CN108676905A

CN108676905A - 西瓜肉色主效基因及其InDel分子标记和应用

Info

Publication number: CN108676905A
Application number: CN201810532822.2A
Authority: CN
Inventors: 尚建立; 马双武; 闫劝劝; 李娜; 王吉明; 周丹; 李楠楠
Original assignee: Zhengzhou Fruit Research Institute CAAS
Current assignee: Zhengzhou Fruit Research Institute CAAS
Priority date: 2018-05-29
Filing date: 2018-05-29
Publication date: 2018-10-19
Anticipated expiration: 2038-05-29
Also published as: CN108676905B

Abstract

本发明公开了一种西瓜肉色主效基因及其InDel分子标记和应用，该西瓜肉色主效基因的InDel分子标记，位于西瓜6号染色体21861691bp处，核苷酸序列为GAGCCCGAGCCC。设计该InDel分子标记的引物，并提供一种西瓜肉色基因型的鉴定方法。设计该西瓜肉色主效基因的引物，并提供一种西瓜肉色基因表达水平的检测方法。将所述的分子标记、所述引物或所述的方法在西瓜肉色分子标记辅助选择中的应用。本发明的分子标记能够在苗期准确快速的鉴定出西瓜红肉或者粉肉，准确性高、检测方便，不受环境因素的影响，可广泛应用于西瓜肉色的鉴定和育种。

Description

西瓜肉色主效基因及其InDel分子标记和应用

技术领域

本发明涉及基因育种技术领域，具体涉及一种西瓜肉色主效基因及其InDel分子标记和应用。

背景技术

西瓜（Citrullus lanatus）属葫芦科植物，西瓜有红、粉、黄、白等瓤色，西瓜肉色的不同是由于所含类胡萝卜素的组成与含量不同。西瓜红色及粉色果肉中含有番茄红素，以及少量的八氢番茄红素、六氢番茄红素、δ-胡萝卜素、α-胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质和紫黄质等多种色素。

随着DNA 分子标记技术的快速发展，西瓜肉色基因的研究有了一定的进展。吕品等通过对类胡萝卜素合成代谢相关酶基因的转录调控的研究发现，其对不同瓤色西瓜果实类胡萝卜素的组成具有十分重要的影响。合成酶基因（包含GGPS）的表达上调以及代谢酶基因 NCEDs 的表达下调导致红瓤和粉瓤西瓜果实中积累大量的类胡萝卜素。中国专利文献CN 104711353 A中，根据SNP 突变位点开发出一种与西瓜果肉颜色相关的CAPS分子标记MluI-6，该标记与西瓜番茄红素β-环化酶基因紧密连锁。中国专利文献CN 105713971 A中，开发出与西瓜果肉颜色相关的InDel分子标记InDel19_fc6。

然而，经本发明人长期研究发现，西瓜果实瓤色有关遗传基因的鉴别、类胡萝卜素合成代谢的调控机制等的研究仍较少，分子标记辅助选择西瓜肉色育种应用仍不够广泛，选择效率和准确率都比较低，如中国专利文献CN 105713971 A中开发出与西瓜果肉颜色相关的分子标记InDel19_fc6在自然群体中验证的准确率仍不够高，对自然群体的验证仍存在较大误差。

因此，亟待开发一种与西瓜肉色紧密连锁的、易于操作的、准确率更高的分子标记，以期可以极大加速基因定位，对西瓜肉色改良育种具有重大意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种西瓜肉色主效基因FC6-1及其InDel分子标记和应用，以期能够在苗期准确快速的鉴定出西瓜果肉颜色，加快西瓜果肉颜色育种进程。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

研究筛选出一种西瓜肉色主效基因FC6-1的InDel分子标记，其位于西瓜6号染色体21861691bp处，其核苷酸序列为GAGCCCGAGCCC。

利用PERL自编程序提取插入缺失相应位置前后各500bp的序列，筛选出西瓜肉色主效基因FC6-1的InDel分子标记的引物如下：

上游引物序列为GACCCTGCATACGAGCCT；

下游引物序列为GGGATTGGAGCTGGAATT。

提供一种西瓜肉色基因型的鉴定方法，包括以下步骤：

（1）采用CTAB法提取西瓜叶片DNA；

（2）PCR扩增：利用上述InDel分子标记的引物对，对待测样品进行PCR扩增；

所述扩增体系为：西瓜叶片总DNA (100ng/μL) 1μL、InDel分子标记上游引物 (10μM)1μL、InDel分子标记下游引物 (10μM) 1μL、2 × Power Taq PCR MasterMix 12.5μL、ddH₂O 9.5μL；

所述扩增程序为：94℃、5min；94℃、20s，55℃、1min，72℃、30s，共35个循环；72℃、5min；

（3）对PCR产物进行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，显影、染色和带型判读，在179bp有条带，即为红肉西瓜；在167bp有条带，即为粉肉西瓜。

设计一种西瓜肉色主效基因FC6-1的引物如下：

上游引物序列为ATCCTTGCTTCTTGCTGCTC；

下游引物序列为 CAATGCCCAAATCTTTCCTG。

提供一种西瓜肉色基因FC6-1表达水平的检测方法，包括以下步骤：

（1）提取待测西瓜果肉RNA；

（2）将提取RNA进行反转录及cDNA合成；

（3）进行qRT-PCR扩增；

所述扩增体系为：

模板cDNA 1μL、主效基因上游引物(10μM) 0.5μL、主效基因下游引物(10μM) 0.5μL、SYBR Green 1 Master Mix 5μL、ddH₂O 3μL；

所述扩增程序为：

95℃、5min；95℃、30s，55℃、30s，72℃、35s，共45个循环； 95℃、1min，60℃、1min，95℃、10min；

（4）按照2^-△△CT法对样品的CT值进行计算。

将所述的分子标记或所述引物在西瓜肉色分子标记辅助选择中的应用。

将所述的方法在西瓜肉色分子标记辅助选择中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：

1. 本发明是根据高通量测序所得到的西瓜基因组数据开发出来的与果肉颜色紧密连锁的InDel分子标记，利用该InDel27_fc6标记能够在苗期准确快速的鉴定出西瓜红肉或者粉肉。具有准确性高、检测方便、不需要酶切等复杂步骤的优点，从而加快西瓜肉色选择育种进程。

2. 本发明的InDel27_fc6分子标记引物对，扩增产物稳定，特异性强，在鉴定过程中灵敏度高，不受环境因素的影响，可广泛应用于西瓜肉色的鉴定和育种。

3. 本发明定位到西瓜肉色主效基因FC6-1，通过qRT-PCR检测发现该基因在果实不同发育时期及不同肉色中的表达均有差异；该基因的定位对于了解西瓜红色和粉色差异的形成机制及肉色调控网络具有重要意义。

附图说明

图1为分子标记InDel27_fc6的引物在母本、父本、F₁及部分自然群体中的PCR扩增结果图；

图2为西瓜肉色主效基因FC6-1的基因表达检测图；

其中，A为母本基因型，B为父本基因型，H为F₁杂合基因型，M为marker的缩写。

具体实施方式

下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例一：西瓜肉色主效基因全基因组QTL定位试验

1. 试验材料：

以中国农业科学院郑州果树研究所西甜瓜种质资源中期库挑选的ZXG01478(母本)、14CB11(父本)为亲本，二亲本杂交获得F₁，F₁自交获得93个F₂群体。

2. 西瓜肉色主效基因初步定位的具有步骤为：

（1）通过SLAF-seq测序技术开发的SNP标记构建了高密度遗传连锁图谱[参考文献Construction of a high-density genetic map for watermelon (Citrullus lanantusL.) based on large-scale SNP discovery by specific length amplified fragmentsequencing (SLAF-seq)]，并对该93株 F₂群体进行肉色表型鉴定；

（2）结合高密度遗传图谱和F₂群体肉色表型鉴定结果，利用WinQTL cartographer 2.5software (http://statgen.ncsu.edu/qtlcart/WQTLCart.htm)进行QTL初定位，在LG6连锁群上检测到一个与西瓜肉色相关的主效QTL，对应的LOD值为23.65，可解释90.36%的表型变异，置信区间为69～106cM，对应物理位置为18～23.8Mb。

实施例二：西瓜F₂群体InDel标记分析试验

1. 实验材料

以实施例一中的ZXG01478(母本)、14CB11(父本)、杂交组合F₁及 93份F₂群体为实验材料。

2. F₂群体基因型鉴定：

利用设计的38对InDel引物（命名为InDel1_fc6 - InDel38_fc6）对ZXG01478(母本)、14CB11(父本)和 F₁单株为实验材料进行多态性筛选，然后利用多态性的InDel引物在F₂群体中进行基因型分析，检测该分子标记的两种基因型在93份F₂群体中的分布情况。

结合F₃群体的肉色表型，经过分析，InDel32_fc6和InDel34_fc6标记在F₂群体中被检测到与肉色基因共分离。且肉色主效基因FC6-1被定位在InDel24_fc6和InDel35_fc6两个分子标记之间，对应物理位置为6号染色体21818728～21933128bp。

具体步骤如下：

（1）利用CTAB法提取叶片总DNA

研磨：取1g新鲜叶片放入研钵，加入液氮快速且用力均匀研成粉末状。

研磨后将叶片粉末随即转入加有1mL CTAB 抽取液的离心管中，充分混匀后置于65℃恒温水浴60min，其间颠倒混合2～3次；

离心：从水浴锅取出后，8000rpm，1min；

取上清液置于新的离心管中，加等体积的氯仿：异戊醇（25：1，V/ V），混匀；

离心：10000rpm，5min；

取上清液到新的离心管中，加入0.7倍体积的异丙醇（冰上预冷30min），混匀后置于-20℃冷冻（不超过30min），让DNA析出；

离心：10000rpm，5min；

留沉淀弃上清液，用无水乙醇清洗沉淀数次，倒掉浸泡液，超净工作台上晾干（10min左右）；

加入200μL的蒸馏水溶解DNA；

用紫外分光光度计测定DNA的浓度，并于-20℃冰箱中保存备用。

（2）引物设计：

根据实施例1中QTL初定位区域并结合亲本重测序结果，在QTL峰值区域发现多个插入缺失片段大于5bp的InDels；

利用PERL自编程序提取插入缺失相应位置前后各500bp的序列，利用Primer 5软件设计引物。

（3）PCR反应体系如表1所示：

表1 反应体系

。

（4）PCR反应程序如表2所示：

表2 反应程序

。

（5）配胶：

5×TBE电泳缓冲液：称取Tris 26.95g，EDTA 1.86g，硼酸13.75g，去离子水定容至500mL。

40% 聚丙烯酰胺溶液：聚丙烯酰胺77.34g，甲叉双丙烯酰胺2.66g，去离子水定容至200mL。

量取40%聚丙烯酰胺溶液10mL，加入5×TBE 5mL，10% TBE 200μL配制8%的胶，摇匀。

倒入制胶板中，并安装梳子，待充分凝固后拔下梳子。

（6）上样：

将1μL PCR产物点到制备好的8%聚丙烯酰胺凝胶的点样孔中，同时另外的点样孔中加入适当的Marker。

（7）电泳：260V，35min。电泳缓冲液为1×TBE。

（8）银染和显影。

（9）观察分析条带的位置差异。

实施例三：西瓜BC₁群体InDel标记分析试验

1. 实验材料

以中国农业科学院郑州果树研究所西甜瓜种质资源中期库挑选的B5-8(母本、粉肉)和B47（父本、红肉）为亲本杂交获取F₁，F₁与B5-8回交获取80份BC₁群体为实验材料，其中红肉42份，粉肉38份。

2. BC1群体中肉色性状的定位

根据QTL定位到的区间并结合实施例二定位到的区间InDel24_fc6和InDel35_fc6设计InDel引物，同时利用实施例二中的InDel32_fc6和InDel34_fc6引物，对BC1群体进行多态性筛选和基因型鉴定。

鉴定方法参照实施例二。

经过验证，其中四对在BC₁群体中表现仍与肉色基因共分离，包括InDel27_fc6，InDel28_fc6，InDel31_fc6和InDel32_fc6。同时，肉色主效基因FC6-1进一步精细定位在InDel26_fc6和InDel33_fc6两个分子标记之间。对应物理位置为6号染色体21851079～21918252bp。

实施例四：西瓜自然群体InDel标记分析试验

1. 试验材料

为了精确定位西瓜肉色主效基因FC6-1，发明人从中国农业科学院郑州果树研究所西甜瓜种质资源中期库挑选93份自然群体为实验材料。

2. 在上述93份自然群体中进行肉色性状的精细定位

根据QTL定位到的区间并将实施例三中筛选到的InDel27_fc6，InDel31_fc6和InDel32_fc6共14对InDel引物在自然群体中进行基因型验证，其中A代表母本基因型，B代表父本基因型，H代表杂合基因型。

表3 93份自然群体的名称及对应不同引物的基因型验证结果统计

。

验证结果如表3：通过与其他13对引物验证到的自然群体的基因型进行比对发现InDel27_fc6标记基因型鉴定的准确率最高，比李娜等开发的与西瓜肉色相关的分子标记在自然群体中验证的准确率高，且有11份实验材料的基因型验证结果有误（具体见表3中InDel19_fc6列）。证明InDel27_fc6标记可以用于鉴定西瓜红肉与粉肉的肉色差异，以及西瓜肉色的选择育种。

InDel27_fc6分子标记上游引物序列为GACCCTGCATACGAGCCT；下游引物为GGGATTGGAGCTGGAATT。

该引物在父本基因型中的扩增产物为179bp，在母本基因型中的扩增产物为167bp。

聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的InDel27_fc6部分结果如图1。

肉色基因被定位在InDel27_fc6分子标记附近，该分子标记在基因Cla018767上，因此最终将调控西瓜粉肉与红肉差异的主效基因FC6-1定位为Cla018767。在父本中，12bp的InDel插入使得Cla018767调控西瓜的红肉性状。

实施例五：不同发育时期及不同基因型的西瓜肉色主效基因FC6-1的表达差异分析试验

1. 试验材料

以实施例一中的F₂群体的单株为实验材料。首先提取西瓜叶片DNA，利用InDel27_fc6引物进行基因型鉴定，具体提取方法参照实施例二。

2. 取样

在西瓜肉色转变的关键期（授粉后16天、21天和26天）进行取样，且每种基因型各取三个瓜（A型、B型和H型）作为实验材料。选取果肉发育良好的区域进行除籽取样。

3. 检测主效基因FC6-1的表达情况

（1）利用RNAprep Pure Plant Kit（Polysaccharides&Polyphenolics-rich）（TIANGEN）提取西瓜果肉总RNA，具体步骤参照试剂盒说明书。

（2）反转录及cDNA合成：

PCR管中配制下列模板RNA/引物混合液，并计算出1µg RNA所需要的体积，总计20μL。

模板引物混合物如表4所示：

表4 模板混合物

。

在65℃条件下加热反应管10min使模板-引物混合物变性，确保RNA二级结构变性。反应结束后立即将反应管置于冰上冷却。

在上述反应管中加入表5中其余的RT反应液组份。轻轻混匀并离心将样本收集于反应管底部。

表5 RT反应液

。

55 ℃下孵育30min，加热至85℃维持5min, 使Transcriptor ReverseTranscriptase失活。将反应管置于冰上以终止反应，-20℃保存备用。

（3）引物设计

利用PERL自编程序提取肉色主效基因FC6-1 DNA序列并利用Primer 5软件设计引物。其中actin作为内参。

FC6-1上游引物序列为：ATCCTTGCTTCTTGCTGCTC；

FC6-1下游引物序列为：CAATGCCCAAATCTTTCCTG。

actin 上游引物序列为：ATTCTCCGTTTGGACCTTGCT；

actin下游引物序列为：TCGTAGTTTTTCTCAATGGAGG。

（4）荧光定量PCR检测基因表达变化

取各样品模板cDNA 3µL加入到42µL ddH₂O中稀释15倍；反应体系如表6所示：

表6 反应体系

。

进行荧光定量PCR扩增，获得各个样品的CT，反应程序如表7所示：

表7 反应程序

。

对各个样品的CT进行计算，计算方法按照2^-△△CT法进行计算。

亲本为ZXG01478和14CB11的F₂中，肉色主效基因FC6-1在不同发育时期（授粉后16天、21天和26天）且基因型分别为A型、B型和H型西瓜果肉中的表达差异检测结果如图2所示：

在三个不同发育时期，西瓜肉色主效基因FC6-1在基因型为B和H的果肉中表达量均高于基因型为A的果肉，且在26天和31天均达到极显著差异水平。随着西瓜果肉的发育，在基因型为A的果肉中，肉色主效基因FC6-1的表达量先增加，随后又减少；而在基因型为B和H的果肉中，肉色主效基因FC6-1的表达量在31天时最高。因此肉色主效基因FC6-1通过不同时期的表达量来影响西瓜肉色，在粉肉中的表达量较低，而在红肉或者杂合基因型中的表达量较高。

上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院郑州果树研究所

<120> 西瓜肉色主效基因及其InDel分子标记和应用

<130> 2018

<160> 5

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 12

<212> DNA

<213> Citrullus lanatus

<400> 1

gagcccgagc cc 12

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gaccctgcat acgagcct 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

gggattggag ctggaatt 18

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

atccttgctt cttgctgctc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

caatgcccaa atctttcctg 20

Claims

1.一种西瓜肉色主效基因的InDel分子标记，其特征在于，所述分子标记位于西瓜6号染色体21861691bp处，其核苷酸序列为GAGCCCGAGCCC。

2.权利要求1所述西瓜肉色主效基因的InDel分子标记的引物，其

上游引物序列为GACCCTGCATACGAGCCT；

下游引物序列为GGGATTGGAGCTGGAATT。

3.一种西瓜肉色基因型的鉴定方法，包括以下步骤：

（1）采用CTAB法提取西瓜叶片DNA；

（2）PCR扩增：利用权利要求2所述的引物对，对待测样品利用如下扩增体系进行PCR扩增：西瓜叶片总DNA 1μL、权利要求2所述上游引物 1μL、权利要求2所述下游引物 1μL、2 ×Power Taq PCR MasterMix 12.5μL、ddH₂O 9.5μL；

扩增程序为：94℃、5min；94℃、20s，55℃、1min，72℃、30s，共35个循环；72℃、5min；

4.一种西瓜肉色主效基因的引物，其

上游引物序列为ATCCTTGCTTCTTGCTGCTC；

下游引物序列为 CAATGCCCAAATCTTTCCTG。

5.一种西瓜肉色基因表达水平的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取待测西瓜果肉RNA；

（2）将提取RNA进行反转录及cDNA合成；

（3）采用如下扩增体系进行qRT-PCR扩增：

模板cDNA 1μL、权利要求4所述上游引物0.5μL、权利要求4所述下游引物0.5μL、SYBRGreen 1 Master Mix 5μL、ddH₂O 3μL；

扩增程序为：

（4）按照2^-△△CT法对样品的CT值进行计算。

6.权利要求1或2所述的分子标记或权利要求4所述引物在西瓜肉色分子标记辅助选择中的应用。

7.权利要求3或5所述的方法在西瓜肉色分子标记辅助选择中的应用。