CN108728576A

CN108728576A - 一种小麦叶绿素含量相关基因的标记及应用

Info

Publication number: CN108728576A
Application number: CN201810920418.2A
Authority: CN
Inventors: 肖永贵; 杨梦娇; 武玉莹; 何中虎; 夏先春
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-08-14
Filing date: 2018-08-14
Publication date: 2018-11-02
Anticipated expiration: 2038-08-14
Also published as: CN108728576B

Abstract

本发明公开了一种小麦叶绿素含量相关基因的标记及应用。本发明提供了检测小麦染色体4BL上SNP AX94573388位点的基因型的物质在鉴定或辅助鉴定小麦叶绿素含量中的应用；所述SNP AX94573388位点为位于小麦染色体4BL上的序列4所示的核苷酸序列第36位。本发明得到一个小麦叶绿素含量主效基因位点QChl.caas‑4BL(752cM)及该位点的辅助筛选小麦叶绿素含量相关基因的SNP位点。利用该SNP位点可以筛选小麦耐旱特性优良的小麦，在培育耐灌浆胁迫小麦品种中发挥重要作用。

Description

一种小麦叶绿素含量相关基因的标记及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种小麦叶绿素含量相关基因的标记及应用。

背景技术

小麦叶片依叶龄增加而自下至上依次衰老(Feller等，1986),尤其在生育后期如遇干旱胁迫会使叶片叶绿体数量、形态以及含量发生改变,导致提前终止光合作用,影响籽粒灌浆，造成大幅度减产(Troy等，2016)。其中，旗叶是唯一贯穿结实全过程向籽粒输送养分的叶片,对于产量形成具有主导地位。倒二和倒三叶虽对籽粒充实有重要作用,但均先于旗叶衰亡。开花至乳熟期是粒重形成主要时期,由于旗叶所需养料大量外运导致叶体营养缺乏，提前变黄衰老(Shen等，2001；Pan等，2004)。同时，倒二和倒三叶因养分运输受一定程度抑制而延缓衰老,使得倒二及部分倒三叶发挥主导作用,保证生育后期灌浆作用持续进行。在漫长的进化道路上,小麦为自身生存和基因连续,已逐渐形成多元进化机制来适应复杂多变的环境。在灌浆时间相同或相似条件下,旗叶“一叶直通”是籽粒充实良好的关键,但与“流畅”紧密相连的性状还有多种状态,比如倒二叶倒三叶“接力式”灌浆，通过改变叶源向经济器官运输和分配同化物方式同样可收到较好甚至更好的效果(张崇午等，2012)。因此，旗叶衰老常与耐旱性状联系在一起被作为研究热点，倒二叶及倒三叶研究可在此基础上调整视角,逐步建立新的理论体系,更好的服务于育种工作。

生理调节是小麦抵御干旱耐热的根本途径之一。依据重要生理性状设计品种并进行直接选择，比传统育种的经验选择更为高效，利于推进小麦抗旱育种进程(Reynolds等，2001)。然而，生理性状测定受环境条件影响较大，在小麦抗旱性改良中的应用进展缓慢。分子标记能够从基因层面瞄定抗旱相关生理性状，通过便捷的鉴定技术从复杂环境中筛选理想株系，挖掘抗旱相关生理性状分子标记是目前小麦抗旱性研究重要内容之一(Kumar等，2014；Xu等，2012)。

中麦895是中国农业科学院作物科学研究所、中国农业科学院棉花研究所以周麦16为母本、荔垦4号为父本杂交选育而成的半冬性多穗型中晚熟品种，具备叶片功能期长、分蘖能力强、灌浆速度快等特性。2009年9月通过国家黄淮麦区南片审定。在2013-2015年三年品种比较试验和大田示范中，中麦895表现出高产广适、抗病抗倒、灌浆后期耐高温等特点。扬麦16是长江中下游麦区种植面积最大的品种，具有灌浆速度快、粒重高等特点。

在开花期至成熟期，田间每7天测定扬麦16/中麦895DH群体旗叶、倒二叶、倒三叶叶绿素含量，利用660K SNP芯片对不同叶位叶绿素含量结果进行QTL定位，得到一个调控花后7天倒三叶的主效QTL位点，利用紧密连锁的SNP标记转化为KASP标记，为小麦分子标记辅助选择育种提供理论参考。

发明内容

本发明一个目的是提供检测小麦染色体4BL上SNP AX94573388位点的基因型的物质的用途。

本发明提供了检测小麦染色体4BL上SNP AX94573388位点的基因型的物质在鉴定或辅助鉴定小麦叶绿素含量中的应用；

所述SNP AX94573388位点为位于小麦染色体4BL上的序列4所示的核苷酸序列第36位。

上述应用中，所述小麦染色体4BL上SNP AX94573388位点的基因型为GG或CC或GC。

本发明还提供了检测小麦染色体4BL上SNP AX94573388位点的基因型的物质在选育高叶绿素含量小麦中的应用。

上述应用中，

所述检测小麦染色体4BL上SNP AX94573388位点的基因型的物质如下1)或2)：

1)为成套引物，所述成套引物由序列表中序列1所示的单链DNA分子或其衍生物、序列表中序列2所示的单链DNA分子或其衍生物和序列表中序列3所示的单链DNA分子组成；

2)含有所述成套引物的PCR试剂或试剂盒。

上述应用中，

所述序列表中序列1所示的单链DNA分子的衍生物为序列1所示的单链DNA分子的5'端连接一种荧光序列；

所述序列表中序列2所示的单链DNA分子的衍生物为序列1所示的单链DNA分子的5'端连接另一种荧光序列；

或，所述荧光基团序列为荧光序列FAM或荧光序列HEX。

所述序列1荧光探针的序列与FAM序列一致；

所述序列2荧光探针的序列与HEX序列一致；

所述FAM和HEX探针的5’端分别有一个FAM和HEX的荧光基团，对应FAM和HEX探针序列的3’端带有淬灭基团的淬灭探针。

在实施例中，上述序列1所示的单链DNA分子与序列3所示的单链DNA分子组合扩增，扩增SNP位点基因型为G:G的片段，携带FAM的序列PCR扩增后的产物经荧光照射显示红色；

上述序列2所示的单链DNA分子与序列3所示的单链DNA分子组合扩增，扩增SNP位点基因型为C:C的片段，携带HEX的序列PCR扩增后的产物经荧光照射显示蓝色。

本发明第2个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定小麦叶绿素含量的方法。

本发明提供的方法，为检测小麦染色体4BL上SNP AX94573388位点的基因型为GG还是CC还是GC，小麦染色体4BL上SNP AX94573388位点的基因型为CC的待测小麦的叶绿素含量高于小麦染色体4BL上SNP AX94573388位点的基因型为GG或GC的待测小麦；

或本发明提供一种选育高叶绿素含量的小麦的方法，为检测小麦染色体4BL上SNPAX94573388位点的基因型为GG还是CC还是GC，选育基因型为CC的待测小麦，得到高叶绿素含量小麦。

上述方法中，所述检测小麦染色体4BL上SNP AX94573388位点的基因型为GG还是CC还是GC的方法为如下A)或B)：

A)直接测序；

B)用上述成套引物对待测小麦基因组DNA进行PCR扩增产物，对所述PCR扩增产物进行基因分型。

所述基因分型鉴定采用PHERAstar^plus荧光酶标仪；

上述方法中，所述基因分型的方法为采用荧光酶标仪照射后，若所述PCR产物仅显示序列1所示DNA分子5'端连接荧光序列的颜色，则待测小麦染色体4BL上SNP AX94573388位点的基因型为GG；若所述PCR产物仅显示序列2所示DNA分子5'端连接荧光序列的颜色，则待测小麦染色体4BL上SNP AX94573388位点的基因型为CC；若所述PCR产物显示序列1所示DNA分子5'端连接荧光序列的颜色和序列2所示DNA分子5'端连接荧光序列的颜色(叠加)，则待测小麦待测小麦染色体4BL上SNP AX94573388位点的基因型为GC。

本发明第3个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定小麦叶绿素含量的物质。

本发明提供的物质，为上述检测小麦染色体4BL上SNP AX94573388位点的基因型的物质。

上述中，所述小麦叶绿素含量为小麦生育后期倒三叶叶绿素含量。

上述待测小麦为单株或群体，上述小麦具体为扬麦16/中麦895DH群体或如下品种中的任一种或任几种：阿夫、CA1055、CA1133、轮选987、京冬8号、秦农731、皖麦52、济宁16、济麦21、鲁麦15、洛麦21、川农52、绵阳26、宁麦9号、镇麦6号。

本发明获得一个小麦叶绿素含量主效基因位点QChl.caas-4BL(752cM)及该位点的辅助筛选小麦叶绿素含量相关基因的SNP位点。利用该SNP位点可以筛选小麦耐旱特性优良的小麦，在培育耐灌浆胁迫小麦品种中发挥重要作用。

附图说明

图1为小麦生育期叶绿素含量分值标准。

图2为一个SNP标记与QChl.caas-4BL基因的连锁图。

图3为供试小麦品种叶绿素含量基因的KASP标记检测结果。

具体实施方式

所有引物合成均由北京奥科生物技术有限责任公司完成。以下实施例中所有用到的小麦材料均来自中国农业科学院国家农作物种质保存中心。

中麦895(Triticum aestivum)记载于如下参考文献：高产矮秆抗倒广适小麦新品种中麦895，何中虎，阎俊，张勇，中国种业，2014年06期。中麦895审定编号为国审麦2012010。

扬麦16(Triticum aestivum)(原名扬00-126)记载于如下参考文献：优质小麦新品种扬麦16特征特性与高产栽培技术，陆成彬，程顺，张伯桥等，现代农业科技，2006年05期；2005年获得国家植物新品种权保护证书,品种权号为CNA20030436.4,公告号为CNA000663G。

供试材料：中麦895和扬麦16分别是我国黄淮麦区和长江中下游冬麦区主推品种之一，农艺性状优良。本研究以扬麦16为母本，中麦895为父本，采用小麦玉米杂交技术，构建DH群体，包括亲本共200个家系。

实施例1、与小麦叶绿素含量相关基因的SNP标记

1、持绿表型调查

利用SPAD-502叶绿素仪(Minolta Camera Co.，Japan)测定DH群体旗叶、倒二叶、倒三叶中段，避开中部叶脉。选取小区内长势一致的植株进行测定，每个叶位测定5次取平均值。测定时期为开花期及花后每7天直至成熟，共5个时期，记为S1—S5。

2、引物获得和标记分析

SNP(单核苷酸多态性)标记在博奥生物有限公司(CapitalBio Corporation,Beijing,China；http://bioservices.capitalbio.com)利用Illumina SNP基因分型检测，主要分为以下步骤：1)将待测小麦品种基因组DNA进行全基因组扩增；2)扩增产物用随机内切酶酶切断化；3)将DNA片段与将DNA片段与芯片进行杂交，芯片的微珠上连接有50-mers长度特异性捕获探针，gDNA酶切后产物与探针互补序列结合；4)清洗去除未杂交上的或错配杂交上的DNA片段；5)二硝基酚(dinitrophenol)和生物素(biotin)标记的核苷酸底物(A/T和C/G)在捕获探针上进行单碱基延伸，只有与gDNA发生互补结合的探针才能得到延伸；通过染色，A/T和C/G将分别标记不同的荧光染料；6)芯片扫描，并利用软件根据两种荧光判读并输出分型结果。

利用Illumina SNP基因分型研究平台对扬麦16/中麦895DH群体进行660K SNP芯片分型，包括BS、BobWhite、CAP、D_contig等系列标记，共计630518个，其中626276个SNP标记在扬麦16/中麦895DH群体内存在差异。

二、关联基因定位和连锁标记AX94573388的发现

利用SAS9.2软件(SAS Institute.2000)进行基本统计量、多重比较分析，并结合SAS的Glmselect程序对SNP数据和叶绿素进行逐步回归，根据P值(P<0.01)判断关联位点。利用IciMappingV4.1定位出AX94573388与位点QChl.caas-4BL关联(P<0.001)。

三、AX94573388位点的等位基因特异标记鉴定

分别提取15个扬麦16/中麦895DH群体的全基因组DNA。以各个基因组DNA为模板用SNP标记AX94573388位点的等位基因特异标记KASP^TM基因分型检测，出现C:C分型的片段表明SNP标记AX94573388能够有效鉴定小麦生育后期叶绿素含量。

表1AX94573388标记等位变异在扬麦16/中麦895DH群体中的分离

结果表明，AX94573388位点的基因型仅为C:C时，与小麦倒三叶叶绿素含量范围相符，说明AX94573388位点能够有效鉴定小麦花后7天倒三叶叶绿素含量基因及其基因型。

根据Wheat DArT maps Version 1.2(http://www.triticarte.com.au)和Allen等(2011)公布的小麦分子标记图谱，将标记AX94573388整合到小麦遗传图谱上，结果如图2所示，确定QChl.caas-4BL在染色体4BL上的752cM位置。

标记AX94573388所对应的SNP AX94573388位点为小麦染色体4BL上序列4所示的核苷酸序列第36位，该核苷酸为A或G；序列4位于小麦染色体4BL上的752cM位置。

四、检测SNP AX94573388位点的引物组设计

根据SNP AX94573388位点在小麦染色体4BL上的752cM的核苷酸序列(序列4)，设计测AX94573388位点的引物组如下：

上游引物：F5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCACGGTAGCGCTTAGAC-3’(序列1)，

上游引物：F5’–GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCACGGTAGCGCTTAGAG-3’(序列2)，

下游引物：R5’-AGAGGAATCTCGACAAACTATCG-3’(序列3)。

在序列1所示的上游引物的5’端添加特异荧光序列FAM：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’；

在序列2所示的上游引物的5’端添加特异荧光序列HEX：F5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’。

上述5’端添加特异荧光序列FAM序列1所示的单链DNA分子与序列3所示的单链DNA分子扩增SNP AX94573388位点基因型为G:G的片段，携带FAM的序列PCR扩增后的产物经荧光照射显示红色；

上述5’端添加特异荧光序列HEX序列2所示的单链DNA分子与序列3所示的单链DNA分子扩增SNP AX94573388位点基因型为C:C的片段，携带HEX的序列PCR扩增后的产物经荧光照射显示蓝色。

上述5’端添加特异荧光序列FAM序列1所示的单链DNA分子、5’端添加特异荧光序列HEX序列2所示的单链DNA分子和序列3所示的单链DNA分子扩增SNP

AX94573388位点基因型为C:G的片段，PCR扩增后的产物经荧光照射照射显示绿色。

五、SNP AX94573388位点检测小麦叶绿素含量方法的建立

提取待测小麦基因组DNA作为模板，用5’端添加特异荧光序列FAM的序列1所示引物、5’端添加特异荧光序列HEX的序列2所示引物和序列3所示引物进行PCR扩增。

PCR扩增的12μL PCR反应体系包括：5’端添加特异荧光序列FAM的序列1所示引物、5’端添加特异荧光序列HEX的序列2所示引物和序列3所示引物，且每条引物终浓度为0.25uM，终浓度为1mmol·L^-1的Tris-HCl(pH 9.0)，终浓度为5mmol·L^-1的KCl，终浓度为2.5mmol·L^-1的MgCl₂(Promega公司)，终浓度为200μmol·L^-1的dNTPs(TaKaRa公司)，TaqDNA聚合酶1.5U(Tiangen公司)，模板DNA 15ng，其余为水。

PCR扩增反应在PTC-200PCR扩增仪上进行，采用Touch down PCR扩增程序为：

94℃预变性15min；(Touch down程序)94℃变性30s，61℃退火60s，72℃延伸30s，11个循环，每个循环退火温度下降0.6℃；(扩增程序)94℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸30s，26个循环；72℃延伸5min；10℃保存。

将得到的PCR扩增产物在PHERAstar^plus荧光酶标仪上用荧光照射进行基因分型，然后在KlusterCaller^TM软件读取分型后的数据。

若PCR扩增产物仅显示红色图像(序列1所示DNA分子5'端连接的荧光颜色)，则待测小麦SNP AX94573388位点基因型为G:G；若PCR扩增产物仅显示蓝色图像(序列2所示DNA分子5'端连接的荧光颜色)，则说明SNP AX94573388位点基因型为C:C；若PCR扩增产物显示绿色图像，则说明SNP AX94573388位点基因型为C/G，基因型为C:G。

PCR扩增产物仅显示蓝色(SNP AX94573388位点为C:C的小麦的叶绿素含量大于PCR扩增产物仅为显示红色(SNP AX94573388位点基因型为G：G)的小麦或PCR扩增产物显示绿色(SNP AX94573388位点为C/G杂合体，基因型为C：G)的小麦。

实施例2、SNP AX94573388位点在检测小麦叶绿素含量中的应用

选用15个非扬麦16/中麦895DH群体的后代品种和亲本。其中15个非扬麦16/中麦895DH群体后代品种为测试组，中麦895和扬麦16对照组；包括阿夫、CA1055、CA1133、轮选987、京冬8号、秦农731、皖麦52、济宁16、济麦21、鲁麦15、洛麦21、川农52、绵阳26、宁麦9号、镇麦6号。

一、检测不同品种小麦生育后期旗叶叶绿素含量

小麦品种叶片叶绿素含量鉴定于2017年夏在中国农业科学院作物科学研究所东边农场进行。采用完全随机区组设计，行长1.5m，行距25cm，株距10cm，每个品种3行种植，3次重复。田间管理同一般大田生产。于开花期及花后每7天测定不同品种旗叶，倒二叶、倒三叶叶绿素含量(方法如持绿表型调查)，共记S1-S5五个时期，不同时期表型如图1所示，S1：开花期；S2：花后7天；S3：花后14天；S4：花后21天；S5：花后27天。

二、检测不同品种小麦SNP位点的基因型

分别提取各个品种小麦的基因组DNA，以基因组DNA为模板，在序列1所示引物的5’端添加特异荧光序列FAM(5’GAAGGTGACCAAGTTCATGCT 3’)，在序列2所示引物的5’端添加特异荧光序列HEX(5’GAAGGTCGGAGTCAACGGATT 3’)。携带FAM的序列PCR扩增后的产物经荧光照射显示红色，而携带HEX的序列PCR扩增后的产物经荧光照射显示蓝色。

将序列1与序列3组合，序列2与序列3组合，以这两组引物分别对同一材料DNA进行PCR扩增。序列1与序列3组合可以扩增SNP位点基因型为G:G的片段，序列2与序列3组合可以扩增SNP位点基因型为C:C的片段。

PCR扩增体系如下：PCR反应使用的扩增体系5.2ul，即为20ng/ul模板DNA 3.0ul，2X KASP reaction mix 2.0ul，引物混合试剂(Assay mix)0.1ul，ddH₂O 0.1ul。

94℃预变性15min；(Touch down程序)94℃变性20s，65℃退火60s，9个循环，每个循环退火温度下降1℃；(扩增程序)94℃变性20s，57℃退火60s，32个循环；72℃延伸5min；10℃保存。

将得到的PCR扩增产物在PHERAstar^plus荧光酶标仪上用荧光照射进行基因分型，然后在KlusterCaller^TM软件读取分型后的数据，仅显示红色图像则说明待测小麦4B染色体752cM位置的基因的第36bp处SNP位点为G，基因型为G:G；仅显示蓝色图像则说明SNP位点碱基为C，基因型为C:C。

对各小麦品种PCR扩增产物进行两两比较，若A小麦PCR扩增产物仅为显示红色(其4B染色体752cM位置的序列4第36位脱氧核糖核苷酸为G的纯合体，基因型为G：G)，B小麦的PCR扩增产物为仅显示蓝色(其4B染色体752cM位置的序列4第36位脱氧核糖核苷酸为C的纯合体，基因型为C：C)。则A小麦的叶绿素含量低于B小麦。

上述各个小麦基因型及S5时期倒三叶叶绿素含量见表2和图3所示。

表2 15个小麦品种SNP位点基因型和叶绿素含量结果

注：中麦895为CC；扬麦16为GG。

以上结果表明：CA1055、CA1133、济麦21在SNP位点基因型为C:C，且这些小麦均具有较高的叶绿素含量。从上述结果中还可看出，SNP位点的基因型为CC的小麦倒三叶叶绿素含量要高于基因型为GG的小麦。

上述结果表明，上述SNP位点可以快速、准确地鉴定小麦品种花后7天倒三叶是否具有较高叶绿素含量。

序列表

<110>中国农业科学院作物科学研究所

<120> 一种小麦叶绿素含量相关基因的标记及应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gaaggtgacc aagttcatgc tgcacggtag cgcttagac 39

<210> 2

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gaaggtcgga gtcaacggat tgcacggtag cgcttagag 39

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 3

<400> 人工序列

agaggaatct cgacaaacta tcg 23

<210> 4

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (36)..(36)

<223> n 为c或g

<400> 4

aaaagaaaag acaggcgggc acggtagcgc ttagantata tcagataagg cacaggatca 60

agaggcgctt t 71

Claims

1.检测小麦染色体4BL上SNP AX94573388位点的基因型的物质在鉴定或辅助鉴定小麦叶绿素含量中的应用；

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述SNP AX94573388位点的基因型为GG或CC或GC。

3.检测小麦染色体4BL上SNP AX94573388位点的基因型的物质在选育高叶绿素含量小麦中的应用。

4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：

2)含有所述成套引物的PCR试剂或试剂盒。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述序列表中序列1所示的单链DNA分子的衍生物为序列1所示的单链DNA分子的5'端连接一种荧光序列；

或，所述荧光基团序列为荧光序列FAM或荧光序列HEX。

6.一种鉴定或辅助鉴定小麦叶绿素含量的方法，为检测小麦染色体4BL上SNPAX94573388位点的基因型为GG还是CC还是GC，小麦染色体4BL上SNP AX94573388位点的基因型为CC的待测小麦的叶绿素含量高于小麦染色体4BL上SNP AX94573388位点的基因型为GG或GC的待测小麦；

或一种选育高叶绿素含量的小麦的方法，为检测小麦染色体4BL上SNPAX94573388位点的基因型为GG还是CC还是GC，选育基因型为CC的待测小麦，得到高叶绿素含量小麦；

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：

所述检测小麦染色体4BL上SNP AX94573388位点的基因型为GG还是CC还是GC的方法为如下A)或B)：

A)直接测序；

B)用权利要求5中的所述成套引物对待测小麦基因组DNA进行PCR扩增产物，对所述PCR扩增产物进行基因分型。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：

所述基因分型的方法为采用荧光酶标仪照射后，若所述PCR产物仅显示序列1所示DNA分子5'端连接荧光序列的颜色，则所述待测小麦染色体4BL上SNP AX94573388位点的基因型为GG；若所述PCR产物仅显示序列2所示DNA分子5'端连接荧光序列的颜色，则所述待测小麦染色体4BL上SNP AX94573388位点的基因型为CC；若所述PCR产物显示序列1所示DNA分子5'端连接荧光序列的颜色和序列2所示DNA分子5'端连接荧光序列的颜色，则所述待测小麦待测小麦染色体4BL上SNP AX94573388位点的基因型为GC。

9.一种鉴定或辅助鉴定小麦叶绿素含量的物质，为权利要求1-5所述应用中的所述检测小麦染色体4BL上SNP AX94573388位点的基因型的物质。

10.根据权利要求1-5任一所述的应用或权利要求6-8任一所述的方法或权利要求9所述的物质，其特征在于：所述小麦叶绿素含量为小麦生育后期倒三叶叶绿素含量。