CN108728375B - 奶牛瘤胃菌群的体外培养及保存方法 - Google Patents

奶牛瘤胃菌群的体外培养及保存方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了奶牛瘤胃菌群的体外培养方法，利用双外流连续培养系统进行奶牛瘤胃菌群的体外培养，将新鲜的奶牛瘤胃液接种至已预热并经CO2饱和的发酵罐中；开启搅拌和CO2通气装置，以瘤胃液供体牛的TMR日粮作为发酵底物，投料量为36‑80g/天，并向系统中输入缓冲液，38.5‑40℃发酵培养4‑10d，收集流出的固相和液相消化糜振荡混匀，纱布过滤，获得含瘤胃菌群的培养物。本发明还提供奶牛瘤胃菌群的体外保存方法，向奶牛瘤胃液或其体外培养物中加入脱脂乳粉后冻干。本发明解决了奶牛瘤胃微生物的体外扩大培养和保存问题，便于瘤胃移植的实施，瘤胃液无需通过瘘管牛现用现取，增加了安全性，有利于瘤胃液移植的推广应用。

Description

奶牛瘤胃菌群的体外培养及保存方法
技术领域
本发明涉及微生物培养及保存技术，具体地说，涉及奶牛瘤胃菌群的体外培养及保存方法。
背景技术
消化代谢类疾病、乳房疾病(包括乳房炎、乳头损伤、乳区坏死等)和蹄病是造成奶牛淘汰率偏高的主要原因。目前，这些疾病的治疗主要依靠依靠抗生素。抗生素的应用在奶牛疾病控制中起了重要作用，但随着抗生素的长期大量使用，其负面效应也日益显露出来，如引起病原微生物产生抗药性、破坏动物体内正常菌群的生态平衡、降低动物机体免疫功能以及药物残留对人类及环境造成的危害等。在奶牛养殖场中，抗生素治疗失败的案例屡见不鲜，是导致奶牛淘汰和经济损失的重要原因。在原奶中的抗生素残留是乳业中难以避免的顽疾，尤其是以含有抗生素残留的原奶所加工生产的婴幼儿奶制品，带来的危害更是无法预计。抗生素对婴幼儿的神经系统造成不可逆的损伤，极易导致婴幼儿失聪与失声。因此对于奶牛养殖业来说，提高饲养管理水平，寻求新的可替代抗生素的治疗方法迫在眉睫。
近些年，对于肠道菌群的重要性认知达到了前所未有的新高度。伴随着众多疾病的肠道菌群研究中表现出来的菌群差异，以及改变肠道菌群结构之后导致了许多疾病的发生，表明肠道菌群与人体疾病发生有着重要的联系。肠道菌群与人体的关系除了在营养消化方面的辅助，同时己经渗透到人体系统性全身疾病免疫防治中。伴随着人类肠道微生物和粪便菌群移植(Fecal microbiota transplantation)研究和应用的发展，瘤胃移植(Rumen transfaunation)也逐渐受到关注。瘤胃移植是指将供体瘤胃液(包括瘤胃菌群和代谢产物)作为整体移植到受体瘤胃内的技术手段。瘤胃菌群移植已被用于简单消化不良的临床治疗。研究发现，瘤胃移植对提高围产期奶牛采食量和产奶量具有积极作用，并对低乳脂症、酮病和真胃移位等代谢疾病的预防和治疗有很好的促进效果。然而，在实际生产中，该方法却很少被使用。目前，瘤胃移植的实施主要通过制作瘘管牛或通过瘤胃插管法，瘘管手术维护成本高；瘤胃插管费时费力，当采集的瘤胃液量过大时，供体牛的健康会受影响，应用受到限制。此外，瘤胃菌群离体后，其环境发生变化，如无氧环境变成有氧环境，微生物代谢底物得不到补充，大部分微生物的失去活性甚至死亡，运送过程导致菌群结构发生改变。采集的瘤胃液，必须在尽可能短的时间内迅速移植，取用极不方便。
发明内容
本发明的目的是提供奶牛瘤胃菌群的体外培养及保存方法。
为了实现本发明目的，本发明提供的奶牛瘤胃菌群的体外培养方法，利用双外流连续培养系统进行奶牛瘤胃菌群的体外培养，具体方法为：将新鲜的奶牛瘤胃液作为接种物接种至已预热并经CO2饱和的发酵罐中；开启搅拌和CO2通气装置，使整个系统处于厌氧环境，以瘤胃液供体牛的TMR日粮作为发酵底物，并向双外流连续培养系统中输入缓冲液，38.5-40℃发酵培养4-10d，收集流出的固相和液相消化糜振荡混匀，纱布过滤，获得含瘤胃菌群的培养物。
更具体地，将750mL新鲜的奶牛瘤胃液作为接种物接种至已预热并经CO2饱和的发酵罐中，发酵罐的有效容积为780mL；开启搅拌和CO2通气装置，气流量为35-45mL/min，以瘤胃液供体牛的TMR日粮作为发酵底物，投料量为36-80g/天(优选36-40g/天，更优选36g/天或40g/天)，分4-6次等量投料(优选6次)，并向双外流连续培养系统中输入缓冲液，将液相消化糜外流速度和固相消化糜外流速度分别控制在4-10％/h和2-7％/h(优选10％/h和5％/h)，38.5-40℃(优选39℃)发酵培养4-10d，收集流出的固相和液相消化糜振荡混匀，纱布过滤，获得含瘤胃菌群的培养物。
优选地，以转速25-30rpm(优选27rpm)进行搅拌，运行方式为搅拌25分钟，间歇5分钟。
优选地，输入缓冲液的流速为1.3mL/min，流过滤网的液相消化糜流速为0.65mL/min。
优选地，固相稀释率控制在5％，液相稀释率控制在10％。
所述瘤胃液供体牛为产3-4胎，泌乳天数60-80d的荷斯坦奶牛。
优选地，收集流出的固相和液相消化糜，在振荡器中间歇振荡混匀3-4次，每次振荡10-15秒，通过双层纱布过滤，获得含有瘤胃菌群的培养物。
优选地，所述TMR日粮为瘤胃液供体奶牛的TMR日粮，依据NRC(2001)配制，其组成及营养水平如表1所示(本发明中使用的是泌乳天数为60-80天的奶牛瘤胃液，因此使用如表1所示的配方，如果是其他泌乳期的奶牛瘤胃液，日粮可替换成与其对应的配方)。
表1奶牛全混合日粮组成(饲喂基础)及营养水平(干物质基础)
Figure BDA0001673996700000021
Figure BDA0001673996700000031
1)预混料为每千克全混合日粮提供:Mn 4800mg，Fe 4800mg，Zn 12850mg，Cu3250mg，I 140mg，Se 150mg，Co 110mg，VA 1000000IU，VD3 280000IU，VE 10000IU，烟酸1000mg。
2)泌乳净能为计算值，其余为实测值。
所述缓冲液的配制方法如下：
取标准缓冲液A 2400mL加入到25L容器中，加入水17435mL，再加入矿物盐溶液B120mL，250.0g/L尿素溶液40mL，搅拌均匀，并以无氧CO2饱和，使用前加入半胱氨酸盐酸盐5g。
其中，所述标准缓冲液A的配方为：NaHCO3 24.5g/L、KHCO3 29.0g/L、NaH2PO49.0g/L、KH2PO4 10.2g/L；所述矿物盐溶液B的配方为：NaCl 47.0g/L、KCL 57.0g/L、MgCl2·6H2O 12.8g/L、CaCl2·2H2O 5.3g/L。
所述接种物的获得方法为：将新鲜采集的瘤胃食糜在CO2饱和及保温条件下，在振荡器中间歇振荡3-5次，每次振荡10-15秒(振荡的目的是使附着在饲料颗粒上的微生物进入液相)，用纱布(单层或双层)过滤，收集滤液，即为接种物。
本发明采用中国农业大学设计的双外流型连续培养系统(参见孟庆翔.双外流连续培养系统用于瘤胃发酵的体外模拟:技术综述.动物营养学报(1999):45-50)。该系统具有12个发酵罐，发酵罐为2000mL聚碳酸酯罐。罐体中部安装有发酵液外流出口，此口下部体积为1460mL。在罐的顶部装有供缓冲液、CO2气体和饲料进入的阀门。发酵在39℃恒温水浴箱中进行，并经磁力搅拌器低速连续搅拌。高纯CO2连续输入用以维持发酵的厌氧环境。缓冲液通过蠕动泵连续加入到发酵罐中，外流发酵液由置于冰浴中的收集瓶收集。
本发明还提供奶牛瘤胃菌群的体外保存方法，向奶牛瘤胃液或其体外培养物中加入脱脂乳粉，然后冷冻干燥，得到瘤胃液冻干粉，于4℃或室温密封避光保存。例如，所得冻干粉装入棕色玻璃瓶或铝膜袋中，密封，4℃或室温保存。
优选地，所述脱脂乳粉的添加量为4％(4g/100mL)。
所述冷冻干燥的步骤为：第一步，-80℃预冻2-4h；第二步，真空度10-12Pa，温度-40--60℃，真空干燥48-60h。
复原时，将冻干粉按照7-20：100(g/mL)的比例溶于无菌水中，得到复原瘤胃液。
本发明还提供一种奶牛养殖用微生态制剂，其活性成分为按照上述方法制备得到的瘤胃液体外培养物，或者按照上述方法制备得到的瘤胃液冻干粉。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)本发明提供的瘤胃菌群体外培养方法简单，操作条件可精确控制，使用该方法制备的瘤胃菌群结构和功能稳定。
(二)本发明提供的瘤胃液冷冻干燥保存方法简单，操作条件可精确控制，使用该方法能够较好的保护瘤胃菌群的发酵活性，所得菌粉可放于低温长久保存。
(三)本发明解决了供体牛瘤胃液的体外扩大培养和保存的问题，便于瘤胃移植的实施，瘤胃液不需要通过瘘管牛现用现取，增加了安全性，有利于推动瘤胃液移植的推广应用。
附图说明
图1为本发明实施例1中发酵产物的pH值。
图2为本发明实施例1中发酵产物中细菌数量。
图3为本发明实施例1中瘤胃液中细菌α多样性分析结果；其中，Inoculant＝天然瘤胃液，A-I代表不同的投料量：A＝36g/d，B＝40g/d，C＝44g/d，D＝48g/d，E＝52g/d，F＝56g/d，G＝60g/d，H＝64g/d，I＝68g/d，J＝72g/d，H＝76g/d，I＝80g/d。
图4为本发明实施例1中瘤胃液中细菌群落结构相似度分析结果；其中，Inoculant＝天然瘤胃液，A-I代表不同的投料量：A＝36g/d，B＝40g/d，C＝44g/d，D＝48g/d，E＝52g/d，F＝56g/d，G＝60g/d，H＝64g/d，I＝68g/d，J＝72g/d，H＝76g/d，I＝80g/d。
图5为本发明实施例2中冷冻干燥对瘤胃液体外发酵产气量的影响；其中，*表示脱脂乳粉添加量相同时，新鲜瘤胃液和复原瘤胃液的发酵参数差异显著；同一列的不同字母表示脱脂乳粉添加量不同时，复原瘤胃液的发酵参数差异显著，P＜0.05作为差异显著的判断标准。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1奶牛瘤胃菌群的体外培养方法
1、实验材料及试剂
瘤胃液的供体动物为3～4头装有永久性瘤胃瘘管的Holstein成母牛(3-4胎，泌乳天数为60-80天)。奶牛采取散栏式饲养，自动采食槽饲喂，日粮依据NRC(2001)配制，其组成及营养水平如表1所示。自由采食，自由饮水，机械挤奶。于晨饲前，通过瘤胃瘘管采集瘤胃内容物，在厌氧和保温(39℃)条件下经振荡器间歇振荡3～4次(每次10～15秒)后，通过双层纱布过滤，并装入发酵罐中。双外流型连续培养系统所适用的缓冲溶液的配方和配置方法如表2所示。供发酵的底物为DIM(泌乳天数)＝60-80天奶牛的TMR(全混合日粮)。
表2缓冲溶液配方和配置方法
Figure BDA0001673996700000051
配制方法：20L缓冲液的配制程序：通常以20L为一配制单位。取标准缓冲液A2400mL加入
到25L容器中，加入自来水17435mL，再加入矿物盐溶液B 120mL，尿素溶液C 40mL，搅拌
均匀，并以无氧CO2饱和，使用前加入结晶半胱氨酸盐酸盐5g备用。此溶液配制后有轻微浑浊，
但经CO2饱和后会变为澄清。
2、试验设计
将750mL新鲜的奶牛瘤胃液作为接种物接种至已预热并经CO2饱和的发酵罐中，发酵罐的有效容积为780mL；开启搅拌和CO2通气装置，以日粮作为发酵底物，将液相消化糜外流速度和固相消化糜外流速度分别控制在10％/h和5％/h，将输入缓冲液的蠕动泵流速精确设定为1.3mL/min，将流过滤网的液相蠕动泵流速设定为0.63mL/min，39℃发酵培养，收集流出的固相和液相消化糜，在振荡器中间歇振荡混匀3-4次，每次振荡10-15秒，通过双层纱布过滤，获得含有瘤胃菌群的培养物。
为了优化培养条件，本试验设计了12个不同的投料量：36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76和80g/天，投料频率为6h/次，固相稀释率为5％，液相稀释率为10％，搅拌频率为27rpm，搅拌时间设定为25分钟、间歇时间5分钟。系统接通并运行2小时后，按确定好的加料量开始加料，在39℃下持续发酵10d，每天流出的瘤胃液体积为1872mL。整个实验在不同时间重复3次。
3、样品采集和分析
发酵前3天为适应期，4-10天为正试期。在正试期期间，每天3次，在投料后3h左右搅拌微电机间歇时，测定发酵罐内发酵液pH值。并用移液管从发酵罐中取一定量的发酵液，送至北京奥维森基因科技有限公司，提取DNA并进行定量PCR和多样性的测定。细菌总量用实时定量PCR测定。微生物组成和多样性分析使用MiSeq高通量测序技术。
4、试验结果与分析
(1)pH值
泌乳奶牛瘤胃液pH值的范围为6-7。在低的pH条件下，细菌和原虫的数量和多样性会受到影响。如图1所示，随着投料量的增加，发酵液的pH值呈下降趋势。当投料量为36-40g/d时，pH值＞6.0，但当投料量＞56g/d时，pH降至5.5以下。因此，在人工培养条件下，投料量应优选为36-40g/d。
(2)细菌数量和多样性分析
①细菌数量
采用RT-PCR技术，研究了体外培养对瘤胃细菌数量的影响。如图2所示，随着投料量的增加，培养液中细菌数量呈先增加后降低的趋势。当投料量为36、40和44g/d时，培养液的细菌数显著低于接种物，仅为接种物的19.21％、21.97％和43.47％；当投料量为48-60g/d时，培养液的细菌数与接种物差异不显著(P＞0.05)；当投料量为66-80g/d时，培养液的细菌数显著多于接种物，前者是后者的1.45-1.78倍。
②细菌α多样性
采用16S rDNA高通量测序技术对样品DNA的16S rDNA V3～V4区进行测序，序列覆盖率＞99％，本次测序结果能代表样本中微生物的真实情况。根据序列相似性97％水平划分得到的OTU总数为2493个，在OTU水平，使用Chao 1指数、Shannon指数、PD_whole_tree和observed_species等多样性指数分析样品中细菌的α多样性。如图3所示，当投料量为36-40g/d，培养液与接种物中观测到的OUT总数、Chao指数、Shannon指数和PD_whole_tree差异均不显著。当投料量大于40g/d时，随着投料量的增加，人工瘤胃液中细菌α多样性呈下降趋势。在人工培养条件下，要保持瘤胃液中细菌的α多样性，投料量应优选为36-40g/d。
③菌群结构相似性分析
利用树枝结构描述和比较多个样本间的相似性和差异关系，树枝长度代表样本间的距离，越是相似的样本越能聚到一起。如图4所示，当投料量为36-40g/d时培养液的细菌群落结构与接种物的最相似。因此，在人工培养条件下，投料量应优选为36-40g/d。
可见，使用双外流连续培养系统对奶牛瘤胃微生物进行体外扩大培养时，优选的投料量为36-40g/d，瘤胃液pH值＞6.0，并且细菌多样性和群落结构与天然瘤胃液的相似度最高。
实施例2奶牛瘤胃菌群的体外保存方法
瘤胃液的供体动物为3～4头装有永久性瘤胃瘘管的Holstein成母牛(3-4胎，泌乳天数＝60-80天)。奶牛采取散栏式饲养，自动采食槽饲喂，日粮依据NRC(2001)配制，其组成及营养水平如表1所示。自由采食，自由饮水，机械挤奶。于晨饲后2h，通过瘤胃瘘管采集瘤胃内容物，在厌氧和保温(39℃)条件下经振荡器间歇振荡3～4次(每次10～15秒)后，通过双层纱布过滤。分成两份，一份用于瘤胃微生物产气发酵试验，一部分用于冷冻干燥。
1、冷冻干燥
为了更好地保护瘤胃中的微生物，提高冻干菌剂的发酵活性，本发明使用脱脂乳粉作为冻干保护剂，并对脱脂乳粉的添加量进行了优化。将用于冷冻干燥的瘤胃液分成4份，每份300mL，分别加入0、12、30和60g脱脂奶粉，脱脂乳粉的添加比例分别为0％、4％、10％和20％。振荡使奶粉充分溶解，分装入平皿(10cm)中，每个平皿30mL。首先放入-80℃预冻2-4h，然后真空度10-12Pa，温度-40--60℃，真空干燥48-60h，得到瘤胃液冻干粉。所使用的冷冻干燥机为FD-2真空冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司生产。
2、瘤胃微生物发酵
(1)AGRS装置及操作条件
本发明采用中国农业大学设计AGRS-Ⅲ装置，研究冻干前后瘤胃菌群的发酵活性。该装置配置有64个总容积为120mL亨氏厌氧发酵瓶(含特制螺盖与白色几丁质胶塞)。
缓冲溶液的配置：2000mL蒸馏水，0.5mL溶液A，1000mL溶液B，1000mL溶液C，200mLNa2S还原溶液以及5mL 0.1％(w/v)刃天青指示剂。其中溶液A为微量元素溶液，每100mL配方包括13.2g CaCl2·2H2O，10.0g MnCl2·4H2O，1.0g CoCl2·6H2O，8g FeCL2·6H2O；溶液B为缓冲溶液，每1000mL配方包括35g NaHCO3，4g NH4HCO3；溶液C为常量元素溶液，每1000mL配方包括5.7g Na2HPO4，6.2g KH2PO4，0.6g MgSO4·7H2O；刃天青溶液，每100mL配方包括100mg刃天青；还原剂溶液，每100mL配方包括625mg Na2S·9H2O和4.0mL浓度为1.0M的NaOH溶液。向配置好的缓冲溶液中持续注入CO2气体直到颜色由红色转为粉红色，最后变为无色为止，pH≈6.85，置于39℃恒温水浴锅中静置。配制好的缓冲液应置入深色避光容器加盖密封保存，不宜长期搁置于敞口烧杯等容器与空气长期接触，现用现配。
缓冲液分装与接种：准确称取规定量的脱脂乳粉于150mL厌氧发酵瓶中，各组设置6个重复。用移液器取50mL备好的39℃的缓冲液和25mL瘤胃液于各个发酵瓶中，自瓶口通入CO2或N2气体2-3s后，加塞并拧紧瓶盖，迅速与AGRS系统装置对应编号的通道气路连接后，进行微生物发酵实时产气量自动记录。
终止发酵：累计发酵48h后终止发酵。发酵终止时，断开连接的气路，将发酵瓶取下，置于冰水中(冰水量以发酵瓶不出现漂浮为宜)。
(2)试验设计
①冻干前瘤胃菌群的产气发酵
本试验分为4组，分别为添加0％、4％、10％和20％脱脂乳粉的新鲜瘤胃液，每组6个重复。
②冻干后瘤胃菌群的产气发酵
每100mL添加0、4、10和20g脱脂乳粉的瘤胃液冻干后所得粉状固体的质量分别为3.47g、7.10g、12.85g和22.69g。按照该比例，将上述干粉分别溶解于无菌水中得到复原瘤胃液。本试验分为4组，每组6个重复。
3、结果与分析
(1)发酵参数
以脱脂乳粉作为保护剂，冷冻干燥制备瘤胃液冻干粉，将冻干粉加无菌水复原后进行体外发酵。如表3所示，与新鲜瘤胃液比较，复原瘤胃液的乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸和TVFA均显著低于新鲜瘤胃液(P＜0.05)，当脱脂乳房添加量为4％时差异最小；脱脂乳粉添加量为0％、10％和20％时，复原瘤胃液的pH值显著低于新鲜瘤胃液，为4％时复原瘤胃液与新鲜瘤胃液差异不显著。说明，瘤胃液在冷冻干燥时，微生物发酵模式发生了显著变化，添加适量(4％)的脱脂乳粉，可以在一定程度上保护瘤胃菌群结构的稳定。
(2)体外发酵产气量
添加不同量的脱脂奶粉作为保护剂，使用真空冷冻干燥法将新鲜瘤胃液制备成冻干粉，按比例加水复原后体外发酵48h，每mL新鲜瘤胃液和复原瘤胃液的产气量如图5所示。复原瘤胃液的产气量显著低于新鲜瘤胃液(P＜0.05)，当脱脂乳粉的添加量为0％、4％、10％和20％时，添加4％脱脂乳粉冻干后瘤胃菌群的产气量最高，其次是添加20％、10％和0％脱脂乳粉冻干后的样品，分别为冻前的65.15％、55.99％、24.56％和20.00％。说明冷冻干燥会降低瘤胃菌群的产气活性，但添加脱脂乳粉作为保护剂可以提高瘤胃菌群的产气活性，添加量为4％时效果较为理想。
可见，真空冷冻干燥会降低瘤胃菌群的发酵和产气活性，添加脱脂乳粉作为保护剂可以提高冻干后瘤胃菌群的活性，添加量优选4％，此时，复原发酵液的pH＞6.0，有机酸含量和产气量与新鲜瘤胃液最接近。1L瘤胃液可得到70.1g冻干粉，1kg冻干粉可复原13.4L瘤胃液。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Figure BDA0001673996700000101

Claims (6)

1.奶牛瘤胃菌群的体外保存方法，其特征在于，向奶牛瘤胃液或其体外培养物中按4％的添加量加入脱脂乳粉，然后冷冻干燥，得到瘤胃液冻干粉，于4℃或室温密封避光保存；
所述冷冻干燥的步骤为：第一步，-80℃预冻2-4h；第二步，真空度10-12Pa，温度-40--60℃，真空干燥48-60h；
其中，奶牛瘤胃液体外培养物的制备方法如下：利用双外流连续培养系统进行奶牛瘤胃菌群的体外培养，具体方法为：将750mL新鲜的奶牛瘤胃液作为接种物接种至已预热并经CO2饱和的发酵罐中，发酵罐的有效容积为780mL；开启搅拌和CO2通气装置，气流量为35-45mL/min，以瘤胃液供体牛的TMR日粮作为发酵底物，投料量为36-80g/天，分4-6次等量投料，并向双外流连续培养系统中输入缓冲液，将液相消化糜外流速度和固相消化糜外流速度分别控制在4-10％/h和2-7％/h，38.5-40℃发酵培养4-10d，收集流出的固相和液相消化糜振荡混匀，纱布过滤，获得含瘤胃菌群的培养物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述奶牛瘤胃液体外培养物的制备方法中，以转速25-30rpm进行搅拌，运行方式为搅拌25分钟，间歇5分钟。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述奶牛瘤胃液体外培养物的制备方法中，输入缓冲液的流速为1.3mL/min，流过滤网的液相消化糜流速为0.65mL/min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述奶牛瘤胃液体外培养物的制备方法中，所述瘤胃液供体牛为产3-4胎，泌乳天数60-80d的荷斯坦奶牛。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述奶牛瘤胃液体外培养物的制备方法中，收集流出的固相和液相消化糜，在振荡器中间歇振荡混匀3-4次，每次振荡10-15秒，通过双层纱布过滤，获得含有瘤胃菌群的培养物。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述奶牛瘤胃液体外培养物的制备方法中，所述缓冲液的配制方法如下：
取标准缓冲液A 2400mL加入到25L容器中，加入水17435mL，再加入矿物盐溶液B120mL，250.0g/L尿素溶液40mL，搅拌均匀，并以无氧CO2饱和，使用前加入半胱氨酸盐酸盐5g；
其中，所述标准缓冲液A的配方为：NaHCO3 24.5g/L、KHCO3 29.0g/L、NaH2PO49.0g/L、KH2PO4 10.2g/L；所述矿物盐溶液B的配方为：NaCl 47.0g/L、KCL 57.0g/L、MgCl2·6H2O12.8g/L、CaCl2·2H2O 5.3g/L。
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