CN108727324B - 一种分离纯化柑橘多甲氧基黄酮的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于化合物提取及纯化技术领域，具体涉及一种分离纯化柑橘多甲氧基黄酮的方法。本发明采用大孔吸附树脂与制备型高效液相色谱联用的方法分离纯化出多个多甲氧基黄酮单体，包括粗提、大孔吸附树脂富集除杂和制备型高效液相色谱纯化得单体的过程。本发明的方法提取的杂质大大减少，目标成分含量增加，分离纯化效率较高，能同时分离纯化出5个PMFs单体且单体纯度95％以上，使用的溶剂安全无毒副作用且能有效回收。

Description

一种分离纯化柑橘多甲氧基黄酮的方法

技术领域

本发明属于化合物提取及纯化技术领域，具体涉及一种分离纯化柑橘多甲氧基黄酮的方法。

背景技术

柑橘富含黄酮类物质，其中的多甲氧基黄酮(PMFs)是柑橘中所特有的，川陈皮素(Nobiletin)、桔皮素(Tangeretin)是其中的代表，它们主要分布在柑橘皮的油胞中，含量在0.4～0.6mg/g。这类物质由于其具有平面结构，含有多个甲氧基，极性低，因此具有多种药理作用如抗癌、抗炎、抗氧化、抗诱变以及降低胆固醇等作用，特别其在抗癌方面的作用要比其它黄酮类强。

目前，提取PMFs的方法主要为有机溶剂提取法(浸渍法)、超临界流体萃取、酶解法、微波辅助提取等方法。目前方法仍存在杂质的共提取问题，提取效率不高等问题。因此，粗提物的杂质多、目标物质含量低，提取效率亟待改善。

而分离纯化主要依靠溶剂萃取、薄层色谱(TLC)、高速逆流色谱(HSCCC)和制备型高效液相色谱(prep-HPLC)等方式，步骤繁琐，有机溶剂难以回收。还有是采用聚酰胺柱和葡聚糖凝胶柱两次纯化柑橘皮粗提物，虽然得到的多甲氧基黄酮含量也较高，但是分离工序较复杂，而且这两种分离介质价格也较昂贵。

目前PMF单体分离纯化中存在杂质提取多、步骤繁琐、有机溶剂难回收等问题。

因此，本发明针对这一现状，根据多甲氧基黄酮的特性设计出大孔吸附树脂(MAR)与prep-HPLC联用的方法分离纯化柑橘中的PMFs，与现有方法相比，本发明的方法提取的杂质大大减少，目标成分含量增加，能同时分离纯化出多个PMFs单体、使用的溶剂安全无毒副作用且能有效回收。

发明内容

目前PMF单体分离纯化中存在杂质提取多、步骤繁琐、有机溶剂难回收等问题。因此可以在PMF单体纯化前增加去杂质的过程。

大孔树脂(MAR)是一种多孔的聚合物吸附剂，通过选择适宜的树脂可以对目标分离物具有较好的吸附作用，然后通过适宜的洗脱剂洗脱下来达到富集除杂的目的，它具有成本低廉，易得，组装简单，分离效果好的优点。可用于粗体物的去杂。

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种分离纯化柑橘多甲氧基黄酮的方法，该方法提取的杂质大大减少，目标成分含量增加，能同时分离纯化出多个PMFs单体，使用的溶剂安全无毒副作用，能有效回收。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种分离纯化柑橘多甲氧基黄酮的方法，其采用大孔吸附树脂与制备型高效液相色谱联用的方法分离纯化出多个多甲氧基黄酮单体，包括以下步骤：

1)提取

柑橘皮渣与85％-95％(v/v)乙醇水溶液混匀，45℃以下辅助以超声处理提取30min-2h，取上清，浓缩得粗提液；

2)富集除杂

预处理好的HPD300大孔树脂装入层析柱，将所述粗提液泵入所述层析柱，3％-10％(v/v)乙醇水溶液泵入所述层析柱水洗除杂，90％-95％(v/v)乙醇水溶液泵入所述层析柱解除吸附，收集解除吸附阶段的洗脱液，浓缩并冻干，得PMF混合物；

3)分离纯化

用色谱级甲醇或乙醇溶解所述PMF混合物，获得待纯化溶液，通过质谱引导的制备型高效液相色谱进行进一步分离纯化：待纯化溶液上样后，采用流动相梯度洗脱，按保留时间收集各馏分，浓缩并冻干，获得多甲氧基黄酮单体；

所述流动相由流动相A和流动相B组成，其中所述流动相A：体积分数为0.1％的甲酸的乙腈溶液；所述流动相B：体积分数为0.1％的甲酸的水溶液；

梯度洗脱时，所述流动相中流动相A占比起始为15％-20％；在40min-50min内流动相A占比上升至55％-70％的高点，其中流动相A占比28％-45％持续的时间为25min-35min；所述流动相A占比上升至55％-70％的高点后，3min-7min回落至15％-20％的起始占比。

本发明建立基于MS-Directed prep-HPLC(质谱引导的制备型高效液相色谱)与MAR联用同时分离纯化柑橘PMFs单体的方法。解决目前PMF单体分离纯化中杂质提取多、步骤繁琐、有机溶剂难回收等问题。

作为优选的方案，所述梯度洗脱具体为：0-6min，流动相A占比从18％升至30％，即流动相B占比82％降至70％；6-35min，流动相A占比由30％升至42％，即流动相B占比70％降至58％；35-45min，流动相A占比由42％升至60％，即流动相B占比58％降至40％；45-50min，流动相A占比由60％降至18％，即流动相B占比40％升至82％。

作为优选的方案，所述流动相的流速为15-25mL/min。

进一步，所述流动相的流速为20mL/min。

作为优选的方案，所述prep-HPLC采用XBridge Prep RP18制备柱。

作为优选的方案，步骤3)所述待纯化溶液过柱前过0.22μm亲水PTFE滤膜。

作为优选的方案，步骤2)所述解除吸附的乙醇水溶液为90％(v/v)乙醇水溶液。

作为优选的方案，步骤2)所述水洗除杂的乙醇水溶液中乙醇浓度为5％-7％(v/v)。

作为优选的方案，步骤2)所述层析柱为规格为22×300mm的玻璃层析柱。其1个柱体积约10mL。

在上述层析柱的基础上探索最佳吸附和解吸条件，具体为：

步骤2)所述粗提液的上样浓度为8.7mg/mL；

步骤2)所述粗提液的上样流速为4BV/h；

步骤2)所述解除吸附流速为4BV/h。

作为优选的方案，步骤1)所述乙醇水溶液浓度为85％-90％(v/v)。

作为优选的方案，步骤1)所述柑橘皮渣与所述乙醇水溶液的质量体积比为1:15-30。

进一步，优选为1:20。

作为优选的方案，步骤1)所述提取温度为45℃以下。

作为优选的方案，步骤1)所述于45℃以下辅助以超声处理的提取过程可重复1-3次。

本发明的方法能够分离纯化出5种多甲氧基黄酮单体，分别为：甜橙黄酮、5,6,7,4'-四甲氧基黄酮、川陈皮素、桔皮素、5-羟基-6,7,8,3',4'-五甲氧基黄酮。

本发明的有益效果在于：本发明提供的分离纯化柑橘多甲氧基黄酮的方法：

1)用大孔树脂富集处理后，减少了提取物中的杂质，大大提高了提取物中目标物质的含量(提高了18.74倍)。

2)同时分离纯化柑橘中5个PMFs单体，纯度均在95％以上，分离纯化效率较高。

3)分离纯化过程中使用的试剂均安全无毒可回收。

4)有效利用了柑橘皮渣，减少资源浪费及环境污染问题。

附图说明

图1为获得的多甲氧基黄酮单体，其中：1为甜橙黄酮；2为5,6,7,4’-四甲氧基黄酮；3为川陈皮素；4为桔皮素；5为5-羟基-6,7,8,3',4'-五甲氧基黄酮。

具体实施方式

以下将(参照附图)对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1 HPD300大孔树脂层析柱的富集除杂工艺

探索本发明的HPD300大孔树脂层析柱的最佳吸附/解吸条件，包括上样吸附流速、上样浓度、解吸浓度和解吸流速。

1.上样吸附流速

采用了1.5BV/h、2.5BV/h、4BV/h、5.5BV/h的上样流速进行实验。结果为：上样流速为1.5BV/h、2.5BV/h上样时间长，效率低；5.5BV/h上样后泄露点出现太早，接触不充分，上样量低；4BV/h为最佳上样速度。

2.上样浓度

采用2.42mg/mL、5.45mg/mL、8.7mg/mL、10.75mg/mL的上样浓度进行实验。结果为：上样浓度为2.42mg/mL、5.45mg/mL时对应的上样量大，上样时间长；上样浓度为10.75mg/mL时浓度过大，容易造成层析柱堵塞；8.7mg/mL为最佳上样浓度。

3.解吸浓度

采用50％、70％、90％(v/v)的乙醇水溶液进行解除吸附实验。结果为：浓度为50％和70％的乙醇解吸太慢，效果不如90％(v/v)的乙醇水溶液。

4.解吸流速

采用了2.5BV/h、4BV/h、5.5BV/h的解吸流速进行实验。结果为：2.5BV/h需要1.2h才能解吸完全，时间长，效率低；5.5BV/h太快，造成溶剂浪费；4BV/h为最佳解吸速度。

实施例2分离纯化柑橘多甲氧基黄酮的方法

1.提取

1)红橘干果皮与89.1％(v/v)乙醇水溶液，按照料液比为1：20(m/v)混匀；在40.9℃下超声辅助提取34.1min，取上清1；沉淀加89.1％(v/v)乙醇水溶液，40.9℃下超声辅助提取34.1min，取上清2。上清1、2混匀，45℃下真空旋蒸浓缩至乙醇旋蒸完全，制得粗提液。

2.富集除杂

1)将预处理好的HPD300大孔树脂采用湿法装入22×300mm的玻璃层析柱中(1个柱体积约10mL)，按照实施例1获得的最佳吸附/解吸条件进行上样/洗脱，收集洗脱液。

最佳吸附条件为：①上样浓度：8.7mg/mL，由粗提液经25％(v/v)乙醇水溶液稀释；②上样流速：4BV/h；③上样量：11BV。最佳解吸条件为：①7％乙醇溶液水洗除杂；②90％乙醇溶液解吸，流速：4BV/h。

2)将获得的洗脱液浓缩并冻干得PMF混合物。

3.分离纯化

1)用甲醇将获得的PMF混合物溶解成100mg/mL，过0.22μm PTFE膜，得待纯化溶液，备用，通过质谱引导的prep-HPLC进行进一步分离纯化。待纯化溶液的进样体积：650μL。

prep-HPLC条件：①采用XBridge Prep RP18制备柱(19×250mm,5μm)；②流动相A为0.1％甲酸/乙腈，流动相B为0.1％甲酸/水；③流速为20mL/min；④梯度洗脱具体为：0-6min，流动相A占比从18％升至30％，即流动相B占比82％降至70％；6-35min，流动相A占比由30％升至42％，即流动相B占比70％降至58％；35-45min，流动相A占比由42％升至60％，即流动相B占比58％降至40％；45-50min，流动相A占比由60％降至18％，即流动相B占比40％升至82％。

2)按保留时间自动收集各馏分

馏分顺序：甜橙黄酮，5,6,7,4’-四甲氧基黄酮，川陈皮素，5-羟基-6,7,8,3',4'-五甲氧基黄酮，橘皮素。将各馏分分类混合后浓缩并冻干。

实施例3结果检测

1.大孔树脂层析柱富集除杂前后提取物中各PMF化合物浓度见表1。

表1提取物中各PMF化合物浓度

其中P1：异橙黄酮；P2：甜橙黄酮；P3：5,7,3',4'-四甲氧基黄酮；P4：5,6,7,4’-四甲氧基黄酮；P5：川陈皮素；P6：3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黄酮；P7：5,7,4’-三甲氧基黄酮；P8：5-羟基-6,7,8,3',4'-五甲氧基黄酮；P9：桔皮素。

因此，本发明采用大孔树脂层析柱进行富集处理，处理后的提取液中杂质减少的同时，目标物质PMF富集在一起。

2.产物分析

实施例2获得的产物PMFs单体见图1，其中：1为甜橙黄酮，纯度为98.92％；2为5,6,7,4’-四甲氧基黄酮，纯度为95.33％；3为川陈皮素，纯度为99.69％；4为桔皮素，纯度为99.46％；5为5-羟基-6,7,8,3',4'-五甲氧基黄酮，纯度为98.14％。

本发明提供的大孔吸附树脂与prep-HPLC联用的方法分离纯化柑橘中的PMFs，本发明的方法提取的杂质大大减少，目标成分含量增加，能同时分离纯化出5个PMFs单体，且单体纯度高。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (8)

1.一种分离纯化柑橘多甲氧基黄酮的方法，其特征在于，采用大孔吸附树脂与制备型高效液相色谱联用的方法分离纯化出多个多甲氧基黄酮单体，包括以下步骤：

1）提取

柑橘皮渣与85%-95%（v/v）乙醇水溶液混匀，于45℃以下辅助以超声处理提取30min-2h，取上清，浓缩得粗提液；

2）富集除杂

预处理好的HPD300大孔树脂装入层析柱，将所述粗提液泵入所述层析柱，3%-10%（v/v）乙醇水溶液泵入所述层析柱水洗除杂，90%-95%（v/v）乙醇水溶液泵入所述层析柱解除吸附，收集解除吸附阶段的洗脱液，浓缩并冻干，得PMF混合物；

3）分离纯化

用甲醇或乙醇溶解所述PMF混合物，获得待纯化溶液，通过质谱引导的制备型高效液相色谱进行进一步分离纯化，待纯化溶液上样后，采用流动相梯度洗脱，按保留时间收集各馏分，浓缩并冻干，获得多甲氧基黄酮单体；

所述方法分离纯化出5种多甲氧基黄酮单体，分别为：甜橙黄酮、5,6,7,4'-四甲氧基黄酮、川陈皮素、橘皮素、5-羟基-6,7,8,3',4'-五甲氧基黄酮；

所述流动相由流动相A和流动相B组成，其中所述流动相A：体积分数为0.1%的甲酸的乙腈溶液；所述流动相B：体积分数为0.1%的甲酸的水溶液；

所述流动相的流速为15-25 mL/min；所述梯度洗脱具体为：0-6 min，流动相A 占比从18%升至30%，即流动相B 占比82%降至70%；6-35 min，流动相A 占比由30%升至42%，即流动相B 占比70%降至58%；35-45 min，流动相A 占比由42%升至60%，即流动相B 占比58%降至40%；45-50 min，流动相A 占比由60%降至18%，即流动相B 占比40%升至82%。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述制备型高效液相色谱采用XBridgePrep RP18制备柱。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）所述待纯化溶液过柱前过0.22μm亲水PTFE滤膜。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）所述层析柱为规格为22 × 300 mm的玻璃层析柱。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2）所述粗提液的上样浓度为8.7mg/mL。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2）所述粗提液的上样流速为4BV/h。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2）所述解除吸附流速为4 BV/h。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）所述于45℃以下辅助以超声处理的提取过程重复1-3次。

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