CN108743532B - 一种黄酮醇-蛋白复合物及其制备方法 - Google Patents

一种黄酮醇-蛋白复合物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种黄酮醇‑蛋白复合物的制备方法，属于黄酮醇类复合物技术领域，所述方法包括以下步骤：1)用乙醇充分溶解黄酮醇类物质和乳清蛋白后，进行第一旋转蒸发去除乙醇获得混合物质；2)将所述混合物质与磷酸缓冲液混合后，进行第二旋转蒸发获得胶束溶液；所述磷酸缓冲液的pH值为7.1～7.8；所述磷酸缓冲液的浓度为30～80mM；3)将所述胶束溶液置于32～38℃孵育8～10h后，离心，收集上清液为黄酮醇‑蛋白复合物。本发明提供的方法制备获得的黄酮醇‑蛋白复合物大大的提高了黄酮醇类物质的溶解度；并且本发明提供的黄酮醇‑蛋白复合物具有良好的自由基清除能力。

Description

一种黄酮醇-蛋白复合物及其制备方法
技术领域
本发明属于黄酮醇类复合物技术领域，尤其涉及一种黄酮醇-蛋白复合物及其制备方法。
背景技术
黄酮醇类物质的结构特点是在黄酮基本母核3位上均连有羟基，它存在约88科230余属植物的花、叶、果实中，天然黄酮醇多数水溶性较差。槲皮素、桑色素、山奈酚均属于黄酮醇类物质，具有抗炎、抗氧化、抗心脑血管等广泛的药理作用，但由于其水溶性差，导致其生物利用度低，因此，大大降低了其临床疗效，也增加了应用的难度。
专利号为CN106220599A的发明专利已授权一种槲皮素赖氨酸无定形物，能显著提高槲皮素的溶解度，但是所述物质由于共无定形是介于无定形药物和共晶药物的新型药物固体形态，以氢键等非共价键结合，处于热力学的高能态，稳定性较差。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种黄酮醇-蛋白复合物及其制备方法，所述黄酮醇-蛋白复合物的形态可以显著增加黄酮醇的水溶性，延缓黄酮醇的氧化，从而提高其生物利用度。
为了实现上述发明目的，本申请提供了一种黄酮醇-蛋白复合物的制备方法，包括以下步骤：1)用乙醇水溶液充分溶解黄酮醇类物质和乳清蛋白后，进行第一减压旋转蒸发去除乙醇获得混合物质；2)将所述混合物质与磷酸缓冲液混合后，进行第二减压旋转蒸发获得胶束溶液；所述磷酸缓冲液的pH值为7.1～7.8；所述磷酸缓冲液的浓度为30～80mM；3)将所述胶束溶液置于32～38℃孵育8～10h后，离心，收集上清液为黄酮醇-蛋白复合物。
优选的，所述黄酮醇类物质为槲皮素、桑色素或山奈酚。
优选的，所述乳清蛋白为α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和血清白蛋白中的一种或几种。
优选的，步骤1)中所述黄酮醇类物质、乳清蛋白和乙醇的比例m:m:v为1mg：(1～3)mg：(0.4～1)ml。
优选的，所述乙醇水溶液的浓度为100～145mL/L。
优选的，所述第一减压旋转蒸发和第二减压旋转蒸发的温度独立为35～38℃；所述第一减压旋转蒸发和第二减压旋转蒸发的时间独立为8～15min。
优选的，步骤3)中所述离心的转速为11000～15000rpm，所述离心的时间为5～8min。
本发明还提供了所述制备方法制备获得的黄酮醇-蛋白复合物。
优选的，所述黄酮醇-蛋白复合物的溶解度为105～200μg/mL。
本发明的有益效果：本发明提供的黄酮醇-蛋白复合物通过黄酮醇与乳清蛋白结合，形成可溶性的复合物，同时又不影响黄酮醇的生物活性，以增加其生物利用度。根据本发明实施例的记载所述黄酮醇-蛋白复合物的溶解度在105～200μg/mL之间，是不进行任何处理的黄酮醇类物质溶解度的13～32倍，大大的提高了黄酮醇类物质的溶解度；并且本发明提供的黄酮醇-蛋白复合物具有良好的自由基清除能力。
附图说明
图1为黄酮醇类物质母环结构图；
图2为槲皮素与β-乳球蛋白结合位点图。
具体实施方式
一种黄酮醇-蛋白复合物的制备方法，包括以下步骤：1)用乙醇充分溶解黄酮醇类物质和乳清蛋白后，进行第一减压旋转蒸发去除乙醇获得混合物质；2)将所述混合物质与磷酸缓冲液混合后，进行第二减压旋转蒸发获得胶束溶液；3)将所述胶束溶液置于32～38℃孵育8～10h后，离心，收集上清液为黄酮醇-蛋白复合物。
在本发明中，所述黄酮醇类物质包括槲皮素、桑色素或山奈酚。本发明对所述槲皮素、桑色素或山奈酚的来源没有特殊限定，采用本领域常规的市售商品即可。
黄酮醇类物质由A、B和C三个芳香环组成，槲皮素、桑色素、山奈酚是多羟基黄酮醇。槲皮素、桑色素或山奈酚的抗氧化作用主要取决于酚羟基，稳定性及生物活性还受羟基所处位置的影响。黄酮醇基本骨架上的羟基是清除自由基的活性基团，羟基的取代位置和取代形式对活性具有重要影响。其中参与黄酮醇抗肿瘤、清除自由基作用的官能团有3′，4′-OH；参与保护心血管作用的官能团有5，7-OH、2，3位双键和4位C＝O。参与抗病毒作用的官能团有2，3位双键和4位C＝O、4′-OH和7-OH。有研究发现，黄酮醇5-OH的存在降低了抗肿瘤活性，所以取代5-OH，可以增强其抗肿瘤活性。
本发明中所述乳清蛋白包括α-乳白蛋白，β-乳球蛋白和血清白蛋白中的一种或几种。所述乳清蛋白它不仅含有必需氨基酸，而且氨基酸的比例也较为适宜，具有较高的营养价值，另外所述乳清蛋白还具有极好的溶解性。乳清蛋白分子结构紧密，表面由水化膜包围，内部含有很多隐藏的-OH、-SH和其他疏水基团，也就是说乳清蛋白具有多个配体结合位点，可同时结合不同的小分子配体，因此可以被用来作为一些疏水小分子的配体，提高脂溶性小分子的生物利用度。
本发明用乙醇充分溶解黄酮醇类物质和乳清蛋白后，进行第一减压旋转蒸发去除乙醇获得混合物质。在本发明中，所述乙醇浓度优选为100～145mL/L，更优选为110～130ml/L，最优选为120～128ml/L。在本发明中，所述黄酮醇类物质、乳清蛋白和乙醇的比例优选为1mg：(1～3)mg：(0.4～1)ml，更优选为1mg：(1.5～2.5)mg:(0.5～0.9)ml。本发明用乙醇充分溶解黄酮醇类物质和乳清蛋白后，进行第一次减压旋转蒸发去除乙醇；所述第一减压旋转蒸发的温度优选为35～38℃，更优选为36～37℃；所述第一减压旋转蒸发的时间优选为8～15min，更优选为11～13min。
本发明将所述混合物质与磷酸缓冲液混合后，进行第二减压旋转蒸发获得胶束溶液。在本发明中，所述磷酸缓冲液的pH值优选为7.1～7.8，更优选为7.2～7.5，最优选为7.3；所述磷酸缓冲液的浓度优选为30～80Mm，更优选为40～60mM，最优选为50mM。本发明中所述磷酸缓冲液的作用为模拟蛋白的生理的条件，确保蛋白保持活性的条件下检测黄酮醇在水溶液中的溶解度。本发明中所述混合物质与磷酸缓冲液的质量体积比优选为(2～4)mg:(0.4～1)ml。本发明中所述第二减压旋转蒸发的温度优选为35～38℃，更优选为36～37℃；所述第二减压旋转蒸发的时间优选为8～15min，更优选为11～13min。本发明中所述第二减压旋转蒸发后获得的胶束溶液的体积为混合物质与磷酸缓冲液混合后总体积的5倍。本发明中，所述第一减压旋转蒸发和第二减压旋转蒸发优选的采用旋转蒸发仪来实现；所述旋转蒸发仪在真空条件下工作时，所述旋转蒸发仪工作时的真空度为15mbar。本发明中所述胶束是当聚合物浓度大于临界胶束浓度(criticalmicelle concentration,CMC)时，在水性介质中自发形成的热力学稳定体系，具有独特的核壳结构。由疏水链组成的胶束内核可以作为疏水性物质的储库，提高该物质在水溶液中的溶解度，避免其在生物环境中失活。同时，由亲水链形成的亲水外壳，可起到空间稳定作用。
本发明在获得所述胶束溶液后，将所述胶束溶液置于32～38℃孵育8～10h后，离心，收集上清液为黄酮醇-蛋白复合物。在本发明中所述孵育的温度优选为33～37℃，更优选为35～36℃；所述孵育的时间优选为9h。本发明中所述孵育的作用为使黄酮醇与蛋白的结合更加稳定。本发明在所述孵育结束后，进行离心，收集上清液为黄酮醇-蛋白复合物。本发明中所述离心的转速优选为11000～15000rpm，更优选为12000～14000rpm；所述离心的时间优选为5～8min，更优选为6～7min。本发明中所述离心的作用为去除非水溶性的物质，收集黄酮醇-蛋白复合物。
本发明还提供了本发明还提供了所述制备方法制备获得的黄酮醇-蛋白复合物。所述黄酮醇-蛋白复合物的溶解度优选为105～200μg/mL。本发明中所述黄酮醇-蛋白复合物的溶解度相对于黄酮醇类物质而言，有了极大的提高，同时所述黄酮醇复合物具有良好的清除自由基的作用，可以应用于抗病毒、抗肿瘤药物的制备中。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种槲皮素-α-乳白蛋白复合物的制备方法，由包括以下步骤的制备方法制备得到：
(1)将8mg槲皮素(100081，中国食品药品检定研究院)与10mgα-乳白蛋白，充分溶解于5mL浓度为120mL/L的乙醇中，制成混合溶液，并在36℃减压旋转蒸发12min后完全除去溶剂。
(2)加入pH＝7.3，5mL浓度为45Mm的磷酸缓冲液，37℃旋蒸12min得到胶束溶液。
(3)将该溶液在36℃水浴中孵育9h过夜，然后在12000rpm下离心6min，取上清液，得到槲皮素-α-乳白蛋白复合物。
通过高效液相色谱测得槲皮素-α-乳白蛋白复合物溶解度，色谱条件为：色谱柱：Waters BEH C18(2.1×50mm，1.7μm)；流动相：乙腈-0.1％甲酸水(45：55)；检测波长：254nm；流速0.3mL/min；进样量10μL。
表1槲皮素—α-乳白蛋白的溶解度(μg/mL)
Figure BDA0001730070230000051
实施例2
一种槲皮素-β-乳球蛋白复合物的制备方法，由包括以下步骤的制备方法制备得到：
(1)将8mg槲皮素(100081，中国食品药品检定研究院)与12mgβ-乳球蛋白，充分溶解于5mL浓度为120mL/L的乙醇中，制成混合溶液，并在36℃减压旋转蒸发除去溶剂。
(2)加入pH＝7.3，浓度为45Mm的磷酸缓冲液，37℃旋蒸12min得到胶束溶液。(3)将该溶液在36℃水浴中孵育9h，然后在12000rpm下离心6min，取上清液，得到槲皮素-β-乳球蛋白复合物。
通过高效液相色谱测得槲皮素-β-乳球蛋白复合物溶解度，色谱条件为：色谱柱：Waters BEH C18(2.1×50mm，1.7μm)；流动相：乙腈-0.1％甲酸水(45：55)；检测波长：254nm；流速0.3mL/min；进样量10μL。
表2槲皮素—β-乳球蛋白的溶解度(μg/mL)
Figure BDA0001730070230000052
Figure BDA0001730070230000061
实施例3
一种槲皮素-血清白蛋白复合物的制备方法，由包括以下步骤的制备方法制备得到：
(1)将8mg槲皮素(100081，中国食品药品检定研究院)与12mg血清白蛋白，充分溶解于4mL浓度为120mL/L的乙醇中，制成混合溶液，并在36℃减压旋转蒸发除去溶剂。
(2)加入pH＝7.3，浓度为50Mm的磷酸缓冲液，37℃旋蒸12min得到胶束溶液。
(3)将该溶液在37℃水浴中孵育9h，然后在12000rpm下离心6min，取上清液，得到槲皮素-血清白蛋白复合物。
通过高效液相色谱测得槲皮素-血清白蛋白复合物溶解度，色谱条件为：色谱柱：Waters BEH C18(2.1×50mm，1.7μm)；流动相：乙腈-0.1％甲酸水(45：55)；检测波长：254nm；流速0.3mL/min；进样量10μL。
表3槲皮素-血清白蛋白的溶解度(μg/mL)
Figure BDA0001730070230000062
实施例4
一种桑色素-α-乳白蛋白复合物的制备方法，由包括以下步骤的制备方法制备得到：
(1)将10mg桑色素(B21110，上海源叶生物科技有限公司)与14mgα-乳白蛋白，充分溶解于4mL浓度为130mL/L的乙醇中，制成混合溶液，并在38℃减压旋转蒸发除去溶剂。
(2)加入pH＝7.3，浓度为50Mm的磷酸缓冲液，38℃旋蒸12min得到胶束溶液。
(3)将该溶液在37℃水浴中孵育10h，然后在12000rpm下离心6min，取上清液，得到桑色素α-乳白蛋白复合物。
通过高效液相色谱测得桑色素-α-乳白蛋白复合物溶解度，色谱条件为：色谱柱：Waters BEH C18(2.1×50mm，1.7μm)；流动相：甲醇-0.4％磷酸溶液(45：55)；检测波长：360nm；流速0.3mL/min；进样量10μL。
表4桑色素—α-乳白蛋白的溶解度(μg/mL)
Figure BDA0001730070230000071
实施例5
一种桑色素-β-乳球蛋白复合物的制备方法，由包括以下步骤的制备方法制备得到：
(1)将10mg桑色素与14mgβ-乳球蛋白，充分溶解于4mL浓度为130mL/L的乙醇中，制成混合溶液，并在38℃减压旋转蒸发除去溶剂。
(2)加入pH＝7.3，浓度为50Mm的磷酸缓冲液，38℃旋蒸12min得到胶束溶液。
(3)将该溶液在37℃水浴中孵育10h，然后在12000rpm下离心6min，取上清液，得到桑色素β-乳球蛋白复合物。
通过高效液相色谱测得桑色素-β-乳球蛋白复合物溶解度，色谱条件为：色谱柱：Waters BEH C18(2.1×50mm，1.7μm)；流动相：甲醇-0.4％磷酸溶液(45：55)；检测波长：360nm；流速0.3mL/min；进样量10μL。
表5桑色素—β-乳球蛋白的溶解度(μg/mL)
Figure BDA0001730070230000072
实施例6
一种桑色素-血清白蛋白复合物的制备方法，由包括以下步骤的制备方法制备得到：
(1)将10mg桑色素与14mg血清白蛋白，充分溶解于4mL浓度为130mL/L的乙醇中，制成混合溶液，并在38℃减压旋转蒸发除去溶剂。
(2)加入pH＝7.3，浓度为50Mm的磷酸缓冲液，38℃旋蒸12min得到胶束溶液。(3)将该溶液在37℃水浴中孵育10h，然后在12000rpm下离心6min，取上清液，得到桑色素-血清白蛋白复合物。
通过高效液相色谱测得桑色素-血清白蛋白复合物溶解度，色谱条件为：色谱柱：Waters BEH C18(2.1×50mm，1.7μm)；甲醇-0.4％磷酸溶液(45：55)；检测波长：360nm；流速0.3mL/min；进样量10μL。
表6桑色素—血清白蛋白的溶解度(μg/mL)
Figure BDA0001730070230000081
实施例7
一种山奈酚-α-乳白蛋白复合物的制备方法，其特征在于，由包括以下步骤的制备方法制备得到：
(1)将10mg山奈酚(B21126，上海源叶生物科技有限公司)与15mgα-乳白蛋白，充分溶解于4mL浓度为120mL/L的乙醇中，制成混合溶液，并在38℃减压旋转蒸发除去溶剂。
(2)加入pH＝7.3，浓度为50Mm的磷酸缓冲液，38℃旋蒸12min得到胶束溶液。
(3)将该溶液在37℃水浴中孵育过夜，然后在12000rpm下离心6min，取上清液，得到山奈酚-α-乳白蛋白复合物。
通过高效液相色谱测得山奈酚-α-乳白蛋白复合物溶解度，色谱条件为：色谱柱：Waters BEH C18(2.1×50mm，1.7μm)；流动相：乙腈-0.1％冰醋酸(60：40)；检测波长：365nm；流速0.4mL/min；进样量10μL。
表7山奈酚—α-乳白蛋白的溶解度(μg/mL)
Figure BDA0001730070230000082
实施例8
一种山奈酚-β-乳球蛋白复合物的制备方法，由包括以下步骤的制备方法制备得到：
(1)将10mg山奈酚(B21126，上海源叶生物科技有限公司)与15mgβ-乳球蛋白，充分溶解于4mL浓度为120mL/L的乙醇中，制成混合溶液，并在38℃减压旋转蒸发除去溶剂。
(2)加入pH＝7.3，浓度为50Mm的磷酸缓冲液，38℃旋蒸12min得到胶束溶液。
(3)将该溶液在37℃水浴中孵育过夜，然后在12000rpm下离心6min，取上清液，得到山奈酚-β-乳球蛋白复合物。
通过高效液相色谱测得山奈酚-β-乳球蛋白复合物溶解度，色谱条件为：色谱柱：Waters BEH C18(2.1×50mm，1.7μm)；流动相：乙腈-0.1％冰醋酸(60：40)；检测波长：365nm；流速0.4mL/min；进样量10μL。
表8山奈酚—β-乳球蛋白的溶解度(μg/mL)
Figure BDA0001730070230000091
实施例9
一种山奈酚-血清白蛋白复合物的制备方法，由包括以下步骤的制备方法制备得到：
(1)将10mg山奈酚(B21126，上海源叶生物科技有限公司)与15mg血清白蛋白，充分溶解于4mL浓度为120mL/L的乙醇中，制成混合溶液，并在38℃减压旋转蒸发除去溶剂。
(2)加入pH＝7.3，浓度为50Mm的磷酸缓冲液，38℃旋蒸12min得到胶束溶液。
(3)将该溶液在37℃水浴中孵育过夜，然后在12000rpm下离心6min，取上清液，得到山奈酚-血清白蛋白复合物。
通过高效液相色谱测得山奈酚-血清白蛋白复合物溶解度，色谱条件为：色谱柱：Waters BEH C18(2.1×50mm，1.7μm)；流动相：乙腈-0.1％冰醋酸(60：40)；检测波长：365nm；流速0.4mL/min；进样量10μL。
表9山奈酚—血清白蛋白的溶解度(μg/mL)
Figure BDA0001730070230000092
Figure BDA0001730070230000101
实施例10
DPPH自由基清除能力的测定，对比例1、2、3分别是槲皮素、桑色素、山奈酚单体对DPPH的清除率。
配制2.5mmol/LDPPH的无水乙醇储备液，4℃避光保存备用。使用时再用无水乙醇稀释，制备0.15mmol/L的DPPH工作液。取96孔测试板，每孔依次加入样品(15μL，30μmol/L，溶剂为乙醇)和DPPH工作液(150μL)。以PBS加DPPH工作液为空白对照，同时用样品加无水乙醇溶液作为样品颜色参比。振荡混合均匀，避光室温条件下放置30min后，用酶标仪测定517nm波长处的吸光度。依据公式计算DPPH自由基清除率。清除率(％)＝[(A0-AS)/A0]×100A0和AS分别为DPPH空白和样品的吸光值(A517)
表10黄酮醇与黄酮醇-蛋白复合物对DPPH的清除率
样品 清除率(％)
实施例1 50
实施例2 53
实施例3 51
实施例4 51
实施例5 50
实施例6 52
实施例7 55
实施例8 57
实施例9 58
对比例1 55
对比例2 53
对比例3 57
此外，本发明利用蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基可以发射荧光的原理，通过乳清蛋白的荧光猝灭程度来判断黄酮醇(槲皮素、桑色素、山奈酚)与乳清蛋白之间的结合程度。在结合的过程中，由于黄酮醇(槲皮素、桑色素、山奈酚)的疏水性，以及其与蛋白之间的相互作用，导致结合位点附近的蛋白二级结构和微环境发生了变化，诱导结合位点处部分的α螺旋与β折叠的转换，并且使得结合位点暴露在一个更加疏水的微环境中。因此，与乳清蛋白结合之后，黄酮醇(槲皮素、桑色素、山奈酚)的水溶性可以得到提升。
以槲皮素与β-乳球蛋白为例，槲皮素与β-乳球蛋白结合后的结构示意图如图2所示，通过分子对接，发现槲皮素结合在β-乳球蛋白的由一段α螺旋和一段β转角组成的空穴中，且该结合位点附近有一个色氨酸残基(Trp19，图中红色细线显示)存在。其中有8个氨基酸残基(Lys100，Lys101，Val123，Arg124，Thr125，Glu127，Asp129)参与了槲皮素与β-乳球蛋白的结合，其中苏氨酸残基(Thr125)与槲皮素的5-OH形成了氢键，其余对槲皮素生物活动影响较大的官能团，如C3-OH、C7-OH、C2，3双键、4-C＝O，还有B环上的羟基未与蛋白结合。因此槲皮素与β-乳球蛋白结合后，其生物活性基本不受影响。
由上述实施例可知本发明提供的黄酮醇-蛋白复合物在水中的溶解度高，是不进行任何处理的黄酮醇类物质溶解度的13～32倍，并且本发明提供的黄酮醇-蛋白复合物具有良好的自由基清除能力。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种黄酮醇-蛋白复合物的制备方法，包括以下步骤：
1)用乙醇水溶液溶解黄酮醇类物质和乳清蛋白后，进行第一减压旋转蒸发去除乙醇获得混合物质；
2)将所述混合物质与磷酸缓冲液混合后，进行第二减压旋转蒸发获得胶束溶液；所述磷酸缓冲液的pH值为7.1～7.8；所述磷酸缓冲液的浓度为30～80mM；
3)将所述胶束溶液置于32～38℃孵育8～10h后，离心，收集上清液为黄酮醇-蛋白复合物；
所述黄酮醇类物质为槲皮素、桑色素或山奈酚；
所述乳清蛋白为α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和血清白蛋白中的一种或几种；
步骤1)中所述黄酮醇类物质、乳清蛋白和乙醇水溶液的比例为1mg：(1～3)mg：(0.4～1)ml。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述乙醇水浓度为100～145mL/L。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第一减压旋转蒸发和第二减压旋转蒸发的温度独立为35～38℃。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述第一减压旋转蒸发和第二减压旋转蒸发的时间独立为8～15min。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中所述离心的转速为11000～15000rpm，所述离心的时间为5～8min。
6.权利要求1～5任意一项所述制备方法制备获得的黄酮醇-蛋白复合物。
7.根据权利要求6所述的黄酮醇-蛋白复合物，其特征在于，所述黄酮醇-蛋白复合物的溶解度为105～200μg/mL。
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