CN108697633A - 从属于透明颤菌属的细菌的生物质获得的澄清裂解液中分离的碳水化合物部分 - Google Patents

从属于透明颤菌属的细菌的生物质获得的澄清裂解液中分离的碳水化合物部分 Download PDF

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Abstract

本发明涉及从通过热解和蛋白水解属于透明颤菌属的细菌的生物质获得的澄清裂解液中分离的碳水化合物部分。

Description

从属于透明颤菌属的细菌的生物质获得的澄清裂解液中分离 的碳水化合物部分
技术领域
本发明涉及旨在用于美容和/或皮肤病学领域的活性剂。
更具体地，本发明涉及从通过热解和蛋白水解属于透明颤菌属的细菌的生物质获得的澄清裂解液中分离的碳水化合物部分，及其作为美容和/或皮肤病学活性剂，优选作为抗衰老活性剂的用途。
背景技术
随着时间的推移，似乎角蛋白物质，例如皮肤、嘴唇、睫毛、眉毛、指甲和头发都会衰老，特别是通过它们的结构和功能的改变而反映出来。
内源性地，角蛋白物质受到超氧化物离子的攻击，超氧化物离子在生理细胞代谢过程中自然产生。
外源地，角蛋白物质在暴露于参与其衰老的环境因素的火线(firing line)，例如阳光，尤其是通过紫外线辐射，或者污染。
受环境影响的皮肤的外在衰老补充了与年龄相关的内在衰老，引起特征性皮肤损伤和变化，这在文献中有很好的描述。
从细胞和分子的角度来看，皮肤衰老反映在以下方面：角质形成细胞和成纤维细胞增殖能力丧失；分化标志物减少，例如转谷氨酰胺酶(TGM)，特别是转谷氨酰胺酶3；真皮成分(例如胶原蛋白和原纤蛋白)的产生与其被不同金属蛋白酶(MMP)的破坏之间的不平衡，使天平偏向细胞外基质的降解和组织破坏；功能是参与连接和将表皮固定到真皮上的分子的损失，例如纤连蛋白和整联蛋白，这导致真皮表皮连接的弱化。
从宏观的角度来看，皮肤衰老明显伴随皱纹和松弛的出现。衰老的皮肤比年轻的皮肤更细，更脆弱。最后，衰老的皮肤往往失去其弹性、其抵抗外部攻击的屏障功能以及其修复能力。
用于预防和/或治疗皮肤衰老迹象的几种组合物或方法在现有技术中是已知的。
例如，已经提出使用非光合性非结果丝状细菌提取物(FR 2 719 768和FR 2 838056)。在这种情况下，通过诱导超氧化物歧化酶的内源性合成的增加，用含有脂多糖的线状透明颤菌(Vitreoscilla filiformis)提取物特别地获得皮肤衰老迹象的预防和/或治疗(FR 2 838 056)。
此外，文献FR 2 762 782中已经描述，从降低和/或延迟皮肤衰老的角度来看，至少一种非光合性丝状细菌的澄清和稳定的培养基具有有益的性质。
因此，需要新的活性剂或新的治疗方法，用于预防和/或治疗皮肤损伤，更具体地说，用于衰老的皮肤。
因此，需要新的抗衰老美容治疗，能够通过诱导角质形成细胞增殖来重新激活表皮再生。
因此，需要新的抗衰老美容治疗，能够通过修复皮肤损伤来维持或甚至增强皮肤的屏障性能。
发明内容
根据第一方面，本发明涉及从通过热解和蛋白水解属于透明颤菌属的细菌的生物质获得的澄清裂解液中分离的碳水化合物部分。
根据另一方面，本发明涉及一种组合物，其在生理学上可接受的介质中包含根据本发明的碳水化合物部分。所述组合物有利地是美容或皮肤病学组合物。
根据另一方面，本发明涉及根据本发明的碳水化合物组分作为美容和/或皮肤病学活性剂，优选作为抗衰老活性剂的用途。
根据另一方面，本发明涉及用于处理角蛋白物质的美容方法，包括局部施用根据本发明的碳水化合物部分或组合物的步骤。
根据另一方面，本发明涉及用于治疗和/或预防皮肤衰老迹象的美容方法，其包括局部施用根据本发明的碳水化合物部分或组合物的步骤。
根据另一方面，本发明涉及一种制备碳水化合物部分的方法，所述碳水化合物部分从属于透明颤菌属的细菌的生物质的裂解液中分离，所述方法包括以下步骤：
-提供属于透明颤菌属的一种或多种细菌的生物质；
-热解和蛋白水解所述生物质，以获得裂解液；
-澄清裂解液，以获得澄清的裂解液；
-纯化澄清的裂解液的多糖。
根据另一方面，本发明涉及从属于透明颤菌属的细菌的生物质的澄清裂解液中分离的碳水化合物部分，其中所述碳水化合物部分通过包括以下步骤的方法获得：
-提供属于透明颤菌属的细菌的生物质；
-热解和蛋白水解所述生物质，以获得裂解液；
-澄清裂解液，以获得澄清的裂解液；以及
-纯化澄清的裂解液的多糖。
具体实施方式
本发明人令人惊讶地观察到，从护理皮肤、粘膜、头皮和/或角蛋白物质的角度来看，从属于透明颤菌属的细菌的生物质的裂解液中分离的碳水化合物部分具有有益的性质。
事实上，在将碳水化合物部分施用于角蛋白物质后，它在角蛋白物质上形成沉积物，其具有美容效果。
特别是，施用于头发的碳水化合物部分使头发具有柔软和光滑的感觉并且很好解开。
当施用于表皮时，碳水化合物部分刺激基因TGM3的表达，基因TGM3编码转谷氨酰胺酶3。
“碳水化合物部分”是指由至少95％单糖和/或多糖，优选多糖，组成的部分。
因此，本发明含义内的碳水化合物部分包含0％至最多5％的氨基酸，肽，蛋白质，脂肪酸，脂质，核苷酸，核苷，核酸，合成中间体，代谢中间体及其混合物。
回想一下，现有技术中已知完全发酵培养基中的属于透明颤菌属的细菌的总裂解液作为用于预防和/或治疗与头皮的头皮屑状况无关的皮脂溢出症的活性剂(FR 2 988607)或作为用于预防和/或治疗头皮的头皮屑状况，尤其是与头皮上的病原微生物的增殖和/或头皮生态菌群的不平衡有关的头皮屑状况的活性剂(FR 2 973 700)。
因此，这些文献中描述的裂解液包含蛋白质、脂质和多糖部分的混合物，并不用于治疗和/或预防皮肤衰老。
此外，根据本发明的碳水化合物部分不同于文献FR 2 838 056描述的脂多糖提取物，特别是其组成，几乎完全由多糖组成。回想起FR 2 838 056描述的脂多糖具有特征性三元结构，由脂质A、中心(核心)寡糖和糖侧链组成，后者构成O抗原。
·根据本发明的分离的碳水化合物部分
根据第一方面，本发明涉及从通过热解和蛋白水解属于透明颤菌属的细菌的生物质获得的澄清裂解液中分离的碳水化合物部分。
“碳水化合物部分”是指最初包含在细菌裂解液中的多糖。
“多糖”是指通过糖苷键彼此键合的至少两个单糖的链。
多糖可具有直链或支链结构。
多糖尤其包含含有5至6个碳原子的亚单位，例如选自包含以下的组的亚单位：甘露糖，鼠李糖，葡萄糖，半乳糖，阿拉伯糖和果糖。
多糖的分子量为5kDa至200kDa。
在一个具体实施方案中，多糖的分子量为约10kDa至约150kDa。
在某些实施方案中，碳水化合物部分对应于所述细菌裂解液的总碳水化合物部分，即包含细菌细胞膜多糖，细胞内多糖以及溶解在细菌培养基，即完全发酵培养基的水性部分中的多糖。
在某些实施方案中，碳水化合物部分基本上包含或者仅包含细菌细胞膜多糖，细胞内多糖或溶解在完全发酵培养基的水性部分中的多糖。
在某些实施方案中，碳水化合物部分基本上包含或者仅包含细菌细胞膜多糖和细胞内多糖的混合物。
在某些实施方案中，碳水化合物部分对应于细菌细胞膜多糖和溶解在完全发酵培养基的水性部分中的多糖的混合物。
在某些实施方案中，碳水化合物部分基本上包含或者仅包含细胞内多糖和溶解在完全发酵培养基的水性部分中的多糖的混合物。
在一个具体实施方案中，碳水化合物部分包含选自包含以下的组的多糖：溶解在完全发酵培养基中的多糖，以及细胞内多糖与细菌细胞膜多糖的混合物。
在本发明的上下文中，“分离的”是指热解和蛋白水解后，本发明意义内的碳水化合物部分与裂解液中包含的其他部分物理分离的结果，即包含肽/蛋白质部分、脂质部分、核酸部分和含有源自细菌培养物的代谢物的部分(例如未消耗的氨基酸和用于细胞代谢途径的合成中间体化合物)的其他部分的物理分离的结果。
在一个具体实施方案中，碳水化合物部分不含氨基酸，肽，蛋白质，脂肪酸，脂质，核苷酸，核苷，核酸，合成中间体，代谢中间体及其混合物。
·属于透明颤菌属的细菌(特别是物种：线状透明颤菌)
如以上规定，根据本发明考虑的裂解液状态的微生物是根据Bergey's Manual ofSystematic Bacteriology(第3卷，第22和23节，第9版，1989)中的分类所定义的非光合性丝状细菌，属于透明颤菌属(特别是物种：线状透明颤菌)。
从下面给出的实施例中可以看出，本发明人意外地发现，这种细菌的生物质的裂解液的碳水化合物部分，任选地在完全发酵培养基中配制，具有意想不到的美容和/或皮肤病学特性。
更具体地说，它是属于贝氏硫细菌属(Beggiatoa)，透明颤菌属，柔发菌属(Flexithrix)或亮发菌属(Leucothrix)的细菌。
根据本发明的优选变体，它是细菌线状透明颤菌。
在一个具体实施方案中，细菌是线状透明颤菌菌株，优选线状透明颤菌菌株ATCC15551。
·完全发酵培养基
在一个具体实施方案中，属于透明颤菌属的细菌的裂解液还包含完整发酵培养基。
在本发明的含义内，表述“完全发酵培养基中的裂解液”是指将裂解液配制在培养细菌的完全培养基中，直到微生物生长期后，这导致使用最初存在于培养基中的营养底物。
在本发明的含义中，表述“完全发酵培养基”旨在表示源自用于微生物的生长和细胞裂解的培养方法的培养基，此外，所述培养基没有为了分离和/或消除其全部或部分非水性成分而进行过任何额外处理。
更具体地，根据本发明考虑的活性剂由微生物裂解液的碳水化合物部分和用于发酵所述细菌的全部或一些(就量而言)培养基形成，并且在培养基中细胞裂解连续进行(即完全发酵培养基)。
因此，根据本发明的活性剂，即从属于透明颤菌属的细菌(特别是物种：线状透明颤菌)的裂解液的碳水化合物部分中获得的活性剂，任选地在完全发酵培养基中，明显不同于属于透明颤菌属的细菌(特别是物种：线状透明颤菌)的发酵培养基的总裂解液或上清液。
此外，根据本发明考虑的活性剂不同于肽/蛋白质部分，不同于脂质部分，不同于核酸部分，并且不同于其混合物，其将从属于透明颤菌属的细菌(特别是物种：线状透明颤菌)的生物质的裂解液中分离或获得，任选地在完全发酵培养基中。
实际上，根据本发明考虑的活性剂，与不同于碳水化合物部分的生物质或生物质部分相反，不同于碳水化合物部分的该裂解液或裂解液部分，含有大量的水溶性细胞多糖，也就是说包含在所述细菌中，或水溶性细胞外多糖，该多糖在所述细菌增殖期间天然释放到培养基中。
因此，表述“完全培养基”还扩展到“浓缩”的完全培养基的形式，就以下事实而言：它是在构成发酵培养基的水部分蒸发后获得的，在该发酵培养基中已经连续地进行相应微生物的培养和其细胞裂解。当然，在经调节的操作条件下进行这种蒸发以便不会不利地影响形成该完全培养基的非水组分的完整性。
在本发明的含义中，表述“非水性组分”意味着水作为常规发酵培养基中的主要成分，在根据本发明的完全培养基中不是必须保持原样即等量的成分之一。
·发酵培养基的组成
通过定义，发酵或培养基是能够培养，并因此根据情况，使细胞、细菌或酵母生长的载体。原则上，细胞在这种培养基中寻得大量用于其快速繁殖的必要成分，有时也会寻得使特定菌属的细菌或特定菌科的生长受到青睐的元素，在这种情况下，细菌属于透明颤菌属(特别是，物种：线状透明颤菌)。
因此，其组成必须满足所考虑的微生物的营养需求并且是后者增殖所必需的。
更具体地说，该培养基的组成必须：
-满足矿物离子和生长因子的需求并提供碳和能量源；
-pH值接近最佳pH值；
-具有最佳离子强度(培养基可以是等渗的，但这不是强制性的)。
因此，适用于本发明的发酵培养基的组成至少包括：
-碳和能量源，通常由糖代表，优选地是葡萄糖；
-钾和磷源，就像例如K2HPO4；
-氮和硫源，其可以由化合物(NH4)2SO4代表；
-镁源，例如，MgCl2；
-钙源，例如CaCl2；
-铁源，更具体地是柠檬酸铁，柠檬酸盐具有将铁保持在溶液中的作用；
-微量元素源，尤其选自Cu，Zn，Co，Ni，B或Ti盐；
-水源，通常是无菌的，对所有生命形态都是必不可少的；以及
-pH缓冲剂，可以用KH2PO4代表。
如果不存在这些组分之一，则细菌不会生长，因为它们本身不能补偿这些组分的不存在。
通过举例说明适合于根据本发明的微生物生长的发酵培养基，尤其可以提及下文实施例1中所示的培养基。
在其中引入根据本发明考虑的有效量的微生物，并将所有置于有利于其增殖的条件下。
·裂解细菌以获得根据本发明的活性剂
裂解液通常表示在通过“细胞裂解”现象破坏或溶解生物细胞(生物质)，因此导致天然包含在所考虑的生物细胞中的细胞内和细胞生物成分释放，之后获得的物质。
在本发明的含义中，术语“裂解液”表示通过裂解相关微生物(生物质)，即属于透明颤菌属的细菌(特别是物种：线状透明颤菌)，而获得的所有细胞内和细胞外物质。
换句话说，因此所用的裂解液由其所有细胞内生物成分，特别是在其细胞裂解过程中产生的其代谢物和细胞壁和细胞膜成分形成。
在本发明的含义中，术语“代谢物”表示源自根据本发明考虑的微生物的代谢的任何物质。
因此，根据本发明考虑的裂解液可以通过由以下组成的过程获得：
-在有利于所述细菌增殖的条件下在发酵培养基上培养至少一种属于透明颤菌属的细菌(特别是物种：线状透明颤菌)以及
-在所述发酵培养基中细胞裂解所述细菌。
本发明含义内的碳水化合物部分表示源自所述生物质的热解和蛋白水解的多糖。
为了在完全发酵培养基中获得属于透明颤菌属的细菌生物质的裂解液，根据包括培养所述细菌的步骤的方法，本领域技术人员可以特别参考实施例1。
有利地，为了在完全发酵培养基中获得属于透明颤菌属的细菌的裂解液，生物质(生长期后的细菌细胞，存在于培养它们的培养基中)可以预先冷冻，例如在-20℃的温度下，然后灭菌，优选通过加热灭菌，特别是通过使预先冷冻的生物质经受在大于100℃的温度下加热的步骤。举例说明，对生物质进行灭菌的步骤可以通过高压灭菌进行，例如在121℃的温度下。
如前文所述，在所述微生物培养之后，后者直接在用于其培养的发酵培养基中转化为裂解液状态。
在一个具体实施方案中，所述裂解液通过所述生物质的热解步骤和蛋白水解步骤而获得。
在一个具体实施方案中，蛋白水解在热解之前进行。
在一个优选的实施方案中，热解在蛋白水解之前进行。
·组合物
根据本发明的碳水化合物部分易于配制在组合物中，所述组合物包含至少一种常用于美容和/或皮肤病学中的成分。
这是因为它是无味的，因此不需要同时存在香料，特别是为了掩盖令人不快的气味。
此外，根据本发明的碳水化合物部分是无色的，因此，一旦将其引入化美容和/或皮肤病学组合物中，不会引起任何不合时宜或不希望的着色。
因此，本发明还涉及组合物，尤其是美容和/或皮肤病学组合物，其在生理学上可接受的介质中包含如本发明所述的碳水化合物部分。
术语“生理学上可接受的介质”是指与人角蛋白物质，特别是与皮肤和头发相容的介质。
在一个具体实施方案中，美容和/或皮肤病学组合物包含从通过热解和蛋白水解属于透明颤菌属的细菌的生物质获得的澄清裂解液中分离的碳水化合物部分，所述裂解液还包含完整发酵培养基。
含有根据本发明的活性剂的组合物可以局部应用。
因此，根据本发明的组合物用于纯美学目的，即为了改善皮肤、粘膜、头皮和角蛋白物质的外观和质地。换句话说，在本发明的含义内，术语“应用”不包括用于医学目的的治疗。
根据本发明的组合物有利地，任选地在完全发酵培养基中包含一定量的从通过热解和蛋白水解属于透明颤菌属的细菌的生物质获得的澄清裂解液中分离的碳水化合物部分，相对于所述组合物的干提取物的总重量，范围为0.1重量％至10重量％。
在某些实施方案中，根据本发明的组合物有利地包含相对于所述组合物的干提取物的总重量，量为0.5重量％至5重量％的碳水化合物部分。
在某些实施方案中，根据本发明的组合物有利地包含相对于所述组合物的干提取物的总重量，量为1重量％至5重量％的碳水化合物部分。
因此，根据本发明的组合物可以是通常可用于特定选定施用方式的任意盖仑制剂形式。
根据所考虑的组合物类型，载体可以是多种性质的。
更具体地，关于用于外部局部施用的组合物，它们可以是水性，水性-醇或油性溶液，洗剂或血清类型的溶液或分散液，乳液类型(milk type)的液体或半液体稠度的乳液，通过将脂肪相分散在水相中(O/W)或反之亦然(W/O)而获得，或乳膏类型的软、半固体或固体稠度的悬浮液或乳液，水性或无水凝胶，微乳液，微胶囊，微粒或离子和/或非离子类型的泡囊分散体。
这些组合物根据常规方法制备。
这些组合物可特别构成清洁，保护，治疗或护理霜，乳液，凝胶或摩丝，用于护理皮肤，粘膜，头皮和/或角蛋白物质。
它们可以用于皮肤，粘膜，头皮和/或角蛋白物质的美容和/或皮肤病学治疗，以溶液，乳膏，凝胶，乳液，摩丝的形式或以适用于气溶胶的组合物的形式，例如还含有加压推进剂。
在某些实施方案中，根据本发明的局部组合物可有利地配制成适合于护发的任何盖仑制剂形式，尤其是以下形式：洗发剂，香波，护发素，调理剂，头发乳膏或凝胶，定型漆，头发定型洗剂，处理剂，染料组合物(特别是用于氧化染色)，任选地以着色香波，头发重构洗剂，烫发组合物，用于对抗脱发的洗剂或凝胶，抗寄生虫香波或含药香波，特别是抗脂溢性香波，头皮护理产品，特别是抗刺激，抗衰老或重组，或其激活血液循环。
以已知的方式，用于局部施用的盖仑制剂形式还可含有在美容和/或皮肤病学领域中常见的佐剂，例如增稠剂，油，蜡，防腐剂，抗氧化剂，溶剂，芳香剂，填充剂，UV屏蔽剂和染料。
这些各种佐剂的量是在所考虑的领域中常规使用的量，例如占组合物总重量的0.01％至20％。取决于它们的性质，可以将这些佐剂引入脂肪相和/或水相中。
本发明的组合物还可以有利地含有水。水可以是泉水和/或矿泉水，特别是选自Vittel水，来自Vichy盆地的水和理肤泉(la Roche Posay)水。
相对于组合物的总重量，水的含量的范围可以为5至99重量％，优选范围为20至95重量％，优选范围为40至95重量％。
·使用和方法
此外，本发明涉及能够通过本发明的方法获得的碳水化合物部分作为美容和/或皮肤病学活性剂，优选作为抗衰老活性剂的用途。
“美容和/或皮肤病学活性剂”是指在施用于角蛋白物质后具有有益性质的活性剂。
例如，有益性质可以是刺激年轻皮肤中存在的并且在衰老的皮肤中具有降低的表达的蛋白质的表达，例如转谷氨酰胺酶。
本发明还涉及用于处理角蛋白物质的非治疗性美容方法，其包括以下步骤：向角蛋白物质局部施用从属于透明颤菌属的细菌的生物质的裂解液中分离的碳水化合物部分，或者包含这种部分的组合物，应理解，所述碳水化合物部分是在澄清通过热解和蛋白水解属于透明颤菌属的细菌的生物质获得的裂解液后获得的。
在本发明的上下文中，“处理角蛋白物质”是指局部施用根据本发明的碳水化合物部分用于护理皮肤，粘膜，嘴唇，指甲，头皮和头发。
本发明还涉及用于治疗和/或防止皮肤衰老的迹象的非治疗性美容方法，其包括以下步骤：向皮肤局部施用从属于透明颤菌属的细菌的生物质的裂解液中分离的碳水化合物部分，或者包含这种部分的组合物，应理解，所述碳水化合物部分是在澄清通过热解和蛋白水解属于透明颤菌属的细菌的生物质获得的裂解液后获得的。
在本发明的上下文中，“治疗皮肤衰老迹象”意指减少或缓解皱纹，细皱纹，皮肤萎缩，皮肤弹性丧失，皮肤张力丧失，真皮变薄，胶原纤维降解，皮肤紧致丧失，皮肤干燥。
在本发明的上下文中，“防止皮肤衰老的迹象”意指不出现或延迟出现皱纹，细皱纹，皮肤萎缩，皮肤张力丧失，皮肤张力丧失，真皮变薄，胶原纤维降解，皮肤紧致丧失，皮肤干燥
在一个具体实施方案中，属于透明颤菌属的细菌的生物质的裂解液还包含完全发酵培养基。
本发明还涉及一种制备从属于透明颤菌属的细菌的生物质的裂解液中分离的碳水化合物部分的方法，所述方法包括以下步骤：
-提供属于透明颤菌属的细菌的生物质；
-热解和蛋白水解所述生物质，以获得裂解液；
-澄清裂解液，以获得澄清的裂解液；
-纯化澄清的裂解液的多糖。
“生物质”是指完全培养物中包含的活生物体或死生物体的所有或一些，也就是说在构成初始完全发酵培养基的所有或一些营养元素消失之后。
在一个优选的实施方案中，热解在蛋白水解之前进行。
在一个具体实施方案中，属于透明颤菌属的细菌的生物质的裂解液还包含完全发酵培养基。
根据一个具体实施方案，热解可以在60℃至120℃的温度下进行，优选70℃至100℃的温度，优选约80℃的温度。
约80℃意味着80℃±5℃的温度。
根据一个具体实施方案，热解可以持续进行30分钟至240分钟，优选持续45分钟至90分钟，约持续60分钟。
约60分钟意味着持续60分钟±5分钟。
根据一个具体实施方案，蛋白质水解可以通过现有技术中已知的任何蛋白水解酶进行，其中可以提及的是胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，胃蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶及其混合物。
在一个具体实施方案中，蛋白水解可以通过碱性蛋白酶进行，特别是通过2.4L FG(出售的枯草杆菌蛋白酶)。
在一个优选的实施方案中，蛋白水解不通过蛋白酶K进行。
当蛋白水解通过市售的蛋白水解酶进行时，关于使用的蛋白酶的量，裂解物与蛋白酶的孵育持续时间和温度以及反应介质的pH，将参考制造商的说明书。
“反应介质”是指包含属于透明颤菌属的细菌的裂解液的水溶液，任选地在完全发酵培养基中，蛋白酶，任选地对于蛋白水解所必需的任何其他成分，例如能够调节盐浓度和调节pH的缓冲液。
本领域技术人员能够确定任选地在其完全发酵培养基中进行裂解液蛋白水解的最佳条件。
通常，蛋白质水解可以用一定量的酶进行，相对于反应介质的总重量，反应介质中酶的量为0.005重量％至5重量％，优选0.05重量％至1.5重量％。
此外，蛋白质水解的持续时间在30分钟至24小时之间，作为所用蛋白酶的量和初始培养基的蛋白质含量的函数。
在一个具体实施方案中，反应介质保持在20℃至80℃的恒定温度，优选30℃至60℃的温度。
在一个具体实施方案中，反应介质的pH在3至10之间，优选在6至9.5之间，优选为约8。
在一个具体实施方案中，当在枯草杆菌蛋白酶存在下进行蛋白质水解时，反应介质的pH值为约7.5。
此外，文献FR 2 838 056中描述的使用蛋白酶K制备脂多糖的方法与本发明所述的制备碳水化合物部分的方法的不同之处在于，在热解步骤之后进行离心步骤，然后通过蛋白酶K对上清液进行蛋白质水解步骤。
与文献FR 2 838 056描述的方法不同，重要的是根据本发明进行的热解和蛋白质水解，在相同的反应介质中进行，以保留裂解液中所含的所有碳水化合物部分，同时减少多糖的处理操作次数，从而在各种纯化步骤中避免其损失。
根据一个具体实施方案，蛋白水解之后可以进行蛋白水解失活步骤，例如通过所用蛋白酶的抑制剂或抑制剂混合物；通过将反应介质在70℃至90℃的温度下孵育，例如在约85℃的温度下；通过使pH相对于反应介质的pH值改变。
不希望受任何理论的束缚，本发明人认为裂解物的热解和蛋白水解导致消除可能对皮肤的凝聚和真皮表皮连接作出负面贡献的细菌菌株固有的酶。
在一个具体实施方案中，蛋白水解失活步骤持续进行几分钟至几小时，例如持续5分钟至2小时，优选持续10分钟至30分钟。
本领域技术人员可以调整蛋白水解失活步骤的条件。
在某些具体实施方案中，裂解液不包含变性和/或离液剂(chaotropic agent)。
在本发明的上下文中，“变性和/或离液剂”是指在标准条件下能够展开裂解液中所含蛋白质的试剂，也就是说特别是去掉导致未折叠且基本上线性的蛋白质结构的二级或三级结构的所有或一部分。
根据一个具体实施方案，制备根据本发明的碳水化合物部分的方法还可以包括酸化培养基的步骤，通常在生物质的热分解和/或蛋白水解步骤之后。可以使用适合于该步骤的任何酸，例如选自包含以下的组的酸：柠檬酸、盐酸、硫酸、磷酸及其混合物。
根据一个具体实施方案，制备根据本发明的碳水化合物部分的方法还可以包括澄清任选酸化的裂解液的步骤，例如通过一系列深度过滤，借助于合适的过滤器，例如具有直径在约0.4μm和20μm之间的孔的过滤器，其包括具有约0.4-0.8μm，1-4μm，4-7μm，7-15μm和8-20μm的截留范围的过滤器。
实施本发明包括纯化多糖的步骤，这可以通过现有技术中已知的任何方法进行(等人2007；Communicating Current Research and Educational Topics andTrends in Applied Microbiology；Mendez-Vilas编辑)。
例如，多糖尤其可以通过醇沉淀，特别是通过乙醇沉淀来纯化；更优选通过膜过滤分离。
在一个具体实施方案中，制备根据本发明的碳水化合物部分的方法还可以包括以下步骤：通过膜超滤浓缩多糖，然后通过膜渗滤纯化。从现有技术中已知，渗滤体积决定了所需的纯度等级。
在该具体实施方案中，该方法可采用膜超滤的步骤，尤其是借助具有合适截留阈值的过滤器。
在实践中，合适的过滤器是例如，阈值为30000Da，10000Da或1000Da的过滤器。
在一个具体实施方案中，适用于膜超滤的过滤器基于再生的羟乙基纤维素和聚醚砜。
在一个具体实施方案中，适合于膜超滤的过滤器优选具有30,000Da的截留阈值并且基于再生的羟乙基纤维素。
在该具体实施方案中，相对于所述部分的总重量，最终多糖浓度可以为0.1重量％至10重量％，优选0.5重量％至5重量％，优选1重量％至2重量％。
在一个具体实施方案中，可以加入一种或多种常用于美容和/或皮肤病学领域的美容防腐剂，例如苯氧基乙醇，以增强活性剂在其储存期间的稳定性。
实施例
1-本发明意义内的碳水化合物部分的制备
将细菌菌株线状透明颤菌在3000升工业发酵罐中培养。在培养结束时，自然的pH值为6.2，固体含量为0.6％，游离葡萄糖含量为0.035％。
将菌株线状透明颤菌在其完全培养基中发酵，完全培养基的组成如下表1所示。
表1：用于培养线状透明颤菌的完全营养培养基的组成。
为了获得根据本发明的美容活性剂，进行以下过程。
线状透明颤菌的初始菌株获自ATCC(菌株15551)。
通过在3000有效升的工业生物反应器中发酵获得生物质；上面给出了培养基的组成。在培养期间，pH保持恒定(7.00)，温度(26℃)和溶解氧(0.5)也保持恒定。当固体含量达到0.6％并且葡萄糖含量达到0.035％时停止培养。
为了从培养物中提取多糖，首先在80℃的温度下进行热解循环15分钟。
在将培养基冷却至55℃的温度后，通过加入1M氢氧化钠水溶液调节pH并保持pH＝8。然后通过添加0.1％(w/w)的从地衣杆菌(Bacillus liceniformis)分离的蛋白酶：2.4L FG(来自)进行蛋白水解。
在3小时的蛋白水解结束时，通过20重量％的磷酸水溶液将培养基中和至pH 7。通过在90℃的温度下加热培养基10分钟使酶失活。
为了避免堵塞，将培养基在再生纤维素膜上澄清，孔隙率为K700，K100，EKS和0.45±0.2μm(来自Pall)。
然后在再生纤维素盒上进行浓缩步骤，截留阈值为30kDa(来自Pall)。
最后将1.5％苯氧基乙醇加入到浓缩后得到的保留物中。
2-根据本发明的碳水化合物部分在感官方面的活性
就纤维的感官性质而言，水中5％的活性剂，在一绺头发上显示出正向的活性。
通过将实施例1中获得的活性剂稀释在市政水中来制备20ml活性剂溶液。
头发(lock)制备
将1个SA11.2质量的2.7g的标准头发，分为三批0.9g当量。
头发的处理
对照头发：将对照头发浸入10ml市政水中5分钟，以400rpm的速度磁力搅拌。然后用市政水进行3次连续洗涤操作，在每次洗涤操作之间手动拧干。在最后一次洗涤操作结束时，用吹风机干燥头发。
2个处理的头发：将头发浸入10ml活性剂溶液中5分钟，以400rpm的速度磁力搅拌。然后用与对照头发相同的方式处理用活性剂处理的头发(洗涤和干燥)。
感官评估
由4人组成的小组进行感官评估。每个人通过使头发在拇指和食指之间滑动来触摸头发。
结果
与用市政用水处理的头发相比，用5％活性剂处理的两缕头发具有更柔软和更光滑的感觉。此外，这两个处理过的头发更容易解开。
3-根据本发明的碳水化合物部分用于在重建表皮模型上诱导TCM3基因(编码转谷 氨酰胺3)的表达的用途
生物模型：
·重建的表皮模型是第17天由SkinethicTM实验室(法国里昂)提供SkinethicTMRHE；通过组织学对照验证了其质量。
·培养条件：所有实验均在37℃，5％CO2的潮湿气氛中进行。
样品的制备：
·未处理的对照组：表皮在对照培养基上培养，无任何本发明化合物；
·测试组：表皮与本发明化合物一起孵育：在对照培养基中制备终浓度为0.001mg/ml和0.0001mg/ml的活性剂的溶液。
处理：
·在37℃，5％CO2的维持培养基中过夜稳定后，将初始培养基用含有或不含本发明化合物的培养基替换，在37℃，5％CO2下18小时。
·评估化合物的三个不同的非细胞毒性浓度。每个剂量一式两份进行测试。
·为了检测和证明本发明化合物的抗衰老活性，在同一测定中评价已知具有抗衰老特性的参考化合物。
定量RT-PCR：
·在处理结束时，去除培养基并将表皮在PBS缓冲液中漂洗2次，然后在-80℃下在中冷冻。
·用Rneasy96 Universal Tissue Kit提取后，通过DNase处理纯化RNA，并在90μl不含RNase的蒸馏水中洗脱。
·RNA的定量通过260nm下的光谱测定法进行(ND-1000，NanoDropTechnologies)。
·然后纯化的部分的质量使用Pico LabChip(Agilent Technologies)RNA 6000试剂盒用Agilent Bioanalyzer 2100检查(比率A260/A280)。
RNA的逆转录和扩增
·使用High Capacity cDNA反转录R试剂盒(Applied Biosystems)将RNA逆转录为cDNA。在PCR之前进行，通过PreAmp Master Mix(Applied Biosystems)扩增cDNA。
实时PCR
·使用TaqMan Gene Expression Assay(Applied Biosystems)进行基因表达的研究。
·为了标准化，分别使用了以下家系(household)基因：TBP，RPL13A，B2M和ATP5B。
结果
通过本发明的碳水化合物部分，下表2总结了编码谷转谷氨酰胺酶3的目标TGM3基因的表达的诱导因子，根据活性剂中的浓度(mg/mL)。
表2
基因的诱导因子，大于或等于2，被认为代表显著的效果。
以0.0001mg/ml的活性剂的浓度，本发明的化合物在目标基因TGM3的诱导中具有显著的效率。
因此，本发明的化合物用作美容和/或皮肤病学药剂，特别是作为抗衰老活性剂。

Claims (11)

1.从通过热解和蛋白水解属于透明颤菌属的细菌的生物质获得的澄清裂解液中分离的碳水化合物部分。
2.如权利要求1所述的碳水化合物部分，其中属于透明颤菌属的细菌的裂解液还包含完全发酵培养基。
3.如权利要求2所述的碳水化合物部分，其包含溶解在完全发酵培养基中的多糖，以及细胞内多糖与细菌细胞膜多糖的混合物。
4.如前述权利要求中任一项所述的碳水化合物部分，其中所述属于透明颤菌属的细菌是菌株线状透明颤菌，优选菌株线状透明颤菌ATCC 15551。
5.一种组合物，其在生理学上可接受的介质中包含根据权利要求1至4中任一项所述的碳水化合物部分。
6.如权利要求5所述的组合物，其中属于透明颤菌属的细菌的裂解液还包含完全发酵培养基。
7.如权利要求1至4中任一项所述的碳水化合物部分作为美容和/或皮肤病学活性剂，优选作为抗衰老活性剂的用途。
8.一种处理角蛋白物质的美容方法，其包括将如权利要求1至4中任一项所述的碳水化合物部分或如权利要求5和6中任一项所述的美容和/或皮肤病学组合物局部施用于角蛋白物质的步骤。
9.一种治疗和/或预防皮肤衰老迹象的美容方法，其包括将如权利要求1至4中任一项所述的碳水化合物部分或如权利要求5和6中任一项所述的组合物局部施用于皮肤的步骤。
10.一种制备碳水化合物部分的方法，所述碳水化合物部分从属于透明颤菌属的细菌的生物质的裂解液中分离，所述方法包括以下步骤：
-提供属于透明颤菌属的细菌的生物质；
-热解和蛋白水解所述生物质，以获得裂解液；
-澄清裂解液，以获得澄清的裂解液；
-纯化澄清的裂解液的多糖。
11.如权利要求10所述的方法，其中热解在蛋白水解之前进行。
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