CN108676834A - 一种大蒜抗肿瘤活性多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种大蒜抗肿瘤活性多肽，其制备方法为：将大蒜粉碱提取得大蒜蛋白提取液，然后向大蒜蛋白提取液加入蛋白酶酶解得酶解液，酶解液经超滤、凝胶柱层析和高效液相色谱处理，即得大蒜多肽活性物质。有益效果为：本发明活性多肽纯度和质量高、活性高、抗肿瘤效果好，该活性多肽的制备方法简单可行、成本低、工艺稳定、能除去大量盐分、得率高。

Description

一种大蒜抗肿瘤活性多肽
技术领域
本发明涉及生物活性成分提取技术领域，尤其是涉及一种大蒜抗肿瘤活性多肽。
背景技术
大蒜为百合科葱属多年生草本缩根植物，俗称葫、葫蒜、独蒜等，我国各地开始种植和食用大蒜延续至今，成为人们所喜爱的、不可缺少的食品。大蒜独特的辛辣味成为人们餐桌上不可缺少的调味剂，同时从古时开始，人们也渐渐地发现大蒜的药用价值。在国内外，有大量的资料文献考证大蒜的药理作用，其作用为：抗菌与抑菌作用；抗原虫作用；对增加纤维蛋白溶解活性作用及心血管系统的作用；降血脂；对免疫力的作用；抗肿瘤作用，其中最吸引人们注意的是防病、治病、杀菌、抑菌等功效。然而这一说法具有悠久的历史，在《别录》、《古今往》、《普济方》、《本草纲目》中均有记载，指出大蒜具有通五脏、达诸鸾、去寒湿、避邪恶、消臃肿、化积食等功效。这些都成为国内外学者研究的热点，并且对大蒜的很多药用价值也提供了有力的依据。大蒜蛋白含有的氨基酸种类比较齐全，几乎是人体所需的全部氨基酸，具有很高的营养价值。大蒜蛋白质中含有高组分的精氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、组氨酸和亮氨酸，还有低组分的蛋氨酸。精氨酸、组氨酸和赖氣酸的含量分别是23.65%、5.15%、5.90%，除了这些必需氨基酸外，还有较为重要的蒜氨酸，在大蒜中以无臭、稳定的形式存在，它是大蒜的气味形成的因素之一。
恶性肿瘤是全世界高发病率和高死亡率的疾病之一。多年恶性肿瘤临床研究表明，传统的治疗方法具有一定的局限性，如对肿瘤细胞选择性不强、易使肿瘤细胞产生耐药性和不能准确识别恶性肿瘤细胞等。虽然免疫细胞治疗、昼夜节律化疗和光动力学疗法等新型恶性肿瘤治疗方法的研究已略显成效，但在临床应用方面还不成熟或尚处于研发阶段。针对传统恶性肿瘤治疗手段局限性和新型恶性肿瘤治疗方法不成熟性的情况，研究学者开始致力于研发具有低毒性、高特异性及不易形成耐药性等优点的抗肿瘤药物。经过长期不断的探索和试验研究，学者发现大蒜肽具有较好的抗肿瘤效果，该种多肽抗肿瘤特异性强且毒副作用小。
现有技术如授权公告号为CN 104327158 B的中国发明专利，公开了大蒜中提取得到的抗肿瘤活性的多肽，其氨基酸序列为：NB-DS-5：RCPSIGICLTT；NB-DS-8：LRMKSPPGGSRTT；NB-DS-9：SRLLMKGRRSPPMTT；NB-DS-10：GSPYLRMKGVGGSMRT；NB-DS-13：MYVSRLGSSGIGL；NB-DS-14：CPSRGSSAMARL；NB-DS-16：MARTSPYGEQSRP。该多肽具有较好的治疗乳腺癌的效果，同时对正常细胞无毒副作用。但是该大蒜多肽的得率较低、纯度不够。
发明内容
本发明的目的在于提供一种大蒜抗肿瘤活性多肽，该活性多肽纯度和质量高、活性高、抗肿瘤效果好，该活性多肽的制备方法简单可行、成本低、工艺稳定、能除去大量盐分、得率高。
本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：
一种大蒜抗肿瘤活性多肽的制备方法，将大蒜粉碱提取得大蒜蛋白提取液，然后向大蒜蛋白提取液加入蛋白酶酶解得酶解液，酶解液经超滤、凝胶柱层析和高效液相色谱处理，即得大蒜多肽活性物质。该制备方法利用大蒜粉制备得到了有重大的药物价值的大蒜活性多肽，具有十分重要的生产意义和经济价值，该制备方法简单可行，工艺稳定，重现性高，所使用的设备为成熟设备，投资成本较低，多肽活性物质回收率高。
一种大蒜抗肿瘤活性多肽的制备方法，其具体步骤为：
碱提取：按料液比为1:30-36（g/mL）将大蒜粉加入浓度为1.4-1.6%的NaOH溶液，碱提取1-2h，然后离心，上清液即为大蒜蛋白提取液，碱可以破坏蛋白分子的次级键尤其是氢键，使一些极性基团发生解离，使得蛋白表面分子具有相同的电荷从而对蛋白质有增溶作用，具有提取率高、成本低的特点，还能除去水溶性糖分、淀粉、纤维素等成分，得到的产品色泽质地比较好，适于工业化生产；
蛋白酶酶解：将向大蒜蛋白提取液预热至30-40℃，用磷酸盐缓冲液调节其pH至7.5-8.5，加入木瓜蛋白酶和弹性蛋白酶进行恒温酶解3-5h，水解结束后灭酶，将水解液静置冷却，离心，上清液即为酶解液，不同蛋白酶作用于蛋白质肽链上的位点不同，造成了水解程度和多肽的组成不同，本发明用不同的蛋白酶进行酶解，能够使大蒜蛋白充分酶解，提高酶解液中多肽活性物质的含量，同时该步骤具有酶解条件温和、易控制反应进程、成本低等优点，酶解过程中，无毒副作用产生；
超滤：将酶解液依次用6-10kDa、3-5kDa、0.3-1kDa的超滤膜进行分离，其中超滤压力为0.033-0.06MPa、超滤时间为15-25min，收集超滤后的组分，即得大蒜活性多肽粗液，该步骤是利用膜两侧的压力差通过膜表面的微孔结构对物质进行分离，当液体的混合物在一定压力下，小分子溶质通过膜上的微孔透过膜，大分子则被截留，从而实现大小物质的分离、浓缩和净化，具有价格低廉、操作简单、分离过程不发生相变、无毒无污染、能有效地保护被分离多肽的活性等优点；
凝胶柱层析：将功能肽粗液上样至柱子内进行层析分离，用双蒸水进行洗脱，设置检测器灵敏度为0.2A，检测器调至280nm处检测，进样量1.8-2.2mL，流速为0.5-0.8mL/min，根据280nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，降血脂活性最强组分为凝胶层析酶解物，冷冻干燥，备用，该方法根据酶解液在层析柱中的移动速度不同，大分子的组分先被洗脱下来，小分子的组分后被洗脱下来，从而达到分离纯化的目的，操作简便，且不需要抗氧化肽与其他物质结合，减少了纯化过程中功能肽的损失，不影响目标组分化学性质，能保持功能肽原有的活性不受破坏；
高效液相色谱：将凝胶层析酶解物用双蒸水配成80-100μg/mL的溶液，利用高效液相色谱进行纯化，根据对降血脂活性获得降血脂功能肽，色谱条件为：设置进样量为4-6μL、色谱柱为Agilent C18（250mm×4.6mm，5μm）、柱温为25-35℃、流动相为10-15%乙腈溶液、洗脱速度为0.8-1.2mL/min。该方法具有分析速度快、分辨率高、灵敏度高、分离效果好的优势，能快速分离纯化目标物质，同时该纯化步骤所需样品量少，进样量以µL为数量级，可同时分离多种成分，能反复进样，且分离过程中样品不被破坏，易回收，获得的组分纯度较高。
作为优选，蛋白酶酶解步骤中磷酸盐缓冲液中含有0.2-0.3mM的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和0.16-0.24mM的黄素腺嘌呤二核苷酸二钠盐。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和黄素腺嘌呤二核苷酸的加入一方面能够维持磷酸盐缓冲中氢离子和氢氧根离子浓度的平衡，进一步提高磷酸盐缓冲的缓冲能力，进而保证酶解体系中pH相对稳定，另一方面能够避免磷酸盐缓冲液中的成分与钙离子Ca2+、Mg2+及一些重金属离子缔合形成沉淀，保证大蒜蛋白与酶充分接触，提高酶解速率，该缓冲液能在一定程度上抵消、减轻酶解产物对溶液酸碱度的影响，从而保持溶液的pH值相对稳定，不需要在酶解过程中一直调节酶解体系的pH，提高酶解的速率和酶解度。
作为优选，碱提取步骤中NaOH溶液中含有0.32-0.43mM的麻黄碱，麻黄碱中左旋体和右旋体的比例为100:2.2-2.7。上述麻黄碱的加入能够保持飞粉液的pH不变，使得碱提取大蒜蛋白的速率不变，节约能源的同时能够避免因时间过长而造成的微生物污染，同时能够减少NaOH溶液的用量，避免最终多肽活性物质中存在大量盐分，提高产品的纯度和质量，且能够避免酸碱的浪费，降低提取成本；而左旋体和右旋体的合理比能够提高蛋白质分子与氨基、羧基的结合力，可保护蛋白质的肽键不被NaOH破坏，防止蛋白质分子的空间结构被破坏而引起蛋白质变性，提高蛋白质的溶解度和得率，最终提高多肽活性物质的得率和活性。
本发明还公开一种大蒜抗肿瘤活性多肽的制备方法制得的大蒜抗肿瘤活性多肽。该大蒜抗肿瘤活性多肽激活超氧化物歧化酶，清除参与肿瘤细胞恶化的活性氧，提高机体的抗氧化能力而发挥抗肿瘤作用，同时也可以干扰或抑制肿瘤细胞的DNA合成而达到抗肿瘤的作用。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1）本发明大蒜抗肿瘤活性多肽激活超氧化物歧化酶，清除参与肿瘤细胞恶化的活性氧，提高机体的抗氧化能力而发挥抗肿瘤作用，同时也可以干扰或抑制肿瘤细胞的DNA合成而达到抗肿瘤的作用；2）本发明制备方法利用大蒜粉制备得到了有重大的药物价值的大蒜活性多肽，具有十分重要的生产意义和经济价值，该制备方法简单可行，工艺稳定，重现性高，所使用的设备为成熟设备，投资成本较低，多肽活性物质回收率高；3）本发明制备方法能避免最终多肽活性物质中存在大量盐分，提高产品的纯度和质量，降低提取成本，提高蛋白质的溶解度和得率，最终提高多肽活性物质的得率和活性。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
一种大蒜抗肿瘤活性多肽的制备方法，将大蒜粉碱提取得大蒜蛋白提取液，然后向大蒜蛋白提取液加入蛋白酶酶解得酶解液，酶解液经超滤、凝胶柱层析和高效液相色谱处理，即得大蒜多肽活性物质。该制备方法利用大蒜粉制备得到了有重大的药物价值的大蒜活性多肽，具有十分重要的生产意义和经济价值，该制备方法简单可行，工艺稳定，重现性高，所使用的设备为成熟设备，投资成本较低，多肽活性物质回收率高。
一种大蒜抗肿瘤活性多肽的制备方法，其具体步骤为：
1）碱提取：按料液比为1:30（g/mL）将大蒜粉加入浓度为1.6%的NaOH溶液，碱提取1h，然后离心，上清液即为大蒜蛋白提取液，碱可以破坏蛋白分子的次级键尤其是氢键，使一些极性基团发生解离，使得蛋白表面分子具有相同的电荷从而对蛋白质有增溶作用，具有提取率高、成本低的特点，还能除去水溶性糖分、淀粉、纤维素等成分，得到的产品色泽质地比较好，适于工业化生产；
2）蛋白酶酶解：将向大蒜蛋白提取液预热至30℃，用磷酸盐缓冲液调节其pH至8.5，加入木瓜蛋白酶和弹性蛋白酶进行恒温酶解3h，水解结束后灭酶，将水解液静置冷却，离心，上清液即为酶解液，不同蛋白酶作用于蛋白质肽链上的位点不同，造成了水解程度和多肽的组成不同，用不同的蛋白酶进行酶解，能够使大蒜蛋白充分酶解，提高酶解液中多肽活性物质的含量，同时该步骤具有酶解条件温和、易控制反应进程、成本低等优点，酶解过程中，无毒副作用产生；
3）超滤：将酶解液依次用10kDa、5kDa、1kDa的超滤膜进行分离，其中超滤压力为0.033MPa、超滤时间为25min，收集超滤后的组分，即得大蒜活性多肽粗液，大蒜活性多肽粗液浓缩、冷冻干燥后，其中活性多肽的含量为93.4%，该步骤是利用膜两侧的压力差通过膜表面的微孔结构对物质进行分离，当液体的混合物在一定压力下，小分子溶质通过膜上的微孔透过膜，大分子则被截留，从而实现大小物质的分离、浓缩和净化，具有价格低廉、操作简单、分离过程不发生相变、无毒无污染、能有效地保护被分离多肽的活性等优点；
4）凝胶柱层析：将功能肽粗液上样至柱子内进行层析分离，用双蒸水进行洗脱，设置检测器灵敏度为0.2A，检测器调至280nm处检测，进样量1.8mL，流速为0.8mL/min，根据280nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，降血脂活性最强组分为凝胶层析酶解物，冷冻干燥，备用，该方法根据酶解液在层析柱中的移动速度不同，大分子的组分先被洗脱下来，小分子的组分后被洗脱下来，从而达到分离纯化的目的，操作简便，且不需要抗氧化肽与其他物质结合，减少了纯化过程中功能肽的损失，不影响目标组分化学性质，能保持功能肽原有的活性不受破坏；
5）高效液相色谱：将凝胶层析酶解物用双蒸水配成80μg/mL的溶液，利用高效液相色谱进行纯化，根据对降血脂活性获得降血脂功能肽，色谱条件为：设置进样量为6μL、色谱柱为Agilent C18（250mm×4.6mm，5μm）、柱温为25℃、流动相为15%乙腈溶液、洗脱速度为0.8mL/min。该方法具有分析速度快、分辨率高、灵敏度高、分离效果好的优势，能快速分离纯化目标物质，同时该纯化步骤所需样品量少，进样量以µL为数量级，可同时分离多种成分，能反复进样，且分离过程中样品不被破坏，易回收，获得的组分纯度较高。
蛋白酶酶解步骤中磷酸盐缓冲液中含有0.3mM的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和0.16mM的黄素腺嘌呤二核苷酸二钠盐。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和黄素腺嘌呤二核苷酸的加入一方面能够维持磷酸盐缓冲中氢离子和氢氧根离子浓度的平衡，进一步提高磷酸盐缓冲的缓冲能力，进而保证酶解体系中pH相对稳定，另一方面能够避免磷酸盐缓冲液中的成分与钙离子Ca2+、Mg2+及一些重金属离子缔合形成沉淀，保证大蒜蛋白与酶充分接触，提高酶解速率，该缓冲液能在一定程度上抵消、减轻酶解产物对溶液酸碱度的影响，从而保持溶液的pH值相对稳定，不需要在酶解过程中一直调节酶解体系的pH，提高酶解的速率和酶解度。
碱提取步骤中NaOH溶液中含有0.43mM的麻黄碱，麻黄碱中左旋体和右旋体的比例为100:2.2。上述麻黄碱的加入能够保持飞粉液的pH不变，使得碱提取大蒜蛋白的速率不变，节约能源的同时能够避免因时间过长而造成的微生物污染，同时能够减少NaOH溶液的用量，避免最终多肽活性物质中存在大量盐分，提高产品的纯度和质量，且能够避免酸碱的浪费，降低提取成本；而左旋体和右旋体的合理比能够提高蛋白质分子与氨基、羧基的结合力，可保护蛋白质的肽键不被NaOH破坏，防止蛋白质分子的空间结构被破坏而引起蛋白质变性，提高蛋白质的溶解度和得率，最终提高多肽活性物质的得率和活性。
一种大蒜抗肿瘤活性多肽的制备方法制得的大蒜抗肿瘤活性多肽。该大蒜抗肿瘤活性多肽激活超氧化物歧化酶，清除参与肿瘤细胞恶化的活性氧，提高机体的抗氧化能力而发挥抗肿瘤作用，同时也可以干扰或抑制肿瘤细胞的DNA合成而达到抗肿瘤的作用。
实施例2：
一种大蒜抗肿瘤活性多肽的制备方法，其具体步骤为：
1）碱提取：按料液比为1:33（g/mL）将大蒜粉加入浓度为1.5%的NaOH溶液，碱提取1.5h，然后离心，上清液即为大蒜蛋白提取液；
2）蛋白酶酶解：将向大蒜蛋白提取液预热至35℃，用磷酸盐缓冲液调节其pH至8.0，加入木瓜蛋白酶和弹性蛋白酶进行恒温酶解4h，水解结束后灭酶，将水解液静置冷却，离心，上清液即为酶解液；
3）超滤：将酶解液依次用8kDa、4kDa、0.6kDa的超滤膜进行分离，其中超滤压力为0.05MPa、超滤时间为20min，收集超滤后的组分，即得大蒜活性多肽粗液，大蒜活性多肽粗液浓缩、冷冻干燥后，其中活性多肽的含量为95.1%；
4）凝胶柱层析：将功能肽粗液上样至柱子内进行层析分离，用双蒸水进行洗脱，设置检测器灵敏度为0.2A，检测器调至280nm处检测，进样量2mL，流速为0.5-0.8mL/min，根据280nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，降血脂活性最强组分为凝胶层析酶解物，冷冻干燥，备用；
5）高效液相色谱：将凝胶层析酶解物用双蒸水配成90μg/mL的溶液，利用高效液相色谱进行纯化，根据对降血脂活性获得降血脂功能肽，色谱条件为：设置进样量为5μL、色谱柱为Agilent C18（250mm×4.6mm，5μm）、柱温为30℃、流动相为12%乙腈溶液、洗脱速度为1mL/min。
蛋白酶酶解步骤中磷酸盐缓冲液中含有0.25mM的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和0.2mM的黄素腺嘌呤二核苷酸二钠盐。
碱提取步骤中NaOH溶液中含有0.38mM的麻黄碱，麻黄碱中左旋体和右旋体的比例为100:2.5。
实施例3：
一种大蒜抗肿瘤活性多肽的制备方法，其具体步骤为：
1）碱提取：按料液比为1:33（g/mL）将大蒜粉加入浓度为1.5%的NaOH溶液，碱提取1.5h，然后离心，上清液即为大蒜蛋白提取液；
2）蛋白酶酶解：将向大蒜蛋白提取液预热至35℃，用磷酸盐缓冲液调节其pH至8.0，加入木瓜蛋白酶和弹性蛋白酶进行恒温酶解4h，水解结束后灭酶，将水解液静置冷却，离心，上清液即为酶解液；
3）超滤：将酶解液依次用8kDa、4kDa、0.6kDa的超滤膜进行分离，其中超滤压力为0.05MPa、超滤时间为20min，收集超滤后的组分，即得大蒜活性多肽粗液，大蒜活性多肽粗液浓缩、冷冻干燥后，其中活性多肽的含量为87.5%；
4）凝胶柱层析：将功能肽粗液上样至柱子内进行层析分离，用双蒸水进行洗脱，设置检测器灵敏度为0.2A，检测器调至280nm处检测，进样量2mL，流速为0.5-0.8mL/min，根据280nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，降血脂活性最强组分为凝胶层析酶解物，冷冻干燥，备用；
5）高效液相色谱：将凝胶层析酶解物用双蒸水配成90μg/mL的溶液，利用高效液相色谱进行纯化，根据对降血脂活性获得降血脂功能肽，色谱条件为：设置进样量为5μL、色谱柱为Agilent C18（250mm×4.6mm，5μm）、柱温为30℃、流动相为12%乙腈溶液、洗脱速度为1mL/min。
由实施例2和实施例3可知，实施例2的活性多肽得率高。
实施例4：
活性多肽的抗肿瘤性能
实验动物：BALB/c裸裸鼠48只，4-5周龄，雄性各半，体重18-20g，按体重随机分为4组，模型组、对照组1、对照组2和试验组均12只；
分组与造模：收集处于对数生长期的HepG-2细胞，1000rpm离心5min，调整细胞浓度至2.5×107个/mL，制备单细胞悬液，以1mL空针将细胞悬液吹打混匀后，取0.2mL接种于裸鼠右侧腋下，含细胞数5×106个/只，注射后注射部位局部按压30s，防止细胞悬液从针孔流出。注射局部出现明显皮丘。
给药：裸鼠于肿瘤接种48h后开始给药，对照组1用药为实施例3（给药剂量为100mg/kg/d），对照组2用药为5-氟尿嘧啶（给药剂量为20mg/kg/d），试验组用药为实施例2（给药剂量为100mg/kg/d），给药方式为腹腔注射，每天给药1次，实验期间，隔天记录裸鼠生长状况，给药后第3天起隔日称重并测量瘤块体积，给药12d后全部处死，计算肿瘤抑制率，瘤体积抑制率（%）=（1-试验组平均瘤体积/对照组2瘤体积）×100%，瘤重抑制率（%）=（1-试验组平均瘤重/对照组2瘤重）×100%，试验结果如表1所示。
表1 活性多肽的抗肿瘤性能测试结果
组别 瘤体积抑制率（%） 瘤重抑制率（%）
模型组 0 0
对照组1 43.42 50.51
对照组2 8.23 9.16
试验组 20.31 19.47
由表1可知，裸鼠皮下移植瘤的生长均不同程度地受到抑制，试验组的抑制作用大于对照组2，说明实施例2的抗肿瘤效果好于实施例3，进而说明实施例2的产品活性好于实施例3。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种大蒜抗肿瘤活性多肽的制备方法，其特征在于：将大蒜粉碱提取得大蒜蛋白提取液，然后向大蒜蛋白提取液加入蛋白酶酶解得酶解液，酶解液经超滤、凝胶柱层析和高效液相色谱处理，即得大蒜多肽活性物质。
2.根据权利要求1所述的一种大蒜抗肿瘤活性多肽的制备方法，其特征在于：所述蛋白酶酶解的具体步骤为：将向大蒜蛋白提取液预热至30-40℃，用磷酸盐缓冲液调节其pH至7.5-8.5，加入木瓜蛋白酶和弹性蛋白酶进行恒温酶解3-5h，水解结束后灭酶，将水解液静置冷却，离心，上清液即为酶解液。
3.根据权利要求1所述的一种大蒜抗肿瘤活性多肽的制备方法，其特征在于：所述磷酸盐缓冲液中含有0.2-0.3mM的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和0.16-0.24mM的黄素腺嘌呤二核苷酸二钠盐。
4.根据权利要求1所述的一种大蒜抗肿瘤活性多肽的制备方法，其特征在于：所述碱提取的具体步骤为：按料液比为1:30-36（g/mL）将大蒜粉加入浓度为1.4-1.6%的NaOH溶液，碱提取1-2h，然后离心，上清液即为大蒜蛋白提取液。
5.根据权利要求1所述的一种大蒜抗肿瘤活性多肽的制备方法，其特征在于：所述NaOH溶液中含有0.32-0.43mM的麻黄碱，所述麻黄碱中左旋体和右旋体的比例为100:2.2-2.7。
6.根据权利要求1所述的一种大蒜抗肿瘤活性多肽的制备方法，其特征在于：所述超滤的具体步骤为：将酶解液依次用6-10kDa、3-5kDa、0.3-1kDa的超滤膜进行分离，其中超滤压力为0.033-0.06MPa、超滤时间为15-25min，收集超滤后的组分，即得大蒜活性多肽粗液。
7.根据权利要求1所述的一种大蒜抗肿瘤活性多肽的制备方法，其特征在于：所述凝胶柱层析的具体步骤为：将功能肽粗液上样至柱子内进行层析分离，用双蒸水进行洗脱，设置检测器灵敏度为0.2A，检测器调至280nm处检测，进样量1.8-2.2mL，流速为0.5-0.8mL/min，根据280nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，降血脂活性最强组分为凝胶层析酶解物，冷冻干燥，备用。
8. 根据权利要求1所述的一种大蒜抗肿瘤活性多肽的制备方法，其特征在于：所述高效液相色谱的具体步骤为：将凝胶层析酶解物用双蒸水配成80-100μg/mL的溶液，利用高效液相色谱进行纯化，根据对降血脂活性获得降血脂功能肽，色谱条件为：设置进样量为4-6μL、色谱柱为Agilent C18（250mm×4.6mm，5μm）、柱温为25-35℃、流动相为10-15%乙腈溶液、洗脱速度为0.8-1.2mL/min。
9.权利要求1-8任何一项所述的一种大蒜抗肿瘤活性多肽的制备方法制得的大蒜抗肿瘤活性多肽。
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