CN114181227A - 一种酸浆苦素的提取方法及其提取液的纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种酸浆苦素的提取方法及其提取液的纯化方法，包括以下步骤：将氯化胆碱、果糖、水混合；将混合后的组分进行恒温搅拌，合成低共熔溶剂，将锦灯笼宿萼烘干后研磨成粉末，过80目筛；将锦灯笼粉末置于提取罐中，加入低共熔溶剂，然后进行恒温搅拌，得到锦灯笼宿萼的提取液。使用本发明低共熔溶剂，采用恒温加热搅拌法提取锦灯笼宿萼中酸浆苦素的方法高效、绿色、安全、成本低廉，与水和乙醇溶剂相比，对锦灯笼宿萼中酸浆苦素具有较高的提取效率和较为简便的纯化流程。

Description

一种酸浆苦素的提取方法及其提取液的纯化方法

技术领域

本发明涉及医药技术领域，更具体的说是涉及一种酸浆苦素的提取方法及其提取液的纯化方法。

背景技术

锦灯笼(Physalis alkengi L.var.franchetii(Mast.)Makino)是茄科酸浆属多年生草本植物。广泛分布于我国东北，内蒙古和西北地区，在俄罗斯，美洲，日本，韩国等地区也有分布。锦灯笼具有清热解毒、利咽化痰和利尿通淋之功效，常用于治疗咽痛音哑、痰热咳嗽、小便不利、热淋涩痛。越来越多的药理活性得到证实。国内外学者从锦灯笼中分离得到的甾体类成分主要为酸浆苦素类成分，也包含其他醉茄内酯类和一些甾醇类等。甾体类化合物是近年来在锦灯笼中发现的最丰富的一类化学成分，其中酸浆苦素类化合物是一种独特的活性物质，其基本结构是13,14-裂环-16,12-环麦角甾烷骨架。酸浆苦素类化合物仅存在于酸浆属中，具有复杂且高度氧化的甾体核心结构，化合物的变化主要取决于碳-碳双键和取代基(羟基、羰基、甲氧基)的位置和数量，从而产生许多异构体。酸浆苦素类化合物是酸浆属植物所特有的药效成分，包括酸浆苦素A，酸浆苦素L、酸浆苦素E、酸浆苦素H等三十多种化合物，其中酸浆苦素A对黑素瘤细胞具有抗增殖功效。酸浆苦素D能够抑制破骨细胞生成和骨质流失，酸浆苦素B和酸浆苦素E具有一定的抗感染、抗菌作用，酸浆苦素B和G能够抑制淋巴细胞功能，可防止小鼠异基因异位心脏移植排斥。王英臣利用酸浆苦素类化合物对球菌，杆菌，霉菌等进行抑菌实验，证实酸浆苦素类化合物对革兰氏阳性菌具有明显的抑菌效果。酸浆苦素B和F可以抑制多种人类白血病细胞。酸浆苦素类具有广泛的药理活性，具有很大的开发前景。

有机溶剂提取法是最常用的中药有效成分提取技术，它利用样品中各组分在同一溶剂中溶解度的差异，使其完全或部分分离的方法，要求提取溶剂的极性与分析物的极性相近，即相似相溶原理，使分析物能进入溶液而样品中其他物质处于不溶状态。甲醇、乙醇常用于提取酸浆苦素类化合物，然而，这种方法提取成分多，组成复杂，不利于酸浆苦素的进一步纯化，而且大量使用有机溶剂可能对人类和环境造成危险。

针对上述现有技术问题，近年来研究发展出超临界流体萃取技术、半仿生提取技术、酶工程技术应用于植物化学成分的高效提取，但提取工艺复杂、酶种类繁杂、提取成本高、技术方案涉密性以及提取设备昂贵等因素限制了以上方法在中药提取领域的应用。

因此，如何提供一种高效、绿色、安全、成本低的从锦灯笼宿萼中提取和纯化酸浆苦素的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种工艺简单，成本低，绿色环保的酸浆苦素的提取方法及其提取液的纯化方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种酸浆苦素的提取方法，包括以下步骤：

(1)将氯化胆碱、果糖与水混合并搅拌得混合组分，然后对混合组分进行恒温搅拌，得低共熔溶剂；

(2)将锦灯笼宿萼烘干后研磨成粉末，过筛；

(3)将过筛后的锦灯笼宿萼粉末置于提取容器中，加入所述低共熔溶剂，然后进行恒温搅拌，得酸浆苦素提取液。

上述方法中，所制备的低共熔溶剂采用的原料经济、易得、安全。本发明制备的低共熔溶剂粘度适中，对酸浆苦素的提取效率高。本发明采用恒温加热搅拌法制备低共熔溶剂，制备得到的溶剂稳定性好，该法操作简便，处理条件简单，无需使用有机试剂，反应原液利用率100％，符合绿色化学指导原则。

且，采用恒温加热搅拌法提取锦灯笼宿萼中酸浆苦素的方法高效、绿色、安全、成本低廉。氯化胆碱与果糖组成的低共熔溶剂与水、乙醇溶剂相比，对锦灯笼宿萼中酸浆苦素具有较高的提取效率和较为简便的纯化流程。

优选的，步骤(1)中所述氯化胆碱和果糖的摩尔比为1:1，其中，每1mol 氯化胆碱的加水量为200ml。

优选的，步骤(1)中所述混合并搅拌中搅拌速度为200-500r/min，搅拌时间为2h。

优选的，步骤(1)中所述恒温搅拌中恒温温度为80℃，搅拌速度为 200-500r/min，搅拌时间为2h。

优选的，步骤(2)中所述烘干温度为80℃，烘干时间为1-2h，所述过筛为过80目筛。

上述优选的有益效果为：上述烘干条件有利于低共熔溶剂对锦灯笼提取及提到提取效率。

优选的，步骤(3)中所述低共熔溶剂的加入量为每1g酸浆苦素加入低共熔溶剂8ml。

优选的，步骤(3)中所述恒温搅拌中恒温温度为80℃，搅拌速度为 500r/min，搅拌时间为2h。

上述优选的有益效果为：在上述条件下，提取条件温和，提取较完全。

本发明的另一个目的在于提供一种酸浆苦素提取液的纯化方法，包括以下步骤：

样品纯化：采用上述的酸浆苦素提取液为样品，取2ml样品置于离心管中，然后加入2ml石油醚，涡旋10min，弃去石油醚层，然后加入2ml乙酸乙酯，涡旋10min，取乙酸乙酯层吹干后加入2ml甲醇复溶即完成纯化。

采用上述纯化方法，方法简便，低共熔溶剂提取锦灯笼宿萼样品后不需要处理，可直接利用石油醚和乙酸乙酯萃取，此萃取方法乳化层少，萃取效率较高，边用利用制备液相纯化。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明纯化方法简便、高效，以低共熔溶剂作为提取溶剂，无需进行处理可直接用乙酸乙酯萃取，乳化层小、萃取效率高、杂质少，有利于酸浆苦素类化合物下一步继续纯化。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为低共熔溶剂空白总离子流图；

图2为低共熔溶剂提取纯化酸浆苦素总离子流图；

图3为水空白溶液总离子流图；

图4为水提取纯化酸浆苦素总离子流图；

图5为乙醇空白溶液总离子流图；

图6为乙醇提取纯化酸浆苦素总离子流图；

图7为酸浆苦素类化合物的基本母核及特征碎片；

图8为色谱条件优化后低共熔溶剂提取纯化酸浆苦素总离子流图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

(一)低共熔溶剂的合成方法，包括以下步骤：

(1)将0.1mol氯化胆碱、0.1mol果糖、20mL超纯水混合，混合转速为 500r/min，混合时间为2h；

(2)将混合后的组分进行恒温搅拌，恒温温度为80℃，搅拌时间为2h，搅拌转速为500r/min，合成低共熔溶剂。

(二)提取酸浆苦素的方法，包括以下步骤：

1)将锦灯笼宿萼烘干后研磨成粉末，过80目筛，烘干温度为80℃，烘干时间为2h；

2)将5g锦灯笼宿萼粉末置于提取罐中，加入低共熔溶剂40mL，然后进行恒温搅拌，恒温温度为80℃，搅拌时间为2h，搅拌转速为500r/min，得到酸浆苦素的提取液。

(三)将酸浆苦素的提取液用0.22um微孔滤膜过滤，采用高效液相色谱串联轨道阱质谱法法检测滤液中的酸浆苦素。

对比例1

(一)水提取酸浆苦素的方法，包括以下步骤：

1)将锦灯笼宿萼烘干后研磨成粉末，过80目筛，烘干温度为80℃，烘干时间为2h；

2)将5g锦灯笼宿萼粉末置于提取罐中，加入水40mL，然后进行恒温搅拌，恒温温度为80℃，搅拌时间为2h，搅拌转速为500r/min，得到酸浆苦素的提取液。

(二)将酸浆苦素的提取液用0.22um微孔滤膜过滤，采用高效液相色谱串联轨道阱质谱法检测滤液中的酸浆苦素。

一、根据实施例1和对比例1所述利用超高效液相色谱法串联四极杆轨道阱质谱法(UHPLC-ESI-Orbitrap-MS/MS)检测锦灯笼宿萼的提取液中酸浆苦素的含量，具体步骤如下：

a、将提取液进行UHPLC-ESI-Orbitrap-MS/MS测定，酸浆苦素质谱数据利用参考文献鉴定，测得各酸浆苦素类化合物峰面积；

对比例2

(一)乙醇提取酸浆苦素的方法，包括以下步骤：

1)将锦灯笼宿萼烘干后研磨成粉末，过80目筛，烘干温度为80℃，烘干时间为2h；

2)将5g锦灯笼宿萼粉末置于提取罐中，加入乙醇40mL，然后进行恒温搅拌，恒温温度为80℃，搅拌时间为2h，搅拌转速为500r/min，得到酸浆苦素的提取液，将提取液中乙醇挥干至浸膏。

(二)将酸浆苦素的提取液用0.22um微孔滤膜过滤，采用高效液相色谱串联轨道阱质谱法检测滤液中的酸浆苦素。

一、根据实施例1、对比例1和对比例2所述利用超高效液相色谱法串联四极杆轨道阱质谱法(UHPLC-ESI-Orbitrap-MS/MS)检测锦灯笼宿萼的提取液中酸浆苦素的含量，具体步骤如下：

a、将提取液进行UHPLC-ESI-Orbitrap-MS/MS测定，酸浆苦素质谱数据利用参考文献鉴定；

实施例2

低共熔溶剂提取锦灯笼宿萼，酸浆苦素提取液的纯化方法，包括以下步骤：

采用权利要求所述酸浆苦素的提取液作为样品，取2mL样品置于离心管中，加入2mL石油醚，涡旋10min，弃去石油醚层后，加入2mL乙酸乙酯，涡旋10min，取乙酸乙酯层吹干后利用2mL甲醇复溶，完成酸浆苦素的提取液的纯化。

对比例3

水提取锦灯笼宿萼，酸浆苦素提取液的纯化方法，包括以下步骤：

采用权利要求所述酸浆苦素的提取液作为样品，取2mL样品置于离心管中，加入2mL石油醚，涡旋10min，弃去石油醚层后，加入2mL乙酸乙酯，涡旋10min，取乙酸乙酯层吹干后利用2mL甲醇复溶，完成酸浆苦素的提取液的纯化。

对比例4

乙醇提取锦灯笼宿萼，酸浆苦素提取液的纯化方法，包括以下步骤：

采用权利要求所述酸浆苦素的提取液浸膏作为样品，取0.054g样品置于离心管中，加入2mL石油醚，涡旋10min，弃去石油醚层后，加入2mL乙酸乙酯，涡旋10min，取乙酸乙酯层吹干后利用2mL甲醇复溶，完成酸浆苦素的提取液的纯化。

根据文献及Pubchem数据库对比二级质谱数据，推测酸浆苦素类化合物的基本母核及特征碎片，确定了酸浆苦素的各质荷比，利用Thermo Xcalibur Qual Browser计算酸浆苦素的峰面积。实施例2及对比例2锦灯笼宿萼的提取液中酸浆苦素峰面积结果见表1。

表1酸浆苦素峰面积

由表1可知低共熔溶剂提取、水提取和醇提取纯化后，提取溶剂为低共熔溶剂和水的酸浆苦素峰面积较大。由图2和图3可知，低共熔溶剂为提取溶剂时，纯化后的杂质少。保留时间20.73、26.16、36.47的质荷比分别为 329.23386、265.14838、339.23334均为空白溶剂峰，因此在纯化过程不应考虑这三个色谱峰的存在。

通过对比文献，推测了三种酸浆苦素的二级质谱裂解规律，图4为在保留时间为18.73分钟酸浆苦素A的二级质谱，图5为在保留时间为15.52分钟酸浆苦素E的二级质谱，图6为在保留时间为18.38分钟酸浆苦素L的二级质谱，并通过碎片裂解规律，确定了不同质荷比的酸浆苦素。图2为低共熔溶剂提取纯化酸浆苦素总离子流图，由图2可见，在保留时间17-20之间，为酸浆苦素的出峰时间，在保留时间20分钟后，都为空白溶剂峰。图3为水提取纯化酸浆苦素总离子流图，通过观察图2和图3发现，以低共熔溶剂提取纯化酸浆苦素的杂质更少。为更好的分离酸浆苦素的色谱峰，本发明进行了色谱条件的优化，得到了四个分离度良好的酸浆苦素色谱峰，证明本发明的提取方法在后续提纯过程中纯化过程简便，纯化效果佳。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (8)

1.一种酸浆苦素的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

将氯化胆碱、果糖与水混合并恒温搅拌得混合组分，得低共熔溶剂；将锦灯笼宿萼烘干后研磨成粉末，过筛；将过筛后的锦灯笼宿萼粉末置于提取容器中，加入所述低共熔溶剂，然后进行恒温搅拌，得酸浆苦素提取液。

2.根据权利要求1所述的一种酸浆苦素的提取方法，其特征在于，步骤(1)中所述氯化胆碱和果糖的摩尔比为1:1，其中，每1mol氯化胆碱的加水量为200ml。

3.根据权利要求1所述的一种酸浆苦素的提取方法，其特征在于，步骤(1)中所述混合并搅拌中搅拌速度为200-500r/min，搅拌时间为2h。

4.根据权利要求1所述的一种酸浆苦素的提取方法，其特征在于，步骤(1)中所述恒温搅拌中恒温温度为80℃，搅拌速度为200-500r/min，搅拌时间为2h。

5.根据权利要求1所述的一种酸浆苦素的提取方法，其特征在于，步骤(2)中所述烘干温度为80℃，烘干时间为1-2h，所述过筛为过80目筛。

6.根据权利要求1所述的一种酸浆苦素的提取方法，其特征在于，步骤(3)中所述低共熔溶剂的加入量为每1g酸浆苦素加入低共熔溶剂8ml。

7.根据权利要求1所述的一种酸浆苦素的提取方法，其特征在于，步骤(3)中所述恒温搅拌中恒温温度为80℃，搅拌速度为500r/min，搅拌时间为2h。

8.一种酸浆苦素提取液的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

样品纯化：采用权利要求1-7中任一所述的酸浆苦素提取液为样品，取2ml样品置于离心管中，然后加入2ml石油醚，涡旋10min，弃去石油醚层，然后加入2ml乙酸乙酯，涡旋10min，取乙酸乙酯层吹干后加入2ml甲醇复溶即完成纯化。

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