CN108686261A - 一种利用冻干海藻酸钙/球霰石碳酸钙复合微球制备的敷料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用冻干海藻酸钙/球霰石碳酸钙复合微球制备的敷料及其制备方法。所述敷料包含负载抑菌药物的复合微球和负载细胞生长因子的复合微球，二者的混合质量比为：1:1～5；所述复合微球为是由均匀分散的球霰石碳酸钙悬浊液和海藻酸钠溶液混匀后采用微流控装置制备得到的。本发明所述敷料以海藻酸钙/球霰石碳酸钙复合微球为缓释载体，使得负载的药物和细胞生长因子的缓释时长超过一周，可避免频繁换药；另外所述敷料在伤口愈合的初期，冻干的海藻酸钙层封堵出血位点，有效吸收创面渗出液，抑菌药物的释放防止细菌滋生感染伤口，伤口恢复的整个时期生长因子缓慢平稳释放，从而实现止血，抑菌，促进损伤组织修复和愈合的功能。

Description

一种利用冻干海藻酸钙/球霰石碳酸钙复合微球制备的敷料 及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医用材料药物缓释微球和生物材料改性抗菌促进伤口愈合技术领域，更具体地，涉及一种利用冻干海藻酸钙/球霰石碳酸钙复合微球制备的敷料及其制备方法。
背景技术
伤口愈合是一个复杂的修复过程，其愈合过程大致可分为3个阶段：凝血、炎症产生，表皮细胞迁移和增殖，外皮形成和重塑。伤口长期高度暴露，皮肤的屏障作用被破坏，坏死组织也能促进许多病原体的繁殖和扩散，导致伤口反复感染，同时引起的细菌免疫反应将会进一步延长组织发炎时间，受伤数周或数月后伤口还处于开放或部分愈合状态。
伤口敷料作为一种促进伤口愈合的药物，可以促进损伤组织的修复。水凝胶敷料相较于其他的敷料，一方面，敷料覆盖在伤口上后为伤口提供湿润的环境，保护伤口肉芽组织的生长，另一方面，可以避免更换药物造成对伤口的二次伤害。但是若伤口创面的渗出液过多，导致伤口创面过于湿润，则容易导致伤口易感染、恢复速度过慢。
而伤口的痊愈是一个逐步的过程，若提供一种使用后既能吸收创面渗出液，又能保证伤口创面一定的润湿度，且具有缓释药物作用的水凝胶敷料，不仅可避免频繁更换药物，还能促进伤口的快速痊愈，避免伤口感染。
发明内容
本发明的目的在于提供冻干海藻酸钙/球霰石碳酸钙复合微球作为缓释载体在制备敷料中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种利用冻干海藻酸钙/球霰石碳酸钙复合微球制备的敷料。所述敷料以具有缓释药物作用的海藻酸钙/球霰石碳酸钙复合微球为载体，将负载抑菌作用药物的复合微球和负载细胞生长因子的复合微球按照合理的比例混合，配伍使用，由于抑菌作用药物和细胞生长因子的持续性释放，伤口可避免感染，快速的痊愈。
本发明的再一目的在于提供所述利用冻干海藻酸钙/球霰石碳酸钙复合微球制备的敷料的制备方法。
本发明的上述目的是通过以下方案予以实现的：
冻干海藻酸钙/球霰石碳酸钙复合微球作为缓释载体在制备敷料中的应用，所述海藻酸钙/球霰石碳酸钙复合微球是由均匀分散的球霰石碳酸钙悬浊液和海藻酸钠溶液混匀后采用微流控装置制备得到的；所述球霰石碳酸钙由共沉淀法经酪蛋白改性制备得到，其粒径为1μm～4μm。
一种利用冻干海藻酸钙/球霰石碳酸钙复合微球制备的敷料，所述敷料包含负载抑菌药物的复合微球和负载细胞生长因子的复合微球，二者的混合比例为：1:1～5；所述复合微球为上述海藻酸钙/球霰石碳酸钙复合微球。
由于单一的海藻酸钙或球霰石碳酸钙负载药物时，药物的缓释作用不佳。因此，本发明采用海藻酸钙/球霰石碳酸钙复合微球作为药物缓释载体，使得制备得到的敷料具有很好的药物缓释作用，药物缓释时长超过一周的时间，可避免频繁换药；另外所述敷料在伤口愈合的初期，冻干的海藻酸钙层封堵出血位点，有效吸收创面渗出液，抑菌药物的释放防止细菌滋生感染伤口，伤口恢复的整个时期生长因子缓慢平稳释放，从而实现止血，抑菌，促进损伤组织修复和愈合的功能。
所述抑菌药物可以为大多数具有抑菌、抗炎的药物。
优选地，所述负载抑菌药物的复合微球和所述负载细胞生长因子的复合微球的混合质量比为1:1。
优选地，所述抑菌药物的负载量1mg/mL～5mg/mL；所述细胞生长因子的负载量为1ug/mL～10ug/mL。
更优选地，所述抑菌药物的负载量为5mg/mL；所述细胞生长因子的负载量为2μg/mL。
由于抑菌药物和细胞生长因子均是在海藻酸钙/球霰石碳酸钙复合微球制备过程中就添加在海藻酸钠/球霰石碳酸钙的混合溶液中，因此上述抑菌药物和细胞生长因子的负载量是指每毫升制备海藻酸钙/球霰石碳酸钙的混合溶液中添加的抑菌药物或细胞生长因子。
优选地，所述细胞生长因子为碱性成纤维细胞生长因子、酸性成纤维细胞生长因子或血管内皮生长因子。
优选地，所述复合微球的粒径为300～500μm；所述复合微球包含有均匀分散的球霰石碳酸钙和海藻酸钙；其中球霰石碳酸钙由共沉淀法制备得到，其粒径为1μm～4μm。
优选地，所述球霰石碳酸钙的制备过程如下：向碳酸盐和酪蛋白的混合溶液中加入钙盐溶液，使得碳酸根离子和钙离子的摩尔质量比为1:1，混匀后得到CaCO3悬浊液，即球霰石碳酸钙悬浊液。
本发明同时还保护所述利用冻干海藻酸钙/球霰石碳酸钙复合微球制备的敷料的制备方法，包括以下步骤：
S1. 共沉淀法制备得到均匀分散的球霰石碳酸钙悬浊液，将球霰石碳酸钙悬浊液分为两组；一组加入抑菌药物，另一组加入细胞生长因子；
S2. 分别将加有抑菌药物的球霰石碳酸钙悬浊液、加有细胞生长因子的球霰石碳酸钙悬浊液与海藻酸钠溶液混匀，制成内相溶液；然后采用微流控装置分别制备得到负载抑菌药物的复合微球和负载细胞生长因子的复合微球；
S3. 将制备的负载抑菌药物的复合微球和负载细胞生长因子的复合微球冷冻干燥后，并按特定比例混合即制备得到所述利用冻干海藻酸钙/球霰石碳酸钙复合微球制备的敷料。
优选地，负载抑菌药物的复合微球和负载细胞生长因子的复合微球中球霰石碳酸钙与海藻酸钙的质量比分别为1:200和1:25。
优选地，采用微流控装置制备复合微球的过程中，采用的收集相为可溶性钙盐溶液；流动相为非极性有机溶剂或弱极性有机溶剂。
优选地，采用微流控装置制备的过程中，内相的流速为5～40μL/min；外相的流速为50～800μL/min。
更优选地，采用微流控装置制备的过程中，内相的流速为10μL/min；外相的流速为200μL/min。
所述利用冻干海藻酸钙/球霰石碳酸钙复合微球制备的敷料的使用方法，将制备得到的微球直接敷于伤口表面后用医用纱布粘贴固定即可。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明所述敷料以海藻酸钙/球霰石碳酸钙复合微球为缓释载体，使得负载的药物和细胞生长因子缓慢的释放，药物缓释时长超过一周的时间，可避免频繁换药；另外所述敷料在伤口愈合的初期，冻干的海藻酸钙层封堵出血位点，有效吸收创面渗出液，抑菌药物的释放防止细菌滋生感染伤口，伤口恢复的整个时期生长因子缓慢平稳释放，从而实现止血，抑菌，促进损伤组织修复和愈合的功能。
附图说明
图1为冻干复合微球的SEM图。
图2为冻干复合微球光镜图。
图3为冻干复合微球重新溶胀恢复到水凝胶状态后的光镜图。
图4为冻干复合微球的pH响应释放结果。
图5为冻干复合微球A和C的抑菌效果图。
图6为冻干复合微球C促进成纤维细胞增殖结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
以下实施例以利福霉素钠为抑菌药物的例子，进行制备得到敷料。其中与利福霉素钠相似的药物有万古霉素、硫酸庆大霉素。
实施例1
一种利用冻干海藻酸钙/球霰石碳酸钙复合微球制备的敷料，本实施例中抑菌药物以利福霉素钠为例，细胞生长因子为小鼠碱性成纤维细胞生长因子，敷料的制备过程如下：
（1）共沉淀法制备球霰石碳酸钙悬浊液：容量为100mL的烧杯中加入浓度为50mM的Na2CO3 + 8mg/mL酪蛋白20mL，600rpm磁力搅拌，磁子直径40mm，同时在分液漏斗中加入20mL50mM的CaCl2，在烧杯的正上方打开旋塞，均匀加入。磁力搅拌20 min，搅拌完毕后，此时溶液中的碳酸根离子和钙离子完全反应，得到CaCO3悬浊液，即球霰石碳酸钙悬浊液，其中CaCO3的浓度为2.5mg/mL。
（2）配置利福霉素钠溶液：在无菌条件下称取适量的利福霉素钠加入pH为7.4的PBS溶液配置成为浓度为10mg/mL的利福霉素钠溶液，备用。
（3）配置小鼠碱性成纤维细胞生长因子溶液：在无菌条件下，小鼠碱性成纤维细胞生长因子8000rpm离心5分钟，加入超纯水后室温静置15分钟使其充分溶解，然后加入含有5%的海藻糖的pH为7.4的PBS溶液稀释成浓度为10μg/mL，备用。
（4）配置质量浓度为2%海藻酸钠（SA）溶液：在无菌条件下称取SA粉末，加pH为7.4的PBS搅拌，制得质量浓度为2%的SA溶液，备用。
（5）球霰石碳酸钙悬浊液加水离心洗涤后，在无菌条件下分别加入适量的利福霉素钠溶液或小鼠碱性成纤维细胞生长因子溶液混匀，再与SA溶液混匀，制备得到内相溶液；然后采用微流控装置制备负载利福霉素钠的复合微球A或负载小鼠碱性成纤维细胞生长因子的复合微球B。
其中复合微球A的内相溶液中：球霰石碳酸钙的质量百分数为0.5%、利福霉素钠溶液的质量浓度为5mg/mL、海藻酸钠溶液的质量百分数为1%。其具体制备过程为：吸取4mL球霰石碳酸钙悬浊液于离心管，离心后加入去离子水洗涤并离心，重复两次。加入1mL利福霉素钠溶液，轻轻吹打重悬涡旋振荡5次每次1分钟。加入1mL 2%的海藻酸钠溶液，磁力搅拌器搅拌均匀。
复合微球B的内相溶液为：球霰石碳酸钙悬浊液的质量百分数为4%、小鼠碱性成纤维细胞生长因子的质量浓度为2μg/mL、海藻酸钠溶液的质量百分数为1%。其具体的制备过程为：现将球霰石碳酸钙悬浊液与SA溶液混匀600rpm磁力搅拌50min再加入小鼠碱性成纤维细胞生长因子溶液搅拌10分钟。
（6）微流控装置在制备复合微球的过程中，内相的流速为10μL/min，外相为二氯甲烷，流速为200μL/min，收集相为102mM的氯化钙溶液。将收集时间定量控制在5min，收集质量约为50mg复合微球，固化时间为30min。
（7）将制备好的复合微球A和复合微球B于-80℃条件下冷冻4h，真空冷冻干燥机干燥24h，然后按照复合微球质量比为1:1的比例混合后置于-20℃密封保存。
制备得到的复合微球A和复合微球B的粒径约为300μm。当改变内相中球霰石碳酸钙的浓度或者改变外相的流速，则制备得到的复合微球的粒径在小范围内有所变化，复合微球的粒径范围为300～500μm。
制备得到的冻干复合微球的SEM图如图1所示，其中a1、b1和c1是不同形状的复合微球的形态图，图a2、b2和c2分别是a1、b1和c1的局部放大图，从中可看出球霰石碳酸钙是均匀分散于复合微球中，随着球霰石碳酸钙含量的增多，冻干微球的形态更加立体，接近于冻干前的状态。其中图a2、b2和c2代表的复合微球中球霰石碳酸钙的添加量为a2＜b2＜c2。
实施例2
（1）按照实施例1中的步骤制备一种利用冻干海藻酸钙/球霰石碳酸钙复合微球制备的敷料，其中为了便于观察和检测，在制备内相时，采用台盼蓝（染料）替代抑菌药物或细胞生长因子作为负载药物，观察制备得到的冻干复合微球，其光学显微镜下形态如图2所示。将冻干复合微球重新溶胀后的光镜图如图3所示。
从图2和图3中可知，冻干后的复合微球重新溶胀形成水凝胶状态后，其空间结构更加饱满立体，与冻干前相比变化不大。
（2）参照（1）中的方法和步骤采用Trypan Blue替代抑菌药物或细胞生长因子作为负载药物，观察制备得到的冻干复合微球在不同pH值环境中的缓释情况。
检测过程如下：将制备好的负载Trypan Blue的复合微球分别加入2mL pH为6.4和pH为7.4的PBS，置于37℃水浴锅中加热，在预先设定好的时间节点取上清1mL于48孔板内，并重新在EP管内加入1mL相应pH的PBS。待所有样品取出收集好后，每孔加入2mg的EDTA轻轻吹打以去除上清液中混有的少量CaCO3和SA碎屑。酶标仪在583 nm处测量吸收峰值。检测组为A-1组和A-2组，A-1组为球霰石碳酸钙的质量百分数为0.5%的复合微球；A-2组为球霰石碳酸钙的质量百分数为4%的复合微球。对照组为无球霰石碳酸钙的A-0组。
测得累计释放结果如图4所示。从图4中可知冻干后的复合微球可实现在PBS缓冲液中持续释放。冻干后的复合微球释放具有一定的pH敏感性，总体而言，在pH为6.4的环境中释放较慢，可持续释放一周而在pH为7.4的环境中释放较快。与对照A-0组相比，复合微球内部的碳酸钙含量高，释放速率慢。
实施例3
检测负载药物的复合微球的抑菌效果，其检测过如下：
（1）金黄色葡萄球菌接种在培养基中（LB、1%蛋白胨、酵母膏0.5%和1%的NaCl），37℃ 条件下200rpm恒温振荡24h。取部分细菌悬液使用梯度法进行稀释。计数后菌浓度为8*108CFU/mL。吸取100 μL均匀涂布在90mm培养皿内的LB琼脂培养基中。
（2）以实施例1中制备的复合微球A、复合微球A和复合微球B按1:1混合后的混合复合微球C（即为敷料）为测试对象，分别将复合微球A和复合微球C放置在90mm的滤纸片上，然后将滤纸片转移至步骤（1）中的培养基中央，培养24h。为分析实验组持续抑菌作用，将上述滤纸片转移到新的培养皿中培养，转移的时间间隔为24h，连续观察5天时间。
其中，以放置未负载任何药物的复合微球的滤纸片和空白滤纸片为对照样品。
检测结果如图5所示。组合微球内部负载利福霉素钠，使用抑菌圈测试组合微球敷料 的抗菌性，将复合微球A组和复合微球C组施加到琼脂板24h后观察到明显的抑菌效果，抑菌圈的直径可达21.2mm。将盛有A和C两组微球的滤纸片取出转移到新的琼脂板中， 在第二天第三天具有明显的抑菌效果，随着内部利福霉素钠的释放，抑菌范围逐渐减小， 累计抑菌可持续5天左右。空白组滤纸片(图5中的a)与无负载的微球(图5中的b和 c)不具备抗菌性。
实施例4
检测复合微球C对细胞增殖的影响，检测方法如下：
将直径为600μm的圆形玻璃片在酒精浸泡4h，PBS清洗干净。然后平铺在24孔板内，小鼠成纤维细胞NIH-3T3以105cells/well的密度接种(DMEM-H with 10% FBS, 1%penicillin/streptomycin)，37℃，5% CO2培养箱中培养48h，细胞铺展面积约为70%后将玻璃片轻轻取出转移到transwell孔板内，每孔加入300μL 培养基再加入30μL CCK-8溶液，培养箱内孵育1h后，轻轻晃动，吸出液体转移到96孔板中每孔100μL，酶标仪450 nm处测量吸收幅值并取平均。此时记为d0。为模拟损伤伤口的环境，每孔内加入500μL pH 6.4的培养基。
按下述分组将冻干微球加入transwell小室内：
复合微球A组：每孔内加入1份冻干的复合微球A，再加入500 μL培养基；
复合微球B组：每孔内加入1份冻干的复合微球B，再加入500 μL培养基；
复合微球C组: 每孔内加入1份冻干的复合微球C，再加入500 μL培养基。
以为添加任何物质的为空白对照组（Control）。
分别在第一天、第三天、第五天、第七天测量细胞数量。
检测结果如图6所示。将时间点测量的CCK-8结果与d0天的OD值作比，研究各组细胞增殖速率变化。A-5-R组由于利福霉素钠的释放，tranwell小室正下方区域细胞部分裂解，细胞数量减少较多。第三天以后由于内部利福霉素钠释放量减弱，细胞呈现较快增长的趋势。复合微球B组由于内部负载生长因子释放，细胞增殖速率最快，复合微球C组细胞增殖速率持续增加，比B组增殖速度稍慢，这是因为生长因子和抗生素的共同作用的结果。从增殖结果和抗菌结果得知复合微球C组具有良好抗菌性的同时，亦能促进成纤维细胞的增殖。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.海藻酸钙/球霰石碳酸钙复合微球作为缓释载体在制备敷料中的应用，其特征在于，所述海藻酸钙/球霰石碳酸钙复合微球是由均匀分散的球霰石碳酸钙悬浊液和海藻酸钠溶液混匀后采用微流控装置制备得到的；所述球霰石碳酸钙由共沉淀法经酪蛋白改性制备得到，其粒径为1μm～4μm。
2.一种利用冻干海藻酸钙/球霰石碳酸钙复合微球制备的敷料，其特征在于，所述敷料包含负载抑菌药物的复合微球和负载细胞生长因子的复合微球，两种复合微球的混合质量比为：1:1～5；所述复合微球为权利要求1中所述海藻酸钙/球霰石碳酸钙复合微球。
3.根据权利要求2所述利用冻干海藻酸钙/球霰石碳酸钙复合微球制备的敷料，其特征在于，所述抑菌药物的负载量为1mg/mL～5mg/mL；所述细胞生长因子的负载量为1ug/mL～10ug/mL。
4.根据权利要求2所述利用冻干海藻酸钙/球霰石碳酸钙复合微球制备的敷料，其特征在于，所述抑菌药物的负载量为5mg/mL；所述细胞生长因子的负载量为2ug/mL。
5.根据权利要求2所述利用冻干海藻酸钙/球霰石碳酸钙复合微球制备的敷料，其特征在于，所述细胞生长因子为碱性成纤维细胞生长因子、酸性成纤维细胞生长因子或血管内皮生长因子。
6.根据权利要求2所述利用冻干海藻酸钙/球霰石碳酸钙复合微球制备的敷料，其特征在于，所述复合微球的粒径为300～500μm；所述复合微球包含有均匀分散的球霰石碳酸钙和海藻酸钙；其中球霰石碳酸钙由共沉淀法制备得到，其粒径为1μm～4μm。
7.权利要求2～6任一所述利用冻干海藻酸钙/球霰石碳酸钙复合微球制备的敷料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1. 共沉淀法制备得到均匀分散的球霰石碳酸钙悬浊液，将球霰石碳酸钙悬浊液分为两组；一组加入抑菌药物，另一组加入细胞生长因子；
S2. 分别将加有抑菌药物的球霰石碳酸钙悬浊液、加有细胞生长因子的球霰石碳酸钙悬浊液与海藻酸钠溶液混匀，制成内相溶液；然后采用微流控装置分别制备得到负载抑菌药物的复合微球和负载细胞生长因子的复合微球；
S3. 将制备得到的负载抑菌药物的复合微球和负载细胞生长因子的复合微球冷冻干燥后，并按特定比例混合即制备得到所述利用冻干海藻酸钙/球霰石碳酸钙复合微球制备的敷料。
8.根据权利要求7所述利用冻干海藻酸钙/球霰石碳酸钙复合微球制备的敷料，其特征在于，所述球霰石碳酸钙的制备过程如下：向碳酸盐和酪蛋白的混合溶液中加入钙盐溶液，使得碳酸根离子和钙离子的摩尔质量比为1:1，混匀后得到球霰石碳酸钙悬浊液。
9.根据权利要求7所述利用冻干海藻酸钙/球霰石碳酸钙复合微球制备的敷料的制备方法，其特征在于，负载抑菌药物的复合微球和负载细胞生长因子的复合微球中球霰石碳酸钙与海藻酸钙的质量比分别为1:200和1:25。
10.根据权利要求7所述利用冻干海藻酸钙/球霰石碳酸钙复合微球制备的敷料的制备方法，其特征在于，采用微流控装置制备复合微球的过程中，采用的收集相为可溶性钙盐溶液；流动相为非极性有机溶剂或弱极性有机溶剂。
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