CN108623548A - 一种分离花生壳中手型圣草酚的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

一种分离花生壳中黄酮类化合物手性圣草酚的方法及其应用，属于植物提取分离药物技术领域。所述的方法步骤如下：花生壳的处理；用乙醇对花生壳粉末回流提取1~3次，得浓缩液；将提取液浓缩，并调节pH，稀释，过大孔树脂柱，水洗脱，乙醇洗脱并收集洗脱液，浓缩，得纯化物；配制醋酸铵，调节体系pH，在配制好的缓冲液中加入MAH‑β‑CD混合、溶解、定容，得运行缓冲液；将纯化物用滤膜过滤，利用毛细管电泳法分离得到R构型体2R‑圣草酚和S构型体的2S‑圣草酚两种圣草酚对映体。本发明的优点是：提高了花生壳的综合利用率，提取分离操作简单、分析时间短、效率高，选择了合适的手性选择剂，分离效率高、手性选择剂用量少、性价比高，分离度达到了4.17。

Description

一种分离花生壳中手型圣草酚的方法及其应用

技术领域

本发明属于植物提取分离药物技术领域，具体涉及一种分离花生壳中黄酮类化合物手性圣草酚的方法及其应用。

背景技术

花生来源于豆科一年生草本植物花生的干燥荚果，花生壳是其荚果的外壳。我国花生壳资源丰富，价格低廉，在医药、工业、农业、保健食品领域有广阔的应用前景。花生壳在民间是中草药，可治疗哮喘、痰多、高血压等。花生壳中的黄酮类成分具有降血压、降血脂、扩张冠状动脉、抗氧化、镇咳、祛痰平喘、抗菌抗炎、增强免疫和抗肿瘤等多种药理活性。研究表明，花生壳中所含的黄酮类化合物与其生理活性密切相关。

比如山东省农业科学院农产品研究所杜方岭等人在发明专利CN201110194346.6中公开了同时检测花生壳中5，7-二羟基色原酮、圣草酚和木犀草素的方法就显示花生壳中富含5，7-二羟基色原酮、圣草酚和木犀草素这三种黄酮类物质，沈阳北苑医药有限公司也在发明专利申请CN201510173099.X中公开了利用提取大孔树脂纯化的方法提取花生壳中的总黄酮，但是花生壳中的黄酮类物质有多种，其中以圣草酚和木犀草素的含量最高，各种黄酮类物质虽然都有增强免疫和抗氧化的功效，但是其具体药用机理和药效却相差很大。

生命是由碳元素组成的，碳原子在形成有机分子的时候，4个原子或基团可以通过4根共价键形成三维的空间结构，形成手性碳原子。由于相连的原子或基团不同，它会形成两种分子结构。这两种分子一般拥有完全一样的物理、化学性质。比如它们的沸点一样，溶解度和光谱也一样。但是从分子的组成形状来看，它们依然是两种分子，圣草酚就是这种具有对映异构体的黄酮类化合物，因为生命体的特殊性，众所周知，绝大多数的药物由手性分子构成，两种手性分子可能具有明显不同的生物活性。药物分子必须与受体（起反应的物质）分子几何结构匹配，才能起到应有的药效，就如右手只能带右手套一样。因此，往往两种异构体中仅有一种是有效的，另一种无效甚至有害，如果能将花生壳中所含有的圣草酚手性异构体进行拆分将能够极大的提高其药效。

但是研究报道很多手性药物对映体的拆分分离方法高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）、薄层色谱法（TLC）、超临界流体色谱法（SFC）等都具有各自的劣势。HPLC与GC所使用的手性柱价格昂贵，且在大多数情况下，一个特定的手性柱只能分析某一类物质，应用往往受限。

发明内容

本发明的目的是为了解决目前没有一种有效拆分花生壳中圣草酚手性对映体的方法的问题，提供一种分离花生壳中手性圣草酚的方法及其应用，具体的是利用毛细管电泳（CE）所具有的分离效率高、分析时间短、手性选择剂种类多、用量少、性价比高等优点，在手性选择剂顺丁烯二酸酐-β-环糊精（MAH-β-CD）的作用下利用CE方法对其进行了成功分离，在圣草酚手性分离领域具有广泛的适用性。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

步骤一：花生壳的处理：去杂、清洗、干燥，粉碎过筛；

步骤二：在花生壳粉末中加入10~20倍重量的40~90wt.%乙醇回流提取，合并提取液；

步骤三：将步骤二的提取液浓缩并使用醋酸调节pH为弱酸性，加去离子水稀释，过大孔树脂柱，水快速洗脱除杂，再加入乙醇洗脱并收集洗脱液，浓缩，即得纯化物；

步骤四：配制pH为8.0~9.0醋酸铵缓冲液，在配制好的缓冲液中加入MAH-β-CD混合、溶解、定容，每次使用前经滤膜过滤掉固体杂质，作为运行缓冲液；

步骤五：将步骤三的纯化物用滤膜过滤，过滤后使用毛细管电泳法进行异构体的拆分，分离电压为20~30kV，运行pH为8.0~9.0的缓冲液，调节冷却系统的实验温度为20~25℃，分别收集R构型体2R-圣草酚和S构型体的2S-圣草酚两种圣草酚对映体。

一种上述方法分离得到的（2S）-圣草酚用于治疗气管炎和心血管疾病的药物。

本发明相对于现有技术的有益效果是：本发明中使用毛细管电泳法分离花生壳中的手性圣草酚，提高了花生壳的综合利用率，使得花生除榨油外有了更多高附加值的利用方案，而且提取分离操作简单，成分分析时间短、效率高，本发明的方法能够同时对花生壳中圣草酚和5，7-二羟基色原酮、木犀草素进行分离，解决了现有的高效液相色谱分离价格昂贵的问题，进一步降低了从植物中提取较强抗氧化性的圣草酚的提取成本，使得花生壳中圣草酚在饮料、食品和酒类作为抗氧化剂的应用更加广泛，本发明选择了合适的手性选择剂，分离效率高、手性选择剂用量少、性价比高，分离度达到了4.17。

附图说明

图1为MAH-β-CD浓度和分离电压对分离度响应面曲线图。

图2为MAH-β-CD浓度和缓冲液pH对分离度响应面曲线图。

图3为分离电压和缓冲液pH对分离度响应面曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修正或等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神范围，均应涵盖在本发明的保护范围之中。

具体实施方式一：本实施方式记载的是一种分离花生壳中手性圣草酚的方法，所述的方法步骤如下：

步骤一：花生壳的处理：去杂、清洗、干燥至表面干燥或表面无明水后，粉碎过40~100目筛；

步骤二：在花生壳粉末中加入10~20倍重量的40~90wt.%乙醇回流提取1~3次，1~2h/次，合并提取液；

步骤三：将步骤二的提取液浓缩并使用醋酸调节pH为弱酸性，加去离子水稀释，过大孔树脂柱，水快速洗脱除杂，再加入60~90wt.%乙醇洗脱并收集洗脱液，浓缩，即得纯化物；

步骤四：配制pH为8.0~9.0醋酸铵缓冲液，在配制好的缓冲液中加入MAH-β-CD混合、溶解、定容，每次使用前经滤膜过滤掉固体杂质，作为运行缓冲液；

步骤五：将步骤三的纯化物用滤膜过滤，过滤后使用毛细管电泳法进行异构体的拆分，分离电压为20~30kV，运行缓冲液pH为8.0~9.0，调节冷却系统的实验温度为20~25℃，分别收集R构型体2R-圣草酚和S构型体的2S-圣草酚两种圣草酚对映体。

具体实施方式二：具体实施方式一所述的一种分离花生壳中手性圣草酚的方法，步骤二中，所述的花生壳粉末中加入15倍重量的60wt.%乙醇回流提取2次，1~2 h/次，合并提取液；步骤三中，将步骤二中的提取液浓缩至原体积的60%，加入醋酸调节pH为5.5，加去离子水稀释2~4倍，过0.10~0.20 g药材/mL树脂柱，水快速洗脱除杂，再加入60~90wt.%乙醇洗脱并收集洗脱液，浓缩到原体积的20~50%，即得纯化物。

具体实施方式三：具体实施方式一所述的一种分离花生壳中手性圣草酚的方法，步骤三中，所述的大孔树脂柱为HPD300、HPD500或D101。

具体实施方式四：具体实施方式一所述的一种分离花生壳中手性圣草酚的方法，步骤四中，所述的MAH-β-CD的合成方法为称取顺丁烯二酸酐溶于二甲基甲酰胺（DMF）中，常温搅拌下加入β-CD，80℃±2℃恒温水浴中反应8~12 h，反应结束后，产物冷却至室温，用三氯甲烷沉淀出产物，丙酮充分洗涤，用抽滤瓶抽干，真空干燥，备用。

具体实施方式五：具体实施方式四所述的一种分离花生壳中手性圣草酚的方法，所述的MAH-β-CD的合成方法为称取5.0 g顺丁烯二酸酐溶于30 mL DMF中，常温搅拌下加入5.6 g β-CD，80 ℃恒温水浴中反应10 h，反应结束后，产物冷却至室温，用30 mL三氯甲烷沉淀出产物，丙酮充分洗涤，用抽滤瓶抽干，80℃真空干燥24 h，备用。

具体实施方式六：具体实施方式一所述的一种分离花生壳中手性圣草酚的方法，步骤五中，所述的毛细管为未涂层熔融石英毛细管柱。

具体实施方式七：具体实施方式六所述的一种分离花生壳中手性圣草酚的方法，所述的未涂层熔融石英毛细管柱经过如下步骤活化：甲醇溶液冲洗10 min；超纯水冲洗10min；0.1mol/L HCl冲洗10min；超纯水冲洗10 min；0.1 mol/L NaOH冲洗一夜；每天实验开始前依次用0.1 mol/L NaOH溶液冲洗10 min、超纯水冲洗10 min，最后用运行缓冲液冲洗20 min，两次电泳运行间用缓冲溶液冲洗5 min。

具体实施方式八：具体实施方式一所述的一种分离花生壳中手性圣草酚的方法，步骤四中，配制20mmol/L醋酸铵缓冲液，通过10mmol/L氨水及醋酸调节体系pH为8.0~9.0，按照缓冲液：MAH-β-CD=1：2的质量比在配置好的缓冲液中加入MAH-β-CD混合、溶解、500mL定容，每次使用前经滤膜过滤掉固体杂质，作为运行缓冲液；步骤五中，所述的毛细管电泳法具体反映条件为：手性选择剂为10~20 mmol/L MAH-β-CD，分离电压25 kV，缓冲溶液pH为8.5，调节冷却系统实验温度为25℃。

具体实施方式九：具体实施方式八所述的一种分离花生壳中手性圣草酚的方法，所述的手性选择剂为15 mmol/L MAH-β-CD。

具体实施方式十：一种具体实施方式一至九任一具体实施方式所述方法分离得到的（2S）-圣草酚用于治疗气管炎和心血管疾病的药物。

实施例1：

一种分离花生壳中手性圣草酚的方法，所述的方法步骤如下：

步骤一：花生壳的处理：去杂、清洗、干燥至水含量为0后，粉碎80目筛；

步骤二：在花生壳粉末中加入15倍重量的40~90wt.%乙醇回流提取2次，1~2h/次，合并提取液；

步骤三：将步骤二的提取液浓缩到原体积的60%并使用醋酸调节pH为弱酸性，加去离子水稀释3倍，过大孔树脂柱，水快速洗脱除杂，再加入60~90wt.%乙醇洗脱并收集洗脱液，浓缩到原体积40%，即得纯化物；

步骤四：配制20 mmol/L醋酸铵缓冲液，通过10 mmol/L氨水及醋酸调节体系pH为8.5，按照缓冲液：MAH-β-CD=1：2的质量比在配制好的缓冲液中加入MAH-β-CD混合、溶解、500mL定容，每次使用前经滤膜过滤，作为运行缓冲液；

步骤五：将步骤三的纯化物用滤膜过滤，过滤后使用毛细管电泳法进行异构体的拆分，分离电压为25kV，运行缓冲液pH为8.5，调节冷却系统的实验温度为20℃，分别收集R构型体2R-圣草酚和S构型体的2S-圣草酚两种圣草酚对映体。

实施例2：

一种分离花生壳中手性圣草酚的方法，步骤四中，所述的MAH-β-CD的合成方法为称取顺丁烯二酸酐溶于二甲基甲酰胺（DMF）中，常温搅拌下加入β-CD，80℃恒温水浴中反应8 h，反应结束后，产物冷却至室温，用三氯甲烷沉淀出产物，丙酮充分洗涤，抽干，真空干燥，备用。

实施例3：

一种分离花生壳中手性圣草酚的方法，所述的MAH-β-CD的合成方法为称取5.0 g顺丁烯二酸酐溶于30 mL DMF中，常温搅拌下加入5.6 g β-CD，82℃恒温水浴中反应12 h，反应结束后，产物冷却至室温，用30 mL三氯甲烷沉淀出产物，丙酮充分洗涤，抽干，80℃真空干燥24 h，备用。

实施例4：

本实施例与实施例1不同之处在于：步骤五中，电泳条件设定为15 mmol/L MAH-β-CD作为手性选择剂，调节冷却系统实验温度为20℃的电泳条件进行拆分，在花生壳粉末大孔树脂纯化中采用HPD500、D101或0.10~0.20g药材/mL树脂，水快速洗脱除杂，再加入60%~90%乙醇洗脱并收集洗脱液，浓缩，即得纯化物。

实施例5：毛细管电泳条件的响应面优化试验

采用Box－Behnken试验设计，探究毛细管电泳条件中手性选择剂浓度、分离电压和缓冲液pH对最终拆分分离度的影响，并建立各因素与分离度的响应面数学模型，响应面试验因素与水平表见表1，Box-bohnken试验设计与结果见表2。

表1：响应面试验因素水平表

表2：Box-bohnken实验设计结果

通过DesignExpert8.0.6对表2的实验数据进行拟合，得到毛细管电泳条件中手性选择剂浓度、分离电压和缓冲液pH对最终拆分分离度的影响响应曲面图，考察所拟合的响应曲面的形状，分析手性选择剂浓度、分离电压和缓冲液pH对毛细管电泳分离的影响，模型中各因素交互作用的响应面参见图1~图3。

Box－Behnken试验优化出毛细管电泳分离的最佳纯化工艺参数为毛细管电泳条件中手性选择剂浓度15 mmol/L MAH-β-CD、分离电压25 kV和缓冲液pH 8.5，在此条件下获得的手性圣草酚分离度最高。

Claims (10)

1.一种分离花生壳中手性圣草酚的方法，其特征在于：所述的方法步骤如下：

步骤一：花生壳的处理：去杂、清洗、干燥，粉碎过筛；

步骤二：在花生壳粉末中加入10~20倍重量的40~90wt.%乙醇回流提取，合并提取液；

步骤三：将步骤二的提取液浓缩并使用醋酸调节pH为弱酸性，加去离子水稀释，过大孔树脂柱，水快速洗脱除杂，再加入乙醇洗脱并收集洗脱液，浓缩，即得纯化物；

步骤四：配制pH为8.0~9.0醋酸铵缓冲液，在配制好的缓冲液中加入MAH-β-CD混合、溶解、定容，每次使用前经滤膜过滤掉固体杂质，作为运行缓冲液；

步骤五：将步骤三的纯化物用滤膜过滤，过滤后使用毛细管电泳法进行异构体的拆分，分离电压为20~30kV，运行pH为8.0~9.0的缓冲液，调节冷却系统的实验温度为20~25℃，分别收集R构型体2R-圣草酚和S构型体的2S-圣草酚两种圣草酚对映体。

2.根据权利要求1所述的一种分离花生壳中手性圣草酚的方法，其特征在于：步骤二中，所述的花生壳粉末中加入15倍重量的60wt.%乙醇回流提取2次，1~2 h/次，合并提取液；步骤三中，将步骤二中的提取液浓缩至原体积的60%，加入醋酸调节pH为5.5，加去离子水稀释2~4倍，过0.10~0.20 g药材/mL树脂柱，水快速洗脱除杂，再加入60~90wt.%乙醇洗脱并收集洗脱液，浓缩到原体积的20~50%，即得纯化物。

3.根据权利要求1所述的一种分离花生壳中手性圣草酚的方法，其特征在于：步骤三中，所述的大孔树脂柱为HPD300、HPD500或D101。

4.根据权利要求1所述的一种分离花生壳中手性圣草酚的方法，其特征在于：步骤四中，所述的MAH-β-CD的合成方法为称取顺丁烯二酸酐溶于二甲基甲酰胺中，常温搅拌下加入β-CD，80℃±2℃恒温水浴中反应8~12 h，反应结束后，产物冷却至室温，用三氯甲烷沉淀出产物，丙酮充分洗涤，抽干，真空干燥，备用。

5.根据权利要求4所述的一种分离花生壳中手性圣草酚的方法，其特征在于：所述的MAH-β-CD的合成方法为称取5.0 g顺丁烯二酸酐溶于30 mL DMF中，常温搅拌下加入5.6 gβ-CD，80 ℃恒温水浴中反应10 h，反应结束后，产物冷却至室温，用30 mL三氯甲烷沉淀出产物，丙酮充分洗涤，抽干，80℃真空干燥24 h，备用。

6.根据权利要求1所述的一种分离花生壳中手性圣草酚的方法，其特征在于：步骤五中，所述的毛细管为未涂层熔融石英毛细管柱。

7.根据权利要求6所述的一种分离花生壳中手性圣草酚的方法，其特征在于：所述的未涂层熔融石英毛细管柱经过如下步骤活化：甲醇溶液冲洗10 min；超纯水冲洗10 min；0.1mol/L HCl冲洗10min；超纯水冲洗10 min；0.1 mol/L NaOH冲洗一夜；每天实验开始前依次用0.1 mol/L NaOH溶液冲洗10 min、超纯水冲洗10 min，最后用运行缓冲液冲洗20min，两次电泳运行间用缓冲溶液冲洗5 min。

8.根据权利要求1所述的一种分离花生壳中手性圣草酚的方法，其特征在于：步骤四中，配制20mmol/L醋酸铵缓冲液，通过10mmol/L氨水及醋酸调节体系pH为8.0~9.0，按照缓冲液：MAH-β-CD=1：2的质量比在配置好的缓冲液中加入MAH-β-CD混合、溶解、定容，每次使用前经滤膜过滤掉固体杂质，作为运行缓冲液；步骤五中，所述的毛细管电泳法具体反映条件为：手性选择剂为10~20 mmol/L MAH-β-CD，分离电压25 kV，缓冲溶液pH为8.5，调节冷却系统实验温度为25℃。

9.根据权利要求8所述的一种分离花生壳中手性圣草酚的方法，其特征在于：所述的手性选择剂为15 mmol/L MAH-β-CD。

10.一种（2S）-圣草酚用于治疗气管炎和心血管疾病的药物。