CN108815210B - 一种高效提取银杏黄酮的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高效提取银杏黄酮的方法，采用半仿生酶法提取银杏叶中的总黄酮成分，经粉碎、浸渍、酶提、干燥得到浸膏。本发明通过模拟药物在人体内不同pH环境，选择性提取活性成分；以种子籽粉末为酶原料，破坏银杏叶细胞壁达到加快黄酮提取的目的。本方法提取率高、提取条件温和、操作简单、环境友好、适合工业化生产。

Description

一种高效提取银杏黄酮的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效提取银杏黄酮的方法。
背景技术
银杏(GinkgobilobaL.)，又名白果，为银杏科银杏属落叶乔木，是现存种子植物中最古老的孑遗树种，系我国特种盛产植物，全年银杏叶产量约占全球80％。《本草纲目》记载，银杏具有敛肺平喘、止遗尿、白带的作用。《食疗本草》记载，银杏叶可用于心悸怔忡、肺虚咳喘等病症。银杏叶中含大量银杏黄酮等活性成分，2015药典规定银杏叶提取物黄酮含量不小于24％。药理实验研究表明，银杏黄酮具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎镇痛、改善心脑血管、降低血糖等多种生物活性，市场开发前景巨大。
银杏叶中总黄酮的传统提取方法为乙醇提取法和热水提取法。乙醇提取法提取率高，但溶剂用量多成本高，且存在溶剂残留风险，如CN106109511A需8倍量乙醇提取3次，CN102727538A在超声辅助下10倍量乙醇提取2次。热水提取法成本低，但提取时间较长，高温容易破坏活性结构。如CN104387356A需要60℃热水提取9h，CN101904877A需碱性热水提取4h。由于传统提取方法存在一定的缺陷，酶辅助提取技术逐渐出现。CN102093326A、CN102106877A等均采用纤维素酶、果胶酶等酶辅助加快银杏黄酮的提取方法，但存在酶本身成本较高，不适合工业化的问题。
西瓜籽、龙眼籽、苹果籽、葡萄籽、樱桃籽等水果籽中含大量β-葡萄糖苷酶等，可破坏植物细胞壁，加快细胞内成分提取。因此，研发出一种以种子籽为酶原料，高效提取银杏黄酮的方法具有重要的应用价值。
发明内容
发明目的：本发明目的在于针对现有技术的不足，提供一种高效提取银杏黄酮的方法。
本发明结合半仿生法选择性提取活性成分和酶法提取效率高的特点，采用半仿生酶法提取银杏叶中总黄酮，首次以废弃的西瓜籽、龙眼籽、苹果籽等种子籽为酶原料，提取工艺简单、试剂成本低廉、适合工业化生产。
技术方案：本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种高效提取银杏黄酮的方法，包括以下步骤：
(1)粉碎：将银杏叶于70℃～80℃烘干，粉碎，过200目筛；
(2)浸渍：称取银杏叶粉，加入pH 1.5～3.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，提取1～
2h后过滤，得到滤饼I，收集滤液I；所述银杏叶粉和磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的重量比为1:10～30；
(3)酶提：向步骤(2)的滤饼I中加入pH 3.6磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液和种子粉，提取1～2h后过滤，得到滤饼II，收集滤液II；向滤饼II中加入pH 7.4磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液和种子粉，提取1～2h后过滤，得到滤饼III，收集滤液III；向滤饼III中加入pH 8.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液和种子粉，提取1～2h后过滤，收集滤液IV；每次提取时，所述银杏叶粉、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液和种子粉的重量比为1:(10～30)：(0.005～0.05)；
(4)干燥：合并滤液I、滤液II、滤液III、滤液IV；浓缩滤液，干燥得到浸膏。
优选地，所述种子粉为水果籽粉末。
进一步优选地，所述种子粉为西瓜籽粉、龙眼籽粉、苹果籽粉、葡萄籽粉、樱桃籽粉末。
更进一步优选地，所述种子粉为西瓜籽粉末。
优选地，所述步骤(2)中银杏叶粉和磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的重量比为1:14。溶剂太少，提取不充分；溶剂太多，废水量大。
优选地，所述步骤(2)中提取温度为40℃～70℃；进一步优选地，所述步骤(2)中提取温度为50℃。温度太低，提取不充分；温度太高，容易使黄酮降解。
优选地，所述步骤(2)中磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的酸碱度为pH 2.2。酸性过小，提取不充分；酸性过大，酶活性低。
优选地，所述步骤(3)中银杏叶粉、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液和种子粉的重量比为1:14:0.02。酶量太少，提取不充分；酶量太多，成本提高。
优选地，所述步骤(3)中提取温度为40℃～70℃；进一步优选地，所述步骤(3)中提取温度为50℃。温度太低，提取不充分；温度太高，容易使黄酮降解。
优选地，所述步骤(4)采用真空干燥，干燥温度为60℃～80℃。进一步优选地，所述步骤(4)中真空干燥温度为70℃。温度太低，干燥不充分；温度太高，容易使黄酮降解。
优选地，所述种子粉的制备方法为：用-4℃丙酮和乙酸乙酯先后洗涤种子，-40℃冷冻干燥12h，粉碎，过200目筛。采用经脱水去脂以及粉碎过筛处理制备得到的种子粉，加快了种子中活性蛋白酶成分对银杏叶细胞内成分的提取。
有益效果：本发明具有如下优点：
(1)本发明结合半仿生法选择性提取活性成分和酶法提取效率高的特点，采用半仿生酶法提取银杏叶中总黄酮，首次以种子籽粉末为酶原料，提取工艺简单、试剂成本低廉、适合工业化生产。
(2)本发明利用水果籽粉进行半仿生酶法提取银杏黄酮的提取率高，达1.43％以上，远优于一般的酶辅助提取法，如专利CN102093326A银杏黄酮的提取率为0.71％、专利CN102106877A银杏黄酮的提取率为0.77％。
(3)本发明利用废弃的水果籽为酶原料，成本低廉、绿色环保。
附图说明
图1为本发明高效提取银杏黄酮的工艺流程图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明技术方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。
本发明的实施例采用水果籽粉作为酶原料，采用以下方法制得水果籽粉：
将西瓜籽、龙眼籽、苹果籽、葡萄籽、樱桃籽等水果籽清水洗净，用-4℃丙酮和乙酸乙酯先后洗涤2次，-40℃冷冻干燥12h，粉碎，过200目筛。
实施例1
一种高效提取银杏黄酮的方法，包括以下步骤：
(1)粉碎：将干净新鲜银杏叶于80℃烘干，粉碎，过200目筛；
(2)浸渍：称取银杏叶粉20g，加入pH 2.2磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液280g，50℃提取1h后过滤，得到滤饼I，收集滤液I；
(3)酶提：向步骤(2)的滤饼I中加入pH 3.6磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液280g和西瓜籽粉0.4g，50℃提取2h后过滤，得到滤饼II，收集滤液II；向滤饼II中加入pH 7.4磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液280g和西瓜籽粉0.4g，50℃提取2h后过滤，得到滤饼III，收集滤液III；向滤饼III中加入pH 8.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液280g和西瓜籽粉0.4g，50℃提取2h后过滤，收集滤液IV；
(4)干燥：合并滤液I、滤液II、滤液III、滤液IV；浓缩滤液，60℃真空干燥得浸膏1.25g。
对浸膏中的银杏总黄酮进行测定：采用紫外分光光度法测定总黄酮。
(1)标准曲线的建立：以芦丁为总黄酮对照品，精密称取0.1g/L芦丁对照品溶液0mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL，分别放入10ml容量瓶，各加入使溶液体积为5.0mL 30％乙醇，然后加5％的亚硝酸钠溶液0.3mL，摇匀，5min后加入10％的硝酸铝溶液0.3mL，摇匀，5min后各加入1mol/L氢氧化钠4.0mL，用蒸馏水稀释至刻度，充分摇匀5min后，以第一瓶作空白，在510nm波长下测定各瓶的吸光度A为纵坐标，浓度c为横坐标，绘制A-c标准曲线，采用二元回归法得吸光度(Y)对芦丁浓度(X)g/L之间回归方程：Y＝6.21X-0.0107。
(2)含量测定：用60％的乙醇溶解步骤(4)得到的银杏叶浸膏，定容至250mL，测定吸光度得到银杏黄酮浓度，根据以下公式计算银杏黄酮提取率为1.61％，浸膏中银杏黄酮纯度为25.8％。
银杏黄酮提取率＝(银杏黄酮浓度(g/L)×0.25)/银杏叶重量(g)×100％。
浸膏中银杏黄酮纯度＝(银杏黄酮浓度(g/L)×0.25)/浸膏重量(g)×100％。
实施例2
一种高效提取银杏黄酮的方法，包括以下步骤：
(1)粉碎：将干净新鲜银杏叶于70℃烘干，粉碎，过200目筛；
(2)浸渍：称取银杏叶粉20g，加入pH 3.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液300g，70℃提取1h后过滤，得到滤饼I，收集滤液I；
(3)酶提：向步骤(2)的滤饼I中加入pH 3.6磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液300g和龙眼籽粉0.1g，70℃提取1h后过滤，得到滤饼II，收集滤液II；向滤饼II中加入pH 7.4磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液300g和龙眼籽粉0.1g，70℃提取1h后过滤，得到滤饼III，收集滤液III；向滤饼III中加入pH 8.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液300g和龙眼籽粉0.1g，70℃提取1h后过滤，收集滤液IV；
(4)干燥：合并滤液I、滤液II、滤液III、滤液IV；浓缩滤液，70℃真空干燥得浸膏1.13g。
按照实施例1中的方法测定银杏黄酮提取率为1.43％，浸膏中银杏黄酮纯度为25.2％。
实施例3
一种高效提取银杏黄酮的方法，包括以下步骤：
(1)粉碎：将干净新鲜银杏叶于80℃烘干，粉碎，过200目筛；
(2)浸渍：称取银杏叶粉20g，加入pH 2.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液400g，60℃提取1.5h后过滤，得到滤饼I，收集滤液I；
(3)酶提：向步骤(2)的滤饼I中加入pH 3.6磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液400g和苹果籽粉0.2g，60℃提取1.5h后过滤，得到滤饼II，收集滤液II；向滤饼II中加入pH 7.4磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液400g和苹果籽粉0.2g，60℃提取1.5h后过滤，得到滤饼III，收集滤液III；向滤饼III中加入pH 8.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液400g和苹果籽粉0.2g，60℃提取1.5h后过滤，收集滤液IV；
(4)干燥：合并滤液I、滤液II、滤液III、滤液IV；浓缩滤液，80℃真空干燥得浸膏1.19g。
按照实施例1中的方法测定银杏黄酮提取率为1.52％，浸膏中银杏黄酮纯度为25.5％。
实施例4
一种高效提取银杏黄酮的方法，包括以下步骤：
(1)粉碎：将干净新鲜银杏叶于75℃烘干，粉碎，过200目筛；
(2)浸渍：称取银杏叶粉20g，加入pH 2.5磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液200g，40℃提取1h后过滤，得到滤饼I，收集滤液I；
(3)酶提：向步骤(2)的滤饼I中加入pH 3.6磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液200g和葡萄籽粉0.3g，40℃提取1h后过滤，得到滤饼II，收集滤液II；向滤饼II中加入pH 7.4磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液200g和葡萄籽粉0.3g，40℃提取1h后过滤，得到滤饼III，收集滤液III；向滤饼III中加入pH 8.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液200g和葡萄籽粉0.3g，40℃提取1h后过滤，收集滤液IV；
(4)干燥：合并滤液I、滤液II、滤液III、滤液IV；浓缩滤液，70℃真空干燥得浸膏1.16g。
按照实施例1中的方法测定银杏黄酮提取率为为1.47％，浸膏中黄酮含量为25.3％。
实施例5
一种高效提取银杏黄酮的方法，包括以下步骤：
(1)粉碎：将干净新鲜银杏叶于70℃烘干，粉碎，过200目筛；
(2)浸渍：称取银杏叶粉20g，加入pH 1.5磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液500g，50℃提取2h后过滤，得到滤饼I，收集滤液I；
(3)酶提：向步骤(2)的滤饼I中加入pH 3.6磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液500g和樱桃籽粉0.6g，50℃提取2h后过滤，得到滤饼II，收集滤液II；向滤饼II中加入pH 7.4磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液500g和樱桃籽粉0.6g，50℃提取2h后过滤，得到滤饼III，收集滤液III；向滤饼III中加入pH 8.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液500g和樱桃籽粉0.6g，50℃提取2h后过滤，收集滤液IV；
(4)干燥：合并滤液I、滤液II、滤液III、滤液IV；浓缩滤液，80℃真空干燥得浸膏1.21g。
按照实施例1中的方法测定银杏黄酮提取率为1.56％，浸膏中银杏黄酮纯度为25.7％。
实施例6
一种高效提取银杏黄酮的方法，包括以下步骤：
(1)粉碎：将干净新鲜银杏叶于75℃烘干，粉碎，过200目筛；
(2)浸渍：称取银杏叶粉20g，加入pH 2.2磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液600g，60℃提取2h后过滤，得到滤饼I，收集滤液I；
(3)酶提：向步骤(2)的滤饼I中加入pH 3.6磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液600g和西瓜籽粉1.0g，60℃提取2h后过滤，得到滤饼II，收集滤液II；向滤饼II中加入pH 7.4磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液600g和西瓜籽粉1.0g，60℃提取2h后过滤，得到滤饼III，收集滤液III；向滤饼III中加入pH 8.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液600g和西瓜籽粉1.0g，60℃提取2h后过滤，收集滤液IV；
(4)干燥：合并滤液I、滤液II、滤液III、滤液IV；浓缩滤液，70℃真空干燥得浸膏1.20g。
按照实施例1中的方法测定银杏黄酮提取率为1.54％，浸膏中银杏黄酮纯度为25.6％。
对比例1：水提法
银杏叶的粉碎方法、干燥方法同本发明实施例2。
取银杏叶粉20g，蒸馏水280g，50℃提取2h，过滤，收集滤液，浓缩干燥得浸膏，测得银杏黄酮提取率为0.86％，浸膏中银杏黄酮纯度为24.3％。
对比例2：醇提法
银杏叶的粉碎方法、干燥方法同本发明实施例2。
取银杏叶粉20g，50％乙醇280g，50℃提取2h，过滤，收集滤液，浓缩干燥得浸膏，测得银杏黄酮提取率为1.09％，浸膏中银杏黄酮纯度为25.1％。
对比例3：普通酶提法一
银杏叶的粉碎方法、干燥方法同本发明实施例2。
取银杏叶粉20g，西瓜籽粉0.2g，蒸馏水280g，50℃提取2h，过滤，收集滤液，浓缩干燥得浸膏，测得银杏黄酮提取率为1.02％，浸膏中银杏黄酮纯度为24.9％。
对比例4：普通酶提法二
银杏叶的粉碎方法、干燥方法同本发明实施例2。
取银杏叶粉20g，西瓜籽粉0.2g，50％乙醇280g，50℃提取2h，过滤，收集滤液，浓缩干燥得浸膏，测得银杏黄酮提取率为1.27％，浸膏中银杏黄酮纯度为24.5％。
将本发明实施例1～6与对比例1～4的银杏黄酮提取结果进行对比，见表1：
表1本发明实施例与对比例银杏黄酮提取结果比较
银杏黄酮提取率(％) 银杏黄酮纯度(％)
实施例1 1.61 25.8
实施例2 1.43 25.2
实施例3 1.52 25.5
实施例4 1.47 25.3
实施例5 1.56 25.7
实施例6 1.54 25.6
对比例1 0.86 24.3
对比例2 1.09 25.1
对比例3 1.02 24.9
对比例4 1.27 24.5
由表1可知，本发明的方法利用水果籽粉进行半仿生酶法提取银杏黄酮，相比较于传统的水提法、醇提法、单纯采用酶法提取银杏黄酮的方法，本发明方法的银杏黄酮提取率更高，达1.43％以上。
此外，与现有专利文献报道相比，本发明远优于一般的酶辅助提取法。如专利CN102093326A中银杏黄酮的提取率为0.71％、专利CN102106877A中银杏黄酮的提取率为0.77％。同时，本发明结合半仿生法选择性提取活性成分和酶法提取效率高的特点，采用半仿生酶法提取银杏叶中总黄酮，首次以种子籽为酶原料，提取工艺简单、试剂成本低廉、绿色环保、适合工业化生产。
如上所述，尽管参照特定的优选实施例已经表示和表述了本发明，但其不得解释为对本发明自身的限制。在不脱离所附权利要求定义的本发明的精神和范围前提下，可对其在形式上和细节上作出各种变化。

Claims (7)

1.一种高效提取银杏黄酮的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）粉碎：将银杏叶于70℃~80℃烘干，粉碎，过200目筛；
（2）浸渍：称取银杏叶粉，加入pH 1.5~3.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，提取1~2h后过滤，得到滤饼I，收集滤液I；所述银杏叶粉和磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的重量比为1:10~30；
（3）酶提：向步骤（2）的滤饼I中加入pH 3.6磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液和种子粉，提取1~2 h后过滤，得到滤饼II，收集滤液II；向滤饼II中加入pH 7.4磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液和种子粉，提取1~2 h后过滤，得到滤饼III，收集滤液III；向滤饼III中加入pH 8.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液和种子粉，提取1~2 h后过滤，收集滤液IV；每次提取时，所述银杏叶粉、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液和种子粉的重量比为1:（10~30）：（0.005~0.05）；
（4）干燥：合并滤液I、滤液II、滤液III、滤液IV；浓缩滤液，干燥得到浸膏；
所述种子粉为西瓜籽粉、龙眼籽粉、苹果籽粉、葡萄籽粉、樱桃籽粉末；
所述种子粉的制备方法为：用-4℃丙酮和乙酸乙酯先后洗涤种子，-40℃冷冻干燥12h，粉碎，过200目筛。
2.根据权利要求1所述的高效提取银杏黄酮的方法，其特征在于，所述步骤（2）中银杏叶粉和磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的重量比为1:14。
3.根据权利要求1所述的高效提取银杏黄酮的方法，其特征在于，所述步骤（2）中提取温度为40℃~70℃。
4.根据权利要求1所述的高效提取银杏黄酮的方法，其特征在于，所述步骤（2）中磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液的酸碱度为pH 2.2。
5.根据权利要求1所述的高效提取银杏黄酮的方法，其特征在于，所述步骤（3）中银杏叶粉、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液和种子粉的重量比为1:14:0.02。
6.根据权利要求1所述的高效提取银杏黄酮的方法，其特征在于，所述步骤（3）中提取温度为40℃~70℃。
7.根据权利要求1所述的高效提取银杏黄酮的方法，其特征在于，所述步骤（4）采用真空干燥，干燥温度为60℃~80℃。
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