CN108640957A - 一种从葛根粗提物中同时提取多种葛根异黄酮苷的方法 - Google Patents

Abstract

一种从葛根粗提物中同时提取多种葛根异黄酮苷的方法，包括以下步骤：（1）在葛根粗提物中，加入冰水，搅拌，离心过滤，得滤饼；（2）先用低碳醇将滤饼分散，再加入填充剂，搅拌均匀，真空干燥，得拌样填充剂；（3）在层析柱中先加入新鲜填充剂，再将拌样填充剂填装于其上；（4）用浓度递增的洗脱剂进行梯度洗脱，分别收集洗脱液，减压浓缩，降温，搅拌析晶，离心过滤，干燥，分别得染料木苷、大豆苷和葛根素。按照本发明方法所得染料木苷的含量高达98.7%，收率高达92%；大豆苷的含量高达98.5%，收率高达92%；葛根素的含量高达99.9%，收率高达97%；本发明方法操作简单、成本低廉、环境友好、适合工业化生产。

Description

一种从葛根粗提物中同时提取多种葛根异黄酮苷的方法

技术领域

本发明涉及一种同时提取多种葛根异黄酮苷的方法，具体涉及一种从葛根粗提物中同时提取多种葛根异黄酮苷的方法。

背景技术

葛根为豆科植物野葛或甘葛藤萝的块根，主要产于河南、湖南、浙江、四川等地。具有解肌退热、生津、透疹、升阳止泻等功效。野生葛根内含有12%的黄酮类化合物，如葛根素、大豆苷、花生素等营养成分，还有蛋白质、氨基酸、糖、异黄酮苷和人体必需的铁、钙、铜、硒等矿物质，是老少皆宜的名贵滋补品，有“千年人参”之美誉。其中，异黄酮苷具有良好的营养价值，可以有效的调节机体代谢，具有防癌和抗癌、预防心脑血管疾病、预防和改善骨质疏松、预防老年痴呆、美容和延缓衰老等作用。

葛根素（Puerarin）是葛根中含量最高、研究和应用最广泛的异黄酮苷。具有退热、镇静、扩张心脑血管、降低心肌氧耗、改善心肌收缩功能和促进血液微循环等作用，常用于治疗冠心病、视网膜动、静脉阻塞和突发性耳聋等微循环障碍病。

大豆苷（Daidzin）也是一种葛根中主要含有的异黄酮苷。现代医学研究发现，大豆苷具有抗癌、预防冠心病、预防骨质疏松、缓解或减轻妇女更年期症状的作用，对乳腺癌、前列腺癌、心脏病、骨质疏松症、心血管疾病及妇女更年期综合症等多种疾病具有独特疗效。

染料木苷（Genistin）同样也是一种葛根中主要含有的异黄酮苷。染料木苷具有多种生理功能，它是一种有效的抗氧化剂，有效的蛋白酪胺酸激活酶抑制剂以及植物雌激素。近年来，越来越多的证据表明染料木苷对乳腺癌、前列腺癌、绝经后症候群、骨质疏松症以及心血管病疾病等具有预防和治疗作用。

CN107814794A公开了一种从葛根中制取高纯度葛根素的方法，是以葛根为原料，通过粉碎，正丁醇浸泡，乙醇提取，大孔树脂吸附，结晶，酸水解，干燥等步骤，得到高纯度葛根素。但是，该方法中所使用的多种有机溶剂交叉混合，在实际生产中无法循环利用，且酸水对环境的污染大，因此，该方法不具备生产的可行性。

CN107522692A公开了一种利用葛根淀粉生产废液分离葛根素的方法，是以葛根淀粉生产废液为原料，通过大孔树脂吸附，乙醇洗脱，浓缩，正丁醇萃取，冰醋酸调节pH值，结晶等步骤，得到葛根素。但是，该方法大量使用的高沸点有机溶剂、部分混合溶剂难以循环利用，成本高昂，因此，该方法也不适合工业化生产。

CN107625804A公开了一种葛根提取物的纯化工艺，是以葛根粗提物为原料，通过溶解，超滤，浓缩，喷雾干燥等步骤，得到葛根提取物粉末。但是，该方法获得的产品中葛根素的含量偏低，不超过40%，无法获得高含量的葛根素。

CN101560201A公开了从葛根中萃取高纯度葛根素及多种珍稀医药成分的工艺，是以野葛为原料，通过乙醇超声提取，浓缩，正丁醇溶解，盐酸水解，乙酸乙酯萃取，氯仿萃取，氧化铝脱色，醋酸萃取，重结晶等步骤，得到葛根素、尿囊素、大豆甙元等成分。但是，该方法步骤繁杂、且大量使用易燃易爆和有毒有害的化工溶剂，成本高昂，无法实现工业化生产。

CN107353282A同样公开了从葛根中萃取高纯度葛根素及多种珍稀医药成分的工艺，是以野葛为原料，通过乙醇超声提取，大孔树脂吸附，洗脱，盐酸水解，再次大孔树脂吸附，再次洗脱等步骤，得到葛根素、大豆甙元和染料木素等成分。但是，该方法步骤繁杂，且葛根素的收率偏低。

CN1769279A公开了一种从葛渣中提取分离异黄酮的方法，CN1769278A公开了一种从葛藤中提取分离异黄酮的方法，是以葛渣或葛藤为原料，通过粉碎、醇提、浓缩、聚酰胺层析、梯度洗脱、浓缩、二次聚酰胺层析、二次梯度洗脱、浓缩、结晶等步骤，得到葛根素和大豆苷元。但是，该方法需反复层析、反复梯度洗脱才能得到高含量的葛根素和大豆苷元，因此，产品的损耗将增大、收率会偏低。此外，对于葛根资源中的其它异黄酮苷，比如染料木苷和大豆苷都没有分离、提纯，异黄酮苷没有得到充分的利用。

CN105949257A公开了一种异黄酮苷类化合物的制备和用途，是以绿豆的干燥茎枝为原料，通过醇提、浓缩、萃取、正相硅胶分离、反相硅胶分离、甲醇重结晶等步骤，得到2^’-羟基大豆苷。但是，该方法使用了大量有毒有害的化工溶剂，污染大，且同时用到了正相硅胶和反相硅胶，得到的产品却只有一种，成本高昂。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种可同时提取多种高纯度、高产量葛根异黄酮苷，且操作简单、成本低廉、环境友好、适合工业化生产的从葛根粗提物中同时提取多种葛根异黄酮苷的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：一种从葛根粗提物中同时提取多种葛根异黄酮苷的方法，包括以下步骤：

（1）除杂：在葛根粗提物中，加入冰水，搅拌，离心过滤，得滤饼；

（2）填充剂拌样：先用低碳醇将步骤（1）所得滤饼分散，再加入填充剂，搅拌均匀，真空干燥，得拌样填充剂；

（3）填充剂填装：在层析柱中先加入新鲜填充剂，再将步骤（2）所得拌样填充剂填装于其上；

（4）梯度洗脱：用浓度递增的洗脱剂对步骤（3）填充剂填装的层析柱进行梯度洗脱，分别收集不同梯度的洗脱液，分别减压浓缩，降温，搅拌析晶，离心过滤，真空干燥，分别得染料木苷、大豆苷和葛根素三种葛根异黄酮苷。

优选地，步骤（1）中，所述葛根粗提物中，染料木苷的质量含量为5～15%，大豆苷的质量含量为8～20%，葛根素的质量含量为30～60%。

优选地，步骤（1）中，所述冰水的用量为葛根粗提物重量的1～5倍。冰水搅拌的目的是除去葛根粗提物中的糖类等水溶性杂质，并减少葛根提取物中多种异黄酮苷的损失。

优选地，步骤（1）中，所述冰水的温度为0～10℃。

优选地，步骤（1）中，所述搅拌的时间为30～60min。若冰水的用量过少或搅拌的时间过短，都将导致水溶性杂质去除不彻底；若冰水的用量过多或搅拌的时间过长，都将造成能源的浪费，且有可能造成葛根异黄酮苷的损失。

优选地，步骤（2）中，所述低碳醇的用量为葛根粗提物原料重量的0.5～1.0倍。用低碳醇分散的目的：一是，将紧实的滤饼变得松散，便于物料与填充剂均匀混合；二是，低碳醇的沸点低，拌样后的填充剂可快速干燥。

优选地，步骤（2）中，所述低碳醇为甲醇和/或乙醇。

优选地，步骤（2）中，所述填充剂的用量为葛根粗提物原料重量的1～2倍。填充剂拌样并干燥的目的是：使待分离的物料快速、均匀地吸附在填充剂上。若用于拌样的填充剂用量过少，物料将难以充分的吸附在填充剂上；若用于拌样的填充剂用量过多，则将造成填充剂的浪费，并增大洗脱的难度。

优选地，步骤（2）中，所述填充剂为氧化铝、硅胶、反相硅胶、聚酰胺树脂、大孔吸附树脂、离子交换树脂、葡聚糖凝胶、活性炭或硅藻土等中的一种或几种。所述填充剂对葛根异黄酮苷都有较强的吸附性能。所述填充剂中的“硅胶”即有别于“反相硅胶”的“正相硅胶”，“硅胶”为本领域对“正相硅胶”的惯常称呼，“硅胶”与“反相硅胶”并不存在上下位关系。

优选地，步骤（3）中，所述新鲜填充剂的用量为葛根粗提物原料重量的5～8倍。先填装新鲜填充剂，再将拌样填充剂填装于其上的目的是：确保填充柱有足够的高径比，利于目标产品的洗脱和分离。

优选地，步骤（3）中，填装填充剂的层析柱的高径比为2～10:1（更优选4～8:1）。若新鲜填充剂的用量过少或填充柱的高径比过小，都将导致梯度洗脱分离效果不佳；若新鲜填充剂的用量过多或填充柱的高径比过大，都将造成资源的浪费、增加生产的成本。

优选地，步骤（4）中，所述梯度洗脱的流速为0.5～2.0BV/h。

优选地，步骤（4）中，所述梯度洗脱各梯度的洗脱剂依次为：梯度Ⅰ，洗脱剂为体积分数5～15%的低碳醇水溶液，用量为2～5BV；梯度Ⅱ，洗脱剂为体积分数20～40%的低碳醇水溶液，用量为2～5BV；梯度Ⅲ，洗脱剂为体积分数50～70%的低碳醇水溶液，用量为2～5BV。梯度洗脱的目的是：用浓度递增的低碳醇水溶液，将极性不同的多种葛根异黄酮苷选择性的从填充柱中依次洗脱出来。若任意一个梯度的洗脱剂体积分数过低或洗脱剂用量过少，目标成分将难以完全洗脱出来；若任意一个梯度的洗脱剂体积分数过高或洗脱剂用量过多，目标成分以外的成分也将被洗脱出来，从而降低各个成分的收率和含量。

优选地，所述低碳醇为甲醇和/或乙醇。

优选地，步骤（4）中，所述减压浓缩的真空度为-0.07～-0.09MPa，温度为60～80℃，减压浓缩至浓缩液的固含量为25～50%。

优选地，步骤（4）中，所述搅拌析晶的温度为5～10℃，搅拌的速度为20～60 r/min，时间为12～24 h。

本发明方法中，1 BV=1个柱体积。

本发明方法的原理是：染料木苷、大豆苷和葛根素是葛根粗提物中三种最主要的异黄酮苷，三者的物理性质基本相似，但是由于分子结构中羟基的数目和糖苷键的位置不同，三者的极性大小有差异，极性从小到大依次是染料木苷、大豆苷和葛根素。而极性较大的成分在填充剂中有较大的保留值范围，也就是说极性较大的成分用洗脱能力低的低度醇难以将其洗脱，只有提高洗脱剂中醇的浓度才可以洗脱下来。因此，通过逐渐提高洗脱剂中醇的浓度的方法（即梯度洗脱），能够将不同的目标成分按照极性从小到大的顺序依次洗脱下来。当三种异黄酮苷吸附在同一根填充柱上时，用梯度洗脱的方法进行洗脱，浓度最低的醇洗脱下来的是极性最小的染料木苷，浓度适中的醇洗脱下来的是极性适中的大豆苷，浓度最高的醇洗脱下来的是极性最大的葛根素。

本发明方法的有益效果如下：

（1）按照本发明方法所得染料木苷产品中，染料木苷的含量可高达98.7%，收率可高达92%；所得大豆苷产品中，大豆苷的含量可高达98.5%，收率可高达92%；所得葛根素产品中，葛根素的含量可高达99.9%，收率可高达97%；

（2）本发明方法在同时提取多种高纯度、高产量葛根异黄酮苷的同时，操作简单、成本低廉、环境友好、适合工业化生产。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

本发明实施例所使用的葛根粗提物购于安康康元医药科技有限公司，葛根粗提物中染料木苷、大豆苷和葛根素的含量分别为11.8%、15.2%和40.1%；本发明实施例所使用的氧化铝、硅胶、聚酰胺树脂均购于西安蓝晓科技新材料股份有限公司；本发明实施例所使用的原料或化学试剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。

本发明实施例中，采用高效液相色谱外标法检测染料木苷、大豆苷和葛根素的含量。

实施例1

（1）除杂：在50kg葛根粗提物中，加入200kg，0℃的冰水，搅拌60min，离心过滤，得滤饼；

（2）氧化铝拌样：先用25kg乙醇将步骤（1）所得滤饼分散，再加入50kg氧化铝，搅拌均匀，真空干燥，得拌样氧化铝；

（3）氧化铝填装：在层析柱中先加入400kg新鲜氧化铝，再将步骤（2）所得拌样氧化铝填装于其上，氧化铝柱的高径比为5:1；

（4）梯度洗脱：依次用如下梯度的洗脱剂，以流速1BV/h，对步骤（3）氧化铝柱进行梯度洗脱：梯度Ⅰ，洗脱剂为体积分数10%的乙醇水溶液，用量为4BV；梯度Ⅱ，洗脱剂为体积分数20%的乙醇水溶液，用量为4BV；梯度Ⅲ，洗脱剂为体积分数65%的乙醇水溶液，用量为4BV，分别收集梯度Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的洗脱液，分别在真空度-0.08MPa，75℃下，减压浓缩至浓缩液的固含量为40%，降温，在5℃，搅拌速度30r/min下，分别搅拌析晶24h后，离心过滤，真空干燥，分别得5.38kg染料木苷、7.10kg大豆苷和19.24kg葛根素三种葛根异黄酮苷。

经高效液相色谱外标法检测，本发明实施例所得染料木苷产品中，染料木苷含量为98.7%，收率为90%；所得大豆苷产品中，大豆苷含量为98.5%，收率为92%；所得葛根素产品中，葛根素含量为99.9%，收率为96%。

实施例2

（1）除杂：在25kg葛根粗提物中，加入125kg，5℃的冰水，搅拌40min，离心过滤，得滤饼；

（2）硅胶拌样：先用12.5kg甲醇将步骤（1）所得滤饼分散，再加入25kg硅胶，搅拌均匀，真空干燥，得拌样硅胶；

（3）硅胶填装：在层析柱中先加入150kg新鲜硅胶，再将步骤（2）所得拌样硅胶填装于其上，硅胶柱的高径比为6:1；

（4）梯度洗脱：依次用如下梯度的洗脱剂，以流速0.5BV/h，对步骤（3）硅胶柱进行梯度洗脱：梯度Ⅰ，洗脱剂为体积分数15%的甲醇水溶液，用量为3BV；梯度Ⅱ，洗脱剂为体积分数25%的甲醇水溶液，用量为3BV；梯度Ⅲ，洗脱剂为体积分数55%的甲醇水溶液，用量为3BV，分别收集梯度Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的洗脱液，分别在真空度-0.09MPa，65℃下，减压浓缩至浓缩液的固含量为45%，降温，在10℃，搅拌速度20r/min下，分别搅拌析晶18h后，离心过滤，真空干燥，分别得2.77kg染料木苷、3.55kg大豆苷和9.54kg葛根素三种葛根异黄酮苷。

经高效液相色谱外标法检测，本发明实施例所得染料木苷产品中，染料木苷含量为98.0%，收率为92%；所得大豆苷产品中，大豆苷含量为97.3%，收率为91%；所得葛根素产品中，葛根素含量为99.8%，收率为95%。

实施例3

（1）除杂：在20kg葛根粗提物中，加入60kg，5℃的冰水，搅拌30min，离心过滤，得滤饼；

（2）聚酰胺树脂拌样：先用15kg乙醇将步骤（1）所得滤饼分散，再加入30kg聚酰胺树脂，搅拌均匀，真空干燥，得拌样聚酰胺树脂；

（3）聚酰胺树脂填装：在层析柱中先加入100kg新鲜聚酰胺树脂，再将步骤（2）所得拌样聚酰胺树脂填装于其上，聚酰胺树脂柱的高径比为4:1；

（4）梯度洗脱：依次用如下梯度的洗脱剂，以流速1.5BV/h，对步骤（3）聚酰胺树脂柱进行梯度洗脱：梯度Ⅰ，洗脱剂为体积分数15%的乙醇水溶液，用量为4BV；梯度Ⅱ，洗脱剂为体积分数30%的乙醇水溶液，用量为4BV；梯度Ⅲ，洗脱剂为体积分数70%的乙醇水溶液，用量为4BV，分别收集梯度Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的洗脱液，分别在真空度-0.07MPa，70℃下，减压浓缩至浓缩液的固含量为35%，降温，在10℃，搅拌速度40r/min下，分别搅拌析晶12h后，离心过滤，真空干燥，分别得2.19kg染料木苷、2.77kg大豆苷和7.8kg葛根素三种葛根异黄酮苷。

经高效液相色谱外标法检测，本发明实施例所得染料木苷产品中，染料木苷含量为97.1%，收率为90%；所得大豆苷产品中，大豆苷含量为97.5%，收率为89%；所得葛根素产品中，葛根素含量为99.7%，收率为97%。

实施例4

（1）除杂：在10kg葛根粗提物中，加入50kg，2℃的冰水，搅拌45min，离心过滤，得滤饼；

（2）硅藻土拌样：先用10kg甲醇将步骤（1）所得滤饼分散，再加入20kg硅藻土，搅拌均匀，真空干燥，得拌样硅藻土；

（3）硅藻土填装：在层析柱中先加入50kg新鲜硅藻土，再将步骤（2）所得拌样硅藻土填装于其上，硅藻土柱的高径比为6:1；

（4）梯度洗脱：依次用如下梯度的洗脱剂，以流速2.0BV/h，对步骤（3）硅藻土柱进行梯度洗脱：梯度Ⅰ，洗脱剂为体积分数10%的乙醇水溶液，用量为5BV；梯度Ⅱ，洗脱剂为体积分数25%的乙醇水溶液，用量为5BV；梯度Ⅲ，洗脱剂为体积分数68%的乙醇水溶液，用量为5BV，分别收集梯度Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的洗脱液，分别在真空度-0.09MPa，70℃下，减压浓缩至浓缩液的固含量为40%，降温，在5℃，搅拌速度20r/min下，分别搅拌析晶24h后，离心过滤，真空干燥，分别得1.09kg染料木苷、1.37kg大豆苷和3.82kg葛根素三种葛根异黄酮苷。

经高效液相色谱外标法检测，本发明实施例所得染料木苷产品中，染料木苷含量为97.7%，收率为90%；所得大豆苷产品中，大豆苷含量为97.2%，收率为88%；所得葛根素产品中，葛根素含量为99.8%，收率为95%。

Claims (9)

1.一种从葛根粗提物中同时提取多种葛根异黄酮苷的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）除杂：在葛根粗提物中，加入冰水，搅拌，离心过滤，得滤饼；

（2）填充剂拌样：先用低碳醇将步骤（1）所得滤饼分散，再加入填充剂，搅拌均匀，真空干燥，得拌样填充剂；

（3）填充剂填装：在层析柱中先加入新鲜填充剂，再将步骤（2）所得拌样填充剂填装于其上；

（4）梯度洗脱：用浓度递增的洗脱剂对步骤（3）填充剂填装的层析柱进行梯度洗脱，分别收集不同梯度的洗脱液，分别减压浓缩，降温，搅拌析晶，离心过滤，真空干燥，分别得染料木苷、大豆苷和葛根素三种葛根异黄酮苷。

2.根据权利要求1所述从葛根粗提物中同时提取多种葛根异黄酮苷的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述葛根粗提物中，染料木苷的质量含量为5～15%，大豆苷的质量含量为8～20%，葛根素的质量含量为30～60%。

3.根据权利要求1或2所述从葛根粗提物中同时提取多种葛根异黄酮苷的方法，其特征在于：步骤（1）中，所述冰水的用量为葛根粗提物重量的1～5倍；所述冰水的温度为0～10℃；所述搅拌的时间为30～60min。

4.根据权利要求1～3之一所述从葛根粗提物中同时提取多种葛根异黄酮苷的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述低碳醇的用量为葛根粗提物原料重量的0.5～1.0倍；所述低碳醇为甲醇和/或乙醇。

5.根据权利要求1～4之一所述从葛根粗提物中同时提取多种葛根异黄酮苷的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述填充剂的用量为葛根粗提物原料重量的1～2倍；所述填充剂为氧化铝、硅胶、反相硅胶、聚酰胺树脂、大孔吸附树脂、离子交换树脂、葡聚糖凝胶、活性炭或硅藻土中的一种或几种。

6.根据权利要求1～5之一所述从葛根粗提物中同时提取多种葛根异黄酮苷的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述新鲜填充剂的用量为葛根粗提物原料重量的5～8倍；填装填充剂的层析柱的高径比为2～10:1。

7.根据权利要求1～6之一所述从葛根粗提物中同时提取多种葛根异黄酮苷的方法，其特征在于：步骤（4）中，所述梯度洗脱的流速为0.5～2.0BV/h；所述梯度洗脱各梯度的洗脱剂依次为：梯度Ⅰ，洗脱剂为体积分数5～15%的低碳醇水溶液，用量为2～5BV；梯度Ⅱ，洗脱剂为体积分数20～40%的低碳醇水溶液，用量为2～5BV；梯度Ⅲ，洗脱剂为体积分数50～70%的低碳醇水溶液，用量为2～5BV；所述低碳醇为甲醇和/或乙醇。

8.根据权利要求1～7之一所述从葛根粗提物中同时提取多种葛根异黄酮苷的方法，其特征在于：步骤（4）中，所述减压浓缩的真空度为-0.07～-0.09MPa，温度为60～80℃，减压浓缩至浓缩液的固含量为25～50%。

9.根据权利要求1～8之一所述从葛根粗提物中同时提取多种葛根异黄酮苷的方法，其特征在于：步骤（4）中，所述搅拌析晶的温度为5～10℃，搅拌的速度为20～60 r/min，时间为12～24 h。