特異的な結合部位は、同じまたは異なるｓｄＡｂを含み得る。いくつかの実施形態において、抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＣＤ１３８、ＣＤ１２３／ＩＬ３Ｒα、ｃ－Ｍｅｔ、ｇｐ１００、ＭＵＣ１、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ／ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ２、ＩＧＦ１Ｒ、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＷＴ１、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、ＧＤ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＧＥ Ａ３、ＧＰＣ３、クローディン１８．２、糖脂質Ｆ７７、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、及び任意のそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、抗原はＧＰＣ３である。
いくつかの実施形態において、本明細書において記載されるＣＡＲは、（ａ）抗原（腫瘍抗原（例えばＧＰＣ３、ＣＤ２０）等）へ特異的に結合する複数（少なくとも約２、３、４、５、６、またはそれ以上のうちの任意の１つ等）の結合部分を含む、細胞外リガンド結合ドメインと；（ｂ）膜貫通ドメインと；（ｃ）細胞内シグナリングドメインとを含む多価（二価、三価、またはより多い価数等）のＣＡＲである。いくつかの実施形態において、本明細書において記載されるＣＡＲは、（ａ）抗原（腫瘍抗原（例えばＧＰＣ３、ＣＤ２０）等）へ特異的に結合する複数（少なくとも約２、３、４、５、６、またはそれ以上のうちの任意の１つ等）のを含む、細胞外リガンド結合ドメインと；（ｂ）膜貫通ドメインと；（ｃ）細胞内シグナリングドメインとを含む多価（二価、三価、またはより多い価数等）のＣＡＲである。いくつかの実施形態において、本明細書において記載されるＣＡＲは、（ａ）抗原（腫瘍抗原（例えばＧＰＣ３、ＣＤ２０）等）へ特異的に結合する複数（少なくとも約２、３、４、５、６、またはそれ以上のうちの任意の１つ等）のｓｄＡｂｓを含む、細胞外リガンド結合ドメインと；（ｂ）膜貫通ドメインと；（ｃ）細胞内シグナリングドメインとを含む多価（二価、三価、またはより多い価数等）のＣＡＲである。いくつかの実施形態において、第１のエピトープ及び第２のエピトープは、異なる。いくつかの実施形態において、第１のエピトープ及び第２のエピトープは、同じである。いくつかの実施形態において、第１の結合部分はｓｄＡｂであり、第２の結合部分はヒト抗体（例えばｓｃＦｖ）に由来する。いくつかの実施形態において、多価ＣＡＲは、抗原上の２つの異なるエピトープへ特異的に結合する。いくつかの実施形態において、多価ＣＡＲは、抗原上の３以上の異なるエピトープへ特異的に結合する。いくつかの実施形態において、本明細書において記載されるＣＡＲは、（ａ）抗原（腫瘍抗原（例えばＧＰＣ３、ＣＤ２０）等）の第１のエピトープへ特異的に結合する第１のｓｄＡｂ及び抗原の第２のエピトープへ特異的に結合する第２のｓｄＡｂを含む、細胞外リガンド結合ドメインと；（ｂ）膜貫通ドメインと；（ｃ）細胞内シグナリングドメインとを含む多価（二価、三価、またはより多い価数等）のＣＡＲである。いくつかの実施形態において、第１のエピトープ及び第２のエピトープは、異なる。いくつかの実施形態において、第１のエピトープ及び第２のエピトープは、同じである。いくつかの実施形態において、本明細書において記載されるＣＡＲは、（ａ）第１の抗原（腫瘍抗原（例えばＧＰＣ３、ＣＤ２０）等）へ特異的に結合する第１のｓｄＡｂ及び第２の抗原へ特異的に結合する第２のｓｄＡｂを含む、細胞外リガンド結合ドメインと；（ｂ）膜貫通ドメインと；（ｃ）細胞内シグナリングドメインとを含む多価（二価、三価、またはより多い価数等）のＣＡＲである。いくつかの実施形態において、第１の抗原及び第２の抗原は、異なる。いくつかの実施形態において、第１の抗原及び第２の抗原は、同じである。いくつかの実施形態において、抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＣＤ１３８、ＣＤ１２３／ＩＬ３Ｒα、ｃ－Ｍｅｔ、ｇｐ１００、ＭＵＣ１、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ／ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ２、ＩＧＦ１Ｒ、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＷＴ１、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、ＧＤ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＧＥ Ａ３、ＧＰＣ３、クローディン１８．２、糖脂質Ｆ７７、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、及び任意のそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、抗原はＧＰＣ３である。いくつかの実施形態において、抗原はＣＤ２０である。
いくつかの実施形態において、本明細書において記載されるＣＡＲは、（ａ）ＧＰＣ３の第１のエピトープへ特異的に結合する第１のｓｄＡｂ（「抗ＧＰＣ３ ｓｄＡｂ１」または「抗ＧＰＣ３ ＶＨＨ１」）及びＧＰＣ３の第２のエピトープへ特異的に結合する第２のｓｄＡｂ（「抗ＧＰＣ３ ｓｄＡｂ２」または「抗ＧＰＣ３ ＶＨＨ２」）を含む、細胞外リガンド結合ドメインと；（ｂ）膜貫通ドメインと；（ｃ）細胞内シグナリングドメインとを含む多価（二価、三価、またはより多い価数等）のＣＡＲである。いくつかの実施形態において、抗ＧＰＣ３ ｓｄＡｂ１及び抗ＧＰＣ３ ｓｄＡｂ２は、同じである。いくつかの実施形態において、抗ＧＰＣ３ ｓｄＡｂ１及び抗ＧＰＣ３ ｓｄＡｂ２は、異なる。
細胞外リガンド結合ドメイン
本明細書において記載されるＣＡＲの細胞外リガンド結合ドメインは、１つまたは複数（１、２、３、４、５、６、またはそれ以上のうちの任意の１つ等）の結合部分（ｓｄＡｂ）を含む。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の結合部分は、抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態において、１つまたは複数結合部分は、４鎖抗体に由来する。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の結合部分は、ラクダ科の動物の抗体に由来する。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の結合部分は、ヒト抗体に由来する。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の結合部分は、ラクダＩｇ、Ｉｇ ＮＡＲ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、Ｆ（ａｂ）’３断片、Ｆｖ、単一鎖Ｆｖ抗体（ｓｃＦｖ）、ｂｉｓ－ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（ｄｓＦｖ）、及び単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の結合部分は、ｓｄＡｂ（例えば抗ＢＣＭＡ ｓｄＡｂ）である。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の結合部分は、非抗体結合タンパク質（ポリペプチドリガンド、または抗原へ結合する操作されたタンパク質等）である。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の結合部分は、リガンドまたは受容体の細胞外ドメインに由来する少なくとも１つのドメインを含み、リガンドまたは受容体は細胞表面抗原である。いくつかの実施形態において、リガンドまたは受容体は、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｆ、ＮＫＧ２Ｄ、ＢＣＭＡ、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＩＬ－３、ＩＬ－１３、ＬＬＴ１、ＡＩＣＬ、ＤＮＡＭ－１、及びＮＫｐ８０からなる群から選択される分子に由来する。いくつかの実施形態において、リガンドは、ＢＣＭＡへ結合し得るＡＰＲＩＬまたはＢＡＦＦに由来する。いくつかの実施形態において、受容体は、Ｆｃ結合ドメイン（Ｆｃ受容体の細胞外ドメイン等）に由来する。いくつかの実施形態において、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）である。いくつかの実施形態において、ＦｃγＲは、ＣＤ１６Ａ（ＦｃγＲＩＩＩａ）、ＣＤ１６Ｂ（ＦｃγＲＩＩＩｂ）、ＣＤ６４Ａ、ＣＤ６４Ｂ、ＣＤ６４Ｃ、ＣＤ３２Ａ、及びＣＤ３２Ｂからなる群から選択される。結合部分は、ペプチド結合またはペプチドリンカーを介して互いに直接的に融合され得る。
いくつかの実施形態において、ＣＡＲの細胞外リガンド結合ドメインは、腫瘍抗原を標的とするｓｃＦｖである。いくつかの実施形態において、ＣＡＲの細胞外リガンド結合ドメインは、抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態において、抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖは、ａ）配列番号８０のうちの任意の１つにおいて示される配列を有するＶＨ鎖領域内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、及びＶＨ－ＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）と、ｂ）配列番号８１のうちの任意の１つにおいて示される配列を有するＶＬ鎖領域内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＬ－ＣＤＲ１、ＶＬ－ＣＤＲ２、及びＶＬ－ＣＤＲ３を含む、軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含む。いくつかの実施形態において、抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖは、ａ）配列番号８２において示されるＶＨ－ＣＤＲ１を含むアミノ酸配列、配列番号８３中で示されるＶＨ－ＣＤＲ２を含むアミノ酸配列、及び配列番号８４中で示されるＶＨ－ＣＤＲ３を含むアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）と；ｂ）配列番号８５において示されるＶＬ－ＣＤＲ１を含むアミノ酸配列、配列番号８６中で示されるＶＬ－ＣＤＲ２を含むアミノ酸配列、及び配列番号８７中で示されるＶＬ－ＣＤＲ３を含むアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。いくつかの実施形態において、抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖは、配列番号８０において示されるアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有するバリアントを含む、重鎖可変領域（ＶＨ）；及び／または配列番号８１において示されるアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有するバリアントを含む、軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
いくつかの実施形態において、抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖは、配列番号５８のアミノ酸配列、または少なくとも約８０％（少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のうちの任意の１つ等）の配列同一性を有するバリアントを含む。いくつかの実施形態において、抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖは、配列番号５８のアミノ酸配列を含む。
単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、１つまたは複数のｓｄＡｂを含む細胞外リガンド結合ドメインを含む。ｓｄＡｂは、同じまたは異なる起源及び同じまたは異なるサイズのものであり得る。例示的なｓｄＡｂとしては、重鎖のみの抗体（例えばＶＨＨまたはＶＮＡＲ）からの重鎖可変ドメイン、軽鎖を天然に欠いている結合分子、従来の４鎖抗体に由来する単一ドメイン（ＶＨまたはＶＬ等）、ヒト化重鎖のみの抗体、ヒト重鎖セグメントを発現するトランスジェニックマウスまたはトランスジェニックラットによって産生されたヒトｓｄＡｂ、及び抗体に由来するもの以外の操作されたドメイン及び単一ドメインスキャフォールドが挙げられるがこれらに限定されない。ＰＣＴ／ＣＮ２０１７／０９６９３８及びＰＣＴ／ＣＮ２０１６／０９４４０８（それらの内容は、参照することによってそれらの全体が本明細書に援用される）中で記載されるｓｄＡｂを包含する、当技術分野において公知であるかまたは本発明者らによって開発された任意のｓｄＡｂを使用して、本明細書において記載されるＣＡＲを構築することができる。ＣＡＲの例示的な構造は、ＰＣＴ／ＣＮ２０１７／０９６９３８の図１５Ａ～１５Ｄ中で示される。ｓｄＡｂは、マウス、ラット、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤツメウナギ、魚類、サメ、ヤギ、ウサギ、及びウシが挙げられるがこれらに限定されない任意の種に由来する。本明細書において企図される単一ドメイン抗体としては、ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）及びサメ以外の種からの天然に存在するｓｄＡｂ分子も挙げられる。
いくつかの実施形態において、ｓｄＡｂは、軽鎖を欠いている重鎖抗体（本明細書において「重鎖のみの抗体」とも称される）として公知の天然に存在する単一ドメイン抗原結合分子に由来する。かかる単一ドメイン分子は、例えばＷＯ９４／０４６７８及びＨａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４６－４４８中で開示される。明瞭性の理由のために、軽鎖を天然に欠いている重鎖分子に由来する可変ドメインは、４鎖免疫グロブリンの従来のＶＨと区別するために、本明細書においてＶＨＨとして認められている。かかるＶＨＨ分子は、ラクダ科の種（例えばラクダ、ラマ、ビクーナ、ヒトコブラクダ、アルパカ、グアナコ）において作製された抗体に由来し得る。ラクダ科以外の他の種は、軽鎖を天然に欠いている重鎖分子を産生してもよく、かかるＶＨＨは本出願の範囲内である。
ラクダ科の動物からのＶＨＨ分子は、ＩｇＧ分子よりも約１０倍小さい。それらは単一ポリペプチドであり、非常に安定的であり、極端なｐＨ及び温度条件耐性があり得る。さらに、それらは、従来の４鎖抗体についての事例では存在しない、プロテアーゼの作用への耐性があり得る。さらに、ＶＨＨのインビトロの発現により、高収率で適切に折り畳まれた機能的ＶＨＨが産生される。加えて、ラクダ科の動物において生成された抗体は、抗体ライブラリーの使用を介してまたはラクダ科の動物以外の哺乳動物の免疫経由でインビトロで生成された抗体によって認識されたもの以外のエピトープを認識し得る（例えばＷＯ９７４９８０５を参照）。それゆえ、１つまたは複数のＶＨＨドメインを含む多重特異性ＣＡＲまたは多価ＣＡＲは、従来の４鎖抗体に由来する抗原結合断片を含む多重特異性ＣＡＲまたは多価ＣＡＲよりも効率的に相互作用し得る。ＶＨＨは「通常ではない」エピトープ（空洞または溝等）の中へ結合することが公知であるので、かかるＶＨＨを含むＣＡＲの親和性は、従来の多重特異性ポリペプチドよりも治療処置に、より好適であり得る。
いくつかの実施形態において、ｓｄＡｂは、軟骨魚類において見出される免疫グロブリンの可変領域に由来する。例えば、ｓｄＡｂは、サメの血清において見出される新規抗原受容体（ＮＡＲ）として公知の免疫グロブリンアイソタイプに由来し得る。ＮＡＲの可変領域に由来する単一ドメイン分子（「ＩｇＮＡＲ」）を産生する方法は、ＷＯ０３／０１４１６１及びＳｔｒｅｌｔｓｏｖ（２００５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１４：２９０１－２９０９中で記載される。
いくつかの実施形態において、ｓｄＡｂは、組み換え、ＣＤＲグラフト、ラクダ化、ヒト化、脱免疫、及び／またはインビトロ生成される（例えばファージディスプレイによって選択される）。いくつかの実施形態において、フレームワーク領域のアミノ酸配列は、フレームワーク領域中の特異的なアミノ酸残基の「ラクダ化」によって変更され得る。ラクダ化は、重鎖抗体のＶＨＨドメイン中の対応する位置（複数可）で出現するアミノ酸残基のうちの１つまたは複数による、従来の４鎖抗体（天然に存在する）からのＶＨドメインのアミノ酸配列中の１つまたは複数のアミノ酸残基の置き換えまたは置換を指す。当該ラクダ化はそれ自体公知の様式で遂行することができ、例えば本明細書におけるさらなる記載に基づいて当業者に明らかだろう。かかる「ラクダ化」置換は、好ましくは、ＶＨ－ＶＬ境界を形成するアミノ酸位置及び／またはＶＨ－ＶＬ境界に存在するアミノ酸位置で、及び／または本明細書において定義されるようないわゆるラクダ科ホールマーク残基で、挿入される（例えばＷＯ９４／０４６７８、Ｄａｖｉｅｓ ａｎｄ Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３３９：２８５－２９０，１９９４；Ｄａｖｉｅｓ ａｎｄ Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９（６）：５３１－５３７，１９９６；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５９：９５７－９６９，１９９６；及びＲｉｅｃｈｍａｎｎ ａｎｄ Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２３１：２５－３８，１９９９を参照）。
いくつかの実施形態において、ｓｄＡｂは、ヒト重鎖セグメントを発現するトランスジェニックマウスまたはトランスジェニックラットによって産生されたヒトｓｄＡｂである。例えばＵＳ２００９０３０７７８７Ａ１、米国特許出願第８，７５４，２８７号、ＵＳ２０１５０２８９４８９Ａ１、ＵＳ２０１００１２２３５８Ａ１、及びＷＯ２００４０４９７９４を参照されたい。いくつかの実施形態において、ｓｄＡｂは、親和性成熟される。
いくつかの実施形態において、特定の抗原または標的に対する天然に存在するＶＨＨドメインは、ラクダ科の動物のＶＨＨ配列の（ナイーブは免疫）ライブラリーから得られ得る。かかる方法は、それ自体公知の１つまたは複数のスクリーニング技法を使用して、前記抗原もしくは標的、または少なくとも１つのその部分、断片、抗原決定基、もしくはエピトープを使用して、かかるライブラリーをスクリーニングすることを、含んでも含まなくてもよい。かかるライブラリー及び技法は、例えばＷＯ９９／３７６８１、ＷＯ０１／９０１９０、ＷＯ０３／０２５０２０、及びＷＯ０３／０３５６９４中で記載される。代替的に、（ナイーブまたは免疫）ＶＨＨライブラリーに由来する改善された合成または半合成のライブラリーが使用され得、例えばＷＯ００／４３５０７中で記載されるランダム突然変異誘発及び／またはＣＤＲシャッフリング等の技法によって、（ナイーブまたは免疫）ＶＨＨライブラリーから得られたＶＨＨライブラリー等である。
いくつかの実施形態において、ｓｄＡｂは、従来の４鎖抗体から生成される。例えばＥＰ０３６８６８４、Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ １９８９ Ｏｃｔ．１２；３４１（６２４２）：５４４－６）、Ｈｏｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００３，２１（１１）：４８４－４９０；ＷＯ０６／０３０２２０；及びＷＯ０６／００３３８８を参照されたい。
本明細書において記載される多重特異性ＣＡＲまたは多価ＣＡＲ中の様々な結合部分（ｓｄＡｂ、リガンド／受容体ドメイン等）は、ペプチドリンカー（セクションＩＩ中で記載されるペプチドリンカーのうちの任意のもの等）を介して互いに融合され得る。いくつかの実施形態において、結合部分（ｓｄＡｂ、リガンド／受容体ドメイン等）は、ペプチドリンカー無しで互いに直接的に融合される。異なる結合部分（ｓｄＡｂ、リガンド／受容体ドメイン等）を接続するペプチドリンカーは、同じまたは異なり得る。ＣＡＲの異なるドメインは、ペプチドリンカーを介しても互いに融合され得る。
ＣＡＲ中の各々のペプチドリンカーは、ｓｄＡｂ及び／または様々なドメイン（例えばリガンド／受容体ドメイン）の構造的特色及び／または機能的特色に依存して、同じまたは異なる長さ及び／または配列を有し得る。各々のペプチドリンカーは、独立して選択及び最適化され得る。ＣＡＲ中で使用されるペプチドリンカー（複数可）の長さ、柔軟性の程度、及び／または他の特性は、１つまたは複数の特定の抗原またはエピトープについての親和性、特異性、またはアビディティーが挙げられるがこれらに限定されない特性にある程度の影響を有し得る。例えば、２つの隣接ドメインが互いに立体的に妨害しないことを保証するために、より長いプチドリンカーが選択され得る。例えば、多量体抗原に対して指向性のあるｓｄＡｂを含む本明細書において記載される多価ＣＡＲまたは多重特異性ＣＡＲにおいて、ペプチドリンカーの長さ及び柔軟性は、好ましくは、多価ＣＡＲ中の各々のｓｄＡｂが多量体のサブユニットの各々上の抗原決定基へ結合することを可能にするようなものである。いくつかの実施形態において、短いペプチドリンカーは、膜貫通ドメインとＣＡＲの細胞内シグナリングドメインとの間に配置され得る。いくつかの実施形態において、隣接ドメインが互いと比べて自由に移動することができるように、ペプチドリンカーは柔軟な残基（グリシン及びセリン等）を含む。例えば、グリシン－セリンダブレットは好適なペプチドリンカーであり得る。
ペプチドリンカーは、任意の好適な長さであり得る。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、またはそれ以上のうちの任意のアミノ酸長である。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、約１００、７５、５０、４０、３５、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、またはそれ以下のうちの任意のアミノ酸長である。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーの長さは、約１アミノ酸～約１０アミノ酸、約１アミノ酸～約２０のアミノ酸、約１アミノ酸～約３０のアミノ酸、約５アミノ酸～約１５のアミノ酸、約１０アミノ酸～約２５のアミノ酸、約５アミノ酸～約３０のアミノ酸、約１０アミノ酸～約３０のアミノ酸長、約３０アミノ酸～約５０のアミノ酸、約５０アミノ酸～約１００のアミノ酸、約１アミノ酸～約１００のアミノ酸のうちの任意のものである。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーは、配列番号５７及び６１～６５のうちの任意のもののアミノ酸配列を含む。
ペプチドリンカーは、天然に存在する配列または天然に存在しない配列を有し得る。例えば、重鎖のみの抗体のヒンジ領域に由来する配列は、リンカーとして使用され得る。例えばＷＯ１９９６／３４１０３を参照されたい。
膜貫通ドメイン
本出願のＣＡＲは、細胞外リガンド結合ドメインへ直接的または間接的に融合され得る膜貫通ドメインを含む。膜貫通ドメインは、天然供給源または合成供給源のいずれかに由来し得る。本明細書において使用される時、「膜貫通ドメイン」は、細胞膜、好ましくは真核生物の細胞膜中で熱力学的に安定的な任意のタンパク質構造を指す。本明細書において記載されるＣＡＲにおける使用に適合性のある膜貫通ドメインは、天然に存在するタンパク質から得られ得る。代替的に、それは、合成の天然に存在しないタンパク質セグメント（例えば細胞膜中で熱力学的に安定的な疎水性タンパク質セグメント）であり得る。
膜貫通ドメインは、膜貫通ドメインの三次元構造に基づいて分類される。例えば、膜貫通ドメインは、αヘリックス、２つ以上のαヘリックスの複合体、βバレル、または細胞のリン脂質二重層を通過することが可能な他の安定的な構造を形成し得る。さらに、膜貫通ドメインは、膜貫通ドメイントポロジー（膜貫通ドメインが膜を横切る通過回数及びタンパク質の方向を包含する）に基づいても分類され得るか、またはそれらに基づいて代替的に分類され得る。例えば、単回通過膜タンパク質は細胞膜を１回横切り、複数回通過膜タンパク質は少なくとも２回（例えば２、３、４、５、６、７、またはそれ以上の回数）細胞膜を横切る。膜タンパク質は、細胞の内側及び外側に比べた膜タンパク質の末端及び膜通過セグメント（複数可）のトポロジーに依存して、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型として定義され得る。Ｉ型膜タンパク質は、単一の膜通過領域を有し、タンパク質のＮ末端が細胞の脂質二重層の細胞外側に存在し、タンパク質のＣ末端は細胞質側に存在するように方向付けられる。ＩＩ型膜タンパク質も、単一の膜通過領域を有するが、タンパク質のＣ末端が細胞の脂質二重層の細胞外側に存在し、タンパク質のＮ末端は細胞質側に存在するように方向付けられる。ＩＩＩ型膜タンパク質は、複数の膜貫通セグメントを有し、膜貫通セグメントの数、ならびにＮ末端及びＣ末端の所在位置に基づいてさらに細分類され得る。
いくつかの実施形態において、本明細書において記載されるＣＡＲの膜貫通ドメインは、Ｉ型単回通過膜タンパク質に由来する。いくつかの実施形態において、複数回通過膜タンパク質からの膜貫通ドメインも、本明細書において記載されるＣＡＲにおける使用に適合し得る。複数回通過膜タンパク質は、複合的な（少なくとも２、３、４、５、６、７、またはそれ以上の）αヘリックスまたはβシート構造を含み得る。好ましくは、複数回通過膜タンパク質のＮ末端及びＣ末端は、脂質二重層の反対側に存在し、例えば、タンパク質のＮ末端は、脂質二重層の細胞質側に存在し、タンパク質のＣ末端は、細胞外側に存在する。
いくつかの実施形態において、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のα鎖、β鎖、もしくはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ－１（ＣＤＩＩａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦｌ）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ－２Ｒβ、ＩＬ－２Ｒγ、ＩＬ－７Ｒａ、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤＩＩａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤＩＯＯ（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、及び／またはＮＫＧ２Ｃの膜貫通ドメインから選ばれる膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のα鎖、β鎖、またはζ鎖、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、及びＰＤ－１からなる群から選択される分子に由来する。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ８αに由来する。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８に由来する。
本明細書において記載されるＣＡＲにおける使用のための膜貫通ドメインは、合成の天然に存在しないタンパク質セグメントの少なくとも一部分も含み得る。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、合成の天然に存在しないαヘリックスまたはβシートである。いくつかの実施形態において、タンパク質セグメントは、少なくともおよそ２０アミノ酸（例えば少なくとも１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはそれ以上のアミノ酸）である。合成膜貫通ドメインの例は当技術分野において公知であり、例えば米国特許第７，０５２，９０６Ｂ１号及びＰＣＴ公開第ＷＯ２０００／０３２７７６Ａ２号（これらの関連開示は参照することによって本明細書において援用される）中でのものである。
膜貫通ドメインは、膜貫通ドメインのＣ末端側に所在する膜貫通領域及び細胞質領域を含み得る。膜貫通ドメインの細胞質領域は３つ以上アミノ酸を含み、いくつかの実施形態において、脂質二重層中で膜貫通ドメインを方向付けることを支援する。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のシステイン残基は、膜貫通ドメインの膜貫通領域中に存在する。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のシステイン残基は、膜貫通ドメインの細胞質領域中に存在する。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインの細胞質領域は、正に荷電したアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインの細胞質領域は、アミノ酸のアルギニン、セリン、及びリジンを含む。
いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインの膜貫通領域は、疎水性アミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、人工疎水性配列を含む。例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、及びバリンのトリプレットは、膜貫通ドメインのＣ末端に存在し得る。いくつかの実施形態において、膜貫通領域は、ほとんどが疎水性アミノ酸残基（アラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、またはバリン等）を含む。いくつかの実施形態において、膜貫通領域は、疎水性である。いくつかの実施形態において、膜貫通領域は、ポリ－ロイシン－アラニン配列を含む。タンパク質またはタンパク質のセグメントの疎水性または疎水性もしくは親水性の特徴は、当技術分野において公知の任意の方法（例えばＫｙｔｅ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅの疎水性分析）によって査定され得る。
細胞内シグナリングドメイン
本出願のＣＡＲは、細胞内シグナリングドメインを含む。細胞内シグナリングドメインは、ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞の正常なエフェクター機能のうちの少なくとも１つの活性化に関与する。「エフェクター機能」という用語は、細胞の特殊化された機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば細胞溶解活性またはヘルパー活性（サイトカインの分泌を包含する）であり得る。したがって「細胞質シグナリングドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に特殊化された機能を遂行するように指令するタンパク質の部分を指す。通常、細胞質シグナリングドメイン全体が用いられ得るが、多くの事例において、鎖全体を使用することは必要ではない。細胞質シグナリングドメインの短縮部分が使用される場合においては、かかる短縮部分は、エフェクター機能シグナルを伝達する限り、インタクトな鎖の代わりに使用され得る。細胞質シグナリングドメインという用語は、したがって、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞質シグナリングドメインの任意の短縮部分を包含することを意味する。
いくつかの実施形態において、細胞内シグナリングドメインは、免疫エフェクター細胞の一次細胞内シグナリングドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、免疫エフェクター細胞の一次細胞内シグナリングドメインから本質的になる細胞内シグナリングドメインを含む。「一次細胞内シグナリングドメイン」は、免疫エフェクター機能を誘導するように刺激様式で作用する細胞質シグナリング配列を指す。いくつかの実施形態において、一次細胞内シグナリングドメインは、免疫受容体チロシン活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして公知のシグナリングモチーフを含有する。「ＩＴＡＭ」は、本明細書において使用される時、多くの免疫細胞において発現されるシグナリング分子の尾部中に概して存在する保存されたタンパク質モチーフである。モチーフは、６～８のアミノ酸によって分離されたアミノ酸配列ＹｘｘＬ／Ｉの２つの反復を含んでもよく、配列中、各々のｘは独立して任意のアミノ酸であり、保存されたモチーフＹｘｘＬ／Ｉｘ（６－８）ＹｘｘＬ／Ｉを産生する。シグナリング分子内のＩＴＡＭは、細胞内のシグナル伝達のために重要であり、当該シグナル伝達は、ＩＴＡＭ中のチロシン残基のリン酸化、続いてシグナリング分子の活性化よって少なくとも部分的に媒介される。ＩＴＡＭは、シグナリング経路に関与する他のタンパク質のためのドッキング部位としても機能し得る。例示的なＩＴＡＭ含有一次細胞質シグナリング配列としては、ＣＤ３ζ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＦｃＲγ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃＲβ（ＦｃεＲＩｂ）、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ６６ｄ、ＦｃγＲＩＩａ、ＤＡＰ１０、及びＤＡＰ１２に由来するものが挙げられる。
いくつかの実施形態において、一次細胞内シグナリングドメインは、ＣＤ３ζに由来する。いくつかの実施形態において、細胞内シグナリングドメインは、ＣＤ３ζの細胞質シグナリングドメインからなる。いくつかの実施形態において、一次細胞内シグナリングドメインは、野生型ＣＤ３ζの細胞質シグナリングドメインである。
共刺激シグナリングドメイン
多くの免疫エフェクター細胞（例えばＴ細胞）は、細胞の増殖、分化、及び生存を促進するために、そして細胞のエフェクター機能を活性化するために、抗原特異的シグナルの刺激に加えて、共刺激を要求する。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、少なくとも１つの共刺激シグナリングドメインを含む。「共刺激シグナリングドメイン」という用語は、本明細書において使用される時、免疫応答（エフェクター機能等）を誘導するように細胞内のシグナル伝達を媒介するタンパク質の少なくとも一部分を指す。本明細書において記載されるキメラ受容体の共刺激シグナリングドメインは、共刺激タンパク質からの細胞質シグナリングドメインであり得、これはシグナルを伝達し、免疫細胞（Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、または好酸球等）によって媒介される応答を調節する。「共刺激シグナリングドメイン」は、共刺激分子の細胞質部分であり得る。「共刺激分子」という用語は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって免疫細胞による共刺激応答（増殖及び生存等であるがこれらに限定されない）を媒介する、免疫細胞（Ｔ細胞等）上の同族結合パートナーを指す。
いくつかの実施形態において、細胞内シグナリングドメインは、単一の共刺激シグナリングドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内シグナリングドメインは、２つ以上（約２、３、４、またはそれ以上のうちの任意のもの等）の共刺激シグナリングドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内シグナリングドメインは、２つ以上の同じ共刺激シグナリングドメイン（例えば２コピーのＣＤ２８またはＣＤ１３７（４－１ＢＢ）の共刺激シグナリングドメイン）を含む。いくつかの実施形態において、細胞内シグナリングドメインは、異なる共刺激タンパク質からの２つ以上の共刺激シグナリングドメイン（本明細書において記載される任意の２つ以上の共刺激タンパク質等）を含む。いくつかの実施形態において、細胞内シグナリングドメインは、一次細胞内シグナリングドメイン（ＣＤ３ζの細胞質シグナリングドメイン等）及び１つまたは複数の共刺激シグナリングドメイン（例えば４－１ＢＢ）を含む。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の共刺激シグナリングドメイン及び一次細胞内シグナリングドメイン（ＣＤ３ζの細胞質シグナリングドメイン等）は、任意選択のペプチドリンカーを介して互いに融合される。一次細胞内シグナリングドメイン及び１つまたは複数の共刺激シグナリングドメインは、任意の好適な順序でアレンジされ得る。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の共刺激シグナリングドメインは、膜貫通ドメインと一次細胞内シグナリングドメイン（ＣＤ３ζの細胞質シグナリングドメイン等）との間に所在する。複数の共刺激シグナリングドメインは、相加的または相乗的な刺激効果を提供し得る。
宿主細胞（例えば免疫細胞）における共刺激シグナリングドメインの活性化は、サイトカインの産生及び分泌、ファゴサイトーシス特性、増殖、分化、生存、及び／または細胞傷害性を増加または減少させるように細胞を誘導し得る。任意の共刺激分子の共刺激シグナリングドメインは、本明細書において記載されるＣＡＲにおける使用に適合し得る。共刺激シグナリングドメインの型（複数可）は、エフェクター分子が発現される免疫エフェクター細胞の型（例えばＴ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、または好酸球）及び所望される免疫エフェクター機能（例えばＡＤＣＣ効果）等の因子に基づいて選択される。ＣＡＲにおける使用のための共刺激シグナリングドメインの例は、共刺激タンパク質の細胞質シグナリングドメインであり得、Ｂ７／ＣＤ２８ファミリーのメンバー（例えばＢ７－１／ＣＤ８０、Ｂ７－２／ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ１／ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、Ｂ７－Ｈ７、ＢＴＬＡ／ＣＤ２７２、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、Ｇｉ２４／ＶＩＳＴＡ／Ｂ７－Ｈ５、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ２／Ｂ７－ＤＣ、及びＰＤＣＤ６）；ＴＮＦスーパーファミリーのメンバー（例えば４－１ＢＢ／ＴＮＦＳＦ９／ＣＤ１３７、４－１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＢＡＦＦ Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＣＤ２７リガンド／ＴＮＦＳＦ７、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＣＤ４０／ＴＮＦＳＦ５、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５、ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、リンホトキシン－α／ＴＮＦ－β、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦ－α、及びＴＮＦ ＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）；ＳＬＡＭファミリーのメンバー（例えば２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４、ＢＬＡＭＥ／ＳＬＡＭＦ８、ＣＤ２、ＣＤ２Ｆ－１０／ＳＬＡＭＦ９、ＣＤ４８／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ５８／ＬＦＡ－３、ＣＤ８４／ＳＬＡＭＦ５、ＣＤ２２９／ＳＬＡＭＦ３、ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７、ＮＴＢ－Ａ／ＳＬＡＭＦ６、及びＳＬＡＭ／ＣＤ１５０）；及び他の共刺激分子（ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ５３、ＣＤ８２／Ｋａｉ－１、ＣＤ９０／Ｔｈｙ１、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ３００ａ／ＬＭＩＲ１、ＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡ－ＤＲ、イカロス、インテグリンα４／ＣＤ４９ｄ、インテグリンα４β１、インテグリンα４β７／ＬＰＡＭ－１、ＬＡＧ－３、ＴＣＬ１Ａ、ＴＣＬ１Ｂ、ＣＲＴＡＭ、ＤＡＰ１２、デクチン－１／ＣＬＥＣ７Ａ、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６、ＥｐｈＢ６、ＴＩＭ－１／ＫＩＭ－１／ＨＡＶＣＲ、ＴＩＭ－４、ＴＳＬＰ、ＴＳＬＰ Ｒ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）及びＮＫＧ２Ｃ等）が限定されずに挙げられる。
いくつかの実施形態において、１つまたは複数の共刺激シグナリングドメインは、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２（ＬＦＡ－２）、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ－１）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１６２（ＳＥＬＰＬＧ）、ＣＤ２５８（ＬＩＧＨＴ）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴＲ）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７９（ＰＤ－１）、ＣＤ３１９（ＳＬＡＭＦ７）、ＬＦＡ－１（リンパ球機能関連抗原－１）、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤＳ、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＩＰＯ－３、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ８３、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ－４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７３（ＰＤ－Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ－Ｌ１）、ＤＡＰ１０、ＴＲＩＭ、ＺＡＰ７０、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、及び任意のそれらの組み合わせからなる群から選択された共刺激分子に由来する。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の共刺激シグナリングドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、及びＣＤ８３へ特に結合するリガンドからなる群から選択される共刺激分子に由来する。
いくつかの実施形態において、本出願のＣＡＲ中の細胞内シグナリングドメインは、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）に由来する共刺激シグナリングドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内シグナリングドメインは、ＣＤ３ζの細胞質シグナリングドメイン及び４－１ＢＢの共刺激シグナリングドメインを含む。
いくつかの実施形態において、本出願のＣＡＲ中の細胞内シグナリングドメインは、ＣＤ２８に由来する共刺激シグナリングドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内シグナリングドメインは、ＣＤ３ζの細胞質シグナリングドメイン及びＣＤ２８の共刺激シグナリングドメインを含む。
いくつかの実施形態において、本出願のＣＡＲ中の細胞内シグナリングドメインは、ＣＤ２８の共刺激シグナリングドメイン及びＣＤ１３７の共刺激シグナリングドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内シグナリングドメインは、ＣＤ３ζの細胞質シグナリングドメイン、ＣＤ２８の共刺激シグナリングドメイン、及びＣＤ１３７の共刺激シグナリングドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内シグナリングドメインは、Ｎ末端からＣ末端の方向へ、ＣＤ２８の共刺激シグナリングドメイン、ＣＤ１３７の共刺激シグナリングドメイン、及びＣＤ３ζの細胞質シグナリングドメインを含むポリペプチドを含む。
共刺激シグナリングドメインが免疫細胞の免疫応答を調節することが可能であるような、本明細書において記載される共刺激シグナリングドメインのうちの任意のもののバリアントも本開示の範囲内である。いくつかの実施形態において、共刺激シグナリングドメインは、野生型カウンターパートに比較して、最大１０（例えば１、２、３、４、５、または８）のアミノ酸残基のバリエーションを含む。１つまたは複数のアミノ酸バリエーションを含むかかる共刺激シグナリングドメインは、バリアントと称され得る。共刺激シグナリングドメインのアミノ酸残基の突然変異は、突然変異を含まない共刺激シグナリングドメインと比べて、シグナル伝達の増加及び免疫応答の刺激の促進をもたらし得る。共刺激シグナリングドメインのアミノ酸残基の突然変異は、突然変異を含まない共刺激シグナリングドメインと比べて、シグナル伝達の減少及び免疫応答の刺激の低減をもたらし得る。
ヒンジ
本出願のＣＡＲは、細胞外リガンド結合ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間に所在するヒンジドメインを含み得る。ヒンジドメインは、概して、タンパク質の２つのドメイン間で見出され、タンパク質の柔軟性、及びドメインのうちの１つまたは両方の互いに比べた運動を可能にし得るアミノ酸セグメントである。エフェクター分子の膜貫通ドメインに比べた細胞外抗原結合ドメインのかかる柔軟性及び運動を提供する任意のアミノ酸配列が使用され得る。
ヒンジドメインは、約１０～１００のアミノ酸（例えば約１５～７５のアミノ酸、２０～５０のアミノ酸、または３０～６０のアミノ酸のうちの任意の１つ）を含有し得る。いくつかの実施形態において、ヒンジドメインは、少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、または７５アミノ酸長のうちの任意の１つであり得る。
いくつかの実施形態において、ヒンジドメインは、天然に存在するタンパク質のヒンジドメインである。ヒンジドメインを含むことが当該技術分野において公知である任意のタンパク質のヒンジドメインは、本明細書において記載されるＣＡＲにおける使用に適合する。いくつかの実施形態において、ヒンジドメインは、天然に存在するタンパク質のヒンジドメインの少なくとも一部分であり、キメラ受容体へ柔軟性を付与する。いくつかの実施形態において、ヒンジドメインは、ＣＤ８αに由来する。いくつかの実施形態において、ヒンジドメインは、ＣＤ８αのヒンジドメインの一部分、例えばＣＤ８αのヒンジドメインのうちの少なくとも１５（例えば２０、２５、３０、３５、または４０）の連続アミノ酸を含有する断片である。
抗体（ＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＥ抗体、またはＩｇＤ抗体等）のヒンジドメインは、本明細書において記載されるｐＨ依存性キメラ受容体系における使用にも適合する。いくつかの実施形態において、ヒンジドメインは、抗体の定常ドメインＣＨ１及びＣＨ２を繋ぐヒンジドメインである。いくつかの実施形態において、ヒンジドメインは抗体のものであり、抗体のヒンジドメイン及び抗体の１つまたは複数の定常領域を含む。いくつかの実施形態において、ヒンジドメインは、抗体のヒンジドメイン及び抗体のＣＨ３定常領域を含む。いくつかの実施形態において、ヒンジドメインは、抗体のヒンジドメイン、ならびに抗体のＣＨ２及びＣＨ３の定常領域を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、ＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＥ抗体、またはＩｇＤ抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、ＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、またはＩｇＧ４抗体である。いくつかの実施形態において、ヒンジ領域は、ヒンジ領域ならびにＩｇＧ１抗体のＣＨ２及びＣＨ３の定常領域を含む。いくつかの実施形態において、ヒンジ領域は、ヒンジ領域及びＩｇＧ１抗体のＣＨ３定常領域を含む。
天然に存在しないペプチドも、本明細書において記載されるキメラ受容体のためにヒンジドメインとして使用され得る。いくつかの実施形態において、Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインのＣ末端及び膜貫通ドメインのＮ末端との間のヒンジドメインは、（ＧｘＳ）ｎリンカー（配列中、ｘ及びｎは、独立して、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはそれ以上を包含する３～１２の整数でありえる）等のペプチドリンカーである。
シグナルペプチド
本出願のＣＡＲは、ポリペプチドのＮ末端において、シグナルペプチド（シグナル配列としても公知である）を含み得る。概して、シグナルペプチドは、ポリペプチドを細胞中の所望される部位へターゲティングするペプチド配列である。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、エフェクター分子を細胞の分泌経路へターゲティングし、脂質二重層の中へのエフェクター分子の組み込み及びアンカリングを可能にするだろう。本明細書において記載されるＣＡＲにおける使用に適合する天然に存在するタンパク質のシグナル配列または合成の天然に存在しないシグナル配列を含むシグナルペプチドは、当業者に明らかだろう。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、ＣＤ８α、ＧＭ－ＣＳＦ受容体α、及びＩｇＧ１重鎖からなる群から選択される分子に由来する。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、ＣＤ８αに由来する。
ＡＣＴＲは、Ｆｃ受容体（ＣＤ１６）をシグナル伝達ドメイン（４－１ＢＢ／ＣＤ３ζ）と組み合わせたキメラタンパク質である。ＡＣＴＲを持つ操作されたＴ細胞は、モノクローナル抗体へ結合することができ、次いで当該モノクローナル抗体は腫瘍細胞への橋として作用する。
いくつかの実施形態において、機能的外来性受容体は、（ａ）リガンドまたは受容体の細胞外ドメインに由来する少なくとも１つドメインを含み、リガンドまたは受容体が、細胞表面抗原（例えばＮＫＧ２Ｄ、ＢＣＭＡ、ＩＬ－３、ＩＬ－１３）である、細胞外リガンド結合ドメインと；（ｂ）膜貫通ドメインと；（ｃ）細胞内シグナリングドメインとを含むキメラ受容体である。
いくつかの実施形態において、細胞外リガンド結合ドメインは、ＢＣＭＡのリガンド（例えばＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ）に由来する少なくとも１つドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞外リガンド結合ドメインは、ＢＣＭＡの１つまたは複数のエピトープを特異的に認識する抗原結合断片（例えばｓｄＡｂ）を含む。
操作されたＴＣＲ
いくつかの実施形態において、機能的外来性受容体は、野生型ＴＣＲに由来するＶα及びＶβを含む細胞外リガンド結合ドメインを含む操作されたＴＣＲ（例えば腫瘍抗原を特異的に認識する操作されたＴＣＲ、または腫瘍抗原－ＭＨＣ複合体）であり、当該Ｖα及びＶβは、抗原（本明細書において記載される抗原のうちの任意のもの等、例えば腫瘍抗原）を一緒に特異的に認識し、Ｖα、Ｖβ、またはその両方は、野生型ＴＣＲに比べて、１つまたは複数のＣＤＲ中で突然変異を含む。いくつかの実施形態において、突然変異は、アミノ酸置換（保存的アミノ酸置換等）を導く。いくつかの実施形態において、操作されたＴＣＲは、野生型ＴＣＲによって結合されるものと同じ同族ペプチド－ＭＨＣへ結合する。いくつかの実施形態において、操作されたＴＣＲは、野生型ＴＣＲによって結合されるものに比較して、より高い親和性で同じ同族ペプチド－ＭＨＣへ結合する。いくつかの実施形態において、操作されたＴＣＲは、野生型ＴＣＲによって結合されるものに比較して、より低い親和性で同じ同族ペプチド－ＭＨＣへ結合する。いくつかの実施形態において、操作されたＴＣＲは、野生型ＴＣＲによって結合されない非同族ペプチド－ＭＨＣへ結合する。いくつかの実施形態において、操作されたＴＣＲは、単一鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）である。いくつかの実施形態において、操作されたＴＣＲは、二量体ＴＣＲ（ｄＴＣＲ）である。いくつかの実施形態において、野生型ＴＣＲは、ＨＬＡ－Ａ２を結合する。いくつかの実施形態において、操作されたＴＣＲは、細胞内シグナリングドメイン（ＣＤ３ζに由来する一次細胞内シグナリングドメイン等）をさらに含む。
いくつかの実施形態において、操作されたＴＣＲは、野生型ＴＣＲに由来するＶα及びＶβを含む細胞外リガンド結合ドメインを含み、当該Ｖα及びＶβは、腫瘍抗原または腫瘍抗原－ＭＨＣ複合体を一緒に特異的に認識し、Ｖα、Ｖβ、またはその両方は、野生型ＴＣＲに比べて、１つまたは複数のＣＤＲ中で突然変異を含む。いくつかの実施形態において、操作された抗腫瘍抗原ＴＣＲは、野生型抗腫瘍抗原ＴＣＲよりも腫瘍抗原への高い結合親和性を有する。いくつかの実施形態において、操作されたＴＣＲは、細胞内シグナリングドメイン（ＣＤ３ζに由来した一次細胞内シグナリングドメイン等）をさらに含む。
ＩＶ．操作された細胞
本出願は、本明細書において記載される、融合タンパク質のうちの任意のもの、ベクターのうちの任意のもの、及び／または核酸のうちの任意のものを含む、操作された細胞を提供する。
いくつかの実施形態において、操作された細胞は、ａ）融合タンパク質（本明細書において記載される融合タンパク質のうちの任意のもの等）とｂ）機能的外来性受容体（本明細書において記載される機能的外来性受容体のうちの任意のもの等）とを含む。いくつかの実施形態において、融合タンパク質及び機能的外来性受容体の両方は、操作された細胞の表面上で発現される。
いくつかの実施形態において、ａ）ｉ）ＴＧＦβＲ１またはＴＧＦβＲ２のうちの一方の細胞外ドメインを含む第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）第１の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）ＩＬ－１２Ｒβ１またはＩＬ－２３Ｒのうちの一方の細胞内ドメインを含む第１の細胞内ドメイン、を含む、第１のポリペプチドと；ｂ）ｉ）ＴＧＦβＲ１またはＴＧＦβＲ２のうちの他方の細胞外ドメインを含む第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）第２の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）ＩＬ－１２Ｒβ１またはＩＬ－２３Ｒのうちの他方の細胞内ドメインを含む第２の細胞内ドメイン、を含む、第２のポリペプチドとを含む融合タンパク質を含む（または発現する）操作された細胞（例えば免疫細胞、例えばＴ細胞、例えばＣＤ８ Ｔ細胞）が提供される。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３受容体複合体細胞内ドメインを介して媒介されたシグナルは、ＴＧＦβの結合により細胞外ドメインから融合タンパク質の細胞内ドメインへ伝達される。
いくつかの実施形態において、操作された細胞（例えば免疫細胞、例えばＴ細胞、例えばＣＤ８ Ｔ細胞）は、ａ）ｉ）ＴＧＦβＲ１の細胞外ドメインを含む第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）ＴＧＦβＲ１の膜貫通ドメインを含む第１の膜貫通ドメイン、ｉｉｉ）ＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインを含む第１の細胞内ドメイン、を含む、第１のポリペプチドと；ｂ）ｉ）ＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインを含む第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）ＴＧＦβＲ２の膜貫通ドメインを含む第２の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）ＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメインを含む第２の細胞内ドメイン、を含む、第２のポリペプチドとを含む融合タンパク質を含む（または発現する）。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、同種異系細胞（例えば同種異系Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、自己由来細胞（例えば自己由来Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、γδＴ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、免疫細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、末梢性血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、造血幹細胞、多能性幹細胞、胚性幹細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、γδＴ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、αβＴ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、内在性ＴＣＲ欠損Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞である。
いくつかの実施形態において、操作された細胞（例えば免疫細胞、例えばＴ細胞、例えばＣＤ８ Ｔ細胞）は、ａ）ｉ）ＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインを含む第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）ＴＧＦβＲ２の膜貫通ドメインを含む第１の膜貫通ドメイン、ｉｉｉ）ＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインを含む第１の細胞内ドメイン、を含む、第１のポリペプチドと；ｂ）ｉ）ＴＧＦβＲ１の細胞外ドメインを含む第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）ＴＧＦβＲ１の膜貫通ドメインを含む第２の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）ＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメインを含む第２の細胞内ドメイン、を含む、第２のポリペプチドとを含む融合タンパク質を含む（または発現する）。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、同種異系細胞（例えば同種異系Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、自己由来細胞（例えば自己由来Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、γδＴ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、免疫細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、末梢性血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、造血幹細胞、多能性幹細胞、胚性幹細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、γδＴ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、αβＴ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、内在性ＴＣＲ欠損Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞である。
いくつかの実施形態において、操作された細胞（例えば免疫細胞、例えばＴ細胞、例えばＣＤ８ Ｔ細胞）は、ａ）ｉ）ＴＧＦβＲ１の細胞外ドメインを含む第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）ＩＬ－２３Ｒの膜貫通ドメインを含む第１の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）ＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインを含む第１の細胞内ドメイン、を含む、第１のポリペプチドと；ｂ）ｉ）ＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインを含む第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）ＩＬ－１２Ｒβ１の膜貫通ドメインを含む第２の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）ＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメインを含む第２の細胞内ドメイン、を含む、第２のポリペプチドとを含む融合タンパク質を含む（または発現する）。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、同種異系細胞（例えば同種異系Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、自己由来細胞（例えば自己由来Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、γδＴ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、免疫細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、末梢性血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、造血幹細胞、多能性幹細胞、胚性幹細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、γδＴ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、αβＴ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、内在性ＴＣＲ欠損Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３受容体複合体細胞内ドメインを介して媒介されたシグナルは、ＴＧＦβの結合により細胞外ドメインから融合タンパク質の細胞内ドメインへ伝達される。
いくつかの実施形態において、操作された細胞（例えば免疫細胞、例えばＴ細胞、例えばＣＤ８ Ｔ細胞）は、ａ）ｉ）ＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインを含む第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）ＩＬ－２３Ｒの膜貫通ドメインを含む第１の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）ＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインを含む第１の細胞内ドメイン、を含む、第１のポリペプチドと；ｂ）ｉ）ＴＧＦβＲ１の細胞外ドメインを含む第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）ＩＬ－１２Ｒβ１の膜貫通ドメインを含む第２の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）ＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメインを含む第２の細胞内ドメイン、を含む、第２のポリペプチドとを含む融合タンパク質を含む（または発現する）。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、同種異系細胞（例えば同種異系Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、自己由来細胞（例えば自己由来Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、γδＴ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、免疫細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、末梢性血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、造血幹細胞、多能性幹細胞、胚性幹細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、γδＴ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、αβＴ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、内在性ＴＣＲ欠損Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３受容体複合体細胞内ドメインを介して媒介されたシグナルは、ＴＧＦβの結合により細胞外ドメインから融合タンパク質の細胞内ドメインへ伝達される。
いくつかの実施形態において、操作された細胞（例えば免疫細胞、例えばＴ細胞、例えばＣＤ８ Ｔ細胞）は、ａ）ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む第１の膜貫通ドメイン、ｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む第１の細胞内ドメイン、を含む、第１のポリペプチドと；ｂ）ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含む第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含む第２の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）配列番号１６を含む第２の細胞内ドメイン、を含む、第２のポリペプチドとを含む融合タンパク質を含む（または発現する）。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドは、第１の膜貫通ドメインと第１の細胞内ドメインとの間にリンカー（例えば膜近傍配列）をさらに含み、任意選択で、リンカーは、配列番号９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドは、第２の膜貫通ドメインと第２の細胞内ドメインとの間にリンカー（例えば膜近傍配列）をさらに含み、リンカーは、任意選択で、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、同種異系細胞（例えば同種異系Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、自己由来細胞（例えば自己由来Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、γδＴ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、免疫細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、末梢性血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、造血幹細胞、多能性幹細胞、胚性幹細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、γδＴ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、αβＴ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、内在性ＴＣＲ欠損Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３受容体複合体細胞内ドメインを介して媒介されたシグナルは、ＴＧＦβの結合により細胞外ドメインから融合タンパク質の細胞内ドメインへ伝達される。
いくつかの実施形態において、操作された細胞（例えば免疫細胞、例えばＴ細胞、例えばＣＤ８ Ｔ細胞）は、ａ）ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含む第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含む第１の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む第１の細胞内ドメイン、を含む、第１のポリペプチドと；ｂ）ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む第２の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む第２の細胞内ドメイン、を含む、第２のポリペプチドとを含む融合タンパク質を含む（または発現する）。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドは、第１の膜貫通ドメインと第１の細胞内ドメインとの間にリンカー（例えば膜近傍配列）をさらに含み、任意選択で、リンカーは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドは、第２の膜貫通ドメインと第２の細胞内ドメインとの間にリンカー（例えば膜近傍配列）をさらに含み、リンカーは、任意選択で、配列番号９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、同種異系細胞（例えば同種異系Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、自己由来細胞（例えば自己由来Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、γδＴ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、免疫細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、末梢性血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、造血幹細胞、多能性幹細胞、胚性幹細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、γδＴ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、αβＴ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、内在性ＴＣＲ欠損Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３受容体複合体細胞内ドメインを介して媒介されたシグナルは、ＴＧＦβの結合により細胞外ドメインから融合タンパク質の細胞内ドメインへ伝達される。
いくつかの実施形態において、操作された細胞（例えば免疫細胞、例えばＴ細胞、例えばＣＤ８ Ｔ細胞）は、ａ）ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含む第１の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む第１の細胞内ドメイン、を含む、第１のポリペプチドと；ｂ）ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含む第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含む第２の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む第２の細胞内ドメイン、を含む、第２のポリペプチドとを含む融合タンパク質を含む（または発現する）。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドは、第１の細胞外ドメインと第１の膜貫通ドメインとの間にリンカー（例えば膜近傍配列）をさらに含む、任意選択で、リンカーは、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドは、第２の細胞外ドメインと第２の膜貫通ドメインとの間にリンカー（例えば膜近傍配列）をさらに含み、任意選択で、リンカーは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、同種異系細胞（例えば同種異系Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、自己由来細胞（例えば自己由来Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、γδＴ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、免疫細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、末梢性血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、造血幹細胞、多能性幹細胞、胚性幹細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、γδＴ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、αβＴ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、内在性ＴＣＲ欠損Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３受容体複合体細胞内ドメインを介して媒介されたシグナルは、ＴＧＦβの結合により細胞外ドメインから融合タンパク質の細胞内ドメインへ伝達される。
いくつかの実施形態において、操作された細胞（例えば免疫細胞、例えばＴ細胞、例えばＣＤ８ Ｔ細胞）は、ａ）ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含む第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含む第１の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む第１の細胞内ドメイン、を含む、第１のポリペプチドと；ｂ）ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含む第２の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む第２の細胞内ドメイン、を含む、第２のポリペプチドとを含む融合タンパク質を含む（または発現する）。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチドは、第１の細胞外ドメインと第１の膜貫通ドメインとの間にリンカー（例えば膜近傍配列）をさらに含む、任意選択で、リンカーは、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のポリペプチドは、第２の細胞外ドメインと第２の膜貫通ドメインとの間にリンカー（例えば膜近傍配列）をさらに含み、任意選択で、リンカーは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、同種異系細胞（例えば同種異系Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、自己由来細胞（例えば自己由来Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、γδＴ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、免疫細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、末梢性血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、造血幹細胞、多能性幹細胞、胚性幹細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、γδＴ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、αβＴ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、内在性ＴＣＲ欠損Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３受容体複合体細胞内ドメインを介して媒介されたシグナルは、ＴＧＦβの結合により細胞外ドメインから融合タンパク質の細胞内ドメインへ伝達される。
いくつかの実施形態において、操作された細胞（例えば免疫細胞、例えばＴ細胞、例えばＣＤ８ Ｔ細胞）は、ａ）Ｎ末端からＣ末端の方向へ、ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含む第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む第１のリンカー、ｉｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含む第１の膜貫通ドメイン、及びｉｖ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む第１の細胞内ドメイン、を含む、第１のポリペプチドと；ｂ）Ｎ末端からＣ末端の方向へ、ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含む第２のリンカー、ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含む第２の膜貫通ドメイン、及びｉｖ）配列番号１６を含む第２の細胞内ドメイン、を含む、第２のポリペプチドとを含む融合タンパク質を含む（または発現する）。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、同種異系細胞（例えば同種異系Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、自己由来細胞（例えば自己由来Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、γδＴ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、免疫細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、末梢性血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、造血幹細胞、多能性幹細胞、胚性幹細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、γδＴ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、αβＴ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、内在性ＴＣＲ欠損Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３受容体複合体細胞内ドメインを介して媒介されたシグナルは、ＴＧＦβの結合により細胞外ドメインから融合タンパク質の細胞内ドメインへ伝達される。
いくつかの実施形態において、操作された細胞（例えば免疫細胞、例えばＴ細胞、例えばＣＤ８ Ｔ細胞）は、１）ａ）ｉ）ＴＧＦβＲ１またはＴＧＦβＲ２のうちの一方の細胞外ドメインを含む第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）第１の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）ＩＬ－１２Ｒβ１またはＩＬ－２３Ｒのうちの一方の細胞内ドメインを含む第１の細胞内ドメイン、を含む、第１のポリペプチドと；ｂ）ｉ）ＴＧＦβＲ１またはＴＧＦβＲ２のうちの他方の細胞外ドメインを含む第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）第２の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）ＩＬ－１２Ｒβ１またはＩＬ－２３Ｒのうちの他方の細胞内ドメインを含む第２の細胞内ドメイン、を含む、第２のポリペプチドとを含む、融合タンパク質；ならびに２）細胞外リガンド結合ドメイン及び任意選択で細胞内シグナリングドメインを含む、機能的外来性受容体を含む（または発現する）。いくつかの実施形態において、機能的外来性受容体は、操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞抗原カプラー（ＴＡＣ）、またはそれらの一部からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、同種異系細胞（例えば同種異系Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、自己由来細胞（例えば自己由来Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、γδＴ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、免疫細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、末梢性血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、造血幹細胞、多能性幹細胞、胚性幹細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、γδＴ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、αβＴ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、内在性ＴＣＲ欠損Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３受容体複合体細胞内ドメインを介して媒介されたシグナルは、ＴＧＦβの結合により細胞外ドメインから融合タンパク質の細胞内ドメインへ伝達される。
いくつかの実施形態において、操作された細胞（例えば免疫細胞、例えばＴ細胞、例えばＣＤ８ Ｔ細胞）は、１）ａ）ｉ）ＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインを含む第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）ＩＬ－２３Ｒの膜貫通ドメインを含む第１の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）ＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインを含む第１の細胞内ドメイン、を含む、第１のポリペプチドと；ｂ）ｉ）ＴＧＦβＲ１の細胞外ドメインを含む第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）ＩＬ－１２Ｒβ１の膜貫通ドメインを含む第２の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）ＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメインを含む第２の細胞内ドメイン、を含む、第２のポリペプチドとを含む、融合タンパク質；２）キメラ抗原受容体（例えば腫瘍抗原を認識するキメラ抗原受容体、例えば抗ＧＰＣ３ ＣＡＲ、例えば抗ＣＤ２０ ＣＡＲ）を含む、機能的外来性受容体を含む（または発現する）。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、同種異系細胞（例えば同種異系Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、自己由来細胞（例えば自己由来Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、γδＴ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、免疫細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、末梢性血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、造血幹細胞、多能性幹細胞、胚性幹細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、γδＴ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、αβＴ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、内在性ＴＣＲ欠損Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３受容体複合体細胞内ドメインを介して媒介されたシグナルは、ＴＧＦβの結合により細胞外ドメインから融合タンパク質の細胞内ドメインへ伝達される。
いくつかの実施形態において、操作された細胞（例えば免疫細胞、例えばＴ細胞、例えばＣＤ８ Ｔ細胞）は、１）ａ）ｉ）ＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインを含む第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）ＩＬ－２３Ｒの膜貫通ドメインを含む第１の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）ＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインを含む第１の細胞内ドメイン、を含む、第１のポリペプチドと；ｂ）ｉ）ＴＧＦβＲ１の細胞外ドメインを含む第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）ＩＬ－１２Ｒβ１の膜貫通ドメインを含む第２の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）ＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメインを含む第２の細胞内ドメイン、を含む、第２のポリペプチドとを含む、融合タンパク質；２）操作されたＴＣＲ（例えば腫瘍抗原を認識する操作されたＴＣＲ）を含む、機能的外来性受容体を含む（または発現する）。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、同種異系細胞（例えば同種異系Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、自己由来細胞（例えば自己由来Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、γδＴ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、免疫細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、末梢性血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、造血幹細胞、多能性幹細胞、胚性幹細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、γδＴ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、αβＴ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、内在性ＴＣＲ欠損Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３受容体複合体細胞内ドメインを介して媒介されたシグナルは、ＴＧＦβの結合により細胞外ドメインから融合タンパク質の細胞内ドメインへ伝達される。
いくつかの実施形態において、操作された細胞（例えば免疫細胞、例えばＴ細胞、例えばＣＤ８ Ｔ細胞）は、１）ａ）ｉ）ＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインを含む第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）ＩＬ－２３Ｒの膜貫通ドメインを含む第１の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）ＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインを含む第１の細胞内ドメイン、を含む、第１のポリペプチドと；ｂ）ｉ）ＴＧＦβＲ１の細胞外ドメインを含む第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）ＩＬ－１２Ｒβ１の膜貫通ドメインを含む第２の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）ＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメインを含む第２の細胞内ドメイン、を含む、第２のポリペプチドとを含む、融合タンパク質；２）Ｔ細胞抗原カプラー（ＴＡＣ）を含む、機能的外来性受容体を含む（または発現する）。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、同種異系細胞（例えば同種異系Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、自己由来細胞（例えば自己由来Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、γδＴ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、免疫細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、末梢性血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、造血幹細胞、多能性幹細胞、胚性幹細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、γδＴ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、αβＴ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、内在性ＴＣＲ欠損Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３受容体複合体細胞内ドメインを介して媒介されたシグナルは、ＴＧＦβの結合により細胞外ドメインから融合タンパク質の細胞内ドメインへ伝達される。
いくつかの実施形態において、操作された細胞（例えば免疫細胞、例えばＴ細胞、例えばＣＤ８ Ｔ細胞）は、１）ａ）Ｎ末端からＣ末端の方向へ、ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含む第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む第１のリンカー、ｉｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含む第１の膜貫通ドメイン、及びｉｖ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む第１の細胞内ドメイン、を含む、第１のポリペプチドと；ｂ）Ｎ末端からＣ末端の方向へ、ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含む第２のリンカー、ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含む第２の膜貫通ドメイン、及びｉｖ）配列番号１６を含む第２の細胞内ドメイン、を含む、第２のポリペプチドとを含む、融合タンパク質；ならびに２）キメラ抗原受容体（例えば腫瘍抗原を認識するキメラ抗原受容体、例えば抗ＧＰＣ３ ＣＡＲ、例えば抗ＣＤ２０ ＣＡＲ）を含む、機能的外来性受容体を含む（または発現する）。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、同種異系細胞（例えば同種異系Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、自己由来細胞（例えば自己由来Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、γδＴ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、免疫細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、末梢性血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、造血幹細胞、多能性幹細胞、胚性幹細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、γδＴ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、αβＴ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、内在性ＴＣＲ欠損Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３受容体複合体細胞内ドメインを介して媒介されたシグナルは、ＴＧＦβの結合により細胞外ドメインから融合タンパク質の細胞内ドメインへ伝達される。
いくつかの実施形態において、操作された細胞（例えば免疫細胞、例えばＴ細胞、例えばＣＤ８ Ｔ細胞）は、１）ａ）Ｎ末端からＣ末端の方向へ、ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含む第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む第１のリンカー、ｉｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含む第１の膜貫通ドメイン、及びｉｖ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む第１の細胞内ドメイン、を含む、第１のポリペプチドと；ｂ）Ｎ末端からＣ末端の方向へ、ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含む第２のリンカー、ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含む第２の膜貫通ドメイン、及びｉｖ）配列番号１６を含む第２の細胞内ドメイン、を含む、第２のポリペプチドとを含む、融合タンパク質；ならびに２）操作されたＴＣＲ（例えば腫瘍抗原を認識する操作されたＴＣＲ）を含む、機能的外来性受容体を含む（または発現する）。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、同種異系細胞（例えば同種異系Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、自己由来細胞（例えば自己由来Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、γδＴ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、免疫細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、末梢性血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、造血幹細胞、多能性幹細胞、胚性幹細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、γδＴ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、αβＴ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、内在性ＴＣＲ欠損Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３受容体複合体細胞内ドメインを介して媒介されたシグナルは、ＴＧＦβの結合により細胞外ドメインから融合タンパク質の細胞内ドメインへ伝達される。
いくつかの実施形態において、操作された細胞（例えば免疫細胞、例えばＴ細胞、例えばＣＤ８ Ｔ細胞）は、１）ａ）Ｎ末端からＣ末端の方向へ、ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含む第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む第１のリンカー、ｉｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含む第１の膜貫通ドメイン、及びｉｖ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む第１の細胞内ドメイン、を含む、第１のポリペプチドと；ｂ）Ｎ末端からＣ末端の方向へ、ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含む第２のリンカー、ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含む第２の膜貫通ドメイン、及びｉｖ）配列番号１６を含む第２の細胞内ドメイン、を含む、第２のポリペプチドとを含む、融合タンパク質；ならびに２）Ｔ細胞抗原カプラー（ＴＡＣ）を含む、機能的外来性受容体を含む（または発現する）。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、同種異系細胞（例えば同種異系Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、自己由来細胞（例えば自己由来Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、γδＴ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、免疫細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、末梢性血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、造血幹細胞、多能性幹細胞、胚性幹細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、γδＴ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、αβＴ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、内在性ＴＣＲ欠損Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３受容体複合体細胞内ドメインを介して媒介されたシグナルは、ＴＧＦβの結合により細胞外ドメインから融合タンパク質の細胞内ドメインへ伝達される。
いくつかの実施形態において、操作された細胞（例えば免疫細胞、例えばＴ細胞、例えばＣＤ８ Ｔ細胞）は、配列番号２８～３３（例えば配列番号３１～３３、例えば配列番号３３）のうちの任意のものにおいても示された核酸配列を含む核酸（または核酸を含むベクター）を含む。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、機能的外来性受容体（例えばＣＡＲ、例えば操作されたＴＣＲ）またはそれをコードする核酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、配列番号２８～３３のうちの任意のものにおいて示される核酸配列を含む核酸は、機能的外来性受容体（例えばＣＡＲ、例えば操作されたＴＣＲ）をコードする核酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、同種異系細胞（例えば同種異系Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、自己由来細胞（例えば自己由来Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、γδＴ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、免疫細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、末梢性血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、造血幹細胞、多能性幹細胞、胚性幹細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、γδＴ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、αβＴ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、内在性ＴＣＲ欠損Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３受容体複合体細胞内ドメインを介して媒介されたシグナルは、ＴＧＦβの結合により細胞外ドメインから融合タンパク質の細胞内ドメインへ伝達される。
いくつかの実施形態において、操作された細胞（例えば免疫細胞、例えばＴ細胞、例えばＣＤ８ Ｔ細胞）は、１）配列番号３３において示される核酸配列と２）腫瘍抗原を認識するＣＡＲをコードする核酸配列（例えば抗ＧＰＣ３ ＣＡＲ、例えば抗ＣＤ２０ ＣＡＲ、例えば配列番号３６または８９のアミノ酸配列を含むＣＡＲ）とを含む核酸を含む。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、同種異系細胞（例えば同種異系Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、自己由来細胞（例えば自己由来Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、γδＴ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、免疫細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、末梢性血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、造血幹細胞、多能性幹細胞、胚性幹細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、γδＴ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、αβＴ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、内在性ＴＣＲ欠損Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２３受容体複合体細胞内ドメインを介して媒介されたシグナルは、ＴＧＦβの結合により細胞外ドメインから融合タンパク質の細胞内ドメインへ伝達される。
Ｖ．操作された細胞を産生する方法
本発明の一態様は、上で記載される操作されたＴ細胞のうちの任意のものを産生する方法を提供する。方法は、概して、本明細書において記載される融合タンパク質のうちの任意のものをコードする核酸配列を含む核酸を、細胞（例えばＴ細胞「前駆細胞」として本明細書において参照される）の中へ導入することを含む。いくつかの実施形態において、核酸は、機能的外来性受容体（操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ、または本明細書において記載されたＡＣＴＲ等）をコードする第２の核酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、機能的外来性受容体（操作されたＴＣＲ、ＣＡＲまたは本明細書において記載されたＡＣＴＲ等）をコードする核酸配列を含む第２の核酸を、前駆細胞の中へ導入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前駆細胞は、免疫細胞である。いくつかの実施形態において、前駆細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、末梢性血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、造血幹細胞、多能性幹細胞、胚性幹細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施形態において、前駆細胞（例えば前駆Ｔ細胞）は、血液、骨髄、リンパ液、またはリンパ器官に由来し、免疫系の細胞（先天性免疫または適応免疫の細胞等）である。いくつかの態様において、細胞は、ヒト細胞である。
いくつかの実施形態において、前駆体（例えば前駆Ｔ細胞）は、細胞株（例えばＴ細胞株）に由来する。細胞は、いくつかの実施形態において、異種供給源から（例えばマウス、ラット、非ヒト霊長動物、及びブタから）得られる。
いくつかの実施形態において、前駆Ｔ細胞は、ＣＤ４＋／ＣＤ８－、ＣＤ４－／ＣＤ８＋、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋、ＣＤ４－／ＣＤ８－、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞である。いくつかの実施形態において、前駆Ｔ細胞は、本明細書において記載される機能的外来性受容体のうちの任意のもの（例えば操作されたＴＣＲまたはＣＡＲ）等で操作されたＴ細胞である。いくつかの実施形態において、前駆Ｔ細胞は、本明細書において記載される機能的外来性受容体（例えば操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ）の発現、及び標的細胞（腫瘍抗原（例えばＧＰＣ３）を発現する腫瘍細胞等）への結合により、ＩＬ－２、ＴＦＮ、及び／またはＴＮＦを産生する。いくつかの実施形態において、ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、本明細書において記載される機能的外来性受容体（例えば操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ）の発現、及び標的細胞への結合により、抗原特異的標的細胞を溶解する。
いくつかの実施形態において、前駆細胞（例えば前駆Ｔ細胞）は、幹細胞（造血幹細胞、多能性幹細胞、ｉＰＳ、または胚性幹細胞等）から分化される。
いくつかの実施形態において、融合タンパク質及び／または機能的外来性受容体（例えば操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ）は、本明細書において記載される核酸のうちの任意の１つまたはベクター（例えば非ウイルスベクター及びレンチウイルスベクター等のウイルスベクター）のうちの任意の１つのトランスフェクションによって、前駆細胞（例えば前駆Ｔ細胞）へ導入される。いくつかの実施形態において、機能的外来性受容体（例えば操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ）は、マイクロ流体系（ＣＥＬＬ ＳＱＵＥＥＺＥ（登録商標）等）を介して細胞を通過させる間に細胞膜の中へタンパク質を挿入することによって、前駆細胞（例えば前駆Ｔ細胞）へ導入される（例えば米国特許出願公開第２０１４０２８７５０９号を参照）。
ベクター（例えばウイルスベクター）または単離された核酸を哺乳動物細胞の中へ導入する方法は、当技術分野において公知である。本明細書において記載されるベクターは、物理学的方法、化学的方法、または生物学的方法によって細胞（例えばＴ細胞）の中へ移行され得る。
細胞（例えばＴ細胞）の中へベクター（例えばウイルスベクター）を導入するための物理的方法としては、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝撃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、及び同種のものが挙げられる。ベクター及び／または外来性核酸を含む細胞を産生する方法は、当技術分野において周知である。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。いくつかの実施形態において、ベクター（例えばウイルスベクター）は、エレクトロポレーションによって細胞の中へ導入される。
細胞（例えばＴ細胞）の中へベクターを導入するための生物学的方法としては、ＤＮＡベクター及びＲＮＡベクターの使用が挙げられる。ウイルスベクターは、遺伝子を哺乳類（例えばヒト細胞）の中へ挿入する最も広く使用される方法となっている。
ベクター（例えばウイルスベクター）を細胞（例えばＴ細胞）の中へ導入するための化学的手段としては、コロイド分散系（マクロ分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを包含する脂質ベースの系等）が挙げられる。インビトロの送達ビヒクルとして使用される例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば人工膜小胞）である。
いくつかの実施形態において、本明細書において記載される融合タンパク質及び／または機能的外来性受容体（例えば操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ）のうちの任意のものをコードするＲＮＡ分子は、従来の方法（例えばインビトロ転写）によって調製され、次いで公知の方法（ｍＲＮＡエレクトロポレーション等）を介して細胞（例えばＴ細胞）の中へ導入され得る。例えばＲａｂｉｎｏｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １７：１０２７－１０３５を参照されたい。
いくつかの実施形態において、形質導入またはトランスフェクションされた細胞は、ベクターまたは単離された核酸の導入後にエクスビボで増殖される。いくつかの実施形態において、形質導入またはトランスフェクションされた細胞は培養されて、少なくとも約１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、１０日間、１２日間、または１４日間のうちの任意の間で増殖される。いくつかの実施形態において、形質導入またはトランスフェクションされた細胞は、さらに評価またはスクリーニングされて、操作された哺乳動物細胞が選択される。
レポーター遺伝子は、可能性のあるトランスフェクションされた細胞を同定するため、及び調節配列の機能性を評価するために使用され得る。概して、レポーター遺伝子は、レシピエント生物体もしくは組織において存在しないか、またはそれらによって発現されず、その発現がいくつかの容易に検出可能な特性（例えば酵素活性）によって明示されるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞の中へ導入された後に、好適な時点でアッセイされる。好適なレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌性アルカリホスファターゼ、または緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子が挙げられ得る（例えばＵｉ－Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４７９：７９－８２（２０００））。好適な発現系は周知であり、公知の技法を使用して調製され得るか、または商業的に得られ得る。
操作された細胞（例えば操作されたＴ細胞）における本明細書において記載される融合タンパク質及び／または機能的外来性受容体（例えば操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ）のうちの任意のものをコードする核酸の存在を確認するための他の方法としては、例えば当業者に周知の分子生物学的アッセイ（サザンブロッティング及びノーザンブロッティング、ＲＴ－ＰＣＲ及びＰＣＲ等）；生化学的アッセイ（例えば免疫学的方法（ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロット等）、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、または磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）によって特定のペプチドの存在または非存在を検出すること等）が挙げられる（実施例セクションも参照）。
したがっていくつかの実施形態において、本明細書において記載される融合タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸を、前駆細胞の中へ導入することを含む、操作された細胞（例えば操作されたＴ細胞、同種異系Ｔ細胞、または内在性ＴＣＲ欠損Ｔ細胞）を産生する方法が提供される。いくつかの実施形態において、核酸は、細胞外リガンド結合ドメイン及び細胞内シグナリングドメインを含む機能的外来性受容体（例えば操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ）のうちの任意のものをコードする第２の核酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、前駆細胞は、細胞外リガンド結合ドメイン及び細胞内シグナリングドメインを含む機能的外来性受容体（例えば操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ）をコードする第２の核酸を含む。いくつかの実施形態において、方法は、細胞外リガンド結合ドメイン及び細胞内シグナリングドメインを含む機能的外来性受容体をコードする第２の核酸を前駆Ｔ細胞の中へ導入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、第１の核酸及び第２の核酸は、Ｔ細胞の中へ逐次的に導入される。したがっていくつかの実施形態において、ａ）融合タンパク質（本明細書において記載される融合タンパク質のうちの任意のもの等）とｂ）機能的外来性受容体（本明細書において記載される機能的外来性受容体のうちの任意のもの等）とをコードする核酸を前駆細胞の中へ導入することを含む、操作された細胞（例えばＴ細胞、同種異系Ｔ細胞、または内在性ＴＣＲ欠損Ｔ細胞）を産生する方法が提供される。いくつかの実施形態において、融合タンパク質をコードする第１の核酸を前駆細胞の中へ導入し、次いで細胞外リガンド結合ドメイン及び細胞内シグナリングドメインを含む機能的外来性受容体をコードする第２の核酸を前駆細胞の中へ導入することを含む、操作された細胞（例えばＴ細胞、同種異系Ｔ細胞、または内在性ＴＣＲ欠損Ｔ細胞）を産生する方法が提供される。いくつかの実施形態において、第１の核酸及び第２の核酸は、Ｔ細胞の中へ同時に導入される。いくつかの実施形態において、第１の核酸及び第２の核酸は、分離したベクター上にある。いくつかの実施形態において、第１の核酸及び第２の核酸は、同じベクター上にある。いくつかの実施形態において、第１の核酸及び第２の核酸は、異なるプロモーターへ作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、第１の核酸は第２の核酸の上流である。いくつかの実施形態において、第１の核酸は第２の核酸の下流である。
いくつかの実施形態において、上流から下流へプロモーター（例えばＥＦ１－α）、機能的外来性受容体（例えば操作されたＴＣＲまたはＣＡＲ）をコードする第１の核酸、及び本明細書において記載される融合タンパク質をコードする第２の核酸である、ベクター（例えばレンチウイルスベクター等ウイルスベクター）を前駆細胞の中へ導入することを含む、操作された細胞（例えば操作されたＴ細胞、操作された同種異系Ｔ細胞、または操作された内在性ＴＣＲ欠損Ｔ細胞）を産生する方法が提供される。いくつかの実施形態において、第１の核酸及び第２の核酸は、マルチシストロン性エレメント（例えばＴ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａからなる群から選択される２Ａの自己切断ペプチド）をコードする第３の核酸によって分離されている。
いくつかの実施形態において、上流から下流へプロモーター（例えばＥＦ１－α）、融合タンパク質（本明細書において記載される融合タンパク質のうちの任意のもの等）をコードする第１の核酸、及び機能的外来性受容体（例えば操作されたＴＣＲまたはＣＡＲ）をコードする第２の核酸である、ベクター（例えばレンチウイルスベクター等ウイルスベクター）を前駆細胞の中へ導入することを含む、操作された細胞（例えば操作されたＴ細胞、操作された同種異系Ｔ細胞、または操作された内在性ＴＣＲ欠損Ｔ細胞）を産生する方法が提供される。いくつかの実施形態において、第１の核酸及び第２の核酸は、マルチシストロン性エレメント（例えばＴ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａからなる群から選択される２Ａの自己切断ペプチド）をコードする第３の核酸によって分離されている。
いくつかの実施形態において、操作された細胞はＴ細胞であり、Ｔ細胞中の内在性ＴＣＲ遺伝子座はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系によって修飾され、それによって内在性ＴＣＲ欠損Ｔ細胞を生成する。例えばＷＯ２０２０／０２０３５９を参照されたい。
いくつかの実施形態において、本明細書において記載される方法は、αβＴ細胞を除去することまたはγδＴ細胞を富化することをさらに含む。
いくつかの実施形態において、プロモーターは、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、サイトメガロウイルス最初期遺伝子プロモーター（ＣＭＶ ＩＥ）、延長因子１αプロモーター（ＥＦ１－α）、ホスホグリセレートキナーゼ－１（ＰＧＫ）プロモーター、ユビキチンＣ（ＵＢＱ－Ｃ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ－アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、ポリオーマエンハンサー／単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ＭＣ１）プロモーター、βアクチン（β－ＡＣＴ）プロモーター、「骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）」プロモーター、ＮＦＡＴプロモーター、ＴＥＴＯＮ（登録商標）プロモーター、及びＮＦκＢプロモーターからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ＥＦ１－αである。
いくつかの実施形態において、マルチシストロン性エレメントは、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａ、ＢｍＣＰＶ ２Ａ、ＢｍＩＦＶ ２Ａ、ＩＲＥＳ、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、またはそれらの組み合わせを含み、配列中、ｎは少なくとも１つの整数である。
いくつかの実施形態において、ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアベクター、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、及びその派生物からなる群から選択された。いくつかの実施形態において、ベクターは、非ウイルスベクター（エピソーム発現ベクター、増強エピソームベクター（ＥＥＶ）、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゼースベクター、またはＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）トランスポゾン系等）である。いくつかの実施形態において、機能的外来性受容体は、操作されたＴＣＲである。いくつかの実施形態において、機能的外来性受容体は、ＣＡＲ（例えば抗抗原ＣＡＲ、リガンド／受容体ＣＡＲ、ＡＣＴＲ）等の非ＴＣＲ受容体である。
いくつかの実施形態において、方法は、融合タンパク質を発現する操作された細胞を少なくとも１つの薬学的に許容される担体と共に製剤化することをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、有効量の融合タンパク質を発現する操作された細胞、または有効量の融合タンパク質を発現する操作された細胞（例えばＴ細胞）及び少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む医薬製剤を、個体へ投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、個体はがんを有する。いくつかの実施形態において、個体はヒトである。
細胞の供給源、細胞調製、及び培養
細胞（例えばＴ細胞）の増殖及び遺伝子修飾の前に、細胞の供給源は個体から得られる。例えば、免疫細胞（例えばＴ細胞）は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染の部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍を包含する多数の供給源から得られ得る。いくつかの実施形態において、当技術分野において利用可能な所望される細胞（例えばＴ細胞）を有する任意の数の細胞株が使用され得る。いくつかの実施形態において、細胞（例えばＴ細胞）は、任意の数の当業者に公知の技法（ＦＩＣＯＬＬ（商標）分離等）を使用して、対象から収集された血液の単位から得られ得る。いくつかの実施形態において、個体の循環血液からの細胞は、アフェレーシスによって得られる。アフェレーシス産物は、典型的には、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、及び血小板を包含するリンパ球を含有する。いくつかの実施形態において、アフェレーシスによって収集された細胞を洗浄して、血漿画分を除去し、細胞を後続するプロセシングステップのために適切なバッファーまたは培地中に置くことができる。いくつかの実施形態において、細胞は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）により洗浄される。いくつかの実施形態において、洗浄溶液はカルシウムを欠如し且つマグネシウムを欠如し得るか、または二価陽イオンすべてではないが多くを欠如し得る。さらに意外にも、カルシウムの非存在下における初期活性化ステップは、活性化の増大を導く。当業者が容易に認識するように、洗浄ステップは、当業者に公知の方法によって（半自動化「フロースルー」遠心分離機（例えばＣｏｂｅ ２９９１ ｃｅｌｌ ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ、Ｂａｘｔｅｒ ＣｙｔｏＭａｔｅ、またはＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｌｌ Ｓａｖｅｒ ５）を製造者の指示に従って使用することによって等）、達成され得る。洗浄後に、細胞は、様々な生体適合性のあるバッファー（例えばＣａ２＋不含有Ｍｇ２＋不含有ＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ、またはバッファー有りもしくは無しの他の食塩溶液等）中で再懸濁され得る。代替的に、アフェレーシスサンプルの所望されない構成要素は除去され、細胞は培養培地中で直接的再懸濁され得る。
いくつかの実施形態において、細胞（Ｔ細胞）は、臍帯血バンク、末梢血バンクから提供されるか、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、複能性及び多能性幹細胞、もしくはヒト胚性幹細胞に由来する。いくつかの実施形態において、細胞（例えばＴ細胞）は、細胞株に由来する。細胞（例えばＴ細胞）は、いくつかの実施形態において、異種供給源から（例えばマウス、ラット、非ヒト霊長動物、及びブタから）得られる。いくつかの実施形態において、細胞（例えばＴ細胞）は、ヒト細胞である。いくつかの態様において、細胞（例えばＴ細胞）は、初代細胞（対象から直接的に単離されたもの及び／または対象から単離及び凍結されたもの等）である。いくつかの実施形態において、細胞は、１つまたは複数のＴ細胞のサブセット、例えば全Ｔ細胞集団、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、及びそのサブ集団（機能、活性化状態、成熟、そして分化、増殖、再循環、局在化、及び／または存続能力についての可能性、抗原特異性、抗原受容体の型、特定の器官または区画における存在、マーカーまたはサイトカイン分泌のプロファイル、及び／または分化の程度によって定義されるもの等）を包含する。治療される対象に関して、細胞は、同種異系及び／または自己由来であり得る。いくつかの事例において、細胞（例えばＴ細胞）は、１つまたは複数の意図されたレシピエントに関して同種異系である。
Ｔ細胞及び／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞及び／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞のサブタイプ及びサブ集団の中には、ナイーブＴ（ＴＮ）細胞、エフェクターＴ細胞（ＴＥＦＦ）、メモリーＴ細胞及びそのサブタイプ、（幹細胞メモリーＴ（ＴＳＣＭ）細胞、セントラルメモリーＴ（ＴＣＭ）細胞、エフェクターメモリーＴ（ＴＥＭ）細胞、または最終分化エフェクターメモリーＴ細胞等）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、未成熟Ｔ細胞、成熟Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞、天然に存在する適応性調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、ヘルパーＴ細胞（ＴＨ１細胞、ＴＨ２細胞、ＴＨ３細胞、ＴＨ１７細胞、ＴＨ９細胞、ＴＨ２２細胞、濾胞ヘルパーＴ細胞、α／βＴ細胞、及びδ／γＴ細胞等）がある。
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、赤血球を溶解し、例えばＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配を介する遠心分離によって、または向流遠心エルトリエーションによって単球を枯渇させることによって、末梢血リンパ球から単離される。Ｔ細胞の特異的サブ集団（ＣＤ３＋ Ｔ細胞、ＣＤ２８＋ Ｔ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、ＣＤ４５ＲＡ＋ Ｔ細胞、及びＣＤ４５ＲＯ＋ Ｔ細胞等）は、ポジティブ選択技法またはネガティブ選択技法によって、さらに単離され得る。例えばいくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、所望されるＴ細胞のポジティブ選択のために十分な期間での、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（すなわち３×２８）コンジュゲートビーズ（ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ等）とのインキュベーションによって単離される。いくつかの実施形態において、期間は、約３０分間である。さらなる実施形態において、期間は、３０分間～３６時間またはそれ以上の範囲、及びそれらの間のすべての整数値である。さらなる実施形態において、期間は、少なくとも１、２、３、４、５、または６時間である。いくつかの実施形態において、期間は、１０～２４時間である。いくつかの実施形態において、インキュベーション期間は、２４時間である。他の細胞型に比較してＴ細胞がほとんどない任意の状況においてＴ細胞を単離するために（腫瘍組織からまたは免疫不全個体から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を単離するような）、より長いインキュベーション時間が使用され得る。さらに、より長いインキュベーション時間の使用は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の捕捉の効率を増加させ得る。したがって、抗ＣＤ３ビーズ／抗ＣＤ２８ビーズへＴ細胞を結合させる時間を単純に短縮もしくは延長することによって、及び／またはビーズ対Ｔ細胞の比を増加もしくは減少させることによって（本明細書においてさらに記載されるように）、Ｔ細胞のサブ集団は、培養開始時またはプロセスの間の他の時間点で優先的に取捨選択され得る。追加で、ビーズまたは他の表面上の抗ＣＤ３抗体及び／または抗ＣＤ２８抗体の比を増加または減少させることによって、Ｔ細胞のサブ集団は培養開始時または他の所望される時間点で優先的に取捨選択され得る。当業者は、複数の選択のラウンドも使用され得ることを認識するだろう。いくつかの実施形態において、選択手順を遂行し、活性化プロセス及び増殖プロセスにおいて「選択されていない」細胞を使用することが、所望され得る。「選択されていない」細胞は、さらなる選択のラウンドにも供され得る。
ネガティブ選択によるＴ細胞集団の富化は、ネガティブ選択された細胞にユニークな表面マーカーへ指向性のある抗体の組み合わせにより達成され得る。１つの方法は、ネガティブ選択された細胞上で存在する細胞表面マーカーへの指向性のあるモノクローナル抗体のカクテルを使用する、ネガティブ磁気免疫付着またはフローサイトメトリーを介する細胞選別及び／または細胞選択である。例えば、ネガティブ選択によってＣＤ４＋細胞を富化するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲ、及びＣＤ８に対する抗体を含む。ある特定の実施形態において、典型的には、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＧＩＴＲ＋、及びＦｏｘＰ３＋を発現する調節性Ｔ細胞を富化またはポジティブ選択することが、所望され得る。代替的に、ある特定の実施形態において、調節性Ｔ細胞は、抗Ｃ２５コンジュゲートビーズまたは他の類似の選択の方法によって枯渇させられる。
ポジティブ選択またはネガティブ選択による所望される細胞の集団の単離のために、細胞濃度及び表面（例えばビーズ等の粒子）は変動し得る。ある特定の実施形態において、細胞とビーズの最大の接触を確実にするために、ビーズ及び細胞が一緒に混合される体積を有意に減少させる（すなわち細胞の濃度を増加させる）ことが所望され得る。例えば、一実施形態において、２０億細胞／ｍＬの濃度が使用される。一実施形態において、１０億細胞／ｍＬの濃度が使用される。さらなる実施形態において、１億細胞／ｍＬ超が使用される。さらなる実施形態において、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万、または５０００万細胞／ｍＬの細胞濃度が使用される。さらに別の実施形態において、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、または１億細胞／ｍＬからの細胞濃度が使用される。さらなる実施形態において、１億２５００万または１億５０００万細胞／ｍＬの濃度が使用され得る。高濃度の使用は、細胞収率の増加、細胞活性化、及び細胞増殖をもたらし得る。さらに、高い細胞濃度の使用は、関心のある標的抗原を弱く発現し得る細胞（ＣＤ２８陰性Ｔ細胞等）、または多くの腫瘍細胞が存在するサンプル（すなわち白血病血液、腫瘍組織など）からの細胞のより効率的な捕捉を可能にする。かかる細胞集団は、治療的価値を有し、得ることが所望されるだろう。例えば、高濃度の細胞の使用は、通常はより弱いＣＤ２８発現を有するＣＤ８＋ Ｔ細胞のより効率的な選択を可能にする。
いくつかの実施形態において、より低い濃度の細胞を使用することが所望され得る。細胞（例えばＴ細胞）及び表面（例えばビーズ等の粒子）の混合物を有意に希釈することによって、粒子と細胞との間の相互作用は最小限にされる。これにより、粒子へ結合する所望される抗原を高い量で発現する細胞が選択される。例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞はより高いレベルのＣＤ２８を発現し、希釈濃度においてＣＤ８＋ Ｔ細胞よりも効率的に捕捉される。いくつかの実施形態において、使用される細胞の濃度は、５×１０６／ｍＬである。いくつかの実施形態において、使用される濃度は、約１×１０５／ｍＬ～１×１０６／ｍＬ、及びその間の任意の整数値であり得る。
いくつかの実施形態において、細胞は、２～１０℃または室温のいずれかで変動速度で変動時間にわたってローテーター上でインキュベーションされ得る。
刺激用のＴ細胞は、洗浄ステップ後に凍結もされ得る。理論に束縛されることを望むものではないが、凍結及び後続する融解ステップは、細胞集団中の顆粒球及びある程度の単球を除去することによって、より均一な産物を提供する。血漿及び血小板を除去する洗浄ステップ後に、細胞は、凍結溶液中で懸濁され得る。多くの凍結溶液及びパラメーターが当技術分野において公知であり、この文脈において有用であるが、１つの方法は、２０％のＤＭＳＯ及び８％のヒト血清アルブミンを含有するＰＢＳ、もしくは１０％のデキストラン４０及び５％のデキストロース、２０％のヒト血清アルブミン、ならびに７．５％のＤＭＳＯを含有する培養培地、もしくは３１．２５％のプラズマライト－Ａ、３１．２５％のデキストロース５％、０．４５％のＮａＣｌ、１０％のデキストラン４０及び５％のデキストロース、２０％のヒト血清アルブミン、ならびに７．５％のＤＭＳＯを含有する培養培地、または例えばＨｅｓｐａｎ及びＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａを含有する他の好適な細胞凍結培地を使用し、次いで細胞は、－８０℃へ毎分１°の速度で凍結され、液体窒素貯蔵タンクの気相中で保存されることを伴う。他の制御された凍結の方法、そして－２０℃でまたは液体窒素中で制御されずに直ちに凍結される方法が使用され得る。
いくつかの実施形態において、凍結保存細胞は、本明細書において記載されるように融解及び洗浄され、活性化の前に室温で１時間静置される。
本明細書において記載される増殖された細胞が必要であり得る前の期間での、対象からの血液サンプルまたはアフェレーシス産物の収集も、本出願において企図される。それゆえ、増殖される予定の細胞の供給源は、必要な任意の時間点で収集され、所望される細胞（Ｔ細胞等）は、Ｔ細胞療法（本明細書において記載されるもの等）から利益を得る任意の数の疾患または病態のためのＴ細胞療法における後の使用のために、単離及び凍結され得る。一実施形態において、血液サンプルまたはアフェレーシスは、概して健康な対象から採取される。ある特定の実施形態において、血液サンプルまたはアフェレーシスは、概して疾患を発症するリスクがあるが、それでもなお疾患を発症していない健康な対象から採取され、関心のある細胞は単離され、後の使用のために凍結される。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、増殖され、冷凍され、及び後に使用され得る。ある特定の実施形態において、サンプルは、本明細書において記載されるような特定の疾患の診断の直後であるが任意の治療前の患者から収集される。さらなる実施形態において、細胞は、任意の数の関連する治療形式の前に、対象からの血液サンプルまたはアフェレーシスから単離され、当該治療形式としては、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化学療法、放射線、免疫抑制剤（シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレート、及びＦＫ５０６等）、抗体、または他の免疫除去剤（ｉｍｍｕｎｏａｂｌａｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）（ＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、サイトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、及び照射等）等の剤による治療が挙げられるがこれらに限定されない。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリンを阻害するか（シクロスポリン及びＦＫ５０６）、または増殖因子誘導性シグナリングのために重要なｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害するか（ラパマイシン）のいずれかである（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６６：８０７－８１５，１９９１；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎ ７３：３１６－３２１，１９９１；Ｂｉｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎ．５：７６３－７７３，１９９３）。さらなる実施形態において、細胞は、患者のために単離され、骨髄移植または幹細胞移植、化学療法剤（フルダラビン等）、外照射療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、または抗体（ＯＫＴ３またはＣＡＭＰＡＴＨ等）のいずれかを使用するＴ細胞アブレーション療法と併用して（例えばその前、それと同時、またはその後）、後の使用のために凍結される。別の実施形態において、細胞は、Ｂ細胞アブレーション療法（ＣＤ２０と反応する作用物質、例えばＲｉｔｕｘａｎ等）の前に単離され、当該療法に続いて、治療のための後の使用のために凍結され得る。
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、治療に続いて患者から直接的に得られる。この点に関して、ある特定のがん治療（特に免疫系を損傷する薬物を用いた治療）に続いて、治療直後の、患者が治療から通常回復する期間の間に、得られたＴ細胞の質がエクスビボで増殖する能力について最適であり得るかまたは改善され得ることが観察された。同様に、本明細書において記載される方法を使用するエクスビボマニピュレーションに続いて、これらの細胞は生着の促進及びインビボの増殖のために好ましい状態であり得る。したがって、この回復相の間の血液細胞（Ｔ細胞、樹状細胞、または造血系譜の他の細胞が挙げられる）を収集することが、本発明の文脈内で企図される。さらに、ある特定の実施形態において、動員（例えばＧＭ－ＣＳＦによる動員）レジメン及び前処置レジメンを使用して、特に治療法後の定義された時間ウィンドウの間に、特定の細胞型の再集団形成（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）、再循環、再生、及び／または増殖が容易になる条件を、対象において生成することができる。例証となる細胞型としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、及び免疫系の他の細胞が挙げられる。
Ｔ細胞の活性化及び増殖
いくつかの実施形態において、細胞は、遺伝子操作の前にまたは遺伝子操作と関連して、インキュベーション及び／または培養される。インキュベーションステップは、培養、養殖、刺激、活性化、及び／または増殖を包含し得る。いくつかの実施形態において、組成物または細胞は、刺激条件または刺激剤の存在下においてインキュベーションされる。かかる条件は、集団中の細胞の増殖、増殖、活性化、及び／または生存を誘導するために、抗原曝露を模倣するために、及び／または遺伝子操作のために（遺伝子操作抗原受容体の導入のために等）細胞をプライミングするためにデザインされたものを包含する。条件としては、特定の培地、温度、酸素含有量、二酸化炭素含量、時間、作用物質、例えば栄養素、アミノ酸、抗生物質、イオン、及び／または刺激因子（サイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナー、融合タンパク質、組み換え可溶性受容体、及び細胞を活性化するようにデザインされた他の作用物質等）のうちの１つまたは複数が挙げられ得る。
本明細書において記載される融合タンパク質または外来性受容体（例えば操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ）によるＴ細胞の遺伝子修飾の前または後にかかわらず、Ｔ細胞は、概して、例えば米国特許第６，３５２，６９４号；同第６，５３４，０５５号；同第６，９０５，６８０号；同第６，６９２，９６４号；同第５，８５８，３５８号；同第６，８８７，４６６号；同第６，９０５，６８１号；同第７，１４４，５７５号；同第７，０６７，３１８号；同第７，１７２，８６９号；同第７，２３２，５６６号；同第７，１７５，８４３号；同第５，８８３，２２３号；同第６，９０５，８７４号；同第６，７９７，５１４号；同第６，８６７，０４１号；及び米国特許出願公開第２００６０１２１００５号中で記載される方法を使用して、活性化及び増殖され得る。
概して、Ｔ細胞は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する作用物質及びＴ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドを、それへ付着される表面と接触させるによって増殖され得る。特に、Ｔ細胞集団は、抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合断片、または表面上に固定化された抗ＣＤ２抗体との接触によって、あるいはカルシウムイオノフォアと併用したタンパク質キナーゼＣ活性化物質（例えばブリオスタチン）との接触によって等で、本明細書において記載されるように刺激され得る。Ｔ細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激のために、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞の集団は、Ｔ細胞の増殖の刺激のために適切な条件下で抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体と接触させられ得る。ＣＤ４＋ Ｔ細胞またはＣＤ８＋ Ｔ細胞のいずれかの増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体。抗ＣＤ２８抗体の例としては、９．３、Ｂ－Ｔ３、ＸＲ－ＣＤ２８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ、Ｂｅｓａｎｃｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）が挙げられ、一般に当技術分野において公知の他の方法と同様に使用され得る（Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ．３０（８）：３９７５－３９７７，１９９８；Ｈａａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０（９）：１３１９１３２８，１９９９；Ｇａｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ．２２７（１－２）：５３－６３，１９９９）。
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、フィーダー細胞（非分裂末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）等）を培養開始組成物へ添加すること（例えば増殖される予定の初期集団中で、もたらされた細胞集団が各々のＴリンパ球について少なくとも約５、１０、２０、または４０以上のＰＢＭＣフィーダー細胞を含有するように）；及び培養物をインキュベーションすること（例えばＴ細胞の数を増殖するのに十分な時間で）によって増殖される。いくつかの態様において、非分裂フィーダー細胞は、ガンマ線照射ＰＢＭＣフィーダー細胞を含み得る。いくつかの実施形態において、ＰＢＭＣは、細胞分裂を防止するために約３０００～３６００ラドの範囲のγ線により照射される。いくつかの態様において、フィーダー細胞は、Ｔ細胞の集団の添加の前に培養培地へ添加される。
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞に対する一次刺激シグナル及び共刺激シグナルは、異なるプロトコルによって提供され得る。例えば、各々のシグナルを提供する作用物質は、溶液中に存在し得るか、または表面へカップリングされ得る。表面へカップリングされる場合に、作用物質は、同じ表面（すなわち「シス」構成で）または分離した表面（すなわち「トランス」構成で）へカップリングされ得る。代替的に、１つの作用物質は表面へカップリングされ、他の作用物質は溶液中に存在し得る。一実施形態において、共刺激シグナルを提供する作用物質は、細胞表面へ結合され、一次活性化シグナルを提供する作用物質は、溶液中に存在するか、または表面へカップリングされる。ある特定の実施形態において、両方の作用物質は、溶液中に存在し得る。別の実施形態において、作用物質は可溶性形態であり得、次いで表面（Ｆｃ受容体もしくは抗体を発現する細胞、または作用物質へ結合する他の結合物質等）へ架橋され得る。この点に関して、本発明におけるＴ細胞の活性化及び増殖における使用のために企図される人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）について、例えば米国特許出願公開第２００４０１０１５１９号及び同２００６００３４８１０号を参照されたい。
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は作用物質コートビーズと組み合わせられ、後続してビーズ及び細胞は分離され、次いで細胞は培養される。代替の実施形態において、培養の前に、作用物質コートビーズ及び細胞は分離されないが、一緒に培養される。さらなる実施形態において、ビーズ及び細胞は、力（磁力等）の適用によって最初に濃縮され、細胞表面マーカーのライゲーションの増加をもたらし、それによって細胞刺激が誘導される。
一例として、細胞表面タンパク質は、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８が付着されている常磁性ビーズ（３×２８ビーズ）をＴ細胞と接触させることによってライゲーションされ得る。一実施形態において、細胞（例えば１０４～１０９のＴ細胞）及びビーズ（例えば１：１の比で、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ常磁性ビーズ）は、バッファー、好ましくはＰＢＳ（カルシウム及びマグネシウム等の二価陽イオン無し）中で組み合わせられる。この場合もやはり、当業者であれば、任意の細胞濃度が使用され得ることを容易に認識し得る。例えば、標的細胞が、サンプル中で非常に稀であり得、サンプルのうちのわずか０．０１％を構成し得るか、またはサンプル全体（すなわち１００％）が、関心のある標的細胞を含み得る。したがって、任意の細胞数は、本発明の文脈内である。ある特定の実施形態において、細胞と粒子の最大の接触を確実にするために、粒子及び細胞が一緒に混合される体積を有意に減少させる（すなわち細胞の濃度を増加させる）ことが所望され得る。例えば、一実施形態において、約２０億細胞／ｍＬの濃度が使用される。別の実施形態において、１億細胞／ｍＬ超が使用される。さらなる実施形態において、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万、または５０００万細胞／ｍＬの細胞濃度が使用される。さらに別の実施形態において、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、または１億細胞／ｍＬからの細胞濃度が使用される。さらなる実施形態において、１億２５００万または１億５０００万細胞／ｍＬの濃度が使用され得る。高濃度の使用は、細胞収率の増加、細胞活性化、及び細胞増殖をもたらし得る。さらに、高い細胞濃度の使用は、関心のある標的抗原（ＣＤ２８陰性Ｔ細胞等）を弱く発現し得る細胞のより効率的な捕捉を可能にする。かかる細胞集団は、治療的価値を有し、ある特定の実施形態において得ることが所望されるだろう。例えば、高濃度の細胞の使用は、通常はより弱いＣＤ２８発現を有するＣＤ８＋ Ｔ細胞のより効率的な選択を可能にする。
いくつかの実施形態において、混合物は、数時間（約３時間）～約１４日、またはその間の任意の整数値の時間で、培養され得る。別の実施形態において、混合物は、２１日間培養され得る。本発明の一実施形態において、ビーズ及びＴ細胞は、約８日間一緒に培養される。別の実施形態において、ビーズ及びＴ細胞は、２～３日間一緒に培養される。Ｔ細胞の培養時間が６０日間以上であり得るように、数サイクルの刺激も所望され得る。Ｔ細胞培養のために適切な条件としては、増殖及び生存能力のために必要な因子を含有し得る適切な培地（例えば最小必須培地またはＲＰＭＩ培地１６４０またはＸ－ｖｉｖｏ １５（Ｌｏｎｚａ））が挙げられ、当該培地は、血清（例えばウシ胎児またはヒト血清）、インターロイキン２（ＩＬ－２）、インスリン、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＴＧＦβ、及びＴＮＦ－α、または当業者に公知の細胞の増殖のための他の添加物を含む。細胞の増殖のための他の添加物としては、界面活性物質、プラスマネート、及び還元剤（Ｎ－アセチル－システイン及び２－メルカプトエタノール等）が挙げられるがこれらに限定されない。培地としては、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、及びビタミンが添加され、血清不含有であるか、あるいは適切な量の血清（または血漿）または定義されたセットのホルモン及び／またはＴ細胞の増殖及び増殖（ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）のために十分な量のサイトカイン（複数可）が補足された、のいずれかである、ＲＰＭＩ １６４０、ＡＩＭ－Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｘ－Ｖｉｖｏ １５及びＸ－Ｖｉｖｏ ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒが挙げられ得る。抗生物質（例えばペニシリン及びストレプトマイシン）は実験培養中にのみ含まれ、対象の中へ注入される予定の細胞の培養中には含まれない。標的細胞は、増殖を支援するのに必要な条件、例えば適切な温度（例えば３７℃）及び雰囲気（例えば空気に加えて５％のＣＯ２）下で維持される。様々な刺激時間へ曝露されたＴ細胞は、異なる特徴を呈し得る。例えば、典型的な血液またはアフェレーシスを行った末梢血単核細胞産物は、細胞傷害性Ｔ細胞集団または抑制性Ｔ細胞集団（ＴＣ、ＣＤ８）よりも多い、ヘルパーＴ細胞集団（ＴＨ、ＣＤ４＋）を有する。ＣＤ３及びＣＤ２８の受容体の刺激によるＴ細胞のエクスビボ増殖は、約８～９日目の前に優先的にＴＨ細胞からなるＴ細胞の集団を産生する一方で、約８～９日目の後に、Ｔ細胞の集団は、次第にＴＣ細胞のより多い集団を含む。したがって、治療の目的に依存して、対象に、ＴＨ細胞を優先的に含むＴ細胞集団を注入することは有利であり得る。同様に、ＴＣ細胞の抗原特異的サブセットが単離されているならば、このサブセットをより高い程度まで増殖させることは有益であり得る。
さらに、ＣＤ４及びＣＤ８のマーカーに加えて、他の表現型マーカーは有意に変動するが、細胞増殖プロセスの過程の間に大部分は再現される。したがって、かかる再現性によって、特定の目的のために活性化Ｔ細胞産物を特別にあつらえる能力が可能になる。
いくつかの実施形態において、方法は、修飾された細胞または操作される予定の細胞の表面上の１つまたは複数のマーカーの発現を査定することを包含する。一実施形態において、方法は、例えば親和性ベースの検出方法によって（フローサイトメトリーによって等）ＴＣＲまたはＣＤ３εの表面発現を査定することを包含する。いくつかの態様において、方法が抗原または他のマーカーの表面発現を明らかにする場合、抗原または他のマーカーをコードする遺伝子は、例えば本明細書において記載される方法を使用して、破壊されるか、またはさもなければ発現が抑制される。
ＶＩ．医薬組成物
本明細書において記載される融合タンパク質を発現する操作された細胞（例えば操作されたＴ細胞）のうちの任意の１つ及び／または本明細書において記載される機能的外来性受容体（例えば抗ＢＣＭＡのＣＡＲ等の操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ）、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が、本出願によってさらに提供される。医薬組成物は、複数の操作された細胞を、任意選択の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定化物質（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））と混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で調製され得る。
許容される担体、賦形剤、または安定化物質は、用いられる投与量及び濃度でレシピエントへ非毒性であり、バッファー、抗酸化物質（アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ、メタ重亜硫酸ナトリウムを包含する）；防腐物質、等張化物質、安定化物質、金属複合体（例えばＺｎ－タンパク質複合体）；キレート剤（ＥＤＴＡ及び／または非イオン性界面活性物質等）が挙げられる。
バッファーは、特に安定性がｐＨ依存性ならば、治療有効性を最適化する範囲中でｐＨを制御するために使用される。バッファーは、好ましくは、約５０ｍＭ～約２５０ｍＭの範囲の濃度で存在する。本発明による使用のために好適なバッファー剤としては、有機酸及び無機酸ならびにそれらの塩の両方が挙げられる。例えば、クエン酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酢酸塩である。追加で、バッファーは、ヒスチジン及びトリメチルアミン塩（トリス等）を含み得る。
防腐物質は、微生物増殖を遅滞させるために添加され、典型的には、０．２％～１．０％（ｗ／ｖ）の範囲中で存在する。本発明による使用に好適な防腐物質としては、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；ベンザルコニウムハロゲン化物（例えば塩化物、臭化物、ヨウ化物）、塩化ベンゼトニウム；チメロサール、フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン（メチルパラベンまたはプロピルパラベン等）；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール、３－ペンタノール、及びｍ－クレゾールが挙げられる。
等張化剤（場合によっては「安定化物質」として公知である）は、組成物における液体の等張性を調整または維持するために存在する。大きな荷電生体分子（タンパク質及び抗体等）と共に使用される場合に、それらは、アミノ酸側鎖の荷電基と相互作用することができ、それによって、分子間及び分子無内の相互作用についての可能性を軽減するので、多くの場合「安定化物質」と称される。等張化剤は、他の成分の相対量を考慮に入れて、重量で０．１％～２５％（好ましくは１～５％）の任意の量で存在し得る。好ましい等張化剤としては、多価フェノールの糖アルコール、好ましくは三価以上の糖アルコール（グリセリン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、及びマンニトール等））を挙げられる。
追加の賦形剤としては、以下の：（１）増量剤、（２）溶解度促進物質、（３）安定化物質、及び（４）変性または容器壁への粘着を予防する作用物質うちの１つまたは複数として働き得る作用物質が挙げられる。かかる賦形剤としては、多価糖アルコール（上で列挙された）；アミノ酸（アラニン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、オルニチン、ロイシン、２－フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニン等）；有機糖または糖アルコール（スクロース、ラクトース、ラクチトール、トレハロース、スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、リビトール、ミオイニシトース（ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｓｅ）、ミオイニシトール（ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｌ）、ガラクトース、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール（例えばイノシトール）、ポリエチレングリコール等）；含硫還元剤（尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α－モノチオグリセロール、及びチオ硫酸ナトリウム等）；低い分子量タンパク質（ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミンまたはゼラチンまたは他の免疫グロブリン等）；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドン等）；単糖（例えばキシロース、マンノース、フルクトース、グルコース）；二糖（例えばラクトース、マルトース、スクロース）；三糖（ラフィノース）；及び多糖（デキストリンまたはデキストラン）が挙げられる。
非イオン性界面活性物質またはデタージェント（「湿潤剤」としても公知である）は、治療剤を可溶化することを支援するために、そして撹拌誘導性凝集に対して治療タンパク質を保護するために存在し、そのことにより、活性のある治療タンパク質または抗体の変性を引き起こさずに、製剤が剪断表面応力へ曝露されることも可能になる。非イオン性界面活性物質は、約０．０５ｍｇ／ｍＬ～約１．０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約０．０７ｍｇ／ｍＬ～約０．２ｍｇ／ｍＬの範囲である。
好適な非イオン性界面活性物質としては、ポリソルベート（２０、４０、６０、６５、８０など）、ポリオキサマー（ｐｏｌｙｏｘａｍｅｒ）（１８４、１８８など）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）ポリオール、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（ＴＷＥＥＮ（登録商標）－２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）－８０など）、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油１０、５０、及び６０、モノステアリン酸グリセロール、ショ糖脂肪酸エステル、メチルセルオース（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、ならびにカルボキシメチルセルロースが挙げられる。使用され得る陰イオンデタージェントとしては、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム、及びスルホン酸ジオクチルナトリウムが挙げられる。陽イオンデタージェントとしては、塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトニウムが挙げられる。
医薬組成物がインビボの投与に使用されるために、それらは滅菌されなくてはならない。医薬組成物は、滅菌済み濾過膜を介する濾過によって滅菌され得る。本明細書における医薬組成物は、概して滅菌アクセスポートを有する容器（例えば皮下注射針によって穿刺可能な栓を有する静注液バッグまたはバイアル）の中へ配置される。
投与経路は、好適な様式での長期間にわたる単回または複数回のボーラスまたは注入（例えば皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、病巣内、または関節内の経路による注射または注入）によって、局所投与、吸入、または持続放出手段もしくは延長放出手段によって等の公知の許容される方法に従うものである。
持続放出性調製物が調製され得る。持続放出性調製物の好適な例としては、アンタゴニストを含有する固体の疎水性ポリマーの半透過性のマトリックスが挙げられ、当該マトリックスは、造形品（例えばフィルムまたはマイクロカプセル）の形態である。持続放出性マトリックスの例としては、ポリエステル、ハイドロゲル（例えばポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ－グルタミン酸及びエチルＬ－グルタミン酸塩のコポリマー、非分解性のエチレン酢酸ビニル、分解性の乳酸－グリコール酸コポリマー（ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸－グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なマイクロスフェア）等）、及びポリ－Ｄ－（－）－３－ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
本明細書において記載される医薬組成物は、治療されている特定の適応症のために必要に応じて２つ以上の活性化合物または作用物質、好ましくは互いに悪影響を与えない相補的活性の有るものも含有し得る。代替的にまたは加えて、組成物は、細胞傷害剤、化学療法剤、サイトカイン、免疫抑制剤、または増殖阻害剤を含み得る。かかる分子は、好適には意図される目的のために有効な量で併用されて存在する。
活性成分は、コロイド性薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子、及びナノカプセル）において、またはマクロエマルジョンにおいて、例えばコアセルベーション（ｃｏａｓｃｅｒｖａｔｉｏｎ）技法によって、または界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えばそれぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセル及びポリ－（メチルメタクイレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセル）中で、トラップもされ得る。かかる技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ中で開示される。
ＶＩＩ．治療の方法
本出願は、有効量の本明細書において記載される操作された細胞を含む医薬組成物を個体へ投与することを含む、個体における疾患または病態を治療する方法をさらに提供する。いくつかの実施形態において、疾患または病態は免疫抑制を伴う。いくつかの実施形態において、疾患のある組織は、疾患または病態の無い個体中の対応する組織よりも高い発現レベルのＴＧＦβ（例えばより高い発現のＴＧＦβｍＲＮＡまたはＴＧＦβタンパク質）を有する。いくつかの実施形態において、疾患のある組織は、疾患または病態無しの個体中の対応する組織よりも高い発現レベルのＴＧＦβＲ（例えばより高い発現のＴＧＦβＲ１／ＴＧＦβＲ２ ｍＲＮＡまたはＴＧＦβＲ１／ＴＧＦβＲ２タンパク質）を有する。いくつかの実施形態において、疾患または病態は、がんである。いくつかの実施形態において、がんは、固形腫瘍である。いくつかの実施形態において、疾患または病態は、感染性疾患、または感染症と関連する病態である。
本出願は、本明細書において記載される操作された細胞の有効量を含む医薬組成物を個体へ投与することを含む、個体中の疾患のある組織における免疫抑制シグナルを低減する方法も提供する。いくつかの実施形態において、免疫抑制シグナルを低減することは、ＴＧＦβＲを介してシグナリングを減少させることを含む。いくつかの実施形態において、疾患のある組織は、疾患または病態の無い個体中の対応する組織よりも高い発現レベルのＴＧＦβ（例えばより高い発現のＴＧＦβｍＲＮＡまたはＴＧＦβタンパク質）を有する。いくつかの実施形態において、疾患のある組織は、疾患または病態無しの個体中の対応する組織よりも高い発現レベルのＴＧＦβＲ（例えばより高い発現のＴＧＦβＲ１／ＴＧＦβＲ２ ｍＲＮＡまたはＴＧＦβＲ１／ＴＧＦβＲ２タンパク質）を有する。いくつかの実施形態において、疾患または病態は、がんである。いくつかの実施形態において、がんは、固形腫瘍である。いくつかの実施形態において、疾患または病態は、感染性疾患、または感染症と関連する病態である。
いくつかの実施形態において、方法は、疾患のある組織におけるＴＧＦβまたはＴＧＦβ受容体（例えばＴＧＦβＲ１及び／またはＴＧＦβＲ２）のレベルを治療の前に査定することをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、疾患のある組織におけるＴＧＦβまたはＴＧＦβ受容体（例えばＴＧＦβＲ１及び／またはＴＧＦβＲ２）のレベルに基づく治療のために個体を選択することをさらに含む。いくつかの実施形態において、個体は、疾患のある組織が、参照組織（例えば健康な個体中の対応する組織）におけるものよりも、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高いＴＧＦβレベル（例えば平均ＴＧＦβレベル）を有する場合に、治療のために選択される。いくつかの実施形態において、個体は、疾患のある組織が、参照組織（例えば健康な個体中の対応する組織）におけるものよりも、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高いＴＧＦβＲレベル（例えば平均ＴＧＦβＲ１レベル及び／または平均ＴＧＦβＲ２レベル）を有する場合に、治療のために選択される。
いくつかの実施形態において、ａ）ｉ）ＴＧＦβＲ１の細胞外ドメインを含む第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）ＴＧＦβＲ１の膜貫通ドメインを含む第１の膜貫通ドメイン、ｉｉｉ）ＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインを含む第１の細胞内ドメイン、を含む、第１のポリペプチドと；ｂ）ｉ）ＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインを含む第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）ＴＧＦβＲ２の膜貫通ドメインを含む第２の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）ＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメインを含む第２の細胞内ドメイン、を含む、第２のポリペプチドとを含む融合タンパク質を含む（または発現する）有効量の操作された細胞（例えば免疫細胞、例えばＴ細胞）を含む組成物（例えば医薬組成物）を投与することを含む、個体における疾患または病態（例えばがん、固形腫瘍、血液がん、または感染性疾患）を治療する方法が提供される。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、同種異系細胞（例えば同種異系Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、自己由来細胞（例えば自己由来Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、γδＴ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、機能的外来性受容体（例えばＣＡＲ、例えば操作されたＴＣＲ）またはそれをコードする核酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、疾患のある組織は、参照組織（例えば健康な個体中の対応する組織）におけるものよりも、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高いＴＧＦβレベル（例えば平均ＴＧＦβレベル）を有する。いくつかの実施形態において、疾患のある組織は、参照組織（例えば健康な個体中の対応する組織）におけるものよりも、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高いＴＧＦβＲレベル（例えば平均ＴＧＦβＲ１レベル及び／または平均ＴＧＦβＲ２レベル）を有する。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、個体の中へ非経口（例えば静脈内）投与される。いくつかの実施形態において、個体はヒトである。
いくつかの実施形態において、ａ）ｉ）ＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインを含む第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）ＴＧＦβＲ２の膜貫通ドメインを含む第１の膜貫通ドメイン、ｉｉｉ）ＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインを含む第１の細胞内ドメイン、を含む、第１のポリペプチドと；ｂ）ｉ）ＴＧＦβＲ１の細胞外ドメインを含む第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）ＴＧＦβＲ１の膜貫通ドメインを含む第２の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）ＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメインを含む第２の細胞内ドメイン、を含む、第２のポリペプチドとを含む融合タンパク質を含む（または発現する）有効量の操作された細胞（例えば免疫細胞、例えばＴ細胞）を含む組成物（例えば医薬組成物）を投与することを含む、個体における疾患または病態（例えばがん、固形腫瘍、血液がん、または感染性疾患）を治療する方法が提供される。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、同種異系細胞（例えば同種異系Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、自己由来細胞（例えば自己由来Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、γδＴ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、機能的外来性受容体（例えばＣＡＲ、例えば操作されたＴＣＲ）またはそれをコードする核酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、疾患のある組織は、参照組織（例えば健康な個体中の対応する組織）におけるものよりも、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高いＴＧＦβレベル（例えば平均ＴＧＦβレベル）を有する。いくつかの実施形態において、疾患のある組織は、参照組織（例えば健康な個体中の対応する組織）におけるものよりも、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高いＴＧＦβＲレベル（例えば平均ＴＧＦβＲ１レベル及び／または平均ＴＧＦβＲ２レベル）を有する。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、個体の中へ非経口（例えば静脈内）投与される。いくつかの実施形態において、個体はヒトである。
いくつかの実施形態において、ａ）ｉ）ＴＧＦβＲ１の細胞外ドメインを含む第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）ＩＬ－２３Ｒの膜貫通ドメインを含む第１の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）ＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインを含む第１の細胞内ドメイン、を含む、第１のポリペプチドと；ｂ）ｉ）ＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインを含む第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）ＩＬ－１２Ｒβ１の膜貫通ドメインを含む第２の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）ＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメインを含む第２の細胞内ドメイン、を含む、第２のポリペプチドとを含む融合タンパク質を含む（または発現する）有効量の操作された細胞（例えば免疫細胞、例えばＴ細胞）を含む組成物（例えば医薬組成物）を投与することを含む、個体における疾患または病態（例えばがん、固形腫瘍、血液がん、または感染性疾患）を治療する方法が提供される。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、同種異系細胞（例えば同種異系Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、自己由来細胞（例えば自己由来Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、γδＴ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、機能的外来性受容体（例えばＣＡＲ、例えば操作されたＴＣＲ）またはそれをコードする核酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、疾患のある組織は、参照組織（例えば健康な個体中の対応する組織）におけるものよりも、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高いＴＧＦβレベル（例えば平均ＴＧＦβレベル）を有する。いくつかの実施形態において、疾患のある組織は、参照組織（例えば健康な個体中の対応する組織）におけるものよりも、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高いＴＧＦβＲレベル（例えば平均ＴＧＦβＲ１レベル及び／または平均ＴＧＦβＲ２レベル）を有する。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、個体の中へ非経口（例えば静脈内）投与される。いくつかの実施形態において、個体はヒトである。
いくつかの実施形態において、ａ）ｉ）ＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインを含む第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）ＩＬ－２３Ｒの膜貫通ドメインを含む第１の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）ＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインを含む第１の細胞内ドメイン、を含む、第１のポリペプチドと；ｂ）ｉ）ＴＧＦβＲ１の細胞外ドメインを含む第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）ＩＬ－１２Ｒβ１の膜貫通ドメインを含む第２の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）ＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメインを含む第２の細胞内ドメイン、を含む、第２のポリペプチドとを含む融合タンパク質を含む（または発現する）有効量の操作された細胞（例えば免疫細胞、例えばＴ細胞）を含む組成物（例えば医薬組成物）を投与することを含む、個体における疾患または病態（例えばがん、固形腫瘍、血液がん、または感染性疾患）を治療する方法が提供される。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、同種異系細胞（例えば同種異系Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、自己由来細胞（例えば自己由来Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、γδＴ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、機能的外来性受容体（例えばＣＡＲ、例えば操作されたＴＣＲ）またはそれをコードする核酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、疾患のある組織は、参照組織（例えば健康な個体中の対応する組織）におけるものよりも、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高いＴＧＦβレベル（例えば平均ＴＧＦβレベル）を有する。いくつかの実施形態において、疾患のある組織は、参照組織（例えば健康な個体中の対応する組織）におけるものよりも、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高いＴＧＦβＲレベル（例えば平均ＴＧＦβＲ１レベル及び／または平均ＴＧＦβＲ２レベル）を有する。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、個体の中へ非経口（例えば静脈内）投与される。いくつかの実施形態において、個体はヒトである。
いくつかの実施形態において、１）ａ）ｉ）ＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインを含む第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）ＩＬ－２３Ｒの膜貫通ドメインを含む第１の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）ＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインを含む第１の細胞内ドメイン、を含む、第１のポリペプチドと；ｂ）ｉ）ＴＧＦβＲ１の細胞外ドメインを含む第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）ＩＬ－１２Ｒβ１の膜貫通ドメインを含む第２の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）ＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメインを含む第２の細胞内ドメイン、を含む、第２のポリペプチドとを含む融合タンパク質；ならびに２）腫瘍抗原（例えばＧＰＣ３またはＢＣＭＡ）を標的とするＣＡＲを含む（または発現する）有効量の操作された細胞（例えば免疫細胞、例えばＴ細胞）を含む組成物（例えば医薬組成物）を投与することを含む、個体における疾患または病態（例えばがん、固形腫瘍、血液がん、または感染性疾患）を治療する方法が提供される。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、同種異系細胞（例えば同種異系Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、自己由来細胞（例えば自己由来Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、γδＴ細胞である。いくつかの実施形態において、疾患のある組織は、参照組織（例えば健康な個体中の対応する組織）におけるものよりも、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高いＴＧＦβレベル（例えば平均ＴＧＦβレベル）を有する。いくつかの実施形態において、疾患のある組織は、参照組織（例えば健康な個体中の対応する組織）におけるものよりも、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高いＴＧＦβＲレベル（例えば平均ＴＧＦβＲ１レベル及び／または平均ＴＧＦβＲ２レベル）を有する。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、個体の中へ非経口（例えば静脈内）投与される。いくつかの実施形態において、個体はヒトである。
いくつかの実施形態において、ａ）ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む第１の膜貫通ドメイン、ｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む第１の細胞内ドメイン、を含む、第１のポリペプチドと；ｂ）ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含む第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含む第２の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）配列番号１６を含む第２の細胞内ドメイン、を含む、第２のポリペプチドとを含む融合タンパク質を含む（または発現する）有効量の操作された細胞（例えば免疫細胞、例えばＴ細胞）を含む組成物（例えば医薬組成物）を投与することを含む、個体における疾患または病態（例えばがん、固形腫瘍、血液がん、または感染性疾患）を治療する方法が提供される。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、同種異系細胞（例えば同種異系Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、自己由来細胞（例えば自己由来Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、γδＴ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、機能的外来性受容体（例えばＣＡＲ、例えば操作されたＴＣＲ）またはそれをコードする核酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、疾患のある組織は、参照組織（例えば健康な個体中の対応する組織）におけるものよりも、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高いＴＧＦβレベル（例えば平均ＴＧＦβレベル）を有する。いくつかの実施形態において、疾患のある組織は、参照組織（例えば健康な個体中の対応する組織）におけるものよりも、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高いＴＧＦβＲレベル（例えば平均ＴＧＦβＲ１レベル及び／または平均ＴＧＦβＲ２レベル）を有する。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、個体の中へ非経口（例えば静脈内）投与される。いくつかの実施形態において、個体はヒトである。
いくつかの実施形態において、ａ）ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含む第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含む第１の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む第１の細胞内ドメイン、を含む、第１のポリペプチドと；ｂ）ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む第２の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む第２の細胞内ドメイン、を含む、第２のポリペプチドとを含む融合タンパク質を含む（または発現する）有効量の操作された細胞（例えば免疫細胞、例えばＴ細胞）を含む組成物（例えば医薬組成物）を投与することを含む、個体における疾患または病態（例えばがん、固形腫瘍、血液がん、または感染性疾患）を治療する方法が提供される。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、同種異系細胞（例えば同種異系Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、自己由来細胞（例えば自己由来Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、γδＴ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、機能的外来性受容体（例えばＣＡＲ、例えば操作されたＴＣＲ）またはそれをコードする核酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、疾患のある組織は、参照組織（例えば健康な個体中の対応する組織）におけるものよりも、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高いＴＧＦβレベル（例えば平均ＴＧＦβレベル）を有する。いくつかの実施形態において、疾患のある組織は、参照組織（例えば健康な個体中の対応する組織）におけるものよりも、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高いＴＧＦβＲレベル（例えば平均ＴＧＦβＲ１レベル及び／または平均ＴＧＦβＲ２レベル）を有する。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、個体の中へ非経口（例えば静脈内）投与される。いくつかの実施形態において、個体はヒトである。
いくつかの実施形態において、ａ）ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含む第１の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む第１の細胞内ドメイン、を含む、第１のポリペプチドと；ｂ）ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含む第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含む第２の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む第２の細胞内ドメイン、を含む、第２のポリペプチドとを含む融合タンパク質を含む（または発現する）有効量の操作された細胞（例えば免疫細胞、例えばＴ細胞）を含む組成物（例えば医薬組成物）を投与することを含む、個体における疾患または病態（例えばがん、固形腫瘍、血液がん、または感染性疾患）を治療する方法が提供される。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、同種異系細胞（例えば同種異系Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、自己由来細胞（例えば自己由来Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、γδＴ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、機能的外来性受容体（例えばＣＡＲ、例えば操作されたＴＣＲ）またはそれをコードする核酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、疾患のある組織は、参照組織（例えば健康な個体中の対応する組織）におけるものよりも、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高いＴＧＦβレベル（例えば平均ＴＧＦβレベル）を有する。いくつかの実施形態において、疾患のある組織は、参照組織（例えば健康な個体中の対応する組織）におけるものよりも、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高いＴＧＦβＲレベル（例えば平均ＴＧＦβＲ１レベル及び／または平均ＴＧＦβＲ２レベル）を有する。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、個体の中へ非経口（例えば静脈内）投与される。いくつかの実施形態において、個体はヒトである。
いくつかの実施形態において、ａ）ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含む第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含む第１の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む第１の細胞内ドメイン、を含む、第１のポリペプチドと；ｂ）ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含む第２の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む第２の細胞内ドメイン、を含む、第２のポリペプチドとを含む融合タンパク質を含む（または発現する）有効量の操作された細胞（例えば免疫細胞、例えばＴ細胞）を含む組成物（例えば医薬組成物）を投与することを含む、個体における疾患または病態（例えばがん、固形腫瘍、血液がん、または感染性疾患）を治療する方法が提供される。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、同種異系細胞（例えば同種異系Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、自己由来細胞（例えば自己由来Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、γδＴ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、機能的外来性受容体（例えばＣＡＲ、例えば操作されたＴＣＲ）またはそれをコードする核酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、疾患のある組織は、参照組織（例えば健康な個体中の対応する組織）におけるものよりも、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高いＴＧＦβレベル（例えば平均ＴＧＦβレベル）を有する。いくつかの実施形態において、疾患のある組織は、参照組織（例えば健康な個体中の対応する組織）におけるものよりも、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高いＴＧＦβＲレベル（例えば平均ＴＧＦβＲ１レベル及び／または平均ＴＧＦβＲ２レベル）を有する。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、個体の中へ非経口（例えば静脈内）投与される。いくつかの実施形態において、個体はヒトである。
いくつかの実施形態において、ａ）Ｎ末端からＣ末端の方向へ、ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含む第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む第１のリンカー、ｉｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含む第１の膜貫通ドメイン、及びｉｖ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む第１の細胞内ドメイン、を含む、第１のポリペプチドと；ｂ）Ｎ末端からＣ末端の方向へ、ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含む第２のリンカー、ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含む第２の膜貫通ドメイン、及びｉｖ）配列番号１６を含む第２の細胞内ドメイン、を含む、第２のポリペプチドとを含む融合タンパク質を含む（または発現する）有効量の操作された細胞（例えば免疫細胞、例えばＴ細胞）を含む組成物（例えば医薬組成物）を投与することを含む、個体における疾患または病態（例えばがん、固形腫瘍、血液がん、または感染性疾患）を治療する方法が提供される。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、同種異系細胞（例えば同種異系Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、自己由来細胞（例えば自己由来Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、γδＴ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、機能的外来性受容体（例えばＣＡＲ、例えば操作されたＴＣＲ）またはそれをコードする核酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、疾患のある組織は、参照組織（例えば健康な個体中の対応する組織）におけるものよりも、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高いＴＧＦβレベル（例えば平均ＴＧＦβレベル）を有する。いくつかの実施形態において、疾患のある組織は、参照組織（例えば健康な個体中の対応する組織）におけるものよりも、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高いＴＧＦβＲレベル（例えば平均ＴＧＦβＲ１レベル及び／または平均ＴＧＦβＲ２レベル）を有する。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、個体の中へ非経口（例えば静脈内）投与される。いくつかの実施形態において、個体はヒトである。
いくつかの実施形態において、配列番号２８～３３（例えば配列番号３１～３３、例えば配列番号３３）のうちの任意のものにおいて示される核酸配列を含む核酸を含む有効量の操作された細胞（例えば免疫細胞、例えばＴ細胞）を含む組成物（例えば医薬組成物）を投与することを含む、個体における疾患または病態（例えばがん、固形腫瘍、血液がん、または感染性疾患）を治療する方法が提供される。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、同種異系細胞（例えば同種異系Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、自己由来細胞（例えば自己由来Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、γδＴ細胞である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、機能的外来性受容体（例えばＣＡＲ、例えば操作されたＴＣＲ）またはそれをコードする核酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、配列番号２８～３３のうちの任意のものにおいて示される核酸配列を含む核酸は、機能的外来性受容体（例えばＣＡＲ、例えば操作されたＴＣＲ）をコードする核酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、疾患のある組織は、参照組織（例えば健康な個体中の対応する組織）におけるものよりも、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高いＴＧＦβレベル（例えば平均ＴＧＦβレベル）を有する。いくつかの実施形態において、疾患のある組織は、参照組織（例えば健康な個体中の対応する組織）におけるものよりも、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高いＴＧＦβＲレベル（例えば平均ＴＧＦβＲ１レベル及び／または平均ＴＧＦβＲ２レベル）を有する。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、個体の中へ非経口（例えば静脈内）投与される。いくつかの実施形態において、個体はヒトである。いくつかの実施形態において、疾患のある組織は、参照組織（例えば健康な個体中の対応する組織）におけるものよりも、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高いＴＧＦβレベル（例えば平均ＴＧＦβレベル）を有する。いくつかの実施形態において、疾患のある組織は、参照組織（例えば健康な個体中の対応する組織）におけるものよりも、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高いＴＧＦβＲレベル（例えば平均ＴＧＦβＲ１レベル及び／または平均ＴＧＦβＲ２レベル）を有する。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、個体の中へ非経口（例えば静脈内）投与される。いくつかの実施形態において、個体はヒトである。
いくつかの実施形態において、１）配列番号３３において示される核酸配列と２）腫瘍抗原を認識するＣＡＲをコードする核酸配列（例えば抗ＧＰＣ３ ＣＡＲ、例えば抗ＣＤ２０ ＣＡＲ、例えば配列番号３６または８９のアミノ酸配列を含むＣＡＲ）とを含む核酸を含む有効量の操作された細胞（例えば免疫細胞、例えばＴ細胞）を含む組成物（例えば医薬組成物）を投与することを含む、個体における疾患または病態（例えばがん、固形腫瘍、血液がん、または感染性疾患）を治療する方法が提供される。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、同種異系細胞（例えば同種異系Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、自己由来細胞（例えば自己由来Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、γδＴ細胞である。いくつかの実施形態において、疾患のある組織は、参照組織（例えば健康な個体中の対応する組織）におけるものよりも、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高いＴＧＦβレベル（例えば平均ＴＧＦβレベル）を有する。いくつかの実施形態において、疾患のある組織は、参照組織（例えば健康な個体中の対応する組織）におけるものよりも、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高いＴＧＦβＲレベル（例えば平均ＴＧＦβＲ１レベル及び／または平均ＴＧＦβＲ２レベル）を有する。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、個体の中へ非経口（例えば静脈内）投与される。いくつかの実施形態において、個体はヒトである。いくつかの実施形態において、疾患のある組織は、参照組織（例えば健康な個体中の対応する組織）におけるものよりも、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高いＴＧＦβレベル（例えば平均ＴＧＦβレベル）を有する。いくつかの実施形態において、疾患のある組織は、参照組織（例えば健康な個体中の対応する組織）におけるものよりも、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高いＴＧＦβＲレベル（例えば平均ＴＧＦβＲ１レベル及び／または平均ＴＧＦβＲ２レベル）を有する。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、個体の中へ非経口（例えば静脈内）投与される。いくつかの実施形態において、個体はヒトである。
いくつかの実施形態において、操作された細胞は、個体に対して自己由来である。
いくつかの実施形態において、操作された細胞は、個体に対して同種異系である。
いくつかの実施形態において、個体は、哺乳動物（例えばヒト、非ヒト霊長動物、ラット、マウス、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコなど）である。いくつかの実施形態において、個体はヒトである。いくつかの実施形態において、個体は、臨床患者、臨床試験ボランティア、実験動物などである。いくつかの実施形態において、個体は、約６０歳よりも若い（例えば約５０、４０、３０、２５、２０、１５、または１０歳のうちの任意のものよりも若い、が挙げられる）。いくつかの実施形態において、個体は、約６０歳よりも高齢である（例えば約７０、８０、９０、または１００歳のうちの任意のものよりも高齢である、が挙げられる）。
いくつかの実施形態において、疾患のある組織は、高いレベルの免疫抑制を呈する。いくつかの実施形態において、疾患のある組織は、参照組織（例えば健康な個体中の対応する組織）におけるものよりも、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高いＴＧＦβレベル（例えば平均ＴＧＦβレベル）を有する。いくつかの実施形態において、疾患のある組織は、参照組織（例えば健康な個体中の対応する組織）におけるものよりも、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高いＴＧＦβＲレベル（例えば平均ＴＧＦβＲ１レベル及び／または平均ＴＧＦβＲ２レベル）を有する。いくつかの実施形態において、疾患のある組織は、参照組織（例えば健康な個体中の対応する組織）におけるものよりも、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％高いＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１（例えば平均ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１レベル）を有する。
医薬組成物の投与は、任意の好都合な様式で実行され得、注射、摂取、輸液、植え込み、または移植によるものが挙げられる。組成物は、患者へ、経動脈投与、皮下投与、皮内投与、腫瘍内投与、結節内投与、髄内投与、筋肉内投与、静脈内投与、または腹腔内投与され得る。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、全身投与される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は注入（静脈内注入等）によって個体へ投与される。免疫療法のための注入技法は、当技術分野において公知である（例えばＲｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ Ｍｅｄ．３１９：１６７６（１９８８）を参照）。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、皮内注射または皮下注射によって個体へ投与される。いくつかの実施形態において、組成物は、静脈注射によって投与される。いくつかの実施形態において、組成物は、腫瘍またはリンパ節の中へ直接的に注射される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、腫瘍の部位へ局所的に（腫瘍細胞の中へ、または腫瘍細胞を有する組織へ直接的に等）投与される。
本発明の医薬組成物の投与量及び所望される薬物濃度は、想定される特定の使用に依存して変動し得る。適切な投与量または投与経路の決定は、当業者の技能内で適切である。動物実験は、ヒト治療法のための有効用量の決定について信頼できる指針を提供する。有効用量の異種間のスケール変更は、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ，Ｊ．ａｎｄ Ｃｈａｐｐｅｌｌ，Ｗ．“Ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ Ｓｃａｌｉｎｇ ｉｎ Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，”Ｉｎ Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｙａｃｏｂｉ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８９，ｐｐ．４２－４６によって規定された原理に従って遂行され得る。異なる製剤が異なる治療及び異なる障害に有効であり、特定の器官または組織を治療することが意図される投与が、別の器官または組織とは異なる様式での送達を必要とし得ることは、本出願の範囲内である。
いくつかの実施形態において、医薬組成物が、融合プロチン（ｐｒｏｔｉｎ）を発現する操作された細胞（例えば操作されたＴ細胞）のうちの任意の１つ及び／または本明細書において記載される機能的外来性受容体（例えば抗ＧＰＣ３ ＣＡＲ等の操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ）を含む場合に、医薬組成物は、少なくとも約１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、または１０９細胞／ｋｇ個体体重のうちの任意の投与量で投与される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、約１０４～約１０５、約１０５～約１０６、約１０６～約１０７、約１０７～約１０８、約１０８～約１０９、約１０４～約１０９、約１０４～約１０６、約１０６～約１０８、または約１０５～約１０７細胞／ｋｇ個体体重のうちの任意の投与量で投与される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、少なくとも約１×１０５、２×１０５、３×１０５、４×１０５、５×１０５、６×１０５、７×１０５、８×１０５、９×１０５、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７細胞／ｋｇのうちの任意のものまたはそれ以上の用量で投与される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、約３×１０５～約７×１０６細胞／ｋｇ、または約３×１０６細胞／ｋｇ用量で投与される。
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、単一回で投与される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、複数回（２、３、４、５、６回、またはそれ以上のうちの任意のもの等）で投与される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間１回、１か月に１回、２か月に１回、３か月に１回、４か月に１回、５か月に１回、６か月に１回、７か月に１回、８か月に１回、９か月に１回、または１年に１回投与される。いくつかの実施形態において、投与間の間隔は、約１週間～２週間、２週間～１か月、２週間～２か月、１か月～２か月、１か月～３か月、３か月～６か月、または６か月～１年のうちの任意の１つある。特定の患者に最適な投与量及び治療レジームは、疾患の徴候について患者をモニタリングし、治療を適宜調整することによって、医薬分野の当業者によって容易に決定され得る。
さらに、投与量は、１つもしくは複数の分離投与によって、または継続的注入によって投与され得る。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、分割用量（約２、３、４、５、またはそれ以上の用量のうちの任意の１つ等）で投与される。いくつかの実施形態において、分割用量は、約１週間にわたって投与される。いくつかの実施形態において、用量は、等しく分割される。いくつかの実施形態において、分割用量は、総用量の約２０％、約３０％、及び約５０％である。いくつかの実施形態において、連続した分割用量間の間隔は、約１日間、２日間、３日間、または以上である。数日またはそれ以上にわたる反復投与のために、病態に依存して、疾患症状の所望される抑制が起こるまで、治療は持続的である。しかしながら、他の投与量レジメンは、有用であり得る。この治療法の進捗は、従来の技法及びアッセイによって容易にモニタリングされる。
いくつかの実施形態において、疾患または病態は、がんである。いくつかの実施形態において、疾患または病態は、固形腫瘍である。本明細書において記載される方法によって治療され得るがんの例としては、副腎皮質癌、原発性骨髄線維症、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫（例えば小脳及び脳の）、基底細胞癌、胆管癌（例えば肝外）、膀胱癌、骨癌（骨肉腫及び悪性線維性組織球腫）、脳腫瘍（例えば神経膠腫、脳幹神経膠腫、小脳星細胞腫または大脳星細胞腫（例えば毛様細胞性星状細胞腫、びまん性星状細胞腫、退形成性（悪性腫瘍）星状細胞腫）、悪性神経膠腫、上衣腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、頭蓋咽頭腫、血管芽腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、視神経視床下部神経膠腫、及び神経膠芽腫）、乳癌、気管支腺腫／カルチノイド、カルチノイド腫瘍（例えば消化管カルチノイド腫瘍）、原発不明がん、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、慢性骨髄増殖症候群、子宮内膜癌（例えば子宮癌）、上衣腫、食道癌、ユーイングファミリー腫瘍、眼癌（例えば眼内メラノーマ及び網膜芽腫）、胆嚢癌、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）（胃（ｓｔｏｍａｃｈ））癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍（例えば頭蓋外、性腺外、卵巣）、妊娠性絨毛性腫瘍、頭頸部癌、肝細胞（肝臓）癌（例えば肝癌（ｈｅｐａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）及び肝癌（ｈｅｐａｔｏｍａ））、下咽頭癌、島細胞癌（膵臓内分泌部）、喉頭癌、喉頭癌、口唇・口腔癌（ｉｐ ａｎｄ ｏｒａｌ ｃａｖｉｔｙ ｃａｎｃｅｒ）、口腔癌（ｏｒａｌ ｃａｎｃｅｒ）、肝臓癌、肺癌（例えば小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、及び肺扁平上皮癌）、髄芽腫、黒色腫、中皮腫、転移性扁平上皮性頸部癌、口内癌、多発性内分泌腫瘍症候群、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、鼻・副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽腫、神経内分泌癌、口腔咽頭癌、卵巣癌（例えば上皮性卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍）、膵臓癌、副甲状腺癌、陰茎癌、腹膜癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体芽腫及びテント上原始神経外胚葉性腫瘍、下垂体部腫瘍、胸膜肺芽腫、肺リンパ管筋腫症、直腸癌、腎癌、腎盂・尿管癌（移行上皮癌）、横紋筋肉腫、唾液腺癌、皮膚癌（例えば非黒色腫（例えば扁平上皮細胞癌）、黒色腫、及びメルケル細胞癌）、小腸癌、扁平上皮癌、精巣癌、咽喉癌、甲状腺癌、結節性硬化症、尿道癌、膣癌、外陰癌、ウィルムス腫瘍、母斑症と関連する異常な血管増殖、浮腫（脳腫瘍と関連するもの等）、ならびにメーグス症候群が挙げられるがこれらに限定されない。
いくつかの実施形態において、操作された細胞は、ＴＧＦβへの曝露により、融合タンパク質無しの対応する細胞に比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％減少したＴＧＦβ下流経路シグナリング（例えばＳｍａｄ２のリン酸化）を呈する。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、ＴＧＦβへの曝露により、融合タンパク質無しの対応する細胞に比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％増加したＩＬ－２３Ｒ下流シグナリング（例えばＳｔａｔ３及び／またはＳｔａｔ４のリン酸化）を呈する。
いくつかの実施形態において、操作された細胞は、ＴＧＦβへの曝露により、融合タンパク質無しの対応する細胞に比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％増加した細胞生存率を呈する。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、ＴＧＦβへの曝露（例えばＴＧＦβへの反復曝露または継続的曝露、例えばＴＧＦβへの１００時間、２００時間、または３００時間にわたる曝露）により、融合タンパク質無しの対応する細胞よりも低い（例えば少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％低い）ＰＤ－１発現を呈する。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、ＴＧＦβへの曝露（例えばＴＧＦβへの反復曝露または継続的曝露、例えばＴＧＦβへの１００時間、２００時間、または３００時間にわたる曝露）により、融合タンパク質無しの対応する細胞よりも（例えば少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％）増加した増殖を呈する。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、ＴＧＦβへの曝露（例えばＴＧＦβへの反復曝露または継続的曝露、例えばＴＧＦβへの１００時間、２００時間、または３００時間にわたる曝露）により、融合タンパク質無しの対応する細胞よりも（例えば少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％）増加した細胞傷害性を呈する。
いくつかの実施形態において、操作された細胞は、インビボで良好な抗腫瘍効果を呈する。いくつかの実施形態において、操作された細胞は、ＴＧＦβへの曝露により、融合タンパク質無しの対応する細胞に比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％低減した腫瘍体積を呈する。
いくつかの実施形態において、治療効果は、個体中の客観的臨床応答を引き起こすことを含む。いくつかの実施形態において、厳格な臨床応答（ｓＣＲ）が、個体において得られる。いくつかの実施形態において、治療効果は、個体において疾患の寛解（部分または完全）を引き起こすことを含む。いくつかにおいて、臨床的寛解は、個体が医薬組成物を受けた後の、多くとも約６か月、５か月、４か月、３か月、２か月、１か月、またはそれ以下のうちの任意の１つの後に得られる。いくつかの実施形態において、治療効果は、個体におけるがんの再発または疾患進行を予防することを含む。いくつかの実施形態において、再発または疾患進行は、少なくとも約６か月、１年、２年、３年、４年、５年、またはそれ以上の間予防される。いくつかの実施形態において、治療効果は、個体における長期生存（無病生存率等）を含む。いくつかの実施形態において、治療効果は、個体における生活の質を改善することを含む。いくつかの実施形態において、治療効果は、固形腫瘍またはリンパ性腫瘍の増殖を阻害することまたはサイズを低減することを含む。
いくつかの実施形態において、固形腫瘍またはリンパ性腫瘍のサイズは、少なくとも約１０％（例えば少なくとも約２０％、３０％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のうちの任意のものが挙げられる）低減される。いくつかの実施形態において、個体における固形腫瘍またはリンパ性腫瘍の増殖を阻害するかまたはサイズを低減する方法が提供される。いくつかの実施形態において、治療効果は、個体における腫瘍転移を阻害することを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも約１０％（例えば少なくとも約２０％、３０％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のうちの任意のものが挙げられる）の転移が阻害される。転移は、血液検査、骨スキャン、Ｘ線スキャン、ＣＴスキャン、ＰＥＴスキャン、及び生検によって等の当技術分野において任意の公知の方法によって査定され得る。
いくつかの実施形態において、本発明の操作された細胞組成は、疾患または障害（例えばがん、例えば固形腫瘍）を治療するために、第２の作用物質、第３の作用物質、または第４の作用物質（例えば抗新生物剤、増殖阻害剤、細胞傷害剤、化学療法剤が挙げられる）と併用して投与される。いくつかの実施形態において、本明細書において記載される感染性疾患を治療する方法は、抗感染症剤を個体へ投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、第２の抗感染剤は、操作された細胞と同時に投与される。いくつかの実施形態において、第２の抗感染剤は、操作された細胞の投与に逐次的に（例えばその前にまたはその後に）投与される。
ＶＩＩＩ．キット及び製造物品
融合タンパク質を発現する操作された細胞（例えば操作されたＴ細胞）のうちの任意の１つ及び／または本明細書において記載される機能的外来性受容体（例えば操作されたＴＣＲまたはＣＡＲ、例えば抗ＧＰＣ３ ＣＡＲ、例えば抗ＣＤ２０ ＣＡＲ）を含む、キット、単位投与量、及び製造物品がさらに提供される。いくつかの実施形態において、本明細書において記載される医薬組成物のうちの任意の１つを含有し、好ましくはその使用のための指示書を提供するキットが提供される。
本出願のキットは、好適なパッケージング中にある。好適なパッケージングとしては、バイアル、ボトル、ジャー、柔軟なパッケージング（例えば密封マイラーバッグまたはプラスチックバッグ）、及び同種のものが挙げられるがこれらに限定されない。キットは、任意選択で追加の構成要素（バッファー及び解釈の情報等）を提供し得る。本出願は、したがって製造物品も提供し、バイアル（密封したバイアル等）、ボトル、ジャー、柔軟なパッケージング、及び同種のものを含む。
製造物品は、容器、及び容器上のまたは当該容器に付随するラベルまたはパッケージインサートを含み得る。好適な容器としては、例えばボトル、バイアル、シリンジなどが挙げられる。容器は、様々な材料（ガラスまたはプラスチック等）から形成され得る。概して、容器は、本明細書において記載される疾患または障害（免疫抑制と関連する疾患または病態等）を治療することまたは個体中の疾患のある組織における免疫抑制シグナルを低減することに有効な組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば容器は、皮下注射針によって穿刺可能な栓を有する静注液バッグまたはバイアルであり得る）。ラベルまたはパッケージインサートは、個体における特定の病態の治療のために、組成物が使用されることを示す。ラベルまたはパッケージインサートは、個体へ組成物を投与するための指示書をさらに含むだろう。ラベルは、再構成及び／または使用のための指示書を示し得る。医薬組成物を保持する容器は、再構成製剤の反復投与（例えば２～６回の投与）を可能にする、複数回使用バイアルであり得る。パッケージインサートは、治療製品の商業用パッケージ中に慣習的に含まれる指示書を指し、これは、かかる治療製品の適応症、使用法、投与量、投与、禁忌、及び／または使用に関する警告についての情報を含有する。追加で、製造物品は、薬学的に許容されるバッファー（注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液等）を含む第２の容器をさらに含み得る。それは商業的な立場及びユーザーの立場から所望される他の材料をさらに含んでもよく、他のバッファー、希釈物質、フィルター、針、及びシリンジが挙げられる。キットまたは製造物品は、複数単位用量の医薬組成物及び使用のための指示書を含み、薬局（例えば病院薬局及び調剤薬局）における、保管及び使用のために十分な量でパッケージングされ得る。
本明細書において記載される実施例は、以下の実験が、すべてまたは唯一の遂行された実験であることを表現するようには意図されない。使用される数値（例えば量、温度など）に関して正確性を確実にする取り組みがなされているが、ある程度の実験の誤差及び偏差が考慮されるべきである。別段の指摘のない限り、部は、重量部であり、分子量は、重量平均分子量であり、温度は、摂氏温度であり、圧力は、大気圧であるかまたは大気圧付近である。
実施例１。ＴＧＦβ受容体とＩＬ－２３受容体の融合タンパク質（ＴＧＢ２３）を発現するＴ細胞の生成
例示的なＴＧＦβ受容体とＩＬ－２３受容体の融合タンパク質（今後本明細書においてＴＧＢ２３と命名する）の構造を、図１Ａ及び図１Ｂ中で示す。ＴＧＦβへの曝露後にＴＧＦβ受容体（ＴＧＦβＲ）シグナルを変換してＩＬ－２３受容体（ＩＬ－２３Ｒ）シグナルを誘導するために、ＴＧＦβ受容体１（ＴＧＦβＲ１）及びＴＧＦβ受容体２（ＴＧＦβＲ２）の細胞内ドメインを、それぞれ、ＩＬ－２３Ｒ細胞内ドメインまたはＩＬ－１２Ｒβ１細胞内ドメインにより置き換えた。ＴＧＦβＲ１（配列番号６６）及びＴＧＦβＲ２（配列番号７０）のヒト天然アイソフォームによる野生型ＴＧＦβＲ（ｗｔＴＧＦβＲ）も生成した。
１．ＴＧＢ２３融合タンパク質を含有するレンチウイルス発現ベクターの調製
ＴＧＢ２３融合タンパク質のヌクレオチド配列を、クローニング部位５’－ＥｃｏＲＩ及び３’－ＸｂａＩで、レンチウイルス発現ベクターの中へクローニングした。ｐＭＤＬｇ．ｐＲＲＥ、ｐＲＳＶ－ＲＥＶ、及びｐＭＤ２．Ｇを含有するレンチウイルスパッケージングプラスミド混合物を、ポリエーテルイミドとの前最適化した比で、図１中で示されるＴＧＢ２３コンストラクトを発現するベクターと前混合し、次いで２５℃で５分間インキュベーションした。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を形質導入混合物の中へ添加した。その後に、細胞を、５％のＣＯ２の細胞インキュベーター中で３７℃で一晩でインキュベーションした。４℃及び３０００ｇで１５分間遠心分離された後に上清を収集し、続いて超遠心分離によって濃縮した。上清を廃棄し、ウイルスペレットをＲＰＭＩ １６４０培地によりリンスした。ウイルスを適切に溶解し、－８０℃で保存した。ウイルス力価を、チャイニーズハムスター卵巣細胞株の形質導入を介する力価測定方法によって決定した。
２．Ｔ細胞の精製及び活性化
以下に記載されるように製造者のプロトコルに従って、Ｐａｎ Ｔ ｃｅｌｌ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ番号１３０－０９６－５３５）を使用して、ＰＢＭＣ（ＴＰＣＳ番号Ａ１９Ｋ４７００４７）からヒトＴ細胞を単離した。細胞数を決定し、細胞懸濁物を３００ｇで１０分間遠心分離し、次いで細胞ペレットを４０μＬバッファー中で再懸濁し、合計で１０７細胞を含有していた。１０μＬのＰａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｔｉｎ－Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｃｋｔａｉｌを１０７の全細胞について添加し、完全に混合し、４℃で５分間インキュベーションした。次いで３０μＬのバッファー及び２０μＬのＰａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ ＭｉｃｒｏＢｅａｄ Ｃｏｃｋｔａｉｌを、１０７細胞について添加し、良く混合し、４℃で１０分間インキュベーションした。最低５００μＬは、磁気分離のために必要であった。磁気分離のために、ＬＳカラムを、好適なＭＡＣＳ分離機の磁界中に置いた。カラムを、３ｍＬのバッファーによりリンスすることによって調製した。次いで細胞懸濁物はカラムの上に適用し、非標識細胞を含有するフロースルーを収集し、それは富化されたＴ細胞画分を示していた。次いでカラムを、通過する非標識細胞の収集のために、３ｍＬのバッファーにより洗浄した。これらの非標識細胞を、以前のステップからのフロースルーと合わせた。プールした富化されたＴ細胞を遠心分離し、１０％のＦＢＳ及び２０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ－β１（Ｒ＆Ｄ番号２４０－Ｂ－０１０）を含有するＲＰＭＩ １６４０培地中で再懸濁した。
精製したＴ細胞を、後続して、製造者のプロトコルに従ってＴ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ／Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ番号１３０－０９１－４４１）により４８時間予め活性化し、そこでは、抗ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８ ＭＡＣＳｉＢｅａｄ粒子を、１：２のビーズ対細胞の比で添加した。
３．Ｔ細胞の形質導入及びＴＧＦ－β受容体の検出
予め活性化されたＴ細胞を、２４ウェルプレート中に１×１０６細胞／ｍＬで再懸濁し、次いでＴＧＢ２３コンストラクトを発現するレンチウイルスベクターにより形質導入し（感染多重度＝１０）、一晩インキュベーションした。翌日に、１０％のＦＢＳ及び２０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１を含有する１．５ｍＬのＲＰＭＩ １６４０培地を、形質導入細胞へ添加した。
ＴＧＢ２３コンストラクトの発現を、ＦＡＣＳによって測定した。細胞を、ＴＧＦ－βＲＩＩ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ番号１３０－１１５－０２４）を含有する１００μＬのＤＰＢＳにより再懸濁し、４℃で３０分間インキュベーションした。形質導入されていないＴ細胞（ＵｎＴ）を、陰性対照として使用した。図２中で示されるように、ＴＧＢ２３－１、ＴＧＢ２３－２、ＴＧＢ２３－３、ＴＧＢ２３－４、ＴＧＢ２３－５、ＴＧＢ２３－６、ｗｔＴＧＦβＲ（野生型ＴＧＦβＲ）、ＴＧＢ２３－１４、及びＴＧＢ２３－１５の陽性率は、８．０６％、３．１６％、６．３０％、５．０１％、９．４７％、４６．５％、６．７８％、４．３７％、及び２．７６％であった。結果から、ＴＧＢ２３－６融合タンパク質／コンストラクトは、他のコンストラクトに比較して、最も良好な発現の効力を有することが指摘される。
４．ＴＧＢ２３を発現するＴ細胞の細胞生存率
ＴＧＢ２３を発現する０．５×１０６のＴ細胞を、形質導入後に１０％のＦＢＳ及び２０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１を含有するＲＰＭＩ １６４０培地により培養した。ＴＧＢ２３ Ｔ細胞を再懸濁し、２０μＬの細胞懸濁物をトリパンブルー染色のために採取した。細胞生存率を記録し、細胞数を、形質導入後３日目、４日目、５日目にＴ４（Ｎｅｘｃｅｌｏｍ）細胞カウンターによってカウントした。
ＵｎＴ及びＴＧＢ２３ Ｔ細胞の細胞生存率及び細胞数を、図３Ａ～３Ｂ中で示す。形質導入の５日後に、ＴＧＦβ１の処理により、それぞれＵｎＴ（５１．８％～３３．６％）及びｗｔＴＧＦβＲ Ｔ細胞（５１．８％～３２．４％）の細胞生存率の減少が導かれた。ＴＧＢ２３ Ｔ細胞は、異なる程度でＴＧＦβ１の機能を打ち消す能力を有する。中でも、ＴＧＢ２３－２、ＴＧＢ２３－４、ＴＧＢ２３－５、ＴＧＢ２３－６、及びＴＧＢ２３－１４は、０日目のものよりも５日目で高い生存率を有していた。形質導入及びＴＧＦβ１の存在下における培養の５日後に、Ｔ細胞の増殖も阻害された（図３Ｂ）。ＵｎＴ及びｗｔＴＧＦβＲのＴ細胞の全数はわずかに増加した。ＴＧＢ２３－１４（非機能的ＩＬ－２３Ｒ細胞内ドメインの突然変異を有する、配列番号２６）及びＴＧＢ２３－１５（両方とも非機能的な短縮ＩＬ－２３Ｒ及び短縮ＩＬ－１２Ｒβ１細胞内ドメインを有する、配列番号２７）コンストラクトは、理論的には異なる程度でＴＧＦβ１の機能を打ち消すことができたが、細胞内シグナリングドメインの機能の非存在は、Ｔ細胞増殖への支援をほとんど提供せず、このことは、形質導入の５日後にＵｎＴ及びｗｔＴＧＦβＲのＴ細胞と類似の細胞数から観察された。ＴＧＢ２３－２、ＴＧＢ２３－３、ＴＧＢ２３－４、ＴＧＢ２３－５、及びＴＧＢ２３－６により形質導入されたＴ細胞は、０日目～５日目で４倍を超えて増加した。これらの結果から、これらのＴＧＢ２３ Ｔ細胞がＴＧＦβへ結合し、細胞内ＩＬ２３受容体を介するシグナリングがＴ細胞に増殖促進シグナルを提供したことが示唆される。中でも、ＴＧＢ２３－５、ＴＧＢ２３－６は、ＴＧＦβ１の存在下においてＴ細胞増殖を促進する最も強力な作用を有する。
実施例２。ＴＧＢ－２３融合タンパク質を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞の生成
ＴＧＢ２３コンストラクトが、ＴＧＦβの存在下の標的細胞に対してＣＡＲ－Ｔ細胞利益を提供することを確認するために、ＴＧＢ２３－６融合タンパク質を共発現するＧＰＣ３ ＣＡＲ－Ｔ細胞を産生した。
１．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びＴＧＢ２３－６を含有するレンチウイルス発現ベクターの調製
Ｎ末端からＣ末端の方向へ、ＣＤ８αヒンジドメイン（配列番号４０）、ＣＤ８α膜貫通ドメイン（配列番号４１）、ＣＤ１３７共刺激シグナリングドメイン（配列番号４２）、及びＣＤ３ζ細胞内シグナリングドメイン（配列番号４３）であるポリペプチドを含むＣＡＲ骨格を、化学的に合成し、前修飾レンチウイルスベクター（ｐＬＳＩＮＫ－ＢＢｚＢＢ）の中へインビトロ転写のための構成的ｈＥＦ１αプロモーターの下流でクローニングし、当該プロモーターへ作動可能に連結させた。抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖを発現させるために、ベクター中のマルチクローニング部位（ＭＣＳ）は、抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖ断片のＮ末端へ融合されたＣＤ８αシグナルペプチドをコードする核酸配列（配列番号３９）へ作動可能に連結されたコザック配列（配列番号５９）を含む核酸配列をＣＡＲ骨格ベクターの中へ挿入し、ＣＡＲ骨格配列へ上流で作動可能に連結させることを可能にした。ＣＤ８αシグナルペプチド及び抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖ断片をコードする核酸配列を、化学的に合成し、当技術分野において公知の分子クローニング技法によって、ＥｃｏＲＩ（５’－ＧＡＡＴＴＣ－３’、配列番号４４）及びＳｐｅＩ（５’－ＡＣＴＡＧＴ－３’、配列番号４５）制限部位を介してｐＬＳＩＮＫ－ＢＢｚＢＢ ＣＡＲ骨格の中へクローニングした。ＴＧＢ２３－６タンパク質を共発現させるために、ＴＧＢ２３－６配列も化学的に合成し、クローニング部位のＨｐａＩ（５’－ＧＴＴＡＡＣ－３’、配列番号４６）及びＭｌｕＩ（５’－ＡＣＧＣＧＴ－３’、配列番号４７）で、ＣＤ３ζ細胞内シグナリングドメインのＣ末端へ連結させ、それはペプチド２Ａリンカー（例えばＰ２Ａリンカー、配列番号４８または６０）によって分離される。上で記載される抗ＧＰＣ３ ＣＡＲ（ｈｕＬＩＣ１９３０９ｂ ＣＡＲと命名される）のアミノ酸配列を、配列番号３６として示す。抗ＧＰＣ３ ＣＡＲ及びＴＧＢ２３－６を含む融合ポリペプチド（ｈｕＬＩＣ１９３０９ｂＴ ＣＡＲと命名される）の発現配列を、配列番号３７（アミノ酸配列）及び配列番号３８（核酸配列）として示す。
ｈｕＬＩＣ１９３０９ｂ ＣＡＲ及びｈｕＬＩＣ１９３０９ｂＴ ＣＡＲを発現するレンチウイルス発現ベクターを調製した。ｐＭＤＬｇ．ｐＲＲＥ、ｐＲＳＶ－ＲＥＶ、及びｐＭＤ２．Ｇを含有するレンチウイルスパッケージングプラスミド混合物を、ポリエーテルイミドとの前最適化した比で、ＣＡＲコンストラクトを発現するベクターと前混合し、次いで実施例１中に記載された標準プロトコルに従った。
２．Ｔ細胞の精製及び活性化
製造者のプロトコルに従って、Ｐａｎ Ｔ ｃｅｌｌ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ番号１３０－０９６－５３５）を使用して、ＰＢＭＣ（ＴＰＣＳ番号Ａ１９Ｚ２８４０９７）からヒトＴ細胞を単離した。実施例１を参照されたい。プールした富化されたＴ細胞を得て、３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含有するＴｅｘＭＡＣＳ（商標）ＧＭＰ培地中で再懸濁した。
精製したＴ細胞を、後続して、製造者のプロトコルに従ってＭＡＣＳ ＧＭＰ Ｔ ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔ（登録商標）ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ番号１７０－０７６－１５６）により４８時間予め活性化し、そこでは、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ ＭＡＣＳｉＢｅａｄ粒子を、４０μＬ／１００万のビーズ対細胞の比で添加した。
３．ＣＡＲ－Ｔ調製
予め活性化されたＴ細胞を、２４ウェルプレート中に１×１０６細胞で再懸濁し、次いでＣＡＲ発現レンチウイルスにより一晩形質導入した（感染多重度＝５）。次いで形質導入したＴ細胞を、３００ｇで１０分間遠心分離し、ＲＰＭＩ １６４０培地、１０％のＦＢＳ、及び３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２により培養した。形質導入されていないＴ細胞（ＵｎＴ）を、陰性対照として使用した。
ＧＰＣ３ ＣＡＲ及びＴＧＦβＲＩＩの細胞表面発現をＦＡＣＳによって測定した。ＣＡＲ陽性細胞中のＧＰＣ３ ＣＡＲ及びＴＧＦβＲＩＩのゲートを、それぞれ細胞集団及びＴＧＦβＲＩＩアイソタイプ対照によって境界を定めた。ＣＡＲ－Ｔ細胞またはＵｎＴ細胞を、ＧＰＣ３タンパク質－Ｈｉｓタグ（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ番号ＧＰ３－Ｈ５２Ｈ４）を含有する１００μＬのＤＰＢＳにより再懸濁し、４℃で４０分間インキュベーションした。次いで細胞をＤＰＢＳにより洗浄し、ＦＩＴＣ－抗Ｈｉｓタグ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ番号Ａ０１６２０）及びＰＥ－抗ＴＧＦβＲＩＩ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ番号１３０－１１５－０２４）を含有する１００μＬのＤＰＢＳにより再懸濁し、４℃で３０分間インキュベーションした。図４中で示されるように、ｈｕＬＩＣ１９３０９ｂ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びｈｕＬＩＣ１９３０９ｂＴ ＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＡＲ陽性率は、６６．６９％及び６４．９１％であった。ＵｎＴのＣＡＲ陽性細胞、ｈｕＬＩＣ１９３０９ｂ ＣＡＲ－Ｔ細胞、及びｈｕＬＩＣ１９３０９ｂＴ ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＴＧＦβＲＩＩの発現レベルは、それぞれ０．０７％、２．６１％、及び９２．２０％であった。
実施例３。ＴＧＦβ１により処理したＴＧＢ２３を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞における、ｐＳｍａｄ２、ｐＳｔａｔ３、及びｐＳｔａｔ４の発現レベル
２つのユニットのＴＧＦβＲ１及びＴＧＦβＲ２を含有する四量体複合体へのＴＧＦβ１のライゲーションにより、Ｓｍａｄ２のリン酸化が誘導されて、細胞核への免疫抑制性シグナルを伝播する（ＷＯ２０１８０９４２４４Ａ１）。したがって、リン酸化Ｓｍａｄ２（ｐＳｍａｄ２）の発現を使用して、ＴＧＦβシグナリング経路活性化を問い合わせる。ＩＬ－２３への細胞応答はＳｔａｔ３及びＳｔａｔ４の受容体二量体化及びリン酸化によって開始される。したがって、ｐＳｔａｔ３及びｐＳｔａｔ４発現、はＲｏｂｉｎｓｏｎ ＲＴを参照してＩＬ－２３受容体シグナリング経路活性化を査定するために使用される。ＩＬ１２Ｒβ１：ｔｈｅ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｈａｔ ｗｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｋｎｏｗ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ．２０１５ Ｆｅｂ；７１（２）：３４８－５９。
ＣＡＲ－Ｔ細胞及びＵｎＴ細胞を、２０ｎｇ／ｍＬの組み換えヒトＴＧＦβ１（Ｒ＆Ｄ番号２４０－Ｂ－００２）により４時間処理し、次いで細胞をｐＳｍａｄ２についてＦＡＣＳによって測定した。ＣＡＲ－Ｔ細胞またはＵｎＴ細胞をパラホルムアルデヒドにより固定し、Ｔｗｅｅｎ－２０により１０分間透過処理をした。細胞を、ＧＰＣ３タンパク質Ｈｉｓ－タグ及びｐＳｍａｄ２抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ番号１８３３８）を含有する１００μＬ ＤＰＢＳにより４℃で４０分間再懸濁した。細胞をＤＰＢＳにより洗浄しＰＥ－抗Ｈｉｓタグ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ番号３６２６０３）及び抗ウサギＩｇＧ－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ番号Ａ１１０３４）を含有する１００μＬのＤＰＢＳにより４℃で３０分間再懸濁し、次いでＦＡＣＳによって検出した。図５中で示されるように、２０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１により処理した後に、ＵｎＴまたはｈｕＬＩＣ１９３０９ｂ ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＳｍａｄ２のリン酸化は、ｈｕＬＩＣ１９３０９ｂＴ ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるものに比較して明らかに増加した。ＵｎＴ、ｈｕＬＩＣ１９３０９ｂ ＣＡＲ－Ｔ細胞、及び２０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１により処理したｈｕＬＩＣ１９３０９ｂＴ ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるｐＳｍａｄ２の中央蛍光強度（ＭＦＩ）は、それぞれ４１５６５、３０９７２、及び１８１４２であった。データから、ＴＧＢ２３コンストラクトの発現が、ＣＡＲ－Ｔ細胞をＴＧＦβ免疫抑制性シグナリングへ非感受性にすることが実証される。
２０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１により４時間処理した後に、細胞を、ｐＳｔａｔ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ番号６５１００４）及びｐＳｔａｔ４抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ番号１７－９０４４－４２）を使用して、ＦＡＣＳによって測定した。図６Ａ及び図６Ｂ中で示されるように、ｈｕＬＩＣ１９３０９ｂＴ ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＳｔａｔ３及びＳｔａｔ４のリン酸化は、２０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１により処理した後に、ＵｎＴ及びｈｕＬＩＣ１９３０９ｂ ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるものに比較して明らかに増加した。２０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１により処理されたＵｎＴ、ｈｕＬＩＣ１９３０９ｂ ＣＡＲ－Ｔ細胞、及びｈｕＬＩＣ１９３０９ｂＴ ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるｐＳｔａｔ３のＭＦＩは、それぞれ８５４、８５８、及び１５４３であった（図６Ａ）。２０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１により処理したＵｎＴ、ｈｕＬＩＣ１９３０９ｂ ＣＡＲ－Ｔ細胞、及びｈｕＬＩＣ１９３０９ｂＴ ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるｐＳｔａｔ４のＭＦＩは、それぞれ２６７、２７１、及び３７０であった（図６Ｂ）。データから、変換されたＴＧＦβシグナルは、ＴＧＢ２３コンストラクトを発現するＣＡＲ－Ｔ細胞においてＩＬ－２３受容体シグナリングを誘導できることが確認される。
これらの結果から、抗ＧＰＣ３ ＣＡＲ及びＴＧＢ２３融合タンパク質を発現するｈｕＬＩＣ１９３０９ｂＴ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、Ｓｍａｄ２のリン酸化を阻害し、ＴＧＦβ１の刺激下でＳｔａｔ３及びＳｔａｔ４のリン酸化を促進できることが示され、このことは、ｈｕＬＩＣ１９３０９ｂＴ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、ＴＧＦβシグナリングを細胞内ＩＬ－２３シグナリングに転換し、下流での応答を引き起こすことができることをと指摘する。要約すると、上記の結果から、ＴＧＢ２３－６コンストラクトが、ＣＡＲ－Ｔ細胞においてＴＧＦβ媒介性阻害シグナルをＩＬ２３媒介性増殖促進シグナルへ変換し、このことが、ＴＧＦβの存在下において標的細胞（例えば腫瘍細胞）を殺滅するより高い効力をＣＡＲ－Ｔ細胞に付与することが強く示される。
実施例４。ＴＧＦβ１により処理した後のＴＧＢ２３－６を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞生存率
３５０万個のＣＡＲ陽性細胞を、形質導入の７日後に、ＲＰＭＩ １６４０培地、１０％のＦＢＳ、及び２０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１を含む６ウェルプレート中で培養した。細胞生存率及びＣＡＲ陽性細胞を、２日毎に細胞カウンター及びＦＡＣＳによって検出した。
図７Ａ及び図７Ｂ中で示されるように、ＵｎＴ群及びｈｕＬＩＣ１９３０９ｂ ＣＡＲ－Ｔ群の細胞生存率及びＣＡＲ陽性細胞の数は、ｈｕＬＡｂ１９３０９ｂＴ ＣＡＲ－Ｔ群と比較して有意に減少した。ＵｎＴ、ｈｕＬＩＣ１９３０９ｂ ＣＡＲ－Ｔ細胞、及びｈｕＬＩＣ１９３０９ｂＴ ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞生存率は、１３日目に２３．６％、３６．４％、及び４８．２％であった（図７Ａ）。ｈｕＬＩＣ１９３０９ｂ ＣＡＲ－Ｔ群のＣＡＲ陽性細胞数は下落傾向を示した一方で、ｈｕＬＩＣ１９３０９ｂＴ ＣＡＲ－Ｔ群の細胞数は維持された（図７Ｂ）。これらの結果から、抗ＧＰＣ３ ＣＡＲ及びＴＧＢ２３－６構造を発現するｈｕＬＩＣ１９３０９ｂＴ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、ＴＧＦβ１の存在下においてのみ、抗ＧＰＣ３ ＣＡＲを発現するｈｕＬＩＣ１９３０９ｂ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも良好に生存できることが示唆される。
実施例５。ＴＧＢ－２３を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞における再チャレンジモデル
１．再チャレンジモデルの調製
ＣＡＲ－Ｔ細胞の存続及び疲弊をインビトロで評価するために、ＣＡＲ－Ｔ細胞反復チャレンジモデル（「再チャレンジモデル」）を樹立した。ＣＡＲ－Ｔ細胞をＧＰＣ３陽性腫瘍細胞によって数ラウンドにわたって続けて刺激して、ＣＡＲ－Ｔ細胞の疲弊表現型を獲得した。再チャレンジアッセイにおいて、２つの処理群：ｈｕＬＩＣ１９３０９ｂ ＣＡＲ－Ｔ群（初期ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ｈｕＬＩＣ１９３０９ｂ ＣＡＲ－Ｔ細胞であった）及びｈｕＬＩＣ１９３０９ｂＴ ＣＡＲ－Ｔ群（初期ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ｈｕＬＩＣ１９３０９ｂＴ ＣＡＲ－Ｔ細胞であった）があった。第１ラウンド（ラウンド１）として、ＣＡＲ－Ｔ細胞を、５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１の存在下において、１：１のエフェクター：標的（Ｅ／Ｔ）比で、ＧＰＣ３を発現するＰＬＣＰＲＦ５細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－８０２４）と一晩共培養した。ＣＤ４＋ＣＡＲ＋細胞及びＣＤ８＋ＣＡＲ＋細胞のＰＤ１の発現を、ＦＡＣＳによって検出した。細胞を、３００ｇで１０分間遠心分離した後に新鮮培地（ＲＰＭＩ １６４０培地、１０％のＦＢＳ、５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１、及び３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ２）中で再懸濁し、さらに２日間培養した。細胞の生存率、カウント、ＣＡＲ陽性率、及び殺滅効力を分析した。次いで細胞を、さらに全部で４つのラウンドについて、ラウンド１と同じ処理のために再使用した。ＴＧＦβ１処理無しのＣＡＲ－Ｔ細胞を対照として使用した。ＰＬＣＰＲＦ５の細胞数を、各ラウンドの標的細胞刺激後に、ＣＡＲ－Ｔ細胞の数に応じて各ラウンドで調整した。
２．再チャレンジモデルにおけるＰＤ１の発現
ＰＬＣＰＲＦ５細胞との一晩の共培養後のＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＰＤ１発現を、ＦＡＣＳによって検出した。各刺激ラウンドから収集したＣＡＲ－Ｔ細胞を、ＧＰＣ３タンパク質－Ｈｉｓタグ（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ＃ＧＰ３－Ｈ５２Ｈ４）を含有する１００μＬのＤＰＢＳにより再懸濁し、４℃で４０分間インキュベーションした。次いで細胞をＤＰＢＳにより洗浄し、ＦＩＴＣ－抗Ｈｉｓタグ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ番号Ａ０１６２０）、ＣＤ４抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ番号３５７４１０）、ＣＤ８抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ番号３４４７１０）、及びＰＤ１抗体（Ｍｉｔｅｎｙｉ番号１３０－１１７－６９４）を含有する１００μＬのＤＰＢＳにより再懸濁し、４℃で３０分間インキュベーションした。
ｈｕＬＩＣ１９３０９ｂ ＣＡＲ－Ｔ群のＣＡＲ陽性サブセットにおいて発現されたＰＤ１のレベルは、５つのラウンドの実験の間に、３．９％から７３．７％、７２．１％、６１．１％、及び５８．５％（ＣＤ４＋ＣＡＲ＋ Ｔ細胞）へ、ならびに１．４％から５０．０％、３５．４％、２３．０％、及び２０．４％（ＣＤ８＋ＣＡＲ＋ Ｔ細胞）へ有意に増加した（図８）。これとは対照的に、ｈｕＬＩＣ１９３０９ｂＴ ＣＡＲ－Ｔ群のＣＡＲ陽性サブセットにおけるＰＤ１発現は、ラウンド５で、２７．５％（ＣＤ４＋ＣＡＲ＋ Ｔ細胞）へ増加し、で１０．７％（ＣＤ８＋ＣＡＲ＋ Ｔ細胞）へ増加した（図８Ａ及び８Ｂ）。ｈｕＬＩＣ１９３０９ｂＴ ＣＡＲ－Ｔ細胞のＰＤ１発現は、再チャレンジモデルにおいてｈｕＬＩＣ１９３０９ｂ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも低く、ＴＧＢ２３を形質導入しないＣＡＲ－Ｔ細胞に比較して、ＴＧＢ２３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の疲弊がより少ないことを指摘する。
３．再チャレンジモードにおけるＣＡＲ陽性Ｔ細胞のパーセンテージ
ＰＬＣＰＲＦ５細胞との共培養後のＣＡＲ陽性Ｔ細胞のパーセンテージを、各刺激ラウンドの終了時にＦＡＣＳによって検出した。結果を図９Ａ及び９Ｂ中で示す。５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１の存在下において、ｈｕＬＩＣ１９３０９ｂ ＣＡＲ－Ｔ群のＣＡＲ陽性Ｔ細胞のパーセンテージは、再チャレンジモデルアッセイの間に２１．６％から３６．８％へ増加した。比較において、ｈｕＬＩＣ１９３０９ｂＴ ＣＡＲ－Ｔ群のＣＡＲ陽性Ｔ細胞のパーセンテージは、２５．９％から９９．３％へ増加した。ＴＧＦβ１の非存在下において、ＣＡＲ陽性Ｔ細胞のパーセンテージは、２つの群間でほとんど同様に増加し、具体的には、それぞれ２１．６％から９０．７％（ｈｕＬＩＣ１９３０９ｂ ＣＡＲ－Ｔ群）及び２５．９％から９９．８％（ｈｕＬＩＣ１９３０９ｂＴ ＣＡＲ－Ｔ群）である。これらの結果から、ＴＧＦβが標的細胞を殺滅するＣＡＲ－Ｔの増殖性効力を妨げる一方で、ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＴＧＢ２３－６コンストラクトの共発現は、ＣＡＲ－Ｔ細胞がＴＧＦβの阻害機能を克服し、標的細胞を殺滅しながらＣＡＲ－Ｔの増殖を促進することを支援したことが指摘される。
ＰＬＣＰＲＦ５細胞との共培養後のＣＡＲ－Ｔ細胞のカウントを、各のラウンドの終了にトリパンブルー染色によりＴ４細胞カウンターによって検出した。２０μＬの細胞懸濁物を２０μＬトリパンブルーと混合し、使い捨ての血球計算板の中へピペットで移し、Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ Ｔ４によって分析した。ＣＡＲ－Ｔ細胞の増幅倍率を、Ｔ細胞の全数及びＣＡＲ陽性細胞のパーセンテージに従って計算した。
図９Ｃおよび図９Ｄ中で示されるように、ｈｕＬＩＣ１９３０９ｂ ＣＡＲ－Ｔ細胞の増幅倍率は、５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１の存在下において１から５．８倍へ及びＴＧＦβ１の非存在下において１から２３倍へ増加した。これとは反対に、ｈｕＬＩＣ１９３０９ｂＴ ＣＡＲ－Ｔ細胞の増幅倍率は、５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１の存在下において１から１１７７倍へ及びＴＧＦβ１の非存在下において１から５８６倍へ増加した。これらの結果から、ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＴＧＢ２３－６の共発現は、ＴＧＦβ阻害性効果を克服しただけでなく、ＴＧＦβ及び抗原の連続的な刺激の存在下においてＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖をもさらに促進したことが指摘される。
４．再チャレンジモデルにおける細胞傷害性アッセイ
ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害性を、ＣＡＲ－Ｔ再チャレンジアッセイにおける各ラウンドの終了時に、１：１の全Ｔ細胞：標的細胞比で、Ｏｎｅ－ｇｌｏ発光ルシフェラーゼアッセイによって査定した。ＧＰＣ３陽性ヒト肝細胞癌（ＨＣＣ）細胞株Ｈｅｐ３Ｂ２．１－７．Ｌｕｃ（ＡＴＣＣ番号ＨＢ－８０６４）及びＰＬＣＰＲＦ５－Ｌｕｃ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－８０２４）を、標的細胞として使用した。標的細胞（２×１０３／各ウェル）を３８４ウェルプレート中に播種し、次いで各ラウンドの終了時に収集した細胞と示されたＥ／Ｔ比で２４時間インキュベーションした。次いでＯｎｅ－ｇｌｏ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ番号Ｅ６１１０）を、各々のウェルへ添加し、残存する発光を、マイクロプレートリーダーにより検出した。ルシフェラーゼが腫瘍細胞においてのみ発現されるので、残存する発光は、ウェル中の生存可能な標的細胞の数に直接的に相関する。最大及び最小のルシフェラーゼ活性を、それぞれＵｎＴ細胞及び培地の添加によって得た。特異的細胞傷害性を、式：特異的細胞傷害性％＝１００％×（１－（ＲＬＵサンプル－ＲＬＵ最小）／（ＲＬＵ最大－ＲＬＵ最小））によって計算した。
図１０Ａ中で示されるように、再チャレンジモデルにおいてＴＧＦβ１無しで処理したｈｕＬＩＣ１９３０９ｂ ＣＡＲ－Ｔ群は、１：１比でＰＬＣＰＲＦ５－Ｌｕｃに対する細胞傷害性の減少を示した（８８．１％±２．４％から６０．４％±３．１％へ）が、５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１の存在下において、細胞傷害性効力はさらに減少した（５６．６％±３．３％から４１．５％±２．６％へ）。比較において、ＰＬＣＰＲＦ５．Ｌｕｃ細胞に対するｈｕＬＩＣ１９３０９ｂＴ ＣＡＲ－Ｔ群の細胞傷害性は、ＴＧＦβ１にかかわらず、実験の間に８０％を越えた。ｈｕＬＩＣ１９３０９ｂＴ ＣＡＲ－Ｔ群は、ラウンド１からラウンド５で、ＰＬＣＰＲＦ５．Ｌｕｃ細胞に対してより高い細胞傷害性（ＴＧＦβ１無しで９２．８％±０．５％から９４．０％±０．７％及びＴＧＦβ１有りで９１．２％±２．１％から９９．４％±１．２％）も示した。類似の傾向は、別の標的細胞（Ｈｅｐ３Ｂ２．１－７－Ｌｕｃ細胞、図１０Ｂ）を使用して繰り返された。これらの結果から、ＴＧＢ２３－６コンストラクトを共発現するＣＡＲ－Ｔ細胞（ｈｕＬＩＣ１９３０９ｂＴ）が、ＴＧＦβ１の媒介性阻害性シグナリングに対する耐性だけでなく、刺激誘導性老化に対する良好な存続も得たことが示される。
実施例６。ＴＧＢ２３－６を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞におけるリアルタイム細胞分析（ＲＴＣＡ）アッセイ
Ｈｅｐ３Ｂ２．１－７細胞と共培養したＣＡＲ－Ｔ細胞におけるリアルタイム細胞傷害性効力を、ＲＴＣＡアッセイによって測定した。Ｈｅｐ３Ｂ２．１－７細胞（４×１０３／各ウェル）を９６ウェルプレート中に播種し、ＲＴＣＡ分析器によって一晩検出した。次いで標的細胞を１：２０のＥ／Ｔ比でＣＡＲ－ＴまたはＵｎＴの細胞によりインキュベーションし、その間に、Ｔ細胞の細胞傷害性効力をリアルタイムで検出した。細胞指数は、標的細胞の活性、接着性、及び数を示す。
図１１中で示されるように、ＵｎＴ細胞と共培養したＨｅｐ３Ｂ２．１－７細胞の細胞指数は、時間の経過と共に有意に増加し、実験の終了時に細胞指数は１３．８であった。ＣＡＲ－Ｔ細胞（ｈｕＬＩＣ１９３０９ｂ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びｈｕＬＩＣ１９３０９ｂＴ ＣＡＲ－Ｔ細胞）は、時間の延長にともなって異なる程度でＨｅｐ３Ｂ２．１－７細胞に対して細胞傷害性を示した。ｈｕＬＩＣ１９３０９ｂ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びｈｕＬＩＣ１９３０９ｂＴ ＣＡＲ－Ｔ細胞と共培養したＨｅｐ３Ｂ２．１－７細胞の細胞指数は、終了時にそれぞれ８．３及び２．１であった。これらの結果から、ＴＧＢ２３－６コンストラクトを共発現するｈｕＬＩＣ１９３０９ｂＴ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、特に後の共培養ステージの間に、ＣＡＲ単独を発現するものよりも、Ｈｅｐ３Ｂ２．１－７細胞増殖を効率的に阻害したことが示唆される。結果から、ＴＧＢ２３－６と共に形質導入されたＣＡＲ－Ｔ細胞が、標的細胞に対して持続する細胞傷害性を呈したことが実証される。
実施例７。ＴＧＢ－２３を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞のインビボの抗腫瘍効果
ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビボの抗腫瘍有効性を、ＮＣＧマウス異種移植片モデルにおいて評価した。皮下異種移植片モデルのために、６～７週齢のＮＣＧマウスに、右側下背中にＨｅｐ３Ｂ２．１－７細胞を皮下接種した（３．７×１０６細胞／マウス）。平均腫瘍体積が１５０ｍｍ３へ接近した時に（異種移植片接種後６日目）、マウスを５つの群へ無作為化し、ｈｕＬＩＣ１９３０９ｂ ＣＡＲ－Ｔ細胞（０．３Ｍまたは０．８Ｍ細胞／マウス）、ｈｕＬＩＣ１９３０９ｂＴ ＣＡＲ－Ｔ細胞（０．３Ｍまたは０．８Ｍ細胞／マウス）及びＵｎＴ細胞（０．８Ｍ細胞／マウス）を尾静脈注射によってそれぞれ処理した。腫瘍サイズを、デジタルキャリパーにより１週間あたり２回測定した。腫瘍体積が２０００ｍｍ３超に達成した場合に、マウスを早く屠殺する。腫瘍体積を、以下の式：
Figure 2024514556000001
に従って計算した。マウス血液中のＴ細胞の増幅も、養子移入後７、１４、２１、及び２８日目にＦＡＣＳによってそれぞれ検出した。
図１２Ａ中で示されるように、これらのマウスの体重を１週間あたり２回測定し、この実験の間に、０．３Ｍの投与量または０．８Ｍの投与量も、マウスの体重減少はＵｎＴ群以外のすべての群において観察されなかった。ＵｎＴ群における体重は、多量の腫瘍量に起因して、３４日目に１２．２％減少した（３４日目で１８．０ｇ ｖｓ ０日目で２０．５ｇ）。
図１２Ｂ中で示されるように、３０万（０．３ ｍｉｌｌｉｏｎ）（Ｍ）／マウスの投与量で、ＵｎＴ群へ比較して、ｈｕＬＡｂ１９３０９ｂ ＣＡＲ－Ｔ群は、腫瘍サイズの２７％の腫瘍低減（９１１．４ｍｍ３ ｖｓ １２４８．５ｍｍ３）を示した一方で、ｈｕＬＡｂ１９３０９ｂＴ ＣＡＲ－Ｔ細胞を投与したマウスは、１９日目に腫瘍サイズの約９７％の低減（２９．０ｍｍ３ ｖｓ １２４８．５ｍｍ３）を呈した。１９日目の後に、ｈｕＬＩＣ１９３０９ｂＴ ＣＡＲ－Ｔ細胞により処理したマウスはほとんど腫瘍が無く、このことから、より低い投与量（０．３Ｍ／マウス）でｈｕＬＩＣ１９３０９ｂＴ ＣＡＲ－Ｔ細胞がｈｕＬＩＣ１９３０９ｂ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも良好な治療能力を有することが示唆された。投与量を０．８Ｍ／マウスへ増加した場合に、ｈｕＬＩＣ１９３０９ｂＴ ＣＡＲ－Ｔ細胞を投与したマウスは、１５日目にＵｎＴと比較して、８１．４％の増殖阻害率（１５６．６ｍｍ３ ｖｓ ８４３．８ｍｍ３）で腫瘍増殖に対する明らかな阻害効果を呈し、類似の腫瘍退縮が、ｈｕＬＩＣ１９３０９ｂ ＣＡＲ－Ｔ細胞処理群において観察された（２４４．１ｍｍ３ ｖｓ ８４３．８ｍｍ３）。ｈｕＬＩＣ１９３０９ｂＴ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びｈｕＬＩＣ１９３０９ｂ ＣＡＲ－Ｔ細胞により処理したマウスは、それぞれ１９日目及び２２日目にほとんど腫瘍が無かった。
マウス血液中のＴ細胞の増幅も、養子移入後７、１４、２１、及び２８日目にＦＡＣＳによって検出した。マウス血液を５００ｇで１０分間遠心分離して血漿及び血液細胞を分離し、次いで血液細胞を赤血球溶解バッファーにより１０分間インキュベーションした。溶解後に、細胞をＤＰＢＳにより洗浄し、ＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ番号３００３１６）により染色した。図１２Ｃ中で示されるように、ｈｕＬＩＣ１９３０９ｂＴ ＣＡＲ－Ｔ細胞群におけるマウスのＴ細胞は、０．３Ｍの投与量で１４日目に有意な増殖を呈し（５７．４％のＣＤ３陽性細胞）、後続して低減した一方で、ｈｕＬＩＣ１９３０９ｂ ＣＡＲ－Ｔ細胞（８．１％のＣＤ３陽性細胞）及びＵｎＴ（５．１％のＣＤ３陽性細胞）により処理されたマウスにおいて１４日目に明らかな増殖はなかった。加えて、ｈｕＬＩＣ１９３０９ｂ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びｈｕＬＩＣ１９３０９ｂＴ ＣＡＲ－Ｔ細胞は０．８Ｍの投与量で類似の抗腫瘍効力を示したが、ｈｕＬＩＣ１９３０９ｂＴ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、１４日目にｈｕＬＩＣ１９３０９ｂ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも良好な増殖を呈した（８５．５％のＣＤ３陽性細胞 ｖｓ ２９．７％のＣＤ３陽性細胞）。
実施例８。ＴＧＢ２３を発現するＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ Ｔ細胞の生成
１．ＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ及びＴＧＢ２３－６発現ベクターの構築
Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入したｐＬＶＸ－Ｐｕｒｏベクターを、ＣｌａＩ制限酵素及びＥｃｏＲＩ制限酵素により消化し、元のＣＭＶプロモーターをヒトＥＦ１αプロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｊ０４６１７．１）により置き換えて、ｐＬＶＸ―ｈＥＦ１αベクターを得た。ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／１１２１８１号及び同第ＰＣＴ／ＣＮ２０２０／１１２１８２号中で開示されるＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ（ＳＩＶ Ｎｅｆ＿Ｍ１１６－ＩＲＥＳ－ＣＤ８α ＳＰ－ＣＤ２０ ｓｃＦｖ（Ｌｅｕ１６）－ＣＤ８α ヒンジ－ＣＤ８α ＴＭ－４－１ＢＢ－ＩＴＡＭ０１０、配列番号９０）の遺伝子を、ｐＬＶＸ―ｈＥＦ１αの中へクローニングして、Ｍ１４３９と命名される組み換えＣＤ２０ ＣＡＲ（配列番号８９）発現プラスミドを形成した。ＴＧＢ２３－６の遺伝子を、ｐＬＶＸ―ｈＥＦ１αの中へクローニングして、Ｍ１６４７と命名される組み換えＴＧＢ２３－６発現プラスミドを形成した。組み換え発現ベクターＭ１４３９及びＭ１６４７を、特定の割合でｐｓＰＡＸ２及びｐＭＤ２．Ｇヘルパープラスミドと個別に混合し、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞の中へコトランスフェクションした。トランスフェクションの６０時間後に、ウイルスベクターを含有する細胞培養上清を収集し、４℃及び３０００ｇで５分間遠心分離した。上清を０．４５μｍフィルターを介して濾過した後に、５００ＫＤ中空糸膜カラム接線流技法をさらに濃縮するために使用して、レンチウイルス濃縮物を調製し、これを後の使用のために－８０℃で保存した。
２．ＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ Ｔ細胞及びＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ＋ＴＧＢ２３－６ Ｔ細胞の調製
Ｔリンパ球を、Ｐａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して、ＴＰＣＳ社から購入した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から精製した。精製したＴ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８磁気ビーズによって活性化し、次いで３７℃、５％のＣＯ２インキュベーター中で２４時間培養した。後続して、Ｔ細胞に上で記載されたウイルスベクターを形質導入して、ＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ Ｔ細胞（Ｍ１４３９ベクターを形質導入した）、またはＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ＋ＴＧＢ２３－６ Ｔ細胞（Ｍ１４３９ベクター及びＭ１６４７ベクターを形質導入した）を産生した。数日の増殖後に、ＴＣＲαβ陰性ＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ Ｔ細胞及びＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ＋ＴＧＢ２３－６ Ｔ細胞を、ＴＣＲαβ ｓｏｒｔｉｎｇ ｋｉｔ（ＴＣＲα／β－Ｂｉｏｔｉｎ、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ、６１９０２２１００４；Ａｎｔｉ－Ｂｉｏｔｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ、６１９０３１２０１０）を使用して、富化した。最終産物からの各々の５×１０５細胞懸濁物を吸引し、室温で遠心分離して上清を廃棄し、次いでＤＰＢＳ中で再懸濁した。１μＬの抗ヒトＣＤ５－ＰＥ－ＣＹ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３６４００８）、１μＬのＡｌｅｘ Ｆｌｕｏｒ ４８８抗ＣＡＲ（ＬＵＣＡＲ）－２０Ｓ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔによって産生されたＣＤ２０ ＣＡＲに対する抗体、注文番号ＬＧＢＵＡＤＡｂ－１）、１μＬのＡＰＣ抗ヒトＴＣＲα／β抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号：Ｂ２５９８３９）、及び１μＬのＰＥ抗ヒトＴＧＦ－βＲＩＩ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号：１３０１１５０２４）を、細胞へ添加し、４℃で３０分間インキュベーションした。細胞を１ｍＬのＤＰＢＳにより２回再懸濁し、室温で遠心分離して上清を廃棄し、最終的に細胞をフローサイトメトリーのためにＤＰＢＳ中で再懸濁して、ＣＤ２０ ＣＡＲ、ＴＣＲαβ、及びＴＧＢ２３－６の陽性率を検出した。
図１３Ａ～１３Ｃ中で示されるように、選別及び富化後のＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ Ｔ細胞及びＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ＋ＴＧＢ２３－６ Ｔ細胞のＴＣＲαβ陰性比は、それぞれ９６．８１％及び９７．３７％である。ＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ Ｔ細胞のＴＣＲαβ陰性及びＣＤ２０ ＣＡＲ陽性の両方の比は９７．６１％であり、ＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ＋ＴＧＢ２３－６ Ｔ細胞の当該比は９８．２５％であった。ＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ Ｔ細胞のＴＣＲαβ陰性及びＴＧＢ２３－６陽性の両方の比は１．５４％であり、ＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ＋ＴＧＢ２３－６ Ｔ細胞の当該比は７２．２９％であり、ＴＧＢ２３－６の発現の成功を示した。形質導入されていないＴ細胞（ＵｎＴ）を、陰性対照として使用した。
実施例９。ＴＧＢ２３を発現するＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ Ｔ細胞の特異的殺滅活性
ＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ Ｔ細胞及びＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ＋ＴＧＢ２３－６ Ｔ細胞の、ＣＤ２０陽性細胞（リンパ腫細胞Ｒａｊｉ）への特異的殺滅能力を、さらに研究する。ＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ Ｔ細胞及びＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ＋ＴＧＢ２３－６ Ｔ細胞を、２０：１、１０：１、または５：１のエフェクター－標的比で、Ｒａｊｉ細胞と、Ｃｏｒｎｉｎｇ ３８４ウェルプレート中で個別に混合し、１２時間～１８時間インキュベーションした。２５μＬのＯｎｅ－Ｇｌｏ ｒｅａｇｅｎｔ（ＴＡＫＡＲＡ、カタログ番号Ｂ６１２０）を、各々のウェルへ添加し、次いでルシフェラーゼの蛍光値を、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ、ｓｐａｒｋ １０Ｍ）によって検出した。各々の群における標的細胞に対するＴリンパ球の細胞傷害性効果を、式：殺滅効率＝１－［（検出サンプル値－最小値）／最大値］によって計算した。
図１４中で示されるように、２０：１、１０：１、及び５：１のエフェクター－標的の比で、ＵｎＴ細胞と比較して、ＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ Ｔ細胞及びＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ＋ＴＧＢ２３－６ Ｔ細胞は、標的細胞Ｒａｊｉを効果的に殺滅することができた（Ｐ＜０．０５）。ＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ Ｔ群とＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ＋ＴＧＢ２３－６Ｔ群との間の細胞傷害性における有意差は無く（Ｐ＞０．０５）、ＴＧＢ２３－６用量が、ＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓの標的細胞への特異性にインビトロで影響しないことを示唆する。
実施例１０。標的細胞刺激の複数ラウンド後のＴＧＢ２３を発現するＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ Ｔ細胞の増殖
上で言及されるように、ＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ Ｔ細胞及びＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ＋ＴＧＢ２３－６ Ｔ細胞を産生した。Ｒａｊｉの細胞密度を１×１０６細胞／ｍＬへ調整した。Ｒａｊｉ細胞を２０μｇ／ｍＬのマイトマイシンにより３７℃で３時間処理し、１０ｍＬのＤＰＢＳにより３回洗浄し、培養培地中で再懸濁した。処理したＲａｊｉ細胞を、１：１の比でＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ Ｔ細胞またはＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ＋ＴＧＢ２３－６ Ｔ細胞と混合し共培養した。ＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ Ｔ細胞及びＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ＋ＴＧＢ２３－６ Ｔ細胞を、第１の刺激後の４日目及び７日目に、１：１のＥ／Ｔ比でＲａｊｉにより反復して刺激した。細胞を、０日目、４日目、７日目、及び１１日目で収集した。細胞数をＫ２自動化細胞カウンターのカウントによりカウントし、ＣＤ５の発現をフローサイトメトリーによって検出した。Ｔリンパ球カウントを全細胞数にＣＤ５の陽性率を掛けることを介して計算し、０日目に基づいてＣＤ５＋細胞数の変化倍率による増殖曲線を描いた。
図１５中で示されるように、Ｒａｊｉ細胞の刺激の３ラウンド後に、ＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ Ｔ細胞はインビトロで約１２倍増殖した一方で、ＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ＋ＴＧＢ２３－６ Ｔ細胞は約５６倍増殖した。ＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ＋ＴＧＢ２３－６ Ｔ細胞は、ＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ Ｔ細胞より４倍以上増幅し（Ｐ＜０．０５）、ＴＧＢ２３－６がＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ Ｔ細胞の増殖能力をインビトロで有意に改善できることを示唆した。
配列一覧
配列番号１。ＴＧＦβＲ１のシグナルペプチド
ＭＥＡＡＶＡＡＰＲＰＲＬＬＬＬＶＬＡＡＡＡＡＡＡＡＡＬＬＰＧＡＴＡ
配列番号２。ＴＧＦβＲ２のシグナルペプチド
ＭＧＲＧＬＬＲＧＬＷＰＬＨＩＶＬＷＴＲＩＡＳ
配列番号３。ＴＧＦβＲ１の細胞外ドメイン
ＬＱＣＦＣＨＬＣＴＫＤＮＦＴＣＶＴＤＧＬＣＦＶＳＶＴＥＴＴＤＫＶＩＨＮＳＭＣＩＡＥＩＤＬＩＰＲＤＲＰＦＶＣＡＰＳＳＫＴＧＳＶＴＴＴＹＣＣＮＱＤＨＣＮＫＩＥＬＰＴＴＶＫＳＳＰＧＬＧＰＶＥＬ
配列番号４。ＴＧＦβＲ２の細胞外ドメイン
ＴＩＰＰＨＶＱＫＳＶＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤＬＬＬＶＩＦＱ
配列番号５。ＴＧＦβＲ１の膜貫通ドメイン
ＡＡＶＩＡＧＰＶＣＦＶＣＩＳＬＭＬＭＶＹＩ
配列番号６。ＴＧＦβＲ２の膜貫通ドメイン
ＶＴＧＩＳＬＬＰＰＬＧＶＡＩＳＶＩＩＩＦＹ
配列番号７。ＩＬ－２３Ｒの膜貫通ドメイン
ＬＬＬＧＭＩＶＦＡＶＭＬＳＩＬＳＬＩＧＩＦ
配列番号８。ＩＬ－１２Ｒβ１の膜貫通ドメイン
ＷＬＩＦＦＡＳＬＧＳＦＬＳＩＬＬＶＧＶＬＧＹＬＧＬ
配列番号９。膜付近のＴＧＦβＲ１細胞内ドメインの配列
ＣＨＮＲＴＶ
配列番号１０。膜付近のＴＧＦβＲ２細胞内ドメインの配列
ＣＹＲＶＮＲＱ
配列番号１１。膜付近のＩＬ－２３Ｒ細胞外ドメインの配列
ＶＰＱＶＴＳＫＡＦＱＨＤＴＷＮＳＧＬＴＶＡＳＩＳＴＧＨＬＴＳＤＮＲＧＤＩＧ
配列番号１２。膜付近のＩＬ－１２Ｒβ１細胞外ドメインの配列
ＶＳＤ
配列番号１３。ＴＧＦβＲ１の細胞内ドメイン
ＣＨＮＲＴＶＩＨＨＲＶＰＮＥＥＤＰＳＬＤＲＰＦＩＳＥＧＴＴＬＫＤＬＩＹＤＭＴＴＳＧＳＧＳＧＬＰＬＬＶＱＲＴＩＡＲＴＩＶＬＱＥＳＩＧＫＧＲＦＧＥＶＷＲＧＫＷＲＧＥＥＶＡＶＫＩＦＳＳＲＥＥＲＳＷＦＲＥＡＥＩＹＱＴＶＭＬＲＨＥＮＩＬＧＦＩＡＡＤＮＫＤＮＧＴＷＴＱＬＷＬＶＳＤＹＨＥＨＧＳＬＦＤＹＬＮＲＹＴＶＴＶＥＧＭＩＫＬＡＬＳＴＡＳＧＬＡＨＬＨＭＥＩＶＧＴＱＧＫＰＡＩＡＨＲＤＬＫＳＫＮＩＬＶＫＫＮＧＴＣＣＩＡＤＬＧＬＡＶＲＨＤＳＡＴＤＴＩＤＩＡＰＮＨＲＶＧＴＫＲＹＭＡＰＥＶＬＤＤＳＩＮＭＫＨＦＥＳＦＫＲＡＤＩＹＡＭＧＬＶＦＷＥＩＡＲＲＣＳＩＧＧＩＨＥＤＹＱＬＰＹＹＤＬＶＰＳＤＰＳＶＥＥＭＲＫＶＶＣＥＱＫＬＲＰＮＩＰＮＲＷＱＳＣＥＡＬＲＶＭＡＫＩＭＲＥＣＷＹＡＮＧＡＡＲＬＴＡＬＲＩＫＫＴＬＳＱＬＳＱＱＥＧＩＫＭ
配列番号１４。ＴＧＦβＲ２の細胞内ドメイン
ＣＹＲＶＮＲＱＱＫＬＳＳＴＷＥＴＧＫＴＲＫＬＭＥＦＳＥＨＣＡＩＩＬＥＤＤＲＳＤＩＳＳＴＣＡＮＮＩＮＨＮＴＥＬＬＰＩＥＬＤＴＬＶＧＫＧＲＦＡＥＶＹＫＡＫＬＫＱＮＴＳＥＱＦＥＴＶＡＶＫＩＦＰＹＥＥＹＡＳＷＫＴＥＫＤＩＦＳＤＩＮＬＫＨＥＮＩＬＱＦＬＴＡＥＥＲＫＴＥＬＧＫＱＹＷＬＩＴＡＦＨＡＫＧＮＬＱＥＹＬＴＲＨＶＩＳＷＥＤＬＲＫＬＧＳＳＬＡＲＧＩＡＨＬＨＳＤＨＴＰＣＧＲＰＫＭＰＩＶＨＲＤＬＫＳＳＮＩＬＶＫＮＤＬＴＣＣＬＣＤＦＧＬＳＬＲＬＤＰＴＬＳＶＤＤＬＡＮＳＧＱＶＧＴＡＲＹＭＡＰＥＶＬＥＳＲＭＮＬＥＮＶＥＳＦＫＱＴＤＶＹＳＭＡＬＶＬＷＥＭＴＳＲＣＮＡＶＧＥＶＫＤＹＥＰＰＦＧＳＫＶＲＥＨＰＣＶＥＳＭＫＤＮＶＬＲＤＲＧＲＰＥＩＰＳＦＷＬＮＨＱＧＩＱＭＶＣＥＴＬＴＥＣＷＤＨＤＰＥＡＲＬＴＡＱＣＶＡＥＲＦＳＥＬＥＨＬＤＲＬＳＧＲＳＣＳＥＥＫＩＰＥＤＧＳＬＮＴＴＫ
配列番号１５。ＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメイン
ＮＲＳＦＲＴＧＩＫＲＲＩＬＬＬＩＰＫＷＬＹＥＤＩＰＮＭＫＮＳＮＶＶＫＭＬＱＥＮＳＥＬＭＮＮＮＳＳＥＱＶＬＹＶＤＰＭＩＴＥＩＫＥＩＦＩＰＥＨＫＰＴＤＹＫＫＥＮＴＧＰＬＥＴＲＤＹＰＱＮＳＬＦＤＮＴＴＶＶＹＩＰＤＬＮＴＧＹＫＰＱＩＳＮＦＬＰＥＧＳＨＬＳＮＮＮＥＩＴＳＬＴＬＫＰＰＶＤＳＬＤＳＧＮＮＰＲＬＱＫＨＰＮＦＡＦＳＶＳＳＶＮＳＬＳＮＴＩＦＬＧＥＬＳＬＩＬＮＱＧＥＣＳＳＰＤＩＱＮＳＶＥＥＥＴＴＭＬＬＥＮＤＳＰＳＥＴＩＰＥＱＴＬＬＰＤＥＦＶＳＣＬＧＩＶＮＥＥＬＰＳＩＮＴＹＦＰＱＮＩＬＥＳＨＦＮＲＩＳＬＬＥＫ
配列番号１６。ＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメイン
ＮＲＡＡＲＨＬＣＰＰＬＰＴＰＣＡＳＳＡＩＥＦＰＧＧＫＥＴＷＱＷＩＮＰＶＤＦＱＥＥＡＳＬＱＥＡＬＶＶＥＭＳＷＤＫＧＥＲＴＥＰＬＥＫＴＥＬＰＥＧＡＰＥＬＡＬＤＴＥＬＳＬＥＤＧＤＲＣＫＡＫＭ
配列番号１７。ＩＬ－２３Ｒ細胞内ドメインの突然変異体
ＮＲＳＦＲＴＧＩＫＲＲＩＬＬＬＩＰＫＷＬＦＥＤＩＰＮＭＫＮＳＮＶＶＫＭＬＱＥＮＳＥＬＭＮＮＮＳＳＥＱＶＬＦＶＤＰＭＩＴＥＩＫＥＩＦＩＰＥＨＫＰＴＤＦＫＫＥＮＴＧＰＬＥＴＲＤＦＰＱＮＳＬＦＤＮＴＴＶＶＦＩＰＤＬＮＴＧＦＫＰＱＩＳＮＦＬＰＥＧＳＨＬＳＮＮＮＥＩＴＳＬＴＬＫＰＰＶＤＳＬＤＳＧＮＮＰＲＬＱＫＨＰＮＦＡＦＳＶＳＳＶＮＳＬＳＮＴＩＦＬＧＥＬＳＬＩＬＮＱＧＥＣＳＳＰＤＩＱＮＳＶＥＥＥＴＴＭＬＬＥＮＤＳＰＳＥＴＩＰＥＱＴＬＬＰＤＥＦＶＳＣＬＧＩＶＮＥＥＬＰＳＩＮＴＦＦＰＱＮＩＬＥＳＨＦＮＲＩＳＬＬＥＫ
配列番号１８。ＩＬ－２３Ｒの短縮細胞内ドメイン
ＮＲＳＦＲＴＧＩＫＲＲ
配列番号１９。ＩＬ－１２Ｒβ１の短縮細胞内ドメイン
ＮＲＡＡＲ
配列番号２０。ＴＧＢ２３－１アミノ酸
ＭＥＡＡＶＡＡＰＲＰＲＬＬＬＬＶＬＡＡＡＡＡＡＡＡＡＬＬＰＧＡＴＡＬＱＣＦＣＨＬＣＴＫＤＮＦＴＣＶＴＤＧＬＣＦＶＳＶＴＥＴＴＤＫＶＩＨＮＳＭＣＩＡＥＩＤＬＩＰＲＤＲＰＦＶＣＡＰＳＳＫＴＧＳＶＴＴＴＹＣＣＮＱＤＨＣＮＫＩＥＬＰＴＴＶＫＳＳＰＧＬＧＰＶＥＬＡＡＶＩＡＧＰＶＣＦＶＣＩＳＬＭＬＭＶＹＩＣＨＮＲＴＶＮＲＳＦＲＴＧＩＫＲＲＩＬＬＬＩＰＫＷＬＹＥＤＩＰＮＭＫＮＳＮＶＶＫＭＬＱＥＮＳＥＬＭＮＮＮＳＳＥＱＶＬＹＶＤＰＭＩＴＥＩＫＥＩＦＩＰＥＨＫＰＴＤＹＫＫＥＮＴＧＰＬＥＴＲＤＹＰＱＮＳＬＦＤＮＴＴＶＶＹＩＰＤＬＮＴＧＹＫＰＱＩＳＮＦＬＰＥＧＳＨＬＳＮＮＮＥＩＴＳＬＴＬＫＰＰＶＤＳＬＤＳＧＮＮＰＲＬＱＫＨＰＮＦＡＦＳＶＳＳＶＮＳＬＳＮＴＩＦＬＧＥＬＳＬＩＬＮＱＧＥＣＳＳＰＤＩＱＮＳＶＥＥＥＴＴＭＬＬＥＮＤＳＰＳＥＴＩＰＥＱＴＬＬＰＤＥＦＶＳＣＬＧＩＶＮＥＥＬＰＳＩＮＴＹＦＰＱＮＩＬＥＳＨＦＮＲＩＳＬＬＥＫＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＧＲＧＬＬＲＧＬＷＰＬＨＩＶＬＷＴＲＩＡＳＴＩＰＰＨＶＱＫＳＶＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤＬＬＬＶＩＦＱＶＴＧＩＳＬＬＰＰＬＧＶＡＩＳＶＩＩＩＦＹＣＹＲＶＮＲＱＮＲＡＡＲＨＬＣＰＰＬＰＴＰＣＡＳＳＡＩＥＦＰＧＧＫＥＴＷＱＷＩＮＰＶＤＦＱＥＥＡＳＬＱＥＡＬＶＶＥＭＳＷＤＫＧＥＲＴＥＰＬＥＫＴＥＬＰＥＧＡＰＥＬＡＬＤＴＥＬＳＬＥＤＧＤＲＣＫＡＫＭ
配列番号２１。ＴＧＢ２３－２アミノ酸
ＭＧＲＧＬＬＲＧＬＷＰＬＨＩＶＬＷＴＲＩＡＳＴＩＰＰＨＶＱＫＳＶＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤＬＬＬＶＩＦＱＶＴＧＩＳＬＬＰＰＬＧＶＡＩＳＶＩＩＩＦＹＣＹＲＶＮＲＱＮＲＳＦＲＴＧＩＫＲＲＩＬＬＬＩＰＫＷＬＹＥＤＩＰＮＭＫＮＳＮＶＶＫＭＬＱＥＮＳＥＬＭＮＮＮＳＳＥＱＶＬＹＶＤＰＭＩＴＥＩＫＥＩＦＩＰＥＨＫＰＴＤＹＫＫＥＮＴＧＰＬＥＴＲＤＹＰＱＮＳＬＦＤＮＴＴＶＶＹＩＰＤＬＮＴＧＹＫＰＱＩＳＮＦＬＰＥＧＳＨＬＳＮＮＮＥＩＴＳＬＴＬＫＰＰＶＤＳＬＤＳＧＮＮＰＲＬＱＫＨＰＮＦＡＦＳＶＳＳＶＮＳＬＳＮＴＩＦＬＧＥＬＳＬＩＬＮＱＧＥＣＳＳＰＤＩＱＮＳＶＥＥＥＴＴＭＬＬＥＮＤＳＰＳＥＴＩＰＥＱＴＬＬＰＤＥＦＶＳＣＬＧＩＶＮＥＥＬＰＳＩＮＴＹＦＰＱＮＩＬＥＳＨＦＮＲＩＳＬＬＥＫＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＥＡＡＶＡＡＰＲＰＲＬＬＬＬＶＬＡＡＡＡＡＡＡＡＡＬＬＰＧＡＴＡＬＱＣＦＣＨＬＣＴＫＤＮＦＴＣＶＴＤＧＬＣＦＶＳＶＴＥＴＴＤＫＶＩＨＮＳＭＣＩＡＥＩＤＬＩＰＲＤＲＰＦＶＣＡＰＳＳＫＴＧＳＶＴＴＴＹＣＣＮＱＤＨＣＮＫＩＥＬＰＴＴＶＫＳＳＰＧＬＧＰＶＥＬＡＡＶＩＡＧＰＶＣＦＶＣＩＳＬＭＬＭＶＹＩＣＨＮＲＴＶＮＲＡＡＲＨＬＣＰＰＬＰＴＰＣＡＳＳＡＩＥＦＰＧＧＫＥＴＷＱＷＩＮＰＶＤＦＱＥＥＡＳＬＱＥＡＬＶＶＥＭＳＷＤＫＧＥＲＴＥＰＬＥＫＴＥＬＰＥＧＡＰＥＬＡＬＤＴＥＬＳＬＥＤＧＤＲＣＫＡＫＭ
配列番号２２。ＴＧＢ２３－３アミノ酸
ＭＥＡＡＶＡＡＰＲＰＲＬＬＬＬＶＬＡＡＡＡＡＡＡＡＡＬＬＰＧＡＴＡＬＱＣＦＣＨＬＣＴＫＤＮＦＴＣＶＴＤＧＬＣＦＶＳＶＴＥＴＴＤＫＶＩＨＮＳＭＣＩＡＥＩＤＬＩＰＲＤＲＰＦＶＣＡＰＳＳＫＴＧＳＶＴＴＴＹＣＣＮＱＤＨＣＮＫＩＥＬＰＴＴＶＫＳＳＰＧＬＧＰＶＥＬＡＡＶＩＡＧＰＶＣＦＶＣＩＳＬＭＬＭＶＹＩＣＨＮＲＴＶＮＲＡＡＲＨＬＣＰＰＬＰＴＰＣＡＳＳＡＩＥＦＰＧＧＫＥＴＷＱＷＩＮＰＶＤＦＱＥＥＡＳＬＱＥＡＬＶＶＥＭＳＷＤＫＧＥＲＴＥＰＬＥＫＴＥＬＰＥＧＡＰＥＬＡＬＤＴＥＬＳＬＥＤＧＤＲＣＫＡＫＭＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＧＲＧＬＬＲＧＬＷＰＬＨＩＶＬＷＴＲＩＡＳＴＩＰＰＨＶＱＫＳＶＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤＬＬＬＶＩＦＱＶＴＧＩＳＬＬＰＰＬＧＶＡＩＳＶＩＩＩＦＹＣＹＲＶＮＲＱＮＲＳＦＲＴＧＩＫＲＲＩＬＬＬＩＰＫＷＬＹＥＤＩＰＮＭＫＮＳＮＶＶＫＭＬＱＥＮＳＥＬＭＮＮＮＳＳＥＱＶＬＹＶＤＰＭＩＴＥＩＫＥＩＦＩＰＥＨＫＰＴＤＹＫＫＥＮＴＧＰＬＥＴＲＤＹＰＱＮＳＬＦＤＮＴＴＶＶＹＩＰＤＬＮＴＧＹＫＰＱＩＳＮＦＬＰＥＧＳＨＬＳＮＮＮＥＩＴＳＬＴＬＫＰＰＶＤＳＬＤＳＧＮＮＰＲＬＱＫＨＰＮＦＡＦＳＶＳＳＶＮＳＬＳＮＴＩＦＬＧＥＬＳＬＩＬＮＱＧＥＣＳＳＰＤＩＱＮＳＶＥＥＥＴＴＭＬＬＥＮＤＳＰＳＥＴＩＰＥＱＴＬＬＰＤＥＦＶＳＣＬＧＩＶＮＥＥＬＰＳＩＮＴＹＦＰＱＮＩＬＥＳＨＦＮＲＩＳＬＬＥＫ
配列番号２３。ＴＧＢ２３－４アミノ酸
ＭＥＡＡＶＡＡＰＲＰＲＬＬＬＬＶＬＡＡＡＡＡＡＡＡＡＬＬＰＧＡＴＡＬＱＣＦＣＨＬＣＴＫＤＮＦＴＣＶＴＤＧＬＣＦＶＳＶＴＥＴＴＤＫＶＩＨＮＳＭＣＩＡＥＩＤＬＩＰＲＤＲＰＦＶＣＡＰＳＳＫＴＧＳＶＴＴＴＹＣＣＮＱＤＨＣＮＫＩＥＬＰＴＴＶＫＳＳＰＧＬＧＰＶＥＬＶＰＱＶＴＳＫＡＦＱＨＤＴＷＮＳＧＬＴＶＡＳＩＳＴＧＨＬＴＳＤＮＲＧＤＩＧＬＬＬＧＭＩＶＦＡＶＭＬＳＩＬＳＬＩＧＩＦＮＲＳＦＲＴＧＩＫＲＲＩＬＬＬＩＰＫＷＬＹＥＤＩＰＮＭＫＮＳＮＶＶＫＭＬＱＥＮＳＥＬＭＮＮＮＳＳＥＱＶＬＹＶＤＰＭＩＴＥＩＫＥＩＦＩＰＥＨＫＰＴＤＹＫＫＥＮＴＧＰＬＥＴＲＤＹＰＱＮＳＬＦＤＮＴＴＶＶＹＩＰＤＬＮＴＧＹＫＰＱＩＳＮＦＬＰＥＧＳＨＬＳＮＮＮＥＩＴＳＬＴＬＫＰＰＶＤＳＬＤＳＧＮＮＰＲＬＱＫＨＰＮＦＡＦＳＶＳＳＶＮＳＬＳＮＴＩＦＬＧＥＬＳＬＩＬＮＱＧＥＣＳＳＰＤＩＱＮＳＶＥＥＥＴＴＭＬＬＥＮＤＳＰＳＥＴＩＰＥＱＴＬＬＰＤＥＦＶＳＣＬＧＩＶＮＥＥＬＰＳＩＮＴＹＦＰＱＮＩＬＥＳＨＦＮＲＩＳＬＬＥＫＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＧＲＧＬＬＲＧＬＷＰＬＨＩＶＬＷＴＲＩＡＳＴＩＰＰＨＶＱＫＳＶＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤＬＬＬＶＩＦＱＶＳＤＷＬＩＦＦＡＳＬＧＳＦＬＳＩＬＬＶＧＶＬＧＹＬＧＬＮＲＡＡＲＨＬＣＰＰＬＰＴＰＣＡＳＳＡＩＥＦＰＧＧＫＥＴＷＱＷＩＮＰＶＤＦＱＥＥＡＳＬＱＥＡＬＶＶＥＭＳＷＤＫＧＥＲＴＥＰＬＥＫＴＥＬＰＥＧＡＰＥＬＡＬＤＴＥＬＳＬＥＤＧＤＲＣＫＡＫＭ
配列番号２４。ＴＧＢ２３－５アミノ酸
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配列番号２５。ＴＧＢ２３－６アミノ酸
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配列番号２６。ＴＧＢ２３－１４アミノ酸
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配列番号２７。ＴＧＢ２３－１５アミノ酸
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配列番号２８。ＴＧＢ２３－１核酸
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配列番号２９。ＴＧＢ２３－２核酸
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配列番号３０。ＴＧＢ２３－３核酸
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配列番号３２。ＴＧＢ２３－５核酸
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配列番号３４。ＴＧＢ２３－１４核酸
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配列番号３５。ＴＧＢ２３－１５核酸
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配列番号３６。ｈｕＬＩＣ１９３０９ｂ ＣＡＲアミノ酸
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配列番号３７。ｈｕＬＩＣ１９３０９ｂＴ ＣＡＲアミノ酸
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配列番号３８。ｈｕＬＩＣ１９３０９ｂＴ ＣＡＲ核酸
ａｔｇｇｃｃｃｔｇｃｃｔｇｔｇａｃｃｇｃｔｃｔｇｃｔｇｃｔｇｃｃｔｃｔｇｇｃｔｃｔｇｃｔｇｃｔｇｃａｃｇｃｔｇｃｃｃｇｃｃｃｔｇａｃａｔｔｇｔｇａｔｇａｃｃｃａｇｔｃｔｃｃｃｃｔｇｔｃｃｃｔｇｃｃａｇｔｇａｃｃｃｃｔｇｇａｇａｇｃｃａｇｃｃｔｃｃａｔｃｔｃｔｔｇｃａｇｇａｇｃｔｃｃｃａｇａｃｃａｔｃｇｔｇｃａｃａｇｃａａｃｇｇｃａａｔａｃａｔａｃｃｔｇｇａｇｔｇｇｔａｔｃｔｇｃａｇａａｇｃｃｃｇｇｃｃａｇｔｃｃｃｃｔｃａｇｃｔｇｃｔｇａｔｃｔａｃａａｇｇｔｇｔｃｔａａｃａｇｇｔｔｃａｇｃｇｇａｇｔｇｃｃａｇａｃｃｇｃｔｔｔａｇｃｇｇａｔｃｃｇｇａｔｃｔｇｇｃａｃｃｇａｔｔｔｃａｃａｃｔｇａａｇａｔｃｔｃｔａｇａｇｔｇｇａｇｇｃｃｇａｇｇａｃｇｔｇｇｇｃｇｔｇｔａｃｔａｔｔｇｃｔｔｃｃａｇｇｔｇａｇｃｃａｃｇｔｇｃｃａｔａｔａｃｃｔｔｔｇｇｃｇｇｃｇｇｃａｃａａａｇｃｔｇｇａｇａｔｃａａｇｇｇｃａｇｃａｃｃｔｃｃｇｇａｔｃｔｇｇｃａａｇｃｃａｇｇａｔｃｃｇｇａｇａｇｇｇａｔｃｔａｃａａａｇｇｇａｃａｇｇｔｇｃａｇｃｔｇｇｔｇｃａｇａｇｃｇｇａｇｃａｇａｇｇｔｇａａｇａａｇｃｃｔｇｇａｇｃｃａｇｃｇｔｇａａｇｇｔｇｔｃｃｔｇｔａａｇｇｃｃｔｃｔｇｇｃｔａｃａｃｃｔｔｃａｃａｇａｃｔａｔｇａｇａｔｇｃａｃｔｇｇｇｔｇｃｇｇｃａｇｇｃａａｃｃｇｇａｃａｇｇｇｃｃｔｇｇａｇｔｇｇａｔｇｇｇａｇｇａａｔｃｇａｃｃｃａｇａｇａｃａｇｇｃａａｃａｃａｇｃｃｔａｃｔｃｃｃａｇａａｇｔｔｔａａｇｇｇｃｃｇｇｇｔｇａｃｃａｔｇａｃａａｇａａａｔａｃｃａｇｃａｔｃｔｃｃａｃａｇｃｃｔａｔａｔｇｇａｇｃｔｇｔｃｔａｇｃｃｔｇａｇａｔｃｔｇａｇｇａｔａｃａｇｃｃｇｔｇｔａｃｔａｔｔｇｔｇｃｔｃｇｃｔａｃｔａｔｔｃｃｔｔｔｇｃｃｔａｃｔｇｇｇｇａｃａｇｇｇｇａｃａｃｔｇｇｔｃａｃｃｇｔｃｔｃａｔｃａａｃｔａｇｔａｃｃａｃｇａｃｇｃｃａｇｃｇｃｃｇｃｇａｃｃａｃｃａａｃａｃｃｇｇｃｇｃｃｃａｃｃａｔｃｇｃｇｔｃｇｃａｇｃｃｃｃｔｇｔｃｃｃｔｇｃｇｃｃｃａｇａｇｇｃｇｔｇｃｃｇｇｃｃａｇｃｇｇｃｇｇｇｇｇｇｃｇｃａｇｔｇｃａｃａｃｇａｇｇｇｇｇｃｔｇｇａｃｔｔｃｇｃｃｔｇｔｇａｔａｔｃｔａｃａｔｃｔｇｇｇｃｇｃｃｃｔｔｇｇｃｃｇｇｇａｃｔｔｇｔｇｇｇｇｔｃｃｔｔｃｔｃｃｔｇｔｃａｃｔｇｇｔｔａｔｃａｃｃｃｔｔｔａｃｔｇｃａａａｃｇｇｇｇｃａｇａａａｇａａａｃｔｃｃｔｇｔａｔａｔａｔｔｃａａａｃａａｃｃａｔｔｔａｔｇａｇａｃｃａｇｔａｃａａａｃｔａｃｔｃａａｇａｇｇａａｇａｔｇｇｃｔｇｔａｇｃｔｇｃｃｇａｔｔｔｃｃａｇａａｇａａｇａａｇａａｇｇａｇｇａｔｇｔｇａａｃｔｇａｇａｇｔｇａａｇｔｔｃａｇｃａｇｇａｇｃｇｃａｇａｃｇｃｃｃｃｃｇｃｇｔａｃｃａｇｃａｇｇｇｃｃａｇａａｃｃａｇｃｔｃｔａｔａａｃｇａｇｃｔｃａａｔｃｔａｇｇａｃｇａａｇａｇａｇｇａｇｔａｃｇａｔｇｔｔｔｔｇｇａｃａａｇａｇａｃｇｔｇｇｃｃｇｇｇａｃｃｃｔｇａｇａｔｇｇｇｇｇｇａａａｇｃｃｇａｇａａｇｇａａｇａａｃｃｃｔｃａｇｇａａｇｇｃｃｔｇｔａｃａａｔｇａａｃｔｇｃａｇａａａｇａｔａａｇａｔｇｇｃｇｇａｇｇｃｃｔａｃａｇｔｇａｇａｔｔｇｇｇａｔｇａａａｇｇｃｇａｇｃｇｃｃｇｇａｇｇｇｇｃａａｇｇｇｇｃａｃｇａｔｇｇｃｃｔｔｔａｃｃａｇｇｇｔｃｔｃａｇｔａｃａｇｃｃａｃｃａａｇｇａｃａｃｃｔａｃｇａｃｇｃｃｃｔｔｃａｃａｔｇｃａｇｇｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃｔｃｇｃｇｔｔａａｃｇｇｃａｇｃｇｇａｇｃｔａｃａａａｃｔｔｃａｇｔｃｔｔｃｔａａａａｃａｇｇｃｔｇｇｔｇａｃｇｔｇｇａｇｇａｇａａｔｃｃｃｇｇｃｃｃｔａｔｇｇａｇｇｃｃｇｃｃｇｔｇｇｃｇｇｃｔｃｃｔｃｇｇｃｃｃｃｇｃｃｔｃｃｔｃｃｔｇｃｔｇｇｔｇｃｔｇｇｃｃｇｃａｇｃｔｇｃｔｇｃｃｇｃｃｇｃｇｇｃｔｇｃｃｔｔｇｃｔｇｃｃｔｇｇｃｇｃｃａｃｃｇｃｇｃｔｇｃａｇｔｇｃｔｔｔｔｇｔｃａｃｃｔａｔｇｃａｃｔａａｇｇａｃａａｃｔｔｃａｃｃｔｇｃｇｔｇａｃｃｇａｃｇｇｃｃｔｇｔｇｃｔｔｃｇｔｇｔｃｃｇｔａａｃａｇａｇａｃｔａｃｃｇａｔａａａｇｔｇａｔｔｃａｃａａｃｔｃｃａｔｇｔｇｃａｔｃｇｃｃｇａｇａｔｔｇａｃｃｔｇａｔｃｃｃｇｃｇｃｇａｃｃｇｃｃｃｃｔｔｃｇｔｃｔｇｔｇｃｔｃｃｃｔｃａｔｃｃａａｇａｃｃｇｇｃａｇｃｇｔｃａｃｃａｃａａｃｔｔａｃｔｇｃｔｇｃａａｃｃａｇｇａｃｃａｃｔｇｔａａｃａａｇａｔｃｇａｇｃｔｇｃｃｃａｃａａｃａｇｔｃａａａｔｃｃｔｃｔｃｃｔｇｇａｔｔｇｇｇａｃｃｃｇｔｇｇａｇｃｔｇｇｔｇａｇｔｇａｃｔｇｇｔｔｇａｔｃｔｔｃｔｔｔｇｃｇａｇｃｃｔａｇｇｃｔｃｃｔｔｃｔｔａａｇｃａｔｃｃｔｔｃｔｔｇｔｇｇｇｃｇｔｃｃｔｇｇｇｔｔａｃｃｔｇｇｇａｃｔｇａａｃｃｇｃｇｃｔｇｃｇｃｇｃｃａｃｃｔｇｔｇｃｃｃｇｃｃｔｃｔｇｃｃａａｃｃｃｃｃｔｇｃｇｃｃｔｃｃｔｃｇｇｃｃａｔｃｇａｇｔｔｃｃｃｃｇｇｇｇｇｇａａｇｇａｇａｃｃｔｇｇｃａａｔｇｇａｔｃａａｔｃｃａｇｔａｇａｃｔｔｔｃａｇｇａｇｇａｇｇｃａｔｃｇｃｔｇｃａｇｇａｇｇｃｔｃｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｇａｔｇａｇｔｔｇｇｇａｃａａｇｇｇｔｇａａｃｇｇａｃｃｇａａｃｃａｃｔｃｇａｇａａａａｃｃｇａｇｃｔｇｃｃａｇａａｇｇｔｇｃｇｃｃｇｇａｇｃｔｇｇｃｃｃｔｇｇａｔａｃｔｇａｇｃｔｔｔｃａｃｔｇｇａｇｇａｃｇｇｃｇａｃａｇｇｔｇｔａａｇｇｃｃａａａａｔｇｇｃｃａｃｃａａｃｔｔｔａｇｃｃｔｇｃｔｇａａａｃａｇｇｃｃｇｇｔｇａｔｇｔｇｇａｇｇａｇａａｔｃｃｇｇｇｃｃｃａａｔｇｇｇｃｃｇｃｇｇｃｃｔｃｃｔａｃｇｔｇｇａｃｔｇｔｇｇｃｃｃｔｔｇｃａｃａｔｃｇｔｇｃｔｔｔｇｇａｃｃｃｇｃａｔｃｇｃｔｔｃｔａｃｃａｔｃｃｃａｃｃｔｃａｔｇｔｇｃａｇａａｇａｇｃｇｔｔａａｔａａｃｇａｃａｔｇａｔｃｇｔｃａｃｔｇａｔａａｃａａｃｇｇｇｇｃｇｇｔｇａａｇｔｔｃｃｃｔｃａｇｃｔｇｔｇｃａａｇｔｔｃｔｇｔｇａｔｇｔａｃｇｃｔｔｃｔｃｔａｃｔｔｇｃｇａｃａａｃｃａｇａａｇａｇｔｔｇｔａｔｇｔｃｔａａｃｔｇｃｔｃｔａｔｔａｃｔｔｃｔａｔｃｔｇｃｇａｇａａｇｃｃｃｃａｇｇａｇｇｔｃｔｇｃｇｔｇｇｃｃｇｔｔｔｇｇａｇｇａａｇａａｔｇａｃｇａｇａａｃａｔｃａｃｔｃｔｇｇａｇａｃａｇｔａｔｇｃｃａｔｇａｔｃｃｇａａｇｃｔｇｃｃｃｔａｔｃａｔｇａｃｔｔｃａｔｃｃｔｇｇａｇｇａｔｇｃｃｇｃａａｇｃｃｃｔａａｇｔｇｃａｔｃａｔｇａａｇｇａｇａａｇａａｇａａｇｃｃｇｇｇｇｇａｇａｃｃｔｔｃｔｔｃａｔｇｔｇｃｔｃｃｔｇｃｔｃｔｔｃｃｇａｔｇａｇｔｇｃａａｃｇａｃａａｃａｔｃａｔｃｔｔｔｔｃｃｇａｇｇａｇｔａｃａａｃａｃｔｔｃｃａａｃｃｃｃｇａｔｃｔｇｃｔｇｔｔｇｇｔｇａｔｔｔｔｃｃａｇｇｔｇｃｃｇｃａｇｇｔｃａｃｃｔｃｃａａｇｇｃｇｔｔｃｃａｇｃａｔｇａｃａｃｃｔｇｇａａｃａｇｃｇｇａｃｔａａｃｃｇｔｇｇｃｔａｇｃａｔｃａｇｃａｃｃｇｇｃｃａｃｔｔｇａｃｃｔｃｃｇａｃａａｃｃｇｃｇｇｇｇａｃａｔｃｇｇｃｃｔｇｃｔａｃｔｃｇｇａａｔｇａｔｃｇｔｇｔｔｃｇｃｇｇｔｇａｔｇｃｔｃｔｃｃａｔｃｃｔｃｔｃｔｃｔｃａｔｃｇｇｃａｔｃｔｔｃａａｃｃｇｃａｇｃｔｔｃｃｇｃａｃｃｇｇｔａｔｔａａｇａｇｇａｇａａｔｔｃｔｇｃｔｔｃｔｃａｔｃｃｃｃａａａｔｇｇｔｔａｔａｃｇａｇｇａｃａｔｃｃｃｃａａｃａｔｇａａａａａｃａｇｃａａｃｇｔｇｇｔｃａａｇａｔｇｃｔｇｃａｇｇａｇａａｔｔｃｇｇａｇｃｔｇａｔｇａａｃａａｔａａｃｔｃａｔｃｇｇａｇｃａｇｇｔｔｃｔｇｔａｃｇｔｇｇａｃｃｃｇａｔｇａｔｃａｃｇｇａａａｔａａａｇｇａｇａｔｃｔｔｃａｔｃｃｃｔｇａｇｃａｃａａｇｃｃｔａｃｃｇａｃｔａｃａａｇａａａｇａｇａａｔａｃｃｇｇｃｃｃｇｃｔｔｇａｇａｃｔｃｇｔｇａｃｔａｔｃｃｔｃａｇａａｃｔｃｔｃｔｇｔｔｃｇａｃａａｃａｃｇａｃｇｇｔｇｇｔｇｔａｃａｔｔｃｃｃｇａｃｔｔｇａａｃａｃｇｇｇｃｔａｃａａａｃｃｃｃａａａｔｔｔｃｃａａｃｔｔｃｃｔｇｃｃｔｇａｇｇｇｃａｇｔｃａｃｃｔｇｔｃｃａａｃａａｃａａｃｇａａａｔｃａｃｃｔｃｃｃｔｇａｃｃｃｔｇａａｇｃｃａｃｃｇｇｔｃｇａｃｔｃｃｔｔｇｇａｃａｇｃｇｇｃａａｃａａｃｃｃｃｃｇａｃｔｃｃａｇａａｇｃａｃｃｃｃａａｔｔｔｔｇｃｔｔｔｔｔｃｃｇｔｇｔｃｃｔｃｃｇｔｃａａｃｔｃｃｃｔｃｔｃａａａｔａｃｃａｔｃｔｔｃｃｔｃｇｇｃｇａｇｃｔｃｔｃｃｃｔｇａｔｃｃｔｇａａｔｃａｇｇｇｃｇａａｔｇｔｔｃｇｔｃｃｃｃｇｇａｃａｔｃｃａｇａａｃｔｃｔｇｔｇｇａｇｇａｇｇａｇａｃｃａｃｇａｔｇｃｔｔｃｔｇｇａｇａａｃｇａｃａｇｃｃｃｇｔｃｃｇａｇａｃｃａｔｃｃｃｃｇａｇｃａｇａｃｇｃｔｔｃｔｇｃｃｃｇａｃｇａｇｔｔｃｇｔｇａｇｔｔｇｃｃｔｇｇｇｃａｔｔｇｔｇａａｃｇａｇｇａａｃｔｇｃｃｔｔｃｔａｔｔａａｃａｃｃｔａｃｔｔｃｃｃｔｃａｇａａｃａｔａｃｔｇｇａｇａｇｃｃａｃｔｔｔａａｃｃｇｔａｔｃｔｃｇｃｔａｔｔｇｇａｇａａｇ
配列番号３９。ＣＤ８αシグナルペプチド
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ
配列番号４０。ＣＤ８αヒンジ
ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ
配列番号４１。ＣＤ８α膜貫通ドメイン
ＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ
配列番号４２。４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）共刺激シグナリングドメイン
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ
配列番号４３。ＣＤ３ζ（ＣＤ３ｚ）細胞内シグナリングドメイン
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ
配列番号４４。ＥｃｏＲＩ制限部位
ＧＡＡＴＴＣ
配列番号４５。ＳｐｅＩ制限部位
ＡＣＴＡＧＴ
配列番号４６。ＨｐａＩ制限部位
ＧＴＴＡＡＣ
配列番号４７。ＭｌｕＩ制限部位
ＡＣＧＣＧＴ
配列番号４８。Ｐ２Ａ
ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ
配列番号４９。ＴＧＦβＲ１ＥＣ－ＴＧＦβＲ１ＴＭ－ＩＬ２３ＲＩＣ
ＭＥＡＡＶＡＡＰＲＰＲＬＬＬＬＶＬＡＡＡＡＡＡＡＡＡＬＬＰＧＡＴＡＬＱＣＦＣＨＬＣＴＫＤＮＦＴＣＶＴＤＧＬＣＦＶＳＶＴＥＴＴＤＫＶＩＨＮＳＭＣＩＡＥＩＤＬＩＰＲＤＲＰＦＶＣＡＰＳＳＫＴＧＳＶＴＴＴＹＣＣＮＱＤＨＣＮＫＩＥＬＰＴＴＶＫＳＳＰＧＬＧＰＶＥＬＡＡＶＩＡＧＰＶＣＦＶＣＩＳＬＭＬＭＶＹＩＣＨＮＲＴＶＮＲＳＦＲＴＧＩＫＲＲＩＬＬＬＩＰＫＷＬＹＥＤＩＰＮＭＫＮＳＮＶＶＫＭＬＱＥＮＳＥＬＭＮＮＮＳＳＥＱＶＬＹＶＤＰＭＩＴＥＩＫＥＩＦＩＰＥＨＫＰＴＤＹＫＫＥＮＴＧＰＬＥＴＲＤＹＰＱＮＳＬＦＤＮＴＴＶＶＹＩＰＤＬＮＴＧＹＫＰＱＩＳＮＦＬＰＥＧＳＨＬＳＮＮＮＥＩＴＳＬＴＬＫＰＰＶＤＳＬＤＳＧＮＮＰＲＬＱＫＨＰＮＦＡＦＳＶＳＳＶＮＳＬＳＮＴＩＦＬＧＥＬＳＬＩＬＮＱＧＥＣＳＳＰＤＩＱＮＳＶＥＥＥＴＴＭＬＬＥＮＤＳＰＳＥＴＩＰＥＱＴＬＬＰＤＥＦＶＳＣＬＧＩＶＮＥＥＬＰＳＩＮＴＹＦＰＱＮＩＬＥＳＨＦＮＲＩＳＬＬＥＫ
配列番号５０。ＴＧＦβＲ２ＥＣ－ＴＧＦβＲ２ＴＭ－ＩＬ１２Ｒβ１ＩＣ
ＭＧＲＧＬＬＲＧＬＷＰＬＨＩＶＬＷＴＲＩＡＳＴＩＰＰＨＶＱＫＳＶＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤＬＬＬＶＩＦＱＶＴＧＩＳＬＬＰＰＬＧＶＡＩＳＶＩＩＩＦＹＣＹＲＶＮＲＱＮＲＡＡＲＨＬＣＰＰＬＰＴＰＣＡＳＳＡＩＥＦＰＧＧＫＥＴＷＱＷＩＮＰＶＤＦＱＥＥＡＳＬＱＥＡＬＶＶＥＭＳＷＤＫＧＥＲＴＥＰＬＥＫＴＥＬＰＥＧＡＰＥＬＡＬＤＴＥＬＳＬＥＤＧＤＲＣＫＡＫＭ
配列番号５１。ＴＧＦβＲ１ＥＣ－ＴＧＦβＲ１ＴＭ－ＩＬ１２Ｒβ１ＩＣ
ＭＥＡＡＶＡＡＰＲＰＲＬＬＬＬＶＬＡＡＡＡＡＡＡＡＡＬＬＰＧＡＴＡＬＱＣＦＣＨＬＣＴＫＤＮＦＴＣＶＴＤＧＬＣＦＶＳＶＴＥＴＴＤＫＶＩＨＮＳＭＣＩＡＥＩＤＬＩＰＲＤＲＰＦＶＣＡＰＳＳＫＴＧＳＶＴＴＴＹＣＣＮＱＤＨＣＮＫＩＥＬＰＴＴＶＫＳＳＰＧＬＧＰＶＥＬＡＡＶＩＡＧＰＶＣＦＶＣＩＳＬＭＬＭＶＹＩＣＨＮＲＴＶＮＲＡＡＲＨＬＣＰＰＬＰＴＰＣＡＳＳＡＩＥＦＰＧＧＫＥＴＷＱＷＩＮＰＶＤＦＱＥＥＡＳＬＱＥＡＬＶＶＥＭＳＷＤＫＧＥＲＴＥＰＬＥＫＴＥＬＰＥＧＡＰＥＬＡＬＤＴＥＬＳＬＥＤＧＤＲＣＫＡＫＭ
配列番号５２。ＴＧＦβＲ２ＥＣ－ＴＧＦβＲ２ＴＭ－ＩＬ２３ＲＩＣ
ＭＧＲＧＬＬＲＧＬＷＰＬＨＩＶＬＷＴＲＩＡＳＴＩＰＰＨＶＱＫＳＶＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤＬＬＬＶＩＦＱＶＴＧＩＳＬＬＰＰＬＧＶＡＩＳＶＩＩＩＦＹＣＹＲＶＮＲＱＮＲＳＦＲＴＧＩＫＲＲＩＬＬＬＩＰＫＷＬＹＥＤＩＰＮＭＫＮＳＮＶＶＫＭＬＱＥＮＳＥＬＭＮＮＮＳＳＥＱＶＬＹＶＤＰＭＩＴＥＩＫＥＩＦＩＰＥＨＫＰＴＤＹＫＫＥＮＴＧＰＬＥＴＲＤＹＰＱＮＳＬＦＤＮＴＴＶＶＹＩＰＤＬＮＴＧＹＫＰＱＩＳＮＦＬＰＥＧＳＨＬＳＮＮＮＥＩＴＳＬＴＬＫＰＰＶＤＳＬＤＳＧＮＮＰＲＬＱＫＨＰＮＦＡＦＳＶＳＳＶＮＳＬＳＮＴＩＦＬＧＥＬＳＬＩＬＮＱＧＥＣＳＳＰＤＩＱＮＳＶＥＥＥＴＴＭＬＬＥＮＤＳＰＳＥＴＩＰＥＱＴＬＬＰＤＥＦＶＳＣＬＧＩＶＮＥＥＬＰＳＩＮＴＹＦＰＱＮＩＬＥＳＨＦＮＲＩＳＬＬＥＫ
配列番号５３。ＴＧＦβＲ１ＥＣ－ＩＬ２３ＲＴＭ－ＩＬ２３ＲＩＣ
ＭＥＡＡＶＡＡＰＲＰＲＬＬＬＬＶＬＡＡＡＡＡＡＡＡＡＬＬＰＧＡＴＡＬＱＣＦＣＨＬＣＴＫＤＮＦＴＣＶＴＤＧＬＣＦＶＳＶＴＥＴＴＤＫＶＩＨＮＳＭＣＩＡＥＩＤＬＩＰＲＤＲＰＦＶＣＡＰＳＳＫＴＧＳＶＴＴＴＹＣＣＮＱＤＨＣＮＫＩＥＬＰＴＴＶＫＳＳＰＧＬＧＰＶＥＬＶＰＱＶＴＳＫＡＦＱＨＤＴＷＮＳＧＬＴＶＡＳＩＳＴＧＨＬＴＳＤＮＲＧＤＩＧＬＬＬＧＭＩＶＦＡＶＭＬＳＩＬＳＬＩＧＩＦＮＲＳＦＲＴＧＩＫＲＲＩＬＬＬＩＰＫＷＬＹＥＤＩＰＮＭＫＮＳＮＶＶＫＭＬＱＥＮＳＥＬＭＮＮＮＳＳＥＱＶＬＹＶＤＰＭＩＴＥＩＫＥＩＦＩＰＥＨＫＰＴＤＹＫＫＥＮＴＧＰＬＥＴＲＤＹＰＱＮＳＬＦＤＮＴＴＶＶＹＩＰＤＬＮＴＧＹＫＰＱＩＳＮＦＬＰＥＧＳＨＬＳＮＮＮＥＩＴＳＬＴＬＫＰＰＶＤＳＬＤＳＧＮＮＰＲＬＱＫＨＰＮＦＡＦＳＶＳＳＶＮＳＬＳＮＴＩＦＬＧＥＬＳＬＩＬＮＱＧＥＣＳＳＰＤＩＱＮＳＶＥＥＥＴＴＭＬＬＥＮＤＳＰＳＥＴＩＰＥＱＴＬＬＰＤＥＦＶＳＣＬＧＩＶＮＥＥＬＰＳＩＮＴＹＦＰＱＮＩＬＥＳＨＦＮＲＩＳＬＬＥＫ
配列番号５４。ＴＧＦβＲ２ＥＣ－ＩＬ１２Ｒβ１ＴＭ－ＩＬ１２Ｒβ１ＩＣ
ＭＧＲＧＬＬＲＧＬＷＰＬＨＩＶＬＷＴＲＩＡＳＴＩＰＰＨＶＱＫＳＶＮＮＤＭＩＶＴＤＮＮＧＡＶＫＦＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＦＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＳＩＣＥＫＰＱＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＥＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＰＹＨＤＦＩＬＥＤＡＡＳＰＫＣＩＭＫＥＫＫＫＰＧＥＴＦＦＭＣＳＣＳＳＤＥＣＮＤＮＩＩＦＳＥＥＹＮＴＳＮＰＤＬＬＬＶＩＦＱＶＳＤＷＬＩＦＦＡＳＬＧＳＦＬＳＩＬＬＶＧＶＬＧＹＬＧＬＮＲＡＡＲＨＬＣＰＰＬＰＴＰＣＡＳＳＡＩＥＦＰＧＧＫＥＴＷＱＷＩＮＰＶＤＦＱＥＥＡＳＬＱＥＡＬＶＶＥＭＳＷＤＫＧＥＲＴＥＰＬＥＫＴＥＬＰＥＧＡＰＥＬＡＬＤＴＥＬＳＬＥＤＧＤＲＣＫＡＫＭ
配列番号５５。ＴＧＦβＲ２ＥＣ－ＩＬ２３ＲＴＭ－ＩＬ２３ＲＩＣ
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配列番号５６。ＴＧＦβＲ１ＥＣ－ＩＬ１２Ｒβ１ＴＭ－ＩＬ１２Ｒβ１ＩＣ
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配列番号５７。リンカー
ＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ
配列番号５８。抗ＧＰＣ３ ｓｃＦｖ
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配列番号５９。コザック配列
ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ
配列番号６０。Ｐ２Ａ
ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ
配列番号６１。リンカー
（Ｇ）ｎ（配列中、ｎは、少なくとも１の整数である）
配列番号６２ リンカー
（ＧＳ）ｎ（配列中、ｎは、少なくとも１の整数である）
配列番号６３ リンカー
（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列中、ｎは、少なくとも１の整数である）
配列番号６４ リンカー
（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列中、ｎは、少なくとも１の整数である）
配列番号６５ リンカー
（ＧＧＧＳ）ｎ（配列中、ｎは、少なくとも１の整数である）
配列番号６６ ＴＧＦβＲ１アイソフォーム－１
ＭＥＡＡＶＡＡＰＲＰＲＬＬＬＬＶＬＡＡＡＡＡＡＡＡＡＬＬＰＧＡＴＡＬＱＣＦＣＨＬＣＴＫＤＮＦＴＣＶＴＤＧＬＣＦＶＳＶＴＥＴＴＤＫＶＩＨＮＳＭＣＩＡＥＩＤＬＩＰＲＤＲＰＦＶＣＡＰＳＳＫＴＧＳＶＴＴＴＹＣＣＮＱＤＨＣＮＫＩＥＬＰＴＴＶＫＳＳＰＧＬＧＰＶＥＬＡＡＶＩＡＧＰＶＣＦＶＣＩＳＬＭＬＭＶＹＩＣＨＮＲＴＶＩＨＨＲＶＰＮＥＥＤＰＳＬＤＲＰＦＩＳＥＧＴＴＬＫＤＬＩＹＤＭＴＴＳＧＳＧＳＧＬＰＬＬＶＱＲＴＩＡＲＴＩＶＬＱＥＳＩＧＫＧＲＦＧＥＶＷＲＧＫＷＲＧＥＥＶＡＶＫＩＦＳＳＲＥＥＲＳＷＦＲＥＡＥＩＹＱＴＶＭＬＲＨＥＮＩＬＧＦＩＡＡＤＮＫＤＮＧＴＷＴＱＬＷＬＶＳＤＹＨＥＨＧＳＬＦＤＹＬＮＲＹＴＶＴＶＥＧＭＩＫＬＡＬＳＴＡＳＧＬＡＨＬＨＭＥＩＶＧＴＱＧＫＰＡＩＡＨＲＤＬＫＳＫＮＩＬＶＫＫＮＧＴＣＣＩＡＤＬＧＬＡＶＲＨＤＳＡＴＤＴＩＤＩＡＰＮＨＲＶＧＴＫＲＹＭＡＰＥＶＬＤＤＳＩＮＭＫＨＦＥＳＦＫＲＡＤＩＹＡＭＧＬＶＦＷＥＩＡＲＲＣＳＩＧＧＩＨＥＤＹＱＬＰＹＹＤＬＶＰＳＤＰＳＶＥＥＭＲＫＶＶＣＥＱＫＬＲＰＮＩＰＮＲＷＱＳＣＥＡＬＲＶＭＡＫＩＭＲＥＣＷＹＡＮＧＡＡＲＬＴＡＬＲＩＫＫＴＬＳＱＬＳＱＱＥＧＩＫＭ
配列番号６７ ＴＧＦβＲ１アイソフォーム－２
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配列番号６８ ＴＧＦβＲ１アイソフォーム－３
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配列番号６９ ＴＧＦβＲ１アイソフォーム－４
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配列番号７０ ＴＧＦβＲ２アイソフォーム－１
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配列番号７１ ＴＧＦβＲ２アイソフォーム－２
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配列番号７２ ＴＧＦβＲ２アイソフォーム－３
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配列番号７３ ＩＬ－２３Ｒアイソフォーム－１
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配列番号７４ ＩＬ－２３Ｒアイソフォーム－２
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配列番号７５ ＩＬ－２３Ｒアイソフォーム－３
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配列番号７６ ＩＬ－２３Ｒアイソフォーム－４
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配列番号７７ ＩＬ－２３Ｒアイソフォーム－５
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配列番号７８ ＩＬ－１２Ｒβ１アイソフォーム－１
ＭＥＰＬＶＴＷＶＶＰＬＬＦＬＦＬＬＳＲＱＧＡＡＣＲＴＳＥＣＣＦＱＤＰＰＹＰＤＡＤＳＧＳＡＳＧＰＲＤＬＲＣＹＲＩＳＳＤＲＹＥＣＳＷＱＹＥＧＰＴＡＧＶＳＨＦＬＲＣＣＬＳＳＧＲＣＣＹＦＡＡＧＳＡＴＲＬＱＦＳＤＱＡＧＶＳＶＬＹＴＶＴＬＷＶＥＳＷＡＲＮＱＴＥＫＳＰＥＶＴＬＱＬＹＮＳＶＫＹＥＰＰＬＧＤＩＫＶＳＫＬＡＧＱＬＲＭＥＷＥＴＰＤＮＱＶＧＡＥＶＱＦＲＨＲＴＰＳＳＰＷＫＬＧＤＣＧＰＱＤＤＤＴＥＳＣＬＣＰＬＥＭＮＶＡＱＥＦＱＬＲＲＲＱＬＧＳＱＧＳＳＷＳＫＷＳＳＰＶＣＶＰＰＥＮＰＰＱＰＱＶＲＦＳＶＥＱＬＧＱＤＧＲＲＲＬＴＬＫＥＱＰＴＱＬＥＬＰＥＧＣＱＧＬＡＰＧＴＥＶＴＹＲＬＱＬＨＭＬＳＣＰＣＫＡＫＡＴＲＴＬＨＬＧＫＭＰＹＬＳＧＡＡＹＮＶＡＶＩＳＳＮＱＦＧＰＧＬＮＱＴＷＨＩＰＡＤＴＨＴＥＰＶＡＬＮＩＳＶＧＴＮＧＴＴＭＹＷＰＡＲＡＱＳＭＴＹＣＩＥＷＱＰＶＧＱＤＧＧＬＡＴＣＳＬＴＡＰＱＤＰＤＰＡＧＭＡＴＹＳＷＳＲＥＳＧＡＭＧＱＥＫＣＹＹＩＴＩＦＡＳＡＨＰＥＫＬＴＬＷＳＴＶＬＳＴＹＨＦＧＧＮＡＳＡＡＧＴＰＨＨＶＳＶＫＮＨＳＬＤＳＶＳＶＤＷＡＰＳＬＬＳＴＣＰＧＶＬＫＥＹＶＶＲＣＲＤＥＤＳＫＱＶＳＥＨＰＶＱＰＴＥＴＱＶＴＬＳＧＬＲＡＧＶＡＹＴＶＱＶＲＡＤＴＡＷＬＲＧＶＷＳＱＰＱＲＦＳＩＥＶＱＶＳＤＷＬＩＦＦＡＳＬＧＳＦＬＳＩＬＬＶＧＶＬＧＹＬＧＬＮＲＡＡＲＨＬＣＰＰＬＰＴＰＣＡＳＳＡＩＥＦＰＧＧＫＥＴＷＱＷＩＮＰＶＤＦＱＥＥＡＳＬＱＥＡＬＶＶＥＭＳＷＤＫＧＥＲＴＥＰＬＥＫＴＥＬＰＥＧＡＰＥＬＡＬＤＴＥＬＳＬＥＤＧＤＲＣＫＡＫＭ
配列番号７９ ＩＬ－１２Ｒβ１アイソフォーム－２
ＭＥＰＬＶＴＷＶＶＰＬＬＦＬＦＬＬＳＲＱＧＡＡＣＲＴＳＥＣＣＦＱＤＰＰＹＰＤＡＤＳＧＳＡＳＧＰＲＤＬＲＣＹＲＩＳＳＤＲＹＥＣＳＷＱＹＥＧＰＴＡＧＶＳＨＦＬＲＣＣＬＳＳＧＲＣＣＹＦＡＡＧＳＡＴＲＬＱＦＳＤＱＡＧＶＳＶＬＹＴＶＴＬＷＶＥＳＷＡＲＮＱＴＥＫＳＰＥＶＴＬＱＬＹＮＳＶＫＹＥＰＰＬＧＤＩＫＶＳＫＬＡＧＱＬＲＭＥＷＥＴＰＤＮＱＶＧＡＥＶＱＦＲＨＲＴＰＳＳＰＷＫＬＧＤＣＧＰＱＤＤＤＴＥＳＣＬＣＰＬＥＭＮＶＡＱＥＦＱＬＲＲＲＱＬＧＳＱＧＳＳＷＳＫＷＳＳＰＶＣＶＰＰＥＮＰＰＱＰＱＶＲＦＳＶＥＱＬＧＱＤＧＲＲＲＬＴＬＫＥＱＰＴＱＬＥＬＰＥＧＣＱＧＬＡＰＧＴＥＶＴＹＲＬＱＬＨＭＬＳＣＰＣＫＡＫＡＴＲＴＬＨＬＧＫＭＰＹＬＳＧＡＡＹＮＶＡＶＩＳＳＮＱＦＧＰＧＬＮＱＴＷＨＩＰＡＤＴＨＴＥＰＶＡＬＮＩＳＶＧＴＮＧＴＴＭＹＷＰＡＲＡＱＳＭＴＹＣＩＥＷＱＰＶＧＱＤＧＧＬＡＴＣＳＬＴＡＰＱＤＰＤＰＡＧＭＡＴＹＳＷＳＲＥＳＧＡＭＧＱＥＫＣＹＹＩＴＩＦＡＳＡＨＰＥＫＬＴＬＷＳＴＶＬＳＴＹＨＦＧＧＮＡＳＡＡＧＴＰＨＨＶＳＶＫＮＨＳＬＤＳＶＳＶＤＷＡＰＳＬＬＳＴＣＰＧＶＬＫＥＹＶＶＲＣＲＤＥＤＳＫＱＶＳＥＨＰＶＱＰＴＥＴＱＶＴＬＳＧＬＲＡＧＶＡＹＴＶＱＶＲＡＤＴＡＷＬＲＧＶＷＳＱＰＱＲＦＳＩＥＶＱＶＳＤＷＬＩＦＦＡＳＬＧＳＦＬＳＩＬＬＶＧＶＬＧＹＬＧＬＮＲＡＡＲＨＬＣＰＰＬＰＴＰＣＡＳＳＡＩＥＦＰＧＧＫＥＴＷＱＷＩＮＰＶＤＦＱＥＥＡＳＬＱＥＡＬＶＶＥＭＳＷＤＫＧＥＲＴＥＰＬＥＫＴＥＬＰＥＧＡＰＥＬＡＬＤＴＥＬＳＬＥＤＧＤＲＣＤＲ
配列番号８０ 抗ＧＰＣ３ ＶＨ（Ｋａｂａｔの定義に従うＣＤＲ配列を太字で示す）
Figure 2024514556000002
配列番号８１ 抗ＧＰＣ３ ＶＬ（Ｋａｂａｔの定義に従うＣＤＲ配列を太字で示す）
Figure 2024514556000003
配列番号８２ 抗ＧＰＣ３ ＶＨ－ＣＤＲ１
ＤＹＥＭＨ
配列番号８３ 抗ＧＰＣ３ ＶＨ－ＣＤＲ２
ＧＩＤＰＥＴＧＮＴＡＹＳＱＫＦＫＧ
配列番号８４ 抗ＧＰＣ３ ＶＨ－ＣＤＲ３
ＹＹＳＦＡＹ
配列番号８５ 抗ＧＰＣ３ ＶＬ－ＣＤＲ１
ＲＳＳＱＴＩＶＨＳＮＧＮＴＹＬＥ
配列番号８６ 抗ＧＰＣ３ ＶＬ－ＣＤＲ２
ＫＶＳＮＲＦＳ
配列番号８７ 抗ＧＰＣ３ ＶＬ－ＣＤＲ３
ＦＱＶＳＨＶＰＹＴ
配列番号８８ ＴＧＦβＲ２アイソフォーム－４
ＭＧＲＧＬＬＲＧＬＷＰＬＨＩＶＬＷＴＲＩＡＳＴＩＰＰＨＶＰＫＳＶＮＳＤＶＭＡＳＤＮＧＧＡＶＫＬＰＱＬＣＫＦＣＤＶＲＬＳＴＣＤＮＱＫＳＣＭＳＮＣＳＩＴＡＩＣＥＫＰＨＥＶＣＶＡＶＷＲＫＮＤＫＮＩＴＬＥＴＶＣＨＤＰＫＬＴＹＨＧＦＴＬＥＤＡＡＳＰＫＣＶＭＫＥＫＫＲＡＧＥＴＦＦＭＣＡＣＮＭＥＥＣＮＤＹＩＩＦＳＥＥＹＴＴＳＳＰＤＬＬＬＶＩＩＱＶＴＧＶＳＬＬＰＰＬＧＩＡＩＡＶＩＩＩＦＹＣＹＲＶＨＲＱＱＫＬＳＰＳＷＥＳＳＫＰＲＫＬＭＤＦＳＤＮＣＡＩＩＬＥＤＤＲＳＤＩＳＳＴＣＡＮＮＩＮＨＮＴＥＬＬＰＩＥＬＤＴＬＶＧＫＧＲＦＡＥＶＹＫＡＫＬＫＱＮＴＳＥＱＦＥＴＶＡＶＫＩＦＰＹＥＥＹＳＳＷＫＴＥＫＤＩＦＳＤＩＮＬＫＨＥＮＩＬＱＦＬＴＡＥＥＲＫＴＥＬＧＫＱＹＷＬＩＴＡＦＨＡＫＧＮＬＱＥＹＬＴＲＨＶＩＳＷＥＤＬＲＫＬＧＳＳＬＡＲＧＩＡＨＬＨＳＤＨＴＰＣＧＲＰＫＭＰＩＶＨＲＤＬＫＳＳＮＩＬＶＫＮＤＬＴＣＣＬＣＤＦＧＬＳＬＲＬＤＰＴＬＳＶＤＤＬＡＮＳＧＱＶＧＴＡＲＹＭＡＰＥＶＬＥＳＲＭＮＬＥＮＶＥＳＦＫＱＴＤＶＹＳＭＡＬＶＬＷＥＭＴＳＲＣＮＡＶＧＥＶＫＤＹＥＰＰＦＧＳＫＶＲＥＨＰＣＶＥＳＭＫＤＳＶＬＲＤＲＧＲＰＥＩＰＳＦＷＬＮＨＱＧＩＱＩＶＣＥＴＬＴＥＣＷＤＨＤＰＥＡＲＬＴＡＱＣＶＡＥＲＦＳＥＬＥＨＰＥＲＬＳＧＲＳＣＳＱＥＫＩＰＥＤＧＳＬＮＴＴＫ
配列番号８９ ＣＤ２０ ＣＡＲアミノ酸
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＥＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＮＭＨＷＶＫＱＴＰＧＱＧＬＥＷＩＧＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＮＱＫＦＫＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＤＹＹＣＡＲＳＮＹＹＧＳＳＹＷＦＦＤＶＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＶＬＴＱＳＰＡＩＬＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＮＹＭＤＷＹＱＫＫＰＧＳＳＰＫＰＷＩＹＡＴＳＮＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＲＶＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＦＮＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＴＳＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＧＥＮＬＹＦＱＳＧＧＤＴＱＡＬＬＲＮＤＱＶＹＱＰＬＲＤＲＤＤＡＱＹＳＨＬＧＧＮＧＧＳＧＥＲＰＰＰＶＰＮＰＤＹＥＰＩＲＫＧＱＲＤＬＹＳＧＬＮＱＲＧＧＳＧＤＫＱＴＬＬＰＮＤＱＬＹＱＰＬＫＤＲＥＤＤＱＹＳＨＬＱＧＮＧＧＳＧＲＫＱＲＩＴＥＴＥＳＰＹＱＥＬＱＧＱＲＳＤＶＹＳＤＬＮＴＱＧＧＳＧ
配列番号９０ ＬＣＡＲ－ＵＬ１８６Ｓ核酸
ＡＴＧＧＧＣＴＣＣＡＧＣＡＡＣＴＣＣＡＡＧＡＧＧＣＡＧＣＡＡＣＡＧＧＧＣＴＴＧＣＴＣＡＡＧＣＴＣＴＧＧＣＧＡＧＧＧＣＴＧＣＧＡＧＧＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＡＧＡＣＴＧＧＧＴＧＣＴＡＴＴＧＴＣＣＧＡＴＣＣＧＣＴＴＡＴＣＧＧＧＣＡＧＴＣＡＴＣＡＡＣＡＧＴＣＣＡＡＧＡＡＧＡＧＴＧＣＧＧＣＡＡＧＧＣＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＣＣＴＧＧＧＧＴＡＡＡＧＧＴＡＡＡＡＴＧＡＣＴＣＣＡＧＡＣＧＧＣＣＧＣＣＧＣＣＴＧＣＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＣＡＣＣＴＴＴＧＡＴＧＡＧＴＧＧＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＴＡＧＧＣＴＴＣＣＣＴＧＴＧＣＡＡＣＣＴＣＧＡＧＴＣＣＣＣＴＴＡＡＧＡＣＡＧＡＴＧＡＣＣＴＡＴＡＡＡＴＴＡＧＣＡＧＴＧＧＡＣＴＴＴＴＣＣＣＡＣＴＴＴＴＴＡＡＡＡＴＣＡＡＡＧＧＧＧＧＧＡＣＴＧＧＡＴＧＧＧＡＴＡＴＡＴＴＡＣＴＣＴＧＡＡＡＧＡＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＴＣＣＴＧＡＡＴＴＴＧＴＡＴＧＣＣＴＴＧＡＡＣＧＡＧＴＧＧＧＧＡＡＴＡＡＴＡＧＡＴＧＡＴＴＧＧＣＡＡＧＣＴＴＡＣＴＣＡＣＣＡＧＧＣＣＣＧＧＧＧＡＴＡＡＧＧＴＡＣＣＣＧＡＧＡＧＴＣＴＴＴＧＧＣＴＴＣＴＧＣＴＴＴＡＡＧＣＴＡＧＴＣＣＣＡＧＴＧＧＡＣＣＴＧＣＡＴＧＡＧＧＡＧＧＣＡＣＧＣＡＡＣＴＧＴＧＡＧＡＧＡＣＡＣＴＧＴＧＣＴＧＣＡＣＡＴＣＣＡＧＣＡＣＡＧＡＴＧＧＧＧＧＡＡＧＡＴＣＣＴＧＡＴＧＧＡＡＴＡＧＡＴＣＡＴＧＧＡＧＡＡＧＴＣＴＴＧＧＴＣＴＧＧＡＡＧＴＴＴＧＡＣＣＣＧＡＡＧＴＴＧＧＣＧＧＴＧＧＡＧＴＡＣＣＧＣＣＣＧＧＡＣＡＴＧＴＴＴＡＡＧＧＡＣＡＴＧＣＡＣＧＡＡＣＡＴＧＣＡＡＡＧＣＧＣＴＧＡＡＣＧＣＧＴＧＣＣＣＣＴＣＴＣＣＣＴＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＴＡＡＣＧＴＴＡＣＴＧＧＣＣＧＡＡＧＣＣＧＣＴＴＧＧＡＡＴＡＡＧＧＣＣＧＧＴＧＴＧＣＧＴＴＴＧＴＣＴＡＴＡＴＧＴＴＡＴＴＴＴＣＣＡＣＣＡＴＡＴＴＧＣＣＧＴＣＴＴＴＴＧＧＣＡＡＴＧＴＧＡＧＧＧＣＣＣＧＧＡＡＡＣＣＴＧＧＣＣＣＴＧＴＣＴＴＣＴＴＧＡＣＧＡＧＣＡＴＴＣＣＴＡＧＧＧＧＴＣＴＴＴＣＣＣＣＴＣＴＣＧＣＣＡＡＡＧＧＡＡＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＧＴＴＧＡＡＴＧＴＣＧＴＧＡＡＧＧＡＡＧＣＡＧＴＴＣＣＴＣＴＧＧＡＡＧＣＴＴＣＴＴＧＡＡＧＡＣＡＡＡＣＡＡＣＧＴＣＴＧＴＡＧＣＧＡＣＣＣＴＴＴＧＣＡＧＧＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＣＣＣＣＡＣＣＴＧＧＣＧＡＣＡＧＧＴＧＣＣＴＣＴＧＣＧＧＣＣＡＡＡＡＧＣＣＡＣＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＡＧＧＣＧＧＣＡＣＡＡＣＣＣＣＡＧＴＧＣＣＡＣＧＴＴＧＴＧＡＧＴＴＧＧＡＴＡＧＴＴＧＴＧＧＡＡＡＧＡＧＴＣＡＡＡＴＧＧＣＴＣＴＣＣＴＣＡＡＧＣＧＴＡＴＴＣＡＡＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＡＡＧＧＡＴＧＣＣＣＡＧＡＡＧＧＴＡＣＣＣＣＡＴＴＧＴＡＴＧＧＧＡＴＣＴＧＡＴＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＧＧＴＧＣＡＣＡＴＧＣＴＴＴＡＣＡＴＧＴＧＴＴＴＡＧＴＣＧＡＧＧＴＴＡＡＡＡＡＡＡＣＧＴＣＴＡＧＧＣＣＣＣＣＣＧＡＡＣＣＡＣＧＧＧＧＡＣＧＴＧＧＴＴＴＴＣＣＴＴＴＧＡＡＡＡＡＣＡＣＧＡＴＧＡＴＡＡＴＡＴＧＧＣＣＡＣＡＧＧＡＴＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＣＴＧＣＣＡＧＴＧＡＣＣＧＣＣＴＴＧＣＴＣＣＴＴＣＣＣＣＴＧＧＣＴＣＴＴＣＴＧＣＴＧＣＡＣＧＣＴＧＣＴＡＧＡＣＣＴＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＡＧＣＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＣＧＣＴＡＧＣＧＴＧＡＡＧＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＡＧＣＴＡＴＡＡＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＡＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＣＧＧＡＧＣＴＡＴＣＴＡＣＣＣＴＧＧＡＡＡＣＧＧＡＧＡＣＡＣＣＴＣＡＴＡＣＡＡＣＣＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＧＡＡＡＧＧＣＴＡＣＣＣＴＧＡＣＣＧＣＴＧＡＣＡＡＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＧＣＴＴＡＣＡＴＧＣＡＧＣＴＧＡＧＣＴＣＡＣＴＧＡＣＣＡＧＣＧＡＧＧＡＣＴＣＣＧＣＣＧＡＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＡＡＧＣＡＡＣＴＡＣＴＡＣＧＧＡＡＧＣＡＧＣＴＡＣＴＧＧＴＴＣＴＴＣＧＡＣＧＴＧＴＧＧＧＧＡＧＣＴＧＧＡＡＣＣＡＣＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＡＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＴＣＣＧＧＡＧＧＣＧＧＡＧＧＡＴＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＴＧＣＴＡＴＣＣＴＧＴＣＴＧＣＣＡＧＣＣＣＴＧＧＡＧＡＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＴＧＡＣＣＴＧＣＡＧＡＧＣＴＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＴＧＡＡＣＴＡＣＡＴＧＧＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＡＡＡＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＧＣＴＣＡＣＣＴＡＡＧＣＣＴＴＧＧＡＴＣＴＡＣＧＣＴＡＣＣＡＧＣＡＡＣＴＴＡＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＴＧＣＴＡＧＡＴＴＣＴＣＣＧＧＡＡＧＣＧＧＣＴＣＴＧＧＡＡＣＣＡＧＣＴＡＣＴＣＣＣＴＴＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＡＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＣＧＣＴＧＣＴＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＣＣＴＣＣＴＡＣＣＴＴＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＡＣＴＡＧＴＡＣＣＡＣＧＡＣＧＣＣＡＧＣＧＣＣＧＣＧＡＣＣＡＣＣＡＡＣＡＣＣＧＧＣＧＣＣＣＡＣＣＡＴＣＧＣＧＴＣＧＣＡＧＣＣＣＣＴＧＴＣＣＣＴＧＣＧＣＣＣＡＧＡＧＧＣＧＴＧＣＣＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＧＧＧＧＧＣＧＣＡＧＴＧＣＡＣＡＣＧＡＧＧＧＧＧＣＴＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＴＧＴＧＡＴＡＴＣＴＡＣＡＴＣＴＧＧＧＣＧＣＣＣＴＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＴＴＧＴＧＧＧＧＴＣＣＴＴＣＴＣＣＴＧＴＣＡＣＴＧＧＴＴＡＴＣＡＣＣＣＴＴＴＡＣＴＧＣＡＡＡＣＧＧＧＧＣＡＧＡＡＡＧＡＡＡＣＴＣＣＴＧＴＡＴＡＴＡＴＴＣＡＡＡＣＡＡＣＣＡＴＴＴＡＴＧＡＧＡＣＣＡＧＴＡＣＡＡＡＣＴＡＣＴＣＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＴＧＴＡＧＣＴＧＣＣＧＡＴＴＴＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＴＧＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＡＡＴＴＴＧＴＡＴＴＴＴＣＡＡＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＣＡＡＧＣＴＣＴＧＴＴＧＡＧＧＡＡＴＧＡＣＣＡＧＧＴＣＴＡＴＣＡＧＣＣＣＣＴＣＣＧＡＧＡＴＣＧＡＧＡＴＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＧＧＡＧＧＡＡＡＣＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＡＧＡＧＧＣＣＡＣＣＡＣＣＴＧＴＴＣＣＣＡＡＣＣＣＡＧＡＣＴＡＴＧＡＧＣＣＣＡＴＣＣＧＧＡＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＧＧＡＣＣＴＧＴＡＴＴＣＴＧＧＣＣＴＧＡＡＴＣＡＧＡＧＡＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＣＴＣＴＧＴＴＧＣＣＣＡＡＴＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＡＣＣＡＧＣＣＣＣＴＣＡＡＧＧＡＴＣＧＡＧＡＡＧＡＴＧＡＣＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＴＴＣＡＡＧＧＡＡＡＣＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＣＧＧＡＡＡＣＡＧＣＧＴＡＴＣＡＣＴＧＡＧＡＣＣＧＡＧＴＣＧＣＣＴＴＡＴＣＡＧＧＡＧＣＴＣＣＡＧＧＧＴＣＡＧＡＧＧＴＣＧＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＧＣＧＡＣＣＴＣＡＡＣＡＣＡＣＡＧＧＧＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＴＡＡ

Claims (49)

  1. ａ）ｉ）ＴＧＦβＲ１またはＴＧＦβＲ２のうちの一方の細胞外ドメインを含む第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）第１の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）ＩＬ－１２Ｒβ１またはＩＬ－２３Ｒのうちの一方の細胞内ドメインを含む第１の細胞内ドメイン、を含む、第１のポリペプチドと；
    ｂ）ｉ）ＴＧＦβＲ１またはＴＧＦβＲ２のうちの他方の細胞外ドメインを含む第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）第２の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）ＩＬ－１２Ｒβ１またはＩＬ－２３Ｒのうちの他方の細胞内ドメインを含む第２の細胞内ドメイン、を含む、第２のポリペプチドと
    を含む、融合タンパク質。
  2. 前記第１の膜貫通ドメイン及び前記第２の膜貫通ドメインが各々、ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２、ＩＬ－１２Ｒβ１、及びＩＬ－２３Ｒのうちの１つの膜貫通ドメインを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
  3. 前記第１の膜貫通ドメイン及び前記第２の膜貫通ドメインが各々、ＩＬ－１２Ｒβ１またはＩＬ－２３Ｒのうちの一方の膜貫通ドメインを含む、請求項２に記載の融合タンパク質。
  4. ａ）前記第１の細胞外ドメインがＴＧＦβＲ１の細胞外ドメインを含み、前記第１の膜貫通ドメインがＴＧＦβＲ１の膜貫通ドメインを含み、前記第１の細胞内ドメインがＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインを含み、前記第２の細胞外ドメインがＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインを含み、前記第２の膜貫通ドメインがＴＧＦβＲ２の膜貫通ドメインを含み、前記第２の細胞内ドメインがＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメインを含むか；
    ｂ）前記第１の細胞外ドメインがＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインを含み、前記第１の膜貫通ドメインがＴＧＦβＲ２の膜貫通ドメインを含み、前記第１の細胞内ドメインがＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインを含み、前記第２の細胞外ドメインがＴＧＦβＲ１の細胞外ドメインを含み、前記第２の膜貫通ドメインがＴＧＦβＲ１の膜貫通ドメインを含み、前記第２の細胞内ドメインがＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメインを含むか；
    ｃ）前記第１の細胞外ドメインがＴＧＦβＲ１の細胞外ドメインを含み、前記第１の膜貫通ドメインがＩＬ－２３Ｒの膜貫通ドメインを含み、前記第１の細胞内ドメインがＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインを含み、前記第２の細胞外ドメインがＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインを含み、前記第２の膜貫通ドメインがＩＬ－１２Ｒβ１の膜貫通ドメインを含み、前記第２の細胞内ドメインがＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメインを含むか；または、
    ｄ）前記第１の細胞外ドメインがＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインを含み、前記第１の膜貫通ドメインがＩＬ－２３Ｒの膜貫通ドメインを含み、前記第１の細胞内ドメインがＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインを含み、前記第２の細胞外ドメインがＴＧＦβＲ１の細胞外ドメインを含み、前記第２の膜貫通ドメインがＩＬ－１２Ｒβ１の膜貫通ドメインを含み、前記第２の細胞内ドメインがＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメインを含む、
    請求項１～３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  5. 前記第１の細胞外ドメインがＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインを含み、前記第１の膜貫通ドメインがＩＬ－２３Ｒの膜貫通ドメインを含み、前記第１の細胞内ドメインがＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインを含み、前記第２の細胞外ドメインがＴＧＦβＲ１の細胞外ドメインを含み、前記第２の膜貫通ドメインがＩＬ－１２Ｒβ１の膜貫通ドメインを含み、前記第２の細胞内ドメインがＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメインを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  6. 前記第１のポリペプチド及び／または前記第２のポリペプチドが、ポリペプチドのＮ末端においてシグナルペプチドをさらに含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  7. 前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドが単一ポリペプチドの状態であり、前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドがマルチシストロン性エレメントによって分離されている、請求項１～６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  8. 前記マルチシストロン性エレメントが、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、またはＦ２Ａからなる群から選択される２Ａ自己切断ペプチドを含む、請求項７に記載の融合タンパク質。
  9. 前記第１のポリペプチドが、前記第２のポリペプチドにとってＮ末端側である、請求項７または請求項８に記載の融合タンパク質。
  10. 前記第１のポリペプチドが、前記第２のポリペプチドにとってＣ末端側である、請求項７または請求項８に記載の融合タンパク質。
  11. 前記単一ポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端の方向へ、
    ａ）ＴＧＦβＲ１の細胞外ドメインを含む前記第１の細胞外ドメイン、ＴＧＦβＲ１の膜貫通ドメインを含む前記第１の膜貫通ドメイン、ＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインを含む前記第１の細胞内ドメイン、２Ａ自己切断ペプチド、ＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインを含む前記第２の細胞外ドメイン、ＴＧＦβＲ２の膜貫通ドメインを含む前記第２の膜貫通ドメイン、及びＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメインを含む前記第２の細胞内ドメイン；
    ｂ）ＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインを含む前記第１の細胞外ドメイン、ＴＧＦβＲ２の膜貫通ドメインを含む前記第１の膜貫通ドメイン、ＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインを含む前記第１の細胞内ドメイン、２Ａ自己切断ペプチド、ＴＧＦβＲ１の細胞外ドメインを含む前記第２の細胞外ドメイン、ＴＧＦβＲ１の膜貫通ドメインを含む前記第２の膜貫通ドメイン、及びＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメインを含む前記第２の細胞内ドメイン；
    ｃ）ＴＧＦβＲ１の細胞外ドメインを含む前記第１の細胞外ドメイン、ＴＧＦβＲ１の膜貫通ドメインを含む前記第１の膜貫通ドメイン、ＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメインを含む前記第１の細胞内ドメイン、２Ａ自己切断ペプチド、ＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインを含む前記第２の細胞外ドメイン、ＴＧＦβＲ２の膜貫通ドメインを含む前記第２の膜貫通ドメイン、及びＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインを含む前記第２の細胞内ドメイン；
    ｄ）ＴＧＦβＲ１の細胞外ドメインを含む前記第１の細胞外ドメイン、ＩＬ－２３Ｒの膜貫通ドメインを含む前記第１の膜貫通ドメイン、ＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインを含む前記第１の細胞内ドメイン、２Ａ自己切断ペプチド、ＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインを含む前記第２の細胞外ドメイン、ＩＬ－１２Ｒβ１の膜貫通ドメインを含む前記第２の膜貫通ドメイン、及びＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメインを含む前記第２の細胞内ドメイン；
    ｅ）ＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインを含む前記第１の細胞外ドメイン、ＩＬ－２３Ｒの膜貫通ドメインを含む前記第１の膜貫通ドメイン、ＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインを含む前記第１の細胞内ドメイン、２Ａ自己切断ペプチド、ＴＧＦβＲ１の細胞外ドメインを含む前記第２の細胞外ドメイン、ＩＬ－１２Ｒβ１の膜貫通ドメインを含む前記第２の膜貫通ドメイン、及びＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメインを含む前記第２の細胞内ドメイン；または
    ｆ）ＴＧＦβＲ１の細胞外ドメインを含む前記第１の細胞外ドメイン、ＩＬ－１２Ｒβ１の膜貫通ドメインを含む前記第１の膜貫通ドメイン、ＩＬ－１２Ｒβ１の細胞内ドメインを含む前記第１の細胞内ドメイン、２Ａ自己切断ペプチド、ＴＧＦβＲ２の細胞外ドメインを含む前記第２の細胞外ドメイン、ＩＬ－２３Ｒの膜貫通ドメインを含む前記第２の膜貫通ドメイン、及びＩＬ－２３Ｒの細胞内ドメインを含む前記第２の細胞内ドメイン
    を含む、請求項７～９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  12. 前記第１の細胞外ドメイン及び前記第２の細胞外ドメインが、ＴＧＦβに対する結合部位を形成し、前記第１の細胞内ドメイン及び前記第２の細胞内ドメインが、ＩＬ－２３受容体複合体を形成し、ＴＧＦβへの前記融合タンパク質の結合により前記ＩＬ－２３受容体複合体を介するシグナリングが伝達される、請求項１～６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  13. ａ）ＩＬ－２３Ｒの前記膜貫通ドメインが、配列番号７のアミノ酸配列、もしくは少なくとも約９０％の配列同一性を有する機能的バリアントを含む；
    ｂ）ＩＬ－１２Ｒβ１の前記膜貫通ドメインが、配列番号８のアミノ酸配列、もしくは少なくとも約９０％の配列同一性を有する機能的バリアントを含む；
    ｃ）ＴＧＦβＲ１の前記膜貫通ドメインが、配列番号５のアミノ酸配列、もしくは少なくとも約９０％の配列同一性を有する機能的バリアントを含む；及び／または
    ｄ）ＴＧＦβＲ２の前記膜貫通ドメインが、配列番号６のアミノ酸配列、もしくは少なくとも約９０％の配列同一性を有する機能的バリアントを含む、
    請求項２～１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  14. ａ）ＴＧＦβＲ１の前記細胞外ドメインが、配列番号３のアミノ酸配列、もしくは少なくとも約９０％の配列同一性を有する機能的バリアントを含む；
    ｂ）ＴＧＦβＲ２の前記細胞外ドメインが、配列番号４のアミノ酸配列、もしくは少なくとも約９０％の配列同一性を有する機能的バリアントを含む；
    ｃ）ＩＬ－２３Ｒの前記細胞内ドメインが、配列番号１５のアミノ酸配列、もしくは少なくとも約９０％の配列同一性を有する機能的バリアントを含む；及び／または
    ｄ）ＩＬ－１２Ｒβ１の前記細胞内ドメインが、配列番号１６のアミノ酸配列、もしくは少なくとも約９０％の配列同一性を有する機能的バリアントを含む、
    請求項１～１３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  15. １）ａ）ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む第１の膜貫通ドメイン、ｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む第１の細胞内ドメイン、を含む、第１のポリペプチドと；ｂ）ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含む第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含む第２の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）配列番号１６を含む第２の細胞内ドメイン、を含む、第２のポリペプチドとを含むか；
    ２）ａ）ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含む第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含む第１の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む第１の細胞内ドメイン、を含む、第１のポリペプチドと；ｂ）ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含む第２の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む第２の細胞内ドメイン、を含む、第２のポリペプチドとを含むか；
    ３）ａ）ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含む第１の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む第１の細胞内ドメイン、を含む、第１のポリペプチドと；ｂ）ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含む第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含む第２の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む第２の細胞内ドメイン、を含む、第２のポリペプチドとを含むか；または
    ４）ａ）ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含む第１の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含む第１の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含む第１の細胞内ドメイン、を含む、第１のポリペプチドと；ｂ）ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む第２の細胞外ドメイン、ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含む第２の膜貫通ドメイン、及びｉｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む第２の細胞内ドメイン、を含む、第２のポリペプチドとを含む、
    請求項１～１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  16. 前記第１のポリペプチド及び／または前記第２のポリペプチドが、２つのドメインの間にリンカーをさらに含み、前記２つのドメインのうちの一方が膜貫通ドメインであり、他方のドメインが細胞外ドメインまたは細胞内ドメインである、請求項１～１５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  17. 前記リンカーが膜近傍配列を含み、前記膜近傍配列及び前記膜貫通ドメインが、同じ分子に由来する、請求項１６に記載の融合タンパク質。
  18. 前記膜近傍領域が、配列番号９～１２のうちの任意のものにおいて示されるアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の融合タンパク質。
  19. ａ）前記第１のポリペプチドが、配列番号４９のアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチドが、配列番号５０のアミノ酸配列を含むか；
    ｂ）前記第１のポリペプチドが、配列番号５０のアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチドが、配列番号４９のアミノ酸配列を含むか；
    ｃ）前記第１のポリペプチドが、配列番号５１のアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチドが、配列番号５２のアミノ酸配列を含むか；
    ｄ）前記第１のポリペプチドが、配列番号５３のアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチドが、配列番号５４のアミノ酸配列を含むか；
    ｅ）前記第１のポリペプチドが、配列番号５５のアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチドが、配列番号５６のアミノ酸配列を含むか；または
    ｆ）前記第１のポリペプチドが、配列番号５６のアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチドが、配列番号５５のアミノ酸配列を含む、
    請求項１～１８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  20. 配列番号２０～２５のうちの任意のものにおいて示されるアミノ酸配列を含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
  21. 請求項１～１８のいずれか１項に記載の融合タンパク質またはその一部をコードする１つまたは複数の核酸配列を含む、核酸。
  22. 配列番号２８～３３のうちの任意のものにおいて示される核酸配列を含む、核酸。
  23. 前記核酸が、機能的外来性受容体をコードする第２の核酸配列をさらに含み、前記機能的外来性受容体が、細胞外リガンド結合領域及び任意選択で細胞内シグナリングドメインを含む、請求項２１または請求項２２に記載の核酸。
  24. 前記機能的外来性受容体が、操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞抗原カプラー（Ｔ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｃｏｕｐｌｅｒ）（ＴＡＣ）、またはそれらの一部からなる群から選択される、請求項２３に記載の核酸。
  25. 前記機能的外来性受容体が、腫瘍抗原を特異的に認識する、請求項２３または請求項２４に記載の核酸。
  26. 前記機能的外来性受容体が、腫瘍抗原を特異的に認識するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、請求項２３～３５のいずれか１項に記載の核酸。
  27. 前記ＣＡＲが、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＣＤ１３８、ＣＤ１２３／ＩＬ３Ｒα、ｃ－Ｍｅｔ、ｇｐ１００、ＭＵＣ１、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ／ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ２、ＩＧＦ１Ｒ、メソテリン、ＰＳＭＡ、ＷＴ１、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、ＧＤ－２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＧＥ Ａ３、ＧＰＣ３、クローディン１８．２、糖脂質Ｆ７７、ＰＤ－Ｌ１、及び／またはＰＤ－Ｌ２を特異的に認識する、請求項２６に記載の核酸。
  28. 前記ＣＡＲが、配列番号５８もしくは８９において示されるアミノ酸配列、または少なくとも約９０％の配列同一性を有する機能的バリアントを含む、請求項２７に記載の核酸。
  29. 前記機能的外来性受容体をコードする前記核酸配列が、前記融合タンパク質をコードする１つまたは複数の核酸配列（「融合タンパク質核酸配列」）のうちの少なくとも１つに対して上流または下流であり、任意選択で、機能的外来性受容体核酸配列及び前記融合タンパク質核酸配列が、第２のマルチシストロン性エレメントをコードする第３の核酸配列によって分離されている、請求項２３～２８のいずれか１項に記載の核酸。
  30. 請求項２１～２９のいずれか１項に記載の核酸を含む、ベクター。
  31. 請求項１～２０のいずれか１項に記載の融合タンパク質、請求項２１もしくは２２に記載の核酸、及び／または請求項３０に記載のベクター
    を含む、操作された細胞。
  32. 機能的外来性受容体をさらに含み、前記機能的外来性受容体が、細胞外リガンド結合ドメイン及び任意選択で細胞内シグナリングドメインを含む、請求項３１に記載の操作された細胞。
  33. 前記機能的外来性受容体が、操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞抗原カプラー（ＴＡＣ）、またはそれらの一部からなる群から選択される、請求項３２に記載の操作された細胞。
  34. 前記機能的外来性受容体が、腫瘍抗原を特異的に認識する、請求項３３に記載の操作された細胞。
  35. 請求項２３～２９のいずれか１項に記載の核酸を含む、操作された細胞。
  36. 免疫細胞である、請求項３１～３５のいずれか１項に記載の操作された細胞。
  37. Ｔ細胞、ＮＫ細胞、末梢性血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、造血幹細胞、多能性幹細胞、胚性幹細胞、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３６に記載の操作された細胞。
  38. 請求項３１～３７のいずれか１項に記載の操作された細胞を含む、医薬組成物。
  39. 請求項３８に記載の医薬組成物を個体へ投与することを含む、前記個体の疾患または病態を治療する方法。
  40. 前記疾患または病態が免疫抑制と関連する、請求項３９に記載の方法。
  41. 請求項３８に記載の医薬組成物を個体へ投与することを含む、前記個体中の疾患のある組織における免疫抑制シグナルを低減する方法。
  42. 前記免疫抑制シグナルを低減することが、ＴＧＦβＲを介してシグナリングを減少させることを含む、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記疾患のある組織が、前記疾患または病態の無い個体中の対応する組織よりも高い発現レベルのＴＧＦβを有する、請求項３９～４２のいずれか１項に記載の方法。
  44. 前記疾患または病態ががんである、請求項３９～４３のいずれか１項に記載の方法。
  45. 前記がんが、固形腫瘍または液性腫瘍である、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記疾患または病態が、感染性疾患、または感染症と関連する病態である、請求項３９～４３のいずれか１項に記載の方法。
  47. 前記医薬組成物中の前記操作された細胞が、前記個体に対して同種異系である、請求項３９～４６のいずれか１項に記載の方法。
  48. 前記医薬組成物中の前記操作された細胞が、前記個体に対して自己由来である、請求項３９～４６のいずれか１項に記載の方法。
  49. 第２の治療法、または、第２の作用物質を投与することをさらに含む、請求項３９～４８のいずれか１項に記載の方法。
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