CN1086221A - 肽化合物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了二肽化合物,两条肽链通过二价桥
基-A-在非末端氨基酸的Cα原子处连在一起。连
到基团-A-上的Cα原子在每一肽链中处于等同位
置,并且每一Cα原子都缺少其天然的α-侧链。基
团-A-如权利要求1所定义。所公开的桥连二肽化
合物对细胞分裂,特别是对骨髓组织生成细胞和骨髓
细胞分裂具有刺激作用。
Description
本发明涉及对细胞繁殖具有刺激作用的肽类的应用,并涉及具有特异和/或一般细胞刺激作用的新的肽类。
哺乳动物体内包含具有各种结构和功能的细胞,其分化和生长的机理已成为众多研究的焦点。已知对于具有连续倒转物的细胞系统,该机理一般包括可分裂并不断向系统提供新细胞的多能干细胞的贮源。而由“贮源”提供的初始的同种干细胞很快变成一种或其他形态,并随后生长为所需功能细胞。
这类干细胞系统的实例有骨髓中的造血系统及上皮与表皮系统。
干细胞分裂的操纵或控制具有重大的治疗潜能,许多研究继续致力于阐明其所包含的机理及所决定的化学信使。到目前为止,已经发现几种生物分子在细胞产生和分化中具有一定作用,它们或者是通过该过程中的刺激作用或者是通过抑制作用步骤。在这方面已经特别地研究了骨髓组织生成,其控制过程中所涉及的分子包括:菌落刺激因子(CSF)如粒细胞菌落刺激因子(G-CSF),巨噬细胞菌落刺激因子(M-CSF),粒细胞-巨噬细胞菌落刺激因子(GM-CSF),多谱系菌落刺激因子(multi-CSF;IL-3)[见Metcalf,Science 229:16(1985)],间白细胞杀菌素11(IL-11)[见Paul等人,Proc Natl Acad Scl USA 87:7521(1990)],乳铁传递蛋白[见Broxmeyer等人,Blood Cells11:429(1986)]前列腺素[见Pelus等人,J.Immunol.140:479(1988)],酸性(H-亚单位)铁蛋白[见Broxmeyer等人,Blood68:1257(1986)],干扰素(α,β和γ)[见Pelus等人,文献同上,及Broxmeyer等人,J.Immunol 131:1300(1983)],肿瘤坏死因子(α和β)[见Broxmeyer等人,J.Immunol 136:4487(1986)],转化生长因子β[见Ottman等人,J.Immunol 140:2661(1988)],及活化素与抑制素[见Broxmeyer等人,Proc.Natl Acad Sci USA 86:779(1989)]。
还发现血调节五肽(PEEDCK)选择性地抑制骨髓组织生成细胞的繁殖[见Paukavits等人,Z.Naturforsch 37:1297(1982)],而且发现相应于一很小的通式的其他肽类在血细胞生成中起着类似的抑制作用[见EP-A-112656和WO 90/02753]。肽单体的氧化生成通过半胱氨酸桥连接的二聚分子,并发现这些二聚分子刺激骨髓组织生成[见Laernm等人,Exp.Hematol 16:274(1988)]。(PEEDCl)2二聚物和其他类似化合物被公开于WO-A-88/03535中。其他二聚肽化合物公开于EP-A-408371中,其中二硫键被连接选择的肽链的碳或碳/硫桥所代替。因此该桥键对水解是相对稳定的,但其本身呈惰性并且不能参与受体-二聚物相互作用。
尽管我们并不希望理论条件的制约。但目前认为这类肽化合物与基质细胞在体内作用,并且基质细胞通过其他可溶因子引起刺激或抑制细胞分裂。因此认为二聚物诱发或促进了刺激细胞调节因子的基质形成,而单体肽类可能或者抑制该过程,或者致使抑制或阻碍细胞分裂的因子产生。因此根据目前的考虑,基质细胞可能分别增大了二聚肽和单体肽的刺激或抑制作用。
仍然需要能够在体内刺激细胞繁殖达到有效程度的二聚肽化合物。在这方面应当注意到,不同程度的刺激作用对某些临床状况比对其他状况可能更为合适,而且特别重要的是对特定类型细胞的选择性刺激作用。
本发明提供肽化合物,它包括两条单链血调节特别是抑制血细胞生成的肽类,此肽类通过碳-碳键或通过末端连接的二价桥基-A-在上述每一肽类的等同位置上的非末端氨基酸的Cα原子处连接在一起,所述的Cα原子缺少天然的α-侧链,其中A为C1-6碳键,它
ⅰ)a)被基团-RA-、-ORA-、-SRA、-NRARA或-COORA或被卤原子如氟、氯、溴或碘单或多取代(其中每个RA独立地代表氢原子或可被单或多羟基化的C1-6烷基、链烷酰基或烷氧基烷基)和/或
b)被一个或多个双重或三重碳碳键隔开,和/或
c)被一个或多个基团-Z-隔开,其中每个Z独立地为-O-、-CO-、
ⅱ)(CH2)y,其中y是1、5或6。
桥基-A-中碳原子的总数优选不超过6。
其中基团RA代表烷基,烷氧基或链烷酰基,这些基团各自可以是直链或支链的。适宜的烷基包括甲基、乙基、2-羟乙基、丙基、丁基、1,3-二羟基丁基、2-甲基-3-羟基丁基和戊基。甲氧基、乙氧基、丙氧基和2-羟基丙氧基是所有适宜的基团RA的烷氧基,而链烷酰基可以是例如甲酰基、乙酰基、丙酰基。
RB为烷基时,烷基碳链可以是直链或支链的,上述RA的那些基团在此也是适宜的。
因此,基团A适宜的骨架结构(可以如上述被进一步取代)包括:
-CH2-
-CH2CH2CH2CH2CH2-
-CH2-CH2CH2CH2CH2CH2-
-HC=CH-
-HC=C=CH-
-CH2-CH=CH-CH2-
-CH2-C≡C-CH2-
-CH2-CH=CH-CH=CH-CH2-
-CH2-CH2-C≡C-CH2-CH2-
-CH2-C≡C-C≡C-CH2-
-CH2-O-CH2-
-CH2-NH-CH2CH2-
-CH2CH2-CO-CH2CH2-
-CH2-CH=CH-CH2-S-CH2-
-CH2-C≡C-CH2-NH-CH2CH2-或
-CH2-CH=CH-CH(COOH)CH2-
具有血调节作用的任何单链肽均适宜作为本发明的被桥连的肽。
用另一种方法表达,本发明提供本发明化合物,其中所述血调节肽链包括下式化合物:
其中Ra代表
R代表
Rf代表
其中n和m独立地代表0或1;
p、q和r独立地代表1或2;
s代表3或4;
R1和R2均为氢原子,或一起代表氧代基;
R3和R4均为氢原子,或一起代表碳-碳键;
R5为氢或酰基;
R6和R7各自独立地代表羟基或氨基,但优选为羟基;
R8代表氢:C2-6烷基;C7-20芳烷基,它们可带有一个或多个羟基、氨基或甲氧基取代基;或代谢不稳定的S-保护基;
R9代表氢或甲基;
R10代表羟基或氨基,氨基酸谷氨酰胺残基或具有N-末端谷氨酰单元的肽的残基)。
上述所有氨基酸残基可以是D或L型。然而优选L-型氨基酸。
当存在N-型保护基R5时,如上所述它可以是具有1-20个碳原子的酰基,例如具有1-5个碳原子的链烷酰基如乙酰基,或具有7-20个碳原子的芳酰基或芳链烷酰基如苯甲酰基或苯乙酰基。
R5也可以是由氨基酸或肽链选举生的酰基。特别地,R5可以是由丝氨酸衍生的酰基,或是由下列氨基酸顺序通过相继除去N-端氨基酸所得到的任意肽衍生的酰基:
Lys-Ile-Ile-His-Glu-Asp-Gly-Tyr-Ser。
式(Ⅰ)整个肽的末端氨基最好被保护起来,例如通过用链烷酰基、芳链烷酰基或芳酰基的酰基化反应。
当R8为C2-6烷基时,它可以是例如乙基、丁基或己基。当R8为芳烷基时,它适宜是芳甲基如苯甲基、二苯甲基或三苯甲基。当R8为代谢不稳定的基团时,它可以是例如具有5至10个碳原子的芳硫基,例如吡啶硫基,或如上定义的酰基。
本发明化合物优选为五肽,即n优选为0。
Ra残基中的环基优选为五员环,即m优选为0。
到目前为止,上述式Ⅰ所定义的任何肽类均具有很低或可以忽略的血调节活性,然而以本发明的桥式它们可以有效刺激细胞繁殖。
由如式Ⅰ所述肽链形成的二聚肽中,链的桥连点优选在Rd。
本发明特别优选的肽化合物是式Ⅱ化合物
其中Ra、Rb、Rc、Re、Rf、A和n均如上所定义,基团-NH-CH-CO-为Rd的衍生形式,它以其缺少天然侧链的方式被连到桥基-A-上。
一个特别优选的式Ⅱ肽化合物是
其中基团A是如上所述的二价桥基。
本发明特别用于刺激病人的骨髓组织生成,这些病人患有骨髓组织生成活性降低的疾病,包括骨髓损伤、粒细胞缺乏症和再生障碍性贫血。该应用包括对由于免疫抑制性治疗而抑制组织反应(例如,在骨髓移植手术中)从而使骨髓机能受到抑制的病人的治疗。
本发明化合物还可以用于对肿瘤和病毒性疾病实施抑制细胞生长的化疗及放疗之后促进骨髓更快的再生。
此外,当病人在骨髓缺乏后因缺乏免疫应答而引起严重感染时,这些新化合物具有特殊的意义。
另一临床应用是与EP-A-112656或WO-A-90/02753所公开的相应单体或相关的骨髓组织生成抑制剂结合使用,从而诱导骨髓细胞中高和低活性的交替峰,这样便扩大了血细胞生成的自然的约24小时的节律。以此方式,抑制细胞生长的治疗可以在低骨髓活性时期进行,这样就减小了骨髓损伤的危险性,而通过接连的活性峰将会促进再生。
通常,为了发挥刺激作用,本发明的肽类可以0.001-100mg的剂量范围给病人口服或通过注射给药,例如每70Kg体得每天1-5mg。如果是静脉内或皮下给药,剂量可以在每70Kg体重每天1-10mg范围内,例如约6mg给药多至十天。当然也可以通过鼻、表面(经皮的)或直肠给药。原则上最好在病人的细胞外中产生约10-13M至10-5M浓度的肽。
本发明的另一方面提供药物组合物,它包括与药物载体或赋形剂结合的一种或多种如前所定义的式(Ⅰ)化合物或其生理上相容的盐。本发明的组合物可以适于口服、鼻、肠胃外或直肠给药的形式提供。
本文所用的术语“药物”包括本发明兽医的应用。
本发明化合物可以给药的常规药物形式提供,如片剂、包衣片剂、鼻喷雾剂、浴液、乳液、粉剂、胶囊剂或持续释放剂型。常规的药物赋形剂以及通常的制备方法可用于制备这些剂型。例如片剂可以通过将一种或多种活性组份与已知的赋形剂混合来制备,例如稀释剂如碳酸钙、磷酸钙或乳糖,崩解剂如玉米淀粉或藻酸,粘合剂如淀粉或明胶,润滑剂如硬脂酸镁或滑石,和/或获得持续释放的试剂如羧聚亚甲基、羧甲基纤维素、乙酸邻苯二甲酸纤维素或聚乙酸乙烯酯。
如果需要片剂可以包括几层。包衣片剂的制备可以通过将以类似于片剂的方法得到的核心用常用于片剂包衣的试剂包覆,例如用聚乙烯吡咯烷酮或紫胶、阿拉伯树胶、滑石、二氧化钛或糖包覆。为了获得持续释放或避免不相容性,核心也可以包括几层。片剂包衣也可以包括几层以便获得持续释放,在此情况下可以使用上述片剂的赋形剂。
也可以使用器官特异性载体体系。
注射浴液可以常规方法制备,如通过加入防腐剂如对羟基苯甲酸盐,或稳定剂如EDTA。然后将浴液充入注射小瓶或安瓿中。
鼻用喷雾剂可以在水溶液中类似地配制,并将其装入含有气雾剂推进剂或带有手动挤压装置的喷雾器中。含有一种或几种活性组份的胶囊可以通过例如将活性组份与惰性载体如乳糖或山梨糖醇混合,并将混合物填充到明胶胶囊中来制备。
合适的栓剂可以通过例如将活性组份或活性组份混合物与为此目的所设想的常用的载体,如天然脂肪或聚乙二醇或其衍生物混合来制备。
含有本发明化合物的剂量单位优选包含0.1-10mg,例如1-5mg式(Ⅰ)的肽或其盐。
因此,本发明提供上述化合物及组合物在细胞分裂刺激作用中的用途。本发明的另一方面是本发明的肽化合物在刺激细胞分裂药物的制备中的用途。具有特殊意义的是对骨髓组织生成和骨髓再生的抑制作用。
本发明的再一个方面是提供刺激细胞分裂,特别是刺激骨髓组织生成的方法,包括给受治疗者施用有效量的如上所定义的化合物或药物组合物。
然而,新肽类的另一主要用途是制备用于免疫学分析方法的物质。然后可以将肽共价连接到合适的高分子载体如清蛋白、聚赖氨酸或聚脯氨酸上,以便将其注射到产生抗体的动物(例如兔子、豚鼠或山羊)体中。也可用于体外免疫接种方法中。通过使用已知的吸收方法用高分子载体获得高特异性抗血清。通过向肽分子引入放射性(3H、125I、14C、35S)可以设计放射免疫试验并用于测定在不同的生物液如血清(血浆)、尿和脑脊髓液中的肽。
本发明的肽类可以任何适宜的方法合成。用以形成氨基酸单元的合适的方法被描述于例如由Robert M.Williams所著的“旋光性α-氨基酸的合成(Synthesis of Optically Active α-Amino Acids)”(Pergamon Press,1989)一书中。通常,存在的反应性侧链基(氨基、硫羟基和/或羧基)在一般合成的偶联反应过程中将被保护起来,但在整个合成方法中可能使某些侧链基不被保护(羟基、咪唑基、伯酰胺基、在环氨基酸象pyroGlu中的酰胺基)。
因此最后一步是使完全保护或部分保护的通式Ⅰ的肽衍生物去保护,而这些方法构成了本发明的另一方面。
Schoellkopt等人已经描述了通过双内酰亚胺醚的金属取代及随后的烷基化反应制备各种氨基酸(例如参见Tetrahedron 39:2085(1983)和Topics Curr.Chem.109:65(1983)。已经证明对此方法的改变可特别用于制备构成本发明基础的桥连氨基酸。特别地,由缬氨酸-甘氨酸二肽衍生的双内酰亚胺醚是桥键形成反应的有用的起始化合物,可以总结如下:
(其中X是离去基团如卤素,例如溴)。
如果初始用D-缬氨酸制备双内酰亚胺醚,则通过该方法可以制备桥连(S,S)-α,α′-二氨基酸。同样,通过用L-缬氨酸可以制备(R,R)-α,α′-二氨基酸。
可用于制备构成本发明桥连二肽化合物基础的桥连-α,α′-二氨基酸的另一方法是对Vederas等人提出的方法(报道于J.Am.Chem.Soc.107:7105(1985)和J.Am.Chem.Soc.110:2237(1988))的改变。此方法取决于由丝氨酸衍生的β-内酯的开环反应。β-内酯可以与许多“软”亲核试剂反应,这些亲核试剂引起内酯烷氧键的断裂。氮杂取代的桥连氨基酸(包括氧杂和硫杂铜系物)可通过该方法制备,通过下列反应图解说明该方法:
对于本发明的桥连二肽化合物(其中-A-为-CH2-),参考文献是Belokon等人,Izv.Akad.Nauk.SSSR.Ser Khim,(1987),852(CA.108:132255V)。
因此,本发明还提供制备肽化合物的方法,包括将其部分或完全保护的衍生物去保护。
另一方面,本发明进一步提供制备肽化合物的方法,所述方法包括
a)将双内酰亚胺醚金属取代并接着烷基化,生成双内酰亚胺二肽醚;
b)将步骤(a)的双内酰亚胺二肽醚水解,生成桥连α,α′-二氨基酸;
c)在肽链中引入其余的氨基酸;
d)将被保护的基团去保护
通过这种方法制备的双内酰亚胺二肽醚和桥连酸α,α′二氨基酸构成了本发明的另一方面。
当桥连二肽已经形成,则肽链中的其余氨基酸可以用常规方法引入。
在形成肽链过程中,原则上可以或在C-端或在N-端开始,不过常用的只有C-端起始方法。
因此,可以在C-端开始,通过适当保护的如赖氨酸衍生物与适当保护的半胱氨酸衍生物反应。赖氨酸衍生物具有激离α-氨基,而另一反应物具有或游离或活化的羧基及保护的氨基。偶联后,中间体可以通过如色谱法纯化,然后选择性地进行N-去保护,以便加入另-N-保护的及游离或活化的氨基酸残基。继续该方法直到完成所需氨基酸顺序。
可使用的活化羧酸的取代基包括对称或混合酸酐、或活化的酯,例如对硝基苄酯、2,4,5-三氯苯酯、N-羟基苯并三唑酯(OBt)、N-羟基琥珀酰亚胺基酯(OSu)或五氟苯酯(OPFP)。
游离氨基和羧基的偶联可以使用如二环己基碳二亚胺(DCC)来进行。可以使用的另一偶合剂是如N-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉(EEDQ)。
通常偶联反应适宜在低温,例如-20℃至室温下进行,并适宜在合适的溶剂体系,例如四氢呋喃、二噁烷、二甲基甲酰胺、二氯甲烷或这些溶剂的混合物中进行。
该合成反应更适宜在固相树脂载体上进行。氯甲基化聚苯乙烯(与1%二乙烯基苯交联)是一类有用的载体;在此情况下合成在C-端开始,例如通过将N-保护的赖氨酸偶联到载体上。
下列文献描述了许多适宜的固相方法:Eric Atherton,Christopher J.Logan和Robert C.Sheppard,J.Chem.Soc.Perkin I,538-46(1981);James P.Tam,Foe S.Tjoeng和R.B.Merrifield,J.Am.Chem.Soc.102,6117-27(1980);James P.Tam,Richard D.Dimarchi和R.B.Merrifield,Imt.J.Peptide Protein Res 16,412-25(1980);Manfred Mutter和Dieter Bellof,Helvetica Chimica Acta 67,2009-16(1984)。
这类偶合反应也可以在溶液中进行。
各种氨基酸保护基都是已知的,并被举例说明于下列文献中:Schrǒder,E.,和Lübke,K.,The Peptides,Vols.1和2,Academic Press,New York和London,1965和1966;Pettit,G.R.,Synthetic Peptides,Vols.1-4,Van Nostrand,Reinhold,New York 1970,1971,1975和1976;Houben-Weyl,Methoden der Organischen Chemie,Synthese von Peptiden,Band 15,Georg Thieme Verlag Stuttgart,NY,1983;The Peptides,Analysis,synthesis,biology 1-7,Ed:Erhard Gross,Johannes Meienhofer,Academic Press,NY,San Fransisco,London;Solid phase peptide synthesis 2nd ed.,John M.Stewart,Janis D.Young,Pierce Chemical Company.
因此,可以使用的胺保护基包括保护基如苄酯基(Z-)、叔丁氧羰基(Boc-)、4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺酰基(Mtr-)、和9-芴基甲氧羰基(Fmoc-)。应当认识到,当肽由C-端形成时,胺保护基将存在于所加的每个新残基的α-氨基上,并且在下一偶联步骤之前必须将其选择性地除去。对于固相体系来说,对这种暂时的胺保护作用特别有用的基团是Fmoc基,可以通过在有机溶剂中用哌啶处理而将Fmoc基选择性地除去。对于溶液中的合成,Boc-是优选的保护基,可以按常规方法将其引入并除去。
氨基酸或肽在被保护(如加入Fmoc)之前常常需要甲硅烷基化,以便改善其在有机溶剂中的溶解性。甲硅烷基化和Fmoc保护反应被总结如下:
所使用的羧基保护基包括容易裂解的酯基,如苄基(-OBZL)、对硝基苄基(-ONB)或叔丁基(tOBu)以及在固体载体上的偶联基,例如连于聚苯乙烯上的甲基。
硫羟基保护基包括对甲氧基苄基(Mob)、三苯甲游基(Trt)和乙酰氨基甲基(Acm)。
应当认识到,还存在各种其他的这类基团,正如在上述参考文献中所详述的,而且在上述方法中所有这类基团的使用均包含在本发明范围之内。
有各种方法除去胺和羧基保护基。然而,它们必须与所用的合成策略相一致。侧链保护基对在下一偶联步骤之前用于除去暂时的α-氨基保护基的反应条件必须是稳定的。
胺保护基如Boc和羧基保护基如tOBu可以通过酸处理,如用三氟乙酸处理而同时除去。硫羟基保护基如Trt可以用氧化剂如碘选择性地除去。
含半胱氨酸的肽可以通过本文所述方法来合成,在最后的合成步骤中除去所有的保护基,包括硫羟基保护基。
给出的下列实施例仅是举例说明。
实施例1
(S,S)-2,7-双(9-芴基甲氧羰基氨基)-(E)-辛-4-烯-1,8-二酸
a)1,4-双((2R5S)-2,5-二氢-3,6-二甲氧基-2-异丙基-5-吡嗪基)-(E)-丁-2-烯
在-78℃下,向搅拌着的(2R)-2,5-二氢-3,6-二甲氧基异丙基吡嗪(5.53g,30mmol)的THF(100ml)溶液中通过注射管加入1.55M丁基锂(19.62ml,31mmol)的己烷溶液,在-78℃继续搅拌1小时。然后加入(E)-1,4-二溴丁-2-烯(3.21g;15mmol)的THF(20ml)溶液,并继续搅拌过夜。减压除去溶剂,将残余物溶于乙醚中并用水萃取。有机层用硫酸镁干燥,蒸发乙醚,残余物通过快速色谱(乙酸乙酯/己烷1/4;硅胶)纯化。
产量4.73g(75%),浅黄色液体。
1H NMR(CDCl3):δ0.67(d,6H),1.04(d,6H),2.1-2.4(m,2H),2.48(dd,4H),3.67(s,6H),3.68(s,6H),3.93(dd,2H),4.03(dd,2H),5.35(dd,2H).
13C NMR(CDCl3):δ16.52,19.07,31.65,37.09,52.16,52.23,55.62,60.60,127.50
C22H35N4O4(420)计算值:C:62.86;H:8.57 N:13.33
实测值:C:62.65;H:8.62 N:12.91
b)(S,S)-2,7-二氨基-(E)-辛-4-烯-1,8-二酸二甲酯
向1,4-双((2R,5S)-2,5-二氢-3,6-二甲氧基-2-异丙基-5-吡嗪基)-(E)-丁-2-烯(4.02g,9.9mmol)和0.5NHCl(40ml,20mmol)的混合物中加入40ml二噁烷,将溶液在室温下搅拌4小时。然后用乙醚萃取,向水溶液中加入氨水直到pH达到9。在后用氯仿萃取水相,有机层用硫酸镁干燥。除去溶剂后,通过球形管蒸馏(30-40℃,0.04mbar)除去缬氨酸甲酯。未蒸馏的标题化合物不用进一步纯化而被使用。
产率1.92g(84.3%);黄色油状物。
1H NMR(CDCl3):δ1.70(s,4H),2.20-2.60(m,4H),3.51(dd,2H),3.69(s,6H),5.46(dd,2H).
13C NMR(CDCl3):δ37.99,52.00,54.11,128.84,175.32
c)(S,S)-2,7-二氨基-(E)-辛-4-烯-1,8-二酸二盐酸盐
将(S,S)-2,7-二氨基-(E)-辛-4-烯-1,8-二酸二甲酯(1.65g,7.17mmol)与6N HCl(10ml,60mmol)加热回流2小时。然后蒸出溶剂,残余物溶于水(10ml)并加入乙醇(100ml)。滤出白色晶体并于40℃下真空干燥。
产量1.32g(67%);白色晶体
1H NMR(D2O):δ2.53(dd,4H),3.93(dd,2H),5.49(dd,2H).
13C NMR(D2O):δ33.57,53.07,128.49,171.49
C8H16N2O4Cl2(275)计算值:C:34.91;H:5.81;N:10.18;Cl:25.78
实测值:C:36.58;H:5.80;N:9.70;Cl:26.01
FAB-MS峰 m/z405.3(11),203.2(100),157.1(19),130.1(7),93.0(18),73.9(13).
d)(S,S)-2,7-双(9-芴基甲氧羰基氨基)-(E)-辛-4-烯-1,8-二酸
将酸性盐酸化物(S,S)-2,7-二氨基-E-辛-4-烯-1,8-二酸二盐酸盐(1.59g,5.8mmol)悬浮于六甲基二硅氮烷(20ml)中,加入1ml氯化三甲基甲硅烷。然后将悬浮液回流过夜。减压除去溶剂,残余物溶于无水二氯甲烷中。将此溶液冷却到0℃并加入9-芴基甲基氯甲酸酯(3.10g,12mmol)的二氯甲烷溶液。溶液搅拌1小时,然后撤去冷却浴。次日早晨蒸出溶剂,残余物溶于THF中。然后用1N HCl水溶液使混合物聚冷,将溶液搅拌2小时。除去有机溶剂,水相用氯仿萃取。有机层经硫酸镁干燥并蒸发。将残余物溶于二氯甲烷中并用乙醚沉淀。
产量2.50g(67%);白色晶体。
1H NMR(DMSO):δ2.2-2.4(s,4H),3.6(s,2H),3.9-4.5(m,8H),5.55(s,2H),7.2-8.1(m,16H)
13C NMR(DMSO):δ33.98,46.56,53.93,65.49,119.66,124.81,126.61,127.17,127.98,140.19,143.28,155.43,172.59
C38H34N2O8(646)计算值:C:70.59;H:5.26;N:4.33
实测值:C:70.17;H:5.58;N:4.08
FAB-MS峰 m/z 661.3(3),647.4(3),191.2(17),179.2(100),165.1(18),78.9(31).
实施例2
(S,S)-2,7-双(9-芴基甲氧羰基氨基)-(Z)-辛-4-烯-1,8-二酸
a)1,4-双((2R,5S)-2,5-二氢-3,6-二甲氧基-2-异丙基-5-吡嗪基)-(Z)-丁-2-烯
将(2R)-(-)-2,5-二氢-3,6-二甲氧基-2-异丙基吡嗪(1.3ml,6.4mmol)溶于无水THF(20ml)中,冷却到-78℃。滴加BuLi(1.6M己烷溶液,8.9ml,6.4mmol),溶渡搅拌30分钟。将顺-1,4-二氯-2-丁烯(0.32ml,3mmol)溶于无水THF(10ml)中,并在-78℃下一次加入。反应混合物在N2气氛下搅拌过夜。用氯化铵(3ml)使反应停止,蒸发。残余物用乙醚萃取,有机相同用水洗涤两次。然后经MgSO4干燥并蒸发。通过硅胶进行纯化(庚烷∶EtOAc/2∶1)。
产量:0.81g(60%),浅黄色油状物。
TLC(庚烷∶EtOAc/2∶1)∶Rf=0.39
HPLC(50-100%MeOH,10分钟):Rt=6.75分钟。
1HNMR(CDCl3):δ0.66(d,6H),1.02(d,6H),2.55(m,2H),2.66(m,4H),3.66(s,6H),3.70(s,6H),3.90(t,2H),4.01(m,2H),5.39(t,2H)
b)(S,S)-2,7-二氨基-(Z)-辛-4-烯-1,8-二酸二甲酯
将1,4-双((2R,5S)-2,5-二氢-3,6-二甲氧基-2-异丙基-5-吡嗪基)-(Z)-丁-2-烯(0.5g,1.23mmol)溶于二噁烷(8ml)中,加入0.25M HCl(8ml,2.5mmol)并在室温下搅拌过夜。TLC(MeCN∶MeOH∶H2O/4∶1∶1)。溶液用乙醚萃取,将水相蒸发。残余物溶于少量水中。加入氨水溶液直至pH达到9。水相用乙醚萃取两次,有机相经MgSO4干燥并蒸发。
产量:0.6g,黄色油状物。
c)(S,S)-2,7-二氨基-(Z)-辛-4-烯-1,8-二酸二盐酸盐
向(S,S)-2,7-二氨基-(Z)-辛-4-烯-1,8-二酸二甲酯(0.6g,1.3mmol)和浓HCl(1ml)混合物中加入二噁烷(10ml),溶液回流2小时,然后蒸发。
产量:0.6g,白色固体。
1H NMR(D2O):δ0.88(2d,6H),2.15(m,1H),2.57(2d,4H),3.68(m,1H),3.68(m,2H),5.51(m,2H)。
d)(S,S)-2,7-双(9-芴基甲氧羰基氨基)-(Z)-辛-4-烯-1,8-二酸
将由步骤(c)得到的酸性盐酸化物(0.6g,2.2mmol)悬浮于六甲基二硅氮烷(12ml)和氯化三甲基甲硅烷(12ml)中。悬浮液在氮气氛下回流过夜。真空蒸除过量HMDS和TMS-Cl。残余物溶于无水二氯甲烷中并冷却到0℃。加入芴甲基氯甲酸酯(712mg,2.8mmol)的无水二氧甲烷溶液,将混合物搅拌2小时然后蒸发。残余物溶于THF中,用1M HCl聚冷并搅拌2小时。除去有机溶剂,水相用氯仿萃取。有机层经MgSO4干燥并蒸发。通过硅胶进行纯化验(庚烷∶EtOAc∶AcOH/3∶6∶1)。
HPLC(40-70%MeCN在0.1%TFA中,10分钟)∶Rt=4.75分钟。
1H NMR(CDCl3):δ2.4-2.7(s,4H),3.7(s,2H),4.0-4.5(m,8H),5.5(s,2H),7.1-7.8(m,16H)。
实施例3
(S,S)-2,7-双(9-芴基甲氧羰基氨基)-辛-4-炔-1,8-二酸
a)1,4-双((2R,5S)-2,5-二氢-3,6-二甲氧基-2-异丙基-5-吡嗪基)-丁-2-炔
将(2R)-(-)-2,5-二氢-3,6-二甲氧基-2-异丙基吡嗪2.76g(15mmol)溶于100ml无水THF中并冷却到-78℃,然后搅拌下滴加9.5ml 1.6M BuLi(15mmol)溶液。1小时后缓慢引入0.92g(7.5mmol)1,4-二氯-2,3-丁炔。1小时后反应混合物的TLC和气相色谱(GC)显示出有大量未反应的2,5-二氢-3,6-二甲氧基-2-异丙基吡嗪和单烷基化产物。使反应继续进行过夜并逐渐达到室温。减压蒸除THF,残余物在乙醚和水之间分配。水相用乙醚萃取两次,干燥(MgSO4)并蒸发。对反应混合物进行Kugelrohr蒸馏,得到2.3g(77%)纯产物。
1H NMR(CDCl3):δ4.03(m,4H,ring H′S);3.68(m,12H,4x OCH3),2.63(br.AB q,4H,2 x CH2),2.27(m,2H,2 x CH(CH3)2),1.05(d,J=6.8Hz,6H,2 x CH3);0.64(d,J=6.8Hz,6H,2 x CH3).
13C NMR(CDCl3):δ163.9,161.0,77.4,60.6(60.68),54.6(54.2),52.3,52.2,31.6(31.20),25.5(25.6),19.3(19.5),16.7(16.9).
MS(CI)419(M++,55),403(4),391(7),279(15),236(17),183(44),167(34),149(100),141(41),113(44).
b)(S,S)-2,7-二氨基-辛-4-炔-1,8-二酸二甲酯
向步骤(a)的产物中加入20ml 1.0M HCl和60ml MeOH,得到0.25M HCl(在(H2O/MeOH中)。反应混合物在室温搅拌过夜,测定后表明没有起始原料留存,除去所有溶剂。残余物溶于水,用乙醚萃取并用浓NH4OH中和水相至pH8。溶液用乙醚洗涤,用EtOAc萃取数次直到所有产物均已被EtOAc相吸收。然后干燥,除去溶剂,通过Kugelrohr蒸馏从混合物分离出缬氨酸甲酯,得到0.97g(78%)甲酯标题化合物。
1H NMR(D2O):δ4.0(m,2H,HC-α),3.6(d,6H,2xOCH3)、2.6(m,4H,2xCH2)。
13C NMR(D2O):δ171,81.6,61.6,56.6,20.5。
c)(S,S)-2,7-二氨基-辛-4-炔-1,8-二酸
以足够的MeOH溶解步骤(b)产物并与20ml 6M HCl混合,在室温下搅拌过夜。TLC用1∶1∶1∶1/nBuOH∶EtOAc∶MeOH∶H2O混合物与水合茚三酮喷雾表明存在甲酯。反应混合物在60℃回流24小时直到所有的甲酯均被水解。将溶液蒸发至干,残余物在高真空下干燥,不用进一步纯化便可使用。
13C NMR(D2O):δ172.3,81.1,55.0,24.3。
d)(S,S)-2,7-双(9-芴基甲氧基氨基)-辛-4-炔-1,8-二酸
将50ml HMDS和1ml TMS Cl加到上面的产物中,混合物在120℃氮气氛下回流直至24小时后得到澄清溶液。然后蒸除过量HMDS,将所得产物溶于50ml无水CH2Cl2中并冷却至0℃。搅拌下缓慢加入溶于20ml无水CH2Cl2中的3gFMOC-Cl,将反应混合物放置过夜。减压除去溶剂,产物在饱和NaHCO3水溶液和乙醚之间分配以除去未反应的FMOC-Cl和其他FMOC分解产物。将水溶液冷却到0℃,用2M HCl酸化至pH3,产物用EtOAc萃取多达5次,然手洗涤、干燥并蒸发。用CHCl3∶MeOH/96∶4进行色谱纯化得到2.35g(66%)标题化合物。尽管TLC显示其为纯产物,但反相HPLC却表明存在与主产物峰几乎同时出现的杂质。通过制备性HPLC纯化在含0.1%TFA的40%MeCN中的产物,用Beckman ODS C-18柱,以0.1%TFA水溶液、然后是0.1%TFA MeCN溶液作洗脱液。
1H NMR(DMSO):δ7.9(d,J7.3Hz,4H,arom.H),7.7(d,J=7Hz,4H,arom.H),7.3(d triplet,J7.2Hz,8H,arom.H),4.26(m,8H,OCH2,2 x CH),2.5(m,4H,CH2).
13C NMR(DMSO):δ170.4,154.5,142.5,139.4,126.5,125.9,124.2,119.0,77.6,65.5,53.0,46.5,21.7.
实施例4
(S,S)-2,4-双(9-芴基甲氧羰基氨基)-(E)-戊烷-1,5-二酸
a)1,1-二((2R,5S)-2,5-二氢-3,6-二甲氧基-2-异丙基-5-吡嗪基)-(E)-甲烷
在-78℃下,向搅拌着的(2R)-2,5-二氢-3,6-二甲氧基异丙基吡嗪(5.53g,30mmol)的THF(100ml)溶液中通过注射管加入1.55M丁基锂(19.62ml,31mmol)的己烷溶液,在-78℃继续搅拌1小时。然后加入(E)溴氯甲烷(15mmol)的THF(20ml)溶液,并继续搅拌过夜。减压除去溶剂,将残余物溶于乙醚中并用水萃取。有机层经硫酸镁干燥,蒸发乙醚,残余物通过快速色谱纯化(乙酸乙酯/己烷1/4;硅胶)。
b)(S,S)-2,4-二氨基-(E)-戊烷-1,5-二酸二甲酯
向1,1-二((2R,5S)-2,5-二氢-3,6-二甲氧基-2-异丙基-5-吡嗪基)-(E)甲烷(4.02g,9.9mmol)和0.5NHCl(40ml,20mmol)的混合物中加入40ml二恶烷,溶液在室温下搅拌4小时。然后用乙醚萃取,向水溶液中加入氨水直到pH为9。然后用氯仿萃取水相,有机层经硫酸镁干燥。除去溶剂后,通过球形管蒸馏(30-40℃,0.04mbar)除去缬氨酸甲酯。未蒸馏的标题化合物不用进一步纯化便可使用。
c)(S,S)-2,4-二氨基-(E)-戊烷-1,5-二酸二盐酸盐
将(S,S)-2,4-二氨基-(E)-戊烷-1,5-二酸二甲酯(1.65g,7.17mmol)与6NHCl(10ml,60mmol)加热回流2小时。然后蒸发溶剂,残余物溶于水(10ml)并加入乙醇(100ml)。滤出白色晶体,在40℃下真空干燥。
d)(S,S)-2,4-双(9-芴基甲氧羰基氨基)-(E)-戊烷-1,5-二酸
将酸性盐酸化物(S,S)-2,4-二氨基-(E)-戊烷-1,5-二酸二盐酸盐(1.59g,5.8mmol)悬浮于六甲基二硅氮烷(20ml)中,加入1ml氯化三甲基甲硅烷。然后将悬浮液回流过夜。减压除去溶剂,残余物溶于无水二氯甲烷中。将该溶液冷却到0℃,加入9-芴基甲基氯甲酸酯3.10g,12mmol)的二氯甲烷溶液。将溶液搅拌1小时,然后撤去冷却溶。次日早晨蒸出溶剂,残余物溶于THF。然后用1N HCl水溶液使混合物骤冷,溶液搅拌2小时。除去有机溶剂,水相用氯仿萃取。有机层经硫酸镁干燥并蒸发。残余物溶于二氯甲烷中用乙醚使其沉淀。
实施例5
(S,S)-2,9-二氨基癸二酸
a)1,6-双[(2R,5S)-3,6-二甲氧基-2-异丙基-2,5-二氢-5-吡嗪基]己烷
将(R)-2,5-二氢-3,6-二甲氧基-2-异丙基吡嗪(4.12g,22.4mmol)溶于无水THF中并使溶液冷却到-78℃。加入BuLi己烷溶液(22.4mmol,14.0ml)。30分钟后在-78℃滴加1,6-二溴己烷(11.2mmol,2.73g)的THF溶液,使溶液达到室温过夜。用磷酸盐缓冲液(pH=7)水解后,将混合物用乙醚萃取,有机层用水和盐水洗涤。干燥(MgSO4)后蒸发溶剂,残余物通过快速色谱纯化(己烷/乙酸乙酯9/1)。产量:2.57g(51%)。
1H NMR(CDCl3)δ:0.67(d,6H),1.04(d,6H),1.10-1.30(m,8H),1.60-1.85(m,4H),2.15-2.35(m,2H),3.66(s,6H),3.67(s,6H),3.91(dd,2H),3.95-4.05(m,2H).13C NMR(CDCl3)δ:16.54,19.08,24.44,29.46,31.63,34.15,52.27,52.28,55.47,60.68,163.41,163.96.
FAB-MS峰 m/z 451.2(80),407.2(33),141.0(100).
b)S,S-2,9-二氨基癸二酸二甲酯(3c)
将在40ml二噁烷中的1,6-双[(2R,5S)-3,6-二甲氧基-2-异丙基-2,5-二氢-5-吡嗪基]己烷(2.57g,5.71mmol)和在36ml水中的22.8mmol HCl(1.90ml)的溶液在室温搅拌6小时,除去溶剂,溶液用乙醚萃取。加入氨水溶液直到pH为9,溶液用氯仿萃取。将有机层干燥(MgSO4)。真空蒸馏(0.03torr,室温)出缬氨酸甲酯。
产量:1.48g(100%)。
1H NMR(CDCl3)δ:1.20-1.70(m,16H),3.36(dd,2H),3.65(s,6H).13C NMR(CDCl3)δ:25.40,29.06,34.77,51.76,54.30,176.51.
c)(S,S)-2,9-二氨基癸二酸二盐酸盐
将(S,S)-2,9-二氨基癸二酸二甲酯(1.40g,5.38mmol)溶于6N HCl(40ml,240mmol)中,在N2气氛下于60℃搅拌12小时。蒸发溶剂,残余物溶于EtOH中,加入EtOEt使其结晶。滤出晶体。
产量:0.700g,白色晶体(42.7%)。
1H NMR(D2O)δ:1.07-1.37(m,8H),1.60-1.90(m,4H),3.85(m,2H).13C NMR(D2O)δ:23.81,27.65,29.61,53.09,172.55.
FAB-MS 峰 m/z 439.3(15),340.3(100),233.2(11).
C10H22N2Cl2O4(450):计算值:N,9.18.
实测值:N,9.13.
d)(S,S)-2,9-双(9-芴基氧羰基氨基)癸二酸将(S,S)-2,6-二氨基癸二酸二盐酸盐(0.50g,1.64mmol)悬浮于HMDS和TMSCl中,氮气氛下回流过夜。除去溶剂,将残余物溶于无水CH2Cl2中。溶液冷却到0℃,加入Fmoccl(1.69g,6.56mmol)的CH2Cl2溶液。将溶液搅拌过夜,除去溶剂,残余物溶于THF。加入5ml 0.5M HCl后,将混合物搅拌2小时,用氯仿萃取并干燥(MgSO4)。残余物通过快速色谱纯化(庚烷/乙酸乙酯/乙酸4/6/1)。
产量:0.580g(52.5%)。
1H(DMSO)δ:1.00-1.44(m,8H),1.44-1.80(m,4H),3.90(s,2H),4.13-4.43(m,4H),7.25-8.05(m,16H)13C(DMSO)δ:21.29,25.63,28.62,31.08,46.86,54.17;65.70,120.25,125.44,127.20,127.77,140.86,143.96,144.04,156.21,174.28
FAB-MS峰m/z699.5(6),677.4(2),603.6(4),409.3(4),339.3(4),179.1(66),72.9(100).
实施例6
(S,S)-2,8-二氨基壬二酸
a)1,5-双[(2R,5S)-3,6-二甲氧基-2-异丙基-2,5-二氢-5-吡嗪基]戊烷
向(R)-2,5-二氢-3,6-二甲氧基-2-异丙基吡嗪(3.68g,20mmol)的THF(68ml)溶液中滴加1.6M n-BuLi的己烷溶液(12.8ml,20.4mmol)(10分钟),在-78℃继续搅拌1小时。然后滴加1,5-二溴戊烷(2.3g,10mmol)的THF(13.2ml)溶液,使混合物恢复到室温过夜。加入50ml NaHCO3使反应停止,混合物用乙醚(50ml)和水(20ml)稀释。分出水层后用乙醚(50ml)萃取两次,将合并的有机层干燥(MgSO4),过滤,浓缩,通过快速色谱纯化(硅胶,己烷∶乙酸乙酯=12∶1)。
产量3.68g(8.43mmol,84.3%)。
1H-NMR(300 MHz,CDCl3):δ=4.02(q,2H,J=2.1Hz),3.92(t,2H,J=3.3Hz),3.68(s,12H),2.28(d sept,2H,J=3.3,6.8Hz),1.71(m,4H),1.21(m,6H),1.05(d,6H,J=6.8),0.68(d,6H,J=6.8);13C-NMR(75 MHz,CDCl3):δ=163.89,163.31,60.62,55.40,52.22,52.19,34.02,34.56,29.31,24.33,19.01,16.48.
FAB-MS m/z 437(M+1).
C23H40N4O4(436.59)计算值:C,63.28;H,9.23;N,12.83.
实测值:C,62.95;H,9.01;N,12.91.
b)(S,S)-2,8-二氨基壬二酸二甲酯
将1,5-双[(2R,5S)-3,6-二甲氧基-2-异丙基-2,5-二氢-5-吡嗪基]戊烷(2.8g,6.4mmol)溶于二恶烷(51.2ml)和0.5M HCl(51.2ml)中,室温下搅拌4小时。该混合物用乙醚(100ml)洗涤,加入25%氨水使pH达到9,用CHCl3(3×75ml)快速萃取。有机层用MgSO4干燥、过滤并浓缩。通过Kugelrohr蒸馏(25-50℃,0.01torr)除去缬氨酸甲酯,产量1.505g(0.11mmol,95.5%)。
1H NMR(300 MHz,CDCl3):δ=3.71(s,6H),3.43(t,2H,J=6.0Hz),1.70(m,2H),1.57-1.34(m,8H);13C NMR(75 MHz,CDCl3):δ=176.40,54.33,51.86,34.79,29.08,25.42.
c)(S,S)-2,8-二氨基壬二酸
将步骤(b)的酯在6M HCl(7.2ml)中N2气氛下回流2小时。蒸发挥发性化合物。残余物溶于水(5ml),加入乙醇(20ml),缓慢加入乙醚产生白色晶状沉淀。将该混合物在冷冻箱内保持12小时,过滤,用乙醚洗涤,真空干燥。
产量1.37g(4.71mmol,77.4%)。
1H NMR(300 MHz,CDCl3):δ=3.74(m,2H),1.80-1.63(m,4H),1.38-1.15(m,6H);13C NMR(75 MHz,CDCl3):δ=173.35,53.62,29.71,27.65,23.65.
FAB-MS m/z(M+-72).
C9H20Cl12N2O4(291.17).计算值:C,37.13;H,6.92.
实测值:C,37.90;H,7.21.
d)(S,S)-2,8-双(9-芴基甲氧羰基氨基)壬二酸
将(S,S)-2,8-二氨基壬二酸(291mg,1mmol)在TMSCl(260mg,2.4mmol)和HMDS(3.5ml)中的悬浮液在N2气氛下回流过夜。冷却到室温后除去挥发性成份(高达50℃,0.01torr),残余物溶于CH2Cl2(6.6ml),冷却到0℃,滴加FmocCl(905mg,3.5mmol)的CH2Cl2(6.6ml)溶液。使混合物恢复到室温过夜。蒸发溶剂,残余物溶于THF(7.5ml)中并加入1M HCl(7.5ml)。将该混合物在室温下搅拌4小时。然后加入氯仿(50ml)和盐水(40ml)使其分相。水层用CHCl3(50ml)萃取2次。合并的有机层被干燥(MgSO4),浓缩,通过快速色谱纯化(硅胶,己烷∶乙酸乙酯∶乙酸=50∶50∶5)。浓缩含产物的馏份并冷冻干燥,产量615mg(0.928mmol,92.8%))。
1H NMR(300 MHz,d6-dmso):δ=7.86(d,4H,J=7.2Hz),7.70(d,4H,J=7.5Hz),7.41-7.27(m,8H),4.24(m,6H),3.86(q,2H,J=4.5Hz),1.62(m,4H),1.24(m,6H).13C NMR(75 MHz,CDCl3):δ=174.40,172.39,156.30,144.31,144.22,141.10,129.31,127.99,127.68,127.44,125.67,121.77,120.46,65.91,54.66,47.12,31.40,28.68,25.57,21.53.
FAB-MS m/z 663(M++1);
C39H38N2O8(662.73).计算值:C,70.68;H,5.78;N,4.23.
实测值:C,71.2;H,5.62;N,4.07.
实施例7
2,3-二氨基丁二酸
a)2,3-双(苄氨基)丁二酸
在室温下,向机械搅拌着的内消旋2,3-二溴丁二酸(27.6g,0.100mol)的醇(20ml)溶液中缓慢加入苄胺(85g,0.80mol)。加完后将混合物回流过夜。出现重的盐沉淀。混合物冷却到50℃并浓缩,加入浓盐酸直到pH为4-5。滤出沉淀,用水和醇洗涤数次并干燥。
产量:24.5g(75%)。
1H NMR(300 MHz,D2O/NaOD):δ3.08(2H,s),3.30(2H,d,J 13 Hz),3.55(2H,d,J 13 Hz),7.2(10H,m).
13C NMR(75 MHz,D2O/NaOD):δ50.9,64.7,127.1,128.5(br),139.2,179.0.
b)内消旋-2,3-二氨基丁二酸
将内消旋2,3-双(苄氨基)丁二酸(9.5g,0.029mol)溶于冰醋酸(50ml)和浓盐酸(50ml)的混合物中。室温下用10%pd/c(1.0g)作催化剂进行氢解。进行反应直到NMR显示不再存在未反应的起始原料。加入水(100ml),过滤除去催化剂。将滤液浓缩(旋转蒸发),残余物溶于稀氢氧化钠中。通过加入冰醋酸调节pH约为5。滤出晶体并洗涤。
产量3.8g(88%),白色固体。
1H NMR(300 MHz,D2O/NaOD):δ3.21(s).13C NMR(75 MHz,D2O/NaOD):δ:60.3,180.0.
C4H8N2O4计算值:C 32.44;H 5.44;N 18.91.
实测值:C 31.51;H 5.41;N 18.32.
c)内消旋-2,3-双(三甲基甲硅烷基氨基)丁二酸二(三甲基甲硅烷基)酯
该反应在氮气氛下进行。将内消旋-2,3-二氨基丁二酸(296mg,2.00mmol)在六甲基二硅氮烷(10ml)和氯代三甲基烷(1ml)中的悬浮液在100℃搅拌过夜,得一澄清溶液。减后蒸除过量甲硅烷基化试剂。白色固体残余物被直接用于酰基化反应。
1H NMR(300 MHz,CDCl3):δ0.03(18H,s),0.28(18H,s),3.5(2H,m).13C NMR(75 MHz,CDCl3):δ-0.3,0.03,60.9,174.1.
d)内消旋-2,3-双[(9-芴基甲氧羰基)氨基]丁二酸
反应在氮气氛下进行。将在步骤(c)中制备的甲硅烷基化二氨基丁二酸溶于无水二氯甲烷(10ml)中并冷却到0℃。加入9-芴基甲基氯甲酸酯(1.14g,4.4mmol)的无水二氯甲烷(4ml)溶液。将反应混合物搅拌过夜然后浓缩。残余物溶于THF(10ml)并加入水(约1ml)。将混合物搅拌10分钟然后浓缩。产物被萃取到乙酸乙酯中,溶液用水洗涤,干燥(MgSO4)并过滤。加入己烷,滤出沉淀并用己烷洗涤。最后将产物通过柱色谱纯化(硅胶,己烷/乙酸乙酯/乙酸1∶3∶1)。
产量0.85g(72%),白色晶体。
1N NMR(300 MHz,DMSO-d6):δ=4.1-4.3(6H,m),4.5(2H,d),7.2-7.4(12H,m),7.6-7.7(4H,m),7.8-7.9(4H,m).
13C NMR(75 MHz,DMSO-d6):δ=47.0,56.1,66.5,120.5,125.9,127.5,128.0,141.0,144.1,156.4,171.1.
FAB-MS 峰 m/z 637.2(3),631.1(5),615.2(21),593.2(2),435.1(9),326.3(15),179.1(100).
e)外消旋-2,3-双[(9-芴基甲氧羰基)氨基]丁二酸酐
将内消旋-2,3-双[(9-芴基甲氧羰基)氨基]丁二酸(150mg,0.25mmol)在乙酸酐中的悬浮液在120℃下搅拌,直到所有物质均溶解(1-2分钟)。真空除去过量酸酐。粗产物不用进一步纯化被用于肽合成中。
1H NMR(300 MHz,DMSO-d6):δ=4.25(2H,t),4.39(4H,d),4.80(2H,d),7.2-7.4(8H,m),7.66(4H,d),7.88(4H,d),8.30(2H,d).13C NMR(75 MHz,DMSO-d6):δ=46.8,55.6,66.9,120.6,125.5,127.5,128.1,141.1,143.9,156.4,168.2.
实施例8
(S,S)-2,7-二氨基-E-辛-4-烯二酸
a)1,4-双[(2R,5S)-3,6-二甲氧基-2-异丙基-2,5-二氢-5-吡嗪基]-E-丁-2-烯
将(2R)-2,5-二氢-3,6-二甲氧基-2-异丙基吡嗪(5.53g,30mmol)溶于无水THF中,将溶液冷却到-78℃。加入BuLi己烷溶液(19.62ml,31.0mmol)。60分钟后在-78℃下滴加E-1,4-二溴丁-2-烯(3.21g,15mmol)的30ml THF溶液,使溶液回到室温过夜。用磷酸盐缓冲液(pH=7)水解后,混合物用乙醚萃取,有机层用水和盐水洗涤。干燥(MgSO4)后蒸发溶剂,残余物通过快速色谱纯化(己烷/乙酸酯4/1)。
产量:4.73g(75%)。
1H-(CDCl3)δ:0.67(d,6H),1.04(d,6H),2.1-2.4(m,2H),2.48(dd,4H),3 67(s,6H),3.68(s,6H),3.93(dd,2H),4.03(dd,2H),5.35(dd,2H)13C-(CDCl3)δ:16.52,19.07,31.61,37.09,52.16,52.23,55.62,60.60,128.50
C22H36N4O4(420)计算值:C,62.86;H,8.57.
实测值:C,62.65;H,8.62.
b)(S,S)-2,7-二氨基-E-辛-4-烯-二酸二甲酯
将在40ml二噁烷中的1,4-双[(2R,4S)-3,6-二甲氧基-2-异丙基-2,5-二氢-5-吡嗪基]-E-丁-2-烯(4.02,9.9mmol)和在38ml水中的20.0mmol HCl(1.67ml)的溶液在室温搅拌4小时。溶液用乙醚萃取。加入氨水溶液直至pH达到9,溶液用氯仿萃取。有机层被干燥(MgSO4)。真空蒸馏(0.04torr,室温)出缬氨酸甲酯。
产量:1.92g(84.3%)。
1H-(CDCl3)δ:1.70(s,4H),2.20-2.60(m,4H),3.51(dd,2H),3.69(s,6H),5.46(dd,2H)13C-(CDCl3)δ:37.99,52.00,54.11,128.84,175.32.
c)(S,S)-2,7-二氨基-E-辛-4-烯-二酸,2HCl
将(S,S)-2,7-二氨基-E-辛-4-烯二酸二甲酯(1.65g,7.17mmol)溶于6N HCl(10ml,60mmol)中,N2气氛下回流2小时。蒸出溶剂,残余物溶于10ml水,加入EtOH(100ml)使其结晶。滤出晶体。
产量:1.32g=67%。
1H-(D2O)δ:2.53(dd,4H),3.97(dd,2H),5.52(dd,2H)13C-(D2O)δ:33.57,53.07,128.85,171.49
FAB-MS 峰 m/z 405.3(11),203.2(100),157.1(19),130.1(7),93.0(18),73.9(13)
C8H16N2O4Cl2(275)
计算值:C,34.91;H,5.81;N,10.18;Cl,25.78.
实测值:C,36.58;H,5.80;N,9.70;Cl,26.01.
d)(S,S)-2,7-双(9-芴基甲氧羰基氨基)-E-辛-4-烯二酸
将(S,S)-2,7-二氨基-E-辛-4-烯二酸二盐酸盐(1.59g,5.8mmol)悬浮于HMDS(20ml)和TMSCl中并回流过夜。除去溶剂,残余物溶于无水二氯甲烷中。将该溶液冷却到0℃,加入FmocCl(3.10g,12mmol)的二氯甲烷溶液。将溶液在此温度下搅拌1小时,并在室温下搅拌过夜。蒸出溶剂,残余物溶于THF。加入1N HCl水溶液之后,将溶液搅拌2小时,用氯仿萃取并干燥(MgSO4)。残余物溶于二氯甲烷中,加入乙醚使其结晶。
产量:2.50g(66.8%)。
1H-(DMSO)δ:2.2-2.4(s,4H),3.6(s,2H),3.9-4.5(m,8H),5.55(s,2H),7.2-8.1(m,16H)13C-(DMSO)δ:33.98,46.56,53.93,65.49,119.66,124.81,126.61,127.17,127.98,140.19,143.28,155.43,172.59
C38N34N2O8(646)计算值:C,70.59;N,5.26;N,4.33.
实测值:C,70.17;N,5.58;N,4.08
实施例9
(S,S)-2,7-二氯基-Z-辛-4-烯二酸
a)1,4-双[(2R,5S)-3,6-二甲氧基-2-异丙基-2,5-二氢-5-吡嗪基]-Z-丁-2-烯
将(2R)-2,5-二氢-3,6-二甲氧基-2-异丙基吡嗪(7.3g,39.2mmol)溶于无水THF中,并将溶液冷却到-78℃。加入BuLi己烷溶液(24.50ml,39.2mmol)。15分钟后在-78℃下,加入16.9ml 1,3-二甲基-2-咪唑啉酮(1.56mmol),5分钟后滴加Z-1,4-二氯丁-2-烯(2.45g,19.6mmol)的10ml THF溶液,将溶液搅拌6小时,并在-20℃保持过夜。用磷酸盐缓冲液(pH=7)水解后,混合物用乙醚萃取,有机层用水和盐水洗涤。干燥(MgSO4)后蒸发溶剂,残余物通过快速色谱纯化(己烷/乙酸乙酯9/1)。
产量:710g(10.2%)。
1H NMR(CDCl3)δ:0.67(d,6H),1.03(d,6H),2.25(m,2H),2.55(m,4H),3.66(s,6H),3.68(s,6H),3.91(dd,2H),4.07(m,2H),5.38(dd,2H)13C NMR(CDCl3)δ:16.50,19.01,31.57,32.01,52.22,52.31,55.46,60.67,127.30,163.19,163.66.
b)(S,S)-2,7-二氨基-Z-辛-4-烯二酸二甲酯
将在30ml二噁烷中的1,4-双[(2R,5S)-3,6-二甲氧基-2-异丙基-2,5-二氢-5-吡嗪基]-Z-丁-2-烯(0.23g,0.55mmol)和在10ml水中的2.2mmol HCl(0.183ml)的溶液在室温搅拌12小时,溶液用乙醚萃取。加入氨水溶液直至pH达到9,溶液用氯仿萃取。将有机层干燥(MgSO4)。蒸除缬氨酸甲酯(0.02torr,室温)。
产量:0.127g(85%)。
1H NMR(CDCl3)δ:1.54(s,4H),2.3-2.6(m,4H),3.52(dd,2H),3.71(s,6H),5.54(m,2H)13C NMR(CDCl3)δ:32.55,52.02,54.17,127.94,175.67.
c)(S,S)-2,7-二氨基-Z-辛-4-烯二酸2HCl
向(S,S)-2,7-二氨基-Z-辛-4-烯二酸二甲酯(0.108g,0.47mmol)的0.7ml甲醇溶液中加入2N LiOH水溶液(1.41mmol,0.71ml)。将溶液在室温下搅拌过夜,然后滴加1N HCl酸化。滤出晶体。
产量:50mg(38.7%)。
1H NMR(D2O)δ:2.58(m,4H),3.99(m,2H),5.51(m,2H)13C NMR(D2O)δ:27.59,52.20,126.84,171.10.
d)(S,S)-2,7-双(9-芴基甲氧羰基氨基)-Z-辛-4-烯二酸
将(S,S)-2,7-二氨基-Z-辛-4-烯二酸(0.050g,0.25mmol)和Na2CO3(0.21g,20.0mmol)溶于3ml水和2ml二噁烷中。将溶液冷却到0℃并加入Fmoc Cl(0.26g,1.0mmol)的1ml二噁烷溶液。该混合物在0℃搅拌3小时,并回到室温过夜。用乙醚萃取后加入盐酸酸化。溶液用氯仿萃取,用氯仿/己烷使氨基酸结晶。通过快速色谱将化合物纯化(氯仿/乙酸9/1)。
产量:90.0mg(55.9%)。
1H(DMSO)δ:2.12-2.64(m,4H),3.88(s,2H),4.04-4.37(m,6H),5.42(s,2H),7.02(s,2H),7.20-8.00(m,16H)
13C(DMSO)δ:29.77,46.88,55.53,65.66,120.23,125.43,127.23,127.74,129.08,140.84,144.11,155.59,174.10
FAB-MS 峰 m/z 676.2(2),587.5(5),447.4(10),419.3(45),391.3(100),363.3(38),261.2(45),233.2(29).
实施例10
(S,S)-2,7-二氨基-辛-4-炔二酸
a)1,4-双((2R,5S)-3,6-二甲氧基-2-异丙基-2,5-二氢-5-吡嗪基)丁-2-濯
向(2R)-2,5-二氢-3,6-二甲氧基-2-异丙基吡嗪(4.605g,25mmol)和1,3-二甲基-2-咪唑啉酮(11.4g,102mmol)的THF(48ml)溶液中滴加1.6M n-BuLi(16ml,25.5mmol)。1小时后滴加1,4-二氯-2-丁炔(1.54g,12.5mmol)的THF(8ml)溶液。使混合物恢复到室温过夜,用1M磷酸盐缓冲液(pH=7)使的反应停止。用乙醚(150ml)和水(40ml)稀释混合物并分层。水层用乙醚(2×150ml)萃取两次,将合并的有机层干燥(MgSO4),过滤,浓缩,并通过快速色谱纯化(硅胶,己烷∶乙醚=7∶1)。
产量:3.325g(7.94mmol,63.6%)。
1H-NMR(300 MHz,CDCl3):δ=4.05-3.99(m,4H),3.68(s,6H,3.67(s,6H),2.70(dd,2H,J=-14.1,3.0Hz),2.57(dd,2H,J=-14.1,3.0Hz),2.26(dsept,2H,J=6.9,3.0Hz),1.05(d,6H,J=6.9Hz),0.64(d,6H,J=6.9Hz);
13C NMR(75 MHz,CDCl3):δ=164.56,161.53,77.52,60.51,54.46,52.34,52.22,31.43,25.26,19.07,16.40.
FAB-MS m/z 419(M++1).
C22H34N4O4(418.53).计算值:C,63.14;H,8.19;N,13.39.
实测值:C,63.27;H,8.12;N,13.54.
b)(S,S)-2,7-二氨基-辛-4-炔二酸二甲酯
将1,4-双(2R,5S)-3,6-二甲氧基-2-异丙基-2,5-二氢-5-吡嗪基)丁-2-炔(920mg,2.2mmol)溶于二噁烷(18ml)和0.5M HCl(18ml)中,在室温搅拌12小时。该混合物用乙醚(30ml)洗涤,加入25%氨水使水层pH=9,并迅速用CHCl3(3×75ml)萃取。有机层用MgSO4干燥,过滤,浓缩。通过Kugelrohr蒸馏(25-50℃,0.01torr)除去缬氨酸甲酯。得到486mg(2.13mmol,96.8%)黄色油状物。
1H-NMR(300 MHz,CDCl3):δ=3.74(s,6H),3.59(t,2H,J=5.4Hz),2.60(d,4H,J=5.4Hz);13C NMR(75MHz,CDCl3):δ=174.46,78.31,53.31,52.22;25.15.
c)、(S,S)-2,7-二氨基-Z-辛-4-炔二酸.2HCl
在N2气氛下,将(S,S)-2,7-二氨基-辛-4-炔二酸二甲酯(450mg,1.97mmol)溶液在6M HCl(7.2ml)中加热到50-60℃12小时。蒸除挥发性化合物(旋转蒸发,水浴40℃)。将残余物溶于水(1ml,混浊),加入乙醇(20ml)并缓慢加入乙醚,使之产生白色晶状沉淀,将该混合物在冷冻箱内保持12小时,过滤,用乙醚洗涤,真空干燥,产量399mg(1.46mmol,74.2%)。
1H NMR(300 MHz,D2O/DCl):δ=4.18(t,2H,J=4.8Hz),2.85(m,AA′X,4H);13C NMR(75MHz,D2O/DCl)):δ=172.62,79.88,53.75,22.60.
FAB-MS m/z 201(M+-72).
d)(S,S)-2,7-双(9-芴基甲氧羰基氨基)-辛-4-炔二酸
将(S,S)-2,7-二氨基-Z-辛-4-炔二酸.2HCl(400mg,1.46mmol)的二噁烷溶液和1M Na2CO3溶液(10.22ml,10.22mmol)冷却到0℃,加入Fmoc Cl(1.14g,4.39mmol)4ml二噁烷溶液。将该混合物在0℃搅拌1小时,使其回到室温过夜。用乙醚(2×50ml)萃取后,加入稀HCl将水层酸化。溶液用氯仿(3×50ml)萃取,干燥(MgSO4)并浓缩。残余物通过快速色谱纯化(硅胶,己烷∶乙酸乙酯∶乙酸=10∶10∶1)。
产量376mg(0.58mmol,39%)。
1H NMR(300 MHz,DMSO):δ=7.87(d,4H,J=7.5Hz),7.73(d,4H,J=7.5Hz),7.41(t,4H,J=7.5Hz),7.33(t,4H,J=7.5Hz),4.26(m,8H),2.52(m,4H);
13C(DMSO)δ=170.43,154.62,152.58,142.32,139.47,126.22,125.94,124.35,119.12,77.68,65.45,53.08,46.57,21.77.
FAB-MS m/z645(M++1).
C38H32N2O8(644.67).计算值:C,70.80;H,5.00;N,4.35.
实测值:C,69.20;H,5.34;N,4.13.
实施例11
(2S,4R,5R,7S)-2,7-二氨基-4,5-二羟基-4,5-0,0-异亚丙基辛二酸
a)(2R,3R)-1,4-双(2R,5S)-3,6-二甲氧基-2-异丙基-2,5-二氢-5-吡嗪基)-2,3-二羟基-2,3-0,0-异亚丙基丁烷
将(2R)-2,5-二氢-3,6-二甲氧基-2-异丙基吡嗪(7.36g,40mmol)溶于无水THF中并将溶液冷却到-78℃下,滴加(2R,3R)-1,4-二溴-2,3-二羟基-2,3-0,0-异亚丙基丁烷(3.78g,13.1mmol)的10ml THF溶液,将溶液在4℃保持36小时。用磷酸盐缓冲液(pH=7)水解后,混合物用乙醚萃取,有机层用水和盐水洗涤。干燥后MgSO4)蒸除溶剂,残余物通过用MeCN重结晶来纯化。
产量:3.70g(57%)。
1H(CDCl3)δ:0.68(d,6H),1.03(d,6H),1.34(s,6H),1.95-2.15(m,4H),2.24(m,2H),3.65(s,6H),3.67(s,6H),3.94(m,2H),4.04(m,2H),4.11(m,2H)13C(CDCl3)δ:16.91,19.05,27.39,31.73,38.32,52.27,52.36,52.70,60.60,77.89,108.19,163.66,163.70
FAB-MS 峰 m/z 495.4(100)
C25H42N4O(494):计算值:C,60.71;H,8.56;N,11.33.
实测值:C,60.76;H,8.32;N,11.36.
b)(2S,4R,5R,7S)-2,7-二氨基-4,5-二羟基-4,5-0,0-异亚丙基辛二酸二甲酯
将(2R,3R)-1,4-((2R,5S)-3,6-二甲氧基-2-异丙基-2,5-二氢-5-吡嗪基)-2,3-二羟基-0,0-异亚丙基丁烷(1.22g,2.47mmol)溶于10ml二恶烷和20ml MeOH中。加入9.88mmol HCl的10ml水溶液,将溶液在室温下搅拌过夜。除去溶剂,残余物溶于水并用EtOEt萃取。向水层加入氨直至pH达到9并用氯仿萃取。干燥(MgSO4)后除去溶剂,蒸除缬氨酸甲酯(30-40℃,0.04Torr)。
产量:0.67g(89.3%)。
1H(CDCl3)δ:1.34(s,6H),1.64(br s,4H),1.72-1.84(m,2H),1.99-2.08(m,2H),3.65(m,2H),3.71(s,6H),3.80(m,2H)13C(CDCl3)δ:27.17,37.54,52.04,52.74,78.78,108.99,175.51.
c)(2S,4R,5R,7S)-2,7-二氨基-4,5-二羟基-4,5-0,0-异亚丙基辛二酸
将(2S,4R,5R,7S)-2,7-二氨基-4,5-二羟基-4,5-0,0-异亚丙基辛二酸二甲酯(0.62g,2.04mmol)溶于2.5ml二噁烷中,加入2.1ml 2N LiOH水溶液,溶液在氩气氛下搅拌过夜。TLC检测表明定量生成了标题化合物。粗反应溶液被用于下一步中。
d)(2S,4R,5R,7S)-2,7-双(9-芴基甲氧羰基氨基)-4,5-二羟基-4,5-0,0-异亚丙基辛二酸
将(2S,4R,5R,7S)-2,7-二氨基-4,5-二羟基-4,5-0,0-异亚丙基辛二酸(2.04mmol)的粗溶液冷却到0℃,加入10ml二噁烷和10ml 1N NaOH溶液。然后分小批加入2.07g Fmoc Cl(8.0mmol),并将混合物在0℃搅拌5小时,在室温下搅拌过夜,用EtOEt萃取混合物,加入KHSO4使其酸化。用CHCl3萃取后将有机层干燥(MgSO4),除去溶剂。通过硅胶以丙酮/MeOH过滤除去未反应的过量Fmoc Cl,残余物用CHCl3/EtOEt沉淀纯化。
产量:0.49g(33.6%)。
1H(DMSO/D2O)δ:1.20(s,6H),1.73(m,2H),1.99(m,2H),3.87(m,2H),4.14-4.24(m,6H),7.23-7.82(m,16H)13C(DMSO)δ:27.78,36.21,47.27,53.75,66.19,78.82,107.89,120.67,125.81,127.76,128.32,141.24,144.39,156.12,175.96.
FAB-MS 峰 m/z 563.2(2),179.1(100).
C41H40N2O10(720):计算值:N,3.89
实测值:N,3.81.
实施例12
(2S,4S,5S,7S)-2,7-二氨基-4,5-二羟基-4,5-0,0-异亚丙基辛二酸
a)(2S,3S)-1,4-双((2R,5S)-3,6-二甲氧基-2-异丙基-2,5-二氨基-5-吡嗪基)-2,3-二羟基-2,3-0,0-异亚基丁烷
将(2R)-2,5-二氢-3,6-二甲氧基-2-异丙基吡嗪(9.59g,52.1mmol)溶于无水THF中,并将溶液冷却到-78℃下。加入BuLi己烷溶液(52mmol,32.5ml)。60分钟后在-78℃下,滴加(2S,3S)-1,4-二溴-2,3-二羟基-2,3-0,0-异亚丙基丁烷(6.0g,20.83nnol)的10ml THF溶液,使溶液恢复到室温过夜,再搅拌24小时。用磷酸盐缓冲液(pH=7)水解后,混合物用乙醚萃取,有机层用水和盐水洗涤。干燥(MgSO4)后蒸发溶剂,残余物通过用MeCN重结晶来纯化。
产量:3.43g(33.3%)。
1H(CDCl3)δ:0.70(d,6H),1.03(d,6H),1.44(s,6H),2.15-2.30(m,4H),3.66(s,6H),3.69(s,6H),3.92(m,2H),4.04(m,2H),4.09-4.20(m,4H)13C(CDCl3)δ:16.78,19.11,27.67,31.88,38.38,52.37,52.44,52.83,60.84,77.65,108.57,163.15,163.88
FAB-MS 峰 m/z 495.4(53),253.2(40),197.2(58),141.1(100)
C25H42N4O(494)计算值:C,60.71;H,8.56;N,11.33
实测值:C,60.89;H,8.42;N,11.45.
b)(2S,4S,5S,7S)-2,7-二氨基-4,5-二羟基-4,5-0,0-异亚丙基辛二酸二甲酯
将(2S,3S)-1,4-双((2R,5S)-3,6-二甲氧基-2-异丙基-2,5-二氢-5-吡嗪基)-2,3-二羟基-2,3-0,0-异亚丙基丁烷(2.5g,5.06mmol)溶于40ml二噁烷中。加入20.0mmol HCl的40ml小溶液,将溶液在室温搅拌过夜。除去溶剂,残余物溶于水并用EtOEt萃取。向水层加入氨直至pH达到9。将其用氯仿萃取。干燥(MgSO4)后除去溶剂,蒸除缬氨酸甲酯(30-40℃,0.04Torr)。
产量:1.507g(98.0%)。
1H(CDCl3)δ:1.32(s,6H),1.53(br s,4H),1.60-1.68(m,2H),1.85-1.94(m,2H),3.63(m,2H),3.67(s,6H),3.80(m,2H)13C(CDCl3)δ:27.25,37.20,51.96,52.74,77.58,108.80,176.10.
c)(2S,4S,5S,7S)-2,7-二氨基-4,5-二羟基-4,5-0,0-异亚丙基辛二酸
将(2S,4S,5S,7S)-2,7-二氨基-4,5-二羟基-4,5-0,0-异亚丙基辛二酸二甲酯(1.51g,4.96mmol)溶于5ml二噁烷中,加入4.9ml 2N LiOH水溶液(9.91mmol),将溶液在氩气氛下搅拌过夜。TLC检测表明定量生成了(2S,4S,5S,7S)-2,7-二氨基-4,5-二羟基-4,5-0,0-异亚丙基辛二酸。此粗反应溶液被用于下一步中。
d)(2S,4S,5S,7S)-2,7-双(9-芴基甲氧羰基氨基)4,5-二羟基-4,5-0,0-异亚丙基辛二酸
将(2S,4S,5S,7S)-2,7-二氨基-4,5-二羟基-4,5-0,0-异亚丙基辛二酸(4.96mmol)的粗溶液冷却到0℃,加入16ml 1N NaOH溶液(16mmol)。然后分小批加入3.89g Fmoc Cl(15.0mmol)的16ml二噁烷溶液,混合物在室温搅拌90分钟。加入KHSO4使溶液酸化。用CHCl3萃取后将有机层干燥(MgSO4),除去溶剂。等份残余物通过快速色谱纯化(己烷/乙酸乙酯/乙酸5/5/1)。
产量:1.69g(46%)。
1H(DMSO/D2O)δ:1.23(s,6H),1.7-2.0(m,4H),3.62(m,2H),4.02(m,2H),4.1-4.35(m,6H),7.2-7.9(m,16H)13C(DMSO)δ:27.94,34.59,47.39,52.29,66.45,77.49,109.13,120.90,125.91,127.97,128.59,141.44,144.44,157.02,174.75.
FAB-MS 峰 m/z 743.3(28),563.2(58),505.2(72).
C41H40N2O10(720)计算值:C,68.32;H,5.59;N,3.89
实测值:C,67.38;H,5.64;N,4.09.
实施例13
(2S,4R,5S,7S)-2,7-二氨基-4,5-二羟基-4,5-0,0-异亚丙基辛二酸
a)(2R,3S)-1,4-双[(2R,5S)-3,6-二甲氧基-2-异丙基-2,5-二氢-5-吡嗪基]-2,3-二羟基-2,3-0,0-异亚丙基丁烷
将(2R)-2,5-二氢-3,6-二甲氧基-2-异丙基吡嗪(6.08g,33.0mmol)溶于无水THF,并将溶液冷却到-78℃。加入BuLi己烷溶液(33.0mmol,20.6ml)。45分钟后在-78℃下,滴加(2R,3S)-1,4-二溴-2,3-二羟基-2,3-0,0-异亚丙基丁(4.52g,15.70mmol)的10ml THF溶液,使溶液恢复到室温过夜,并再搅拌24小时。用磷酸盐缓冲液(pH=7)水解后,混合物用乙醚萃取。有机层用水和盐水洗涤。干燥(MgSO4)后蒸发溶剂,残余物通过快速色谱纯化(己烷/乙酸乙酸9/1)。
产量:0.77g(10.0%)。
1H(CDCl3)δ:0.68(m,6H),1.03(m,6H),1.32(s,3H),1.45(s,3H),1.30-1.55(m,1H),1.85-2.30(m,5H),3.62(s,3H),3.66(s,3H),3.68(s,6H),3.92(m,2H),4.06-4.26(m,3H),4.45(m,1H)13C(CDCl3)δ:16.62,16.77,19.04,19.08,26.20,28.49,31.71,31.91,33.69,35.07,52.21,52.27,52.32,52.35,52.40,52.98,60.58,60.80,74.31,74.66,107.16,163.03,163.40,163.91,164.30.
b)(2S,4R,5S,7S)-2,7-二氨基-4,5-二羟基-4,5-0,0-异亚丙基辛二酸二甲酯
将(2R,3S)-1,4-双((2R,5S)-3,6-二甲氧基-2-异丙基-2,5-二氢-5-吡嗪基)-2,3-二羟基-2,3-0,0-异亚丙基丁烷(0.77g,1.55mmol)溶于12ml二噁烷中。加入6.0mmol HCl的12ml水溶液,溶液在室温搅拌5小时。加入氨直到pH为9,溶液用氯仿萃取。干燥(MgSO4)后除去溶剂,并蒸掉缬氨酸甲酯(30-40℃,0.05Torr)。
产量:0.36g(77%)。
1H(CDCl3)δ:1.30(s,3H),1.41(s,3H),1.40-1.48(m,1H),1.72(s,4H),1.75-2.00(m,3H),3.60-3.67(m,2H),3.70(s,6H),4.20-4.40(m,2H).13C(CDCl3)δ:25.81,28.26,34.69,34.89,51.55,52.00,52.02,52.66,74.26,75.20,108.23,175.43,176.51.
c)(2S,4R,5S,7S)-2,7-二氨基-4,5-二羟基-4,5-0,0-异亚丙基辛二酸
将(2S,4R,5S,7S)-2,7-二氨基-4,5-羟基-4,5-0,0-异亚丙基辛二酸二甲酸(0.36g,1.19mmol)溶于5ml二噁烷中,加入1.19ml 2N LiOH水溶液(2.38mmol),将溶液在氩气氛下搅拌过夜。TLC检测表明定量生成了(2S,4R,5S,7S)-2,7-二氨基-4,5-二羟基-4,5-0,0-异亚丙基辛二酸。将此粗反应溶液用于下一步骤。
d)(2S,4R,5S,7S)-2,7-双(9-芴基甲氧羰基氨基)-4,5-二羟基-4,5-0,0-异亚丙基辛二酸
将(2S,4R,5S,7S)-2,7-二氨基-4,5-二羟基-4,5-0,0-异亚丙基辛二酸(1.19mmol)的粗溶液冷却到0℃,加入4.0ml 1N NaHCO3溶液(4.0mmol)。然后小批加入1.03g Fmoc Cl(4.0mmol)的4ml二噁烷溶液,混合物在室温下搅拌60分钟。加入KHSO4使溶液酸化。用CHCl3萃取后将有机层干燥(MgSO4),除去溶剂。残余物通过快速色谱纯化(己烷/乙酸乙酯/乙酸5/5/1)。
产量:0.566g(66%)。
1H(DMSO,D2O)δ:1.16(s,3H),1.30(s,3H),1.50-2.05(m,4H),3.80-4.40(m,8H),7.15-8.0(m,16H)13C(DMSO,D2O)δ:26.63,29.05,31.50,31.94,47.43,51.52,52.19,66.50,74.10,75.10,108.36,120.88,125.93,127.98,128.60,141.48,144.39,144.76,156.82,157.12,174.11,175.11.
实施例14
(S,S)-2,6-二氨基-4-氧杂庚二酸
a)双[(2R,5S)-2,5-二氢-3,6-二甲氧基-2-异丙基-5-吡嗪基]甲醚
在-78℃,将丁基锂己烷溶液(1.6M 6.25ml,10.0mmol)加到(2R)-2,5-二氢-3,6-二甲氧基-2-异丙基吡嗪(1.84g,10.0mmol)的无水THF(8ml)溶液中。混合物搅拌15分钟。加入双(氯甲基)醚(0.67g,5.0mmol)的无水THF(2ml)溶液。使反应混合物达到室温过夜。蒸发溶剂,残余物溶于乙醚。用水洗涤乙醚溶液,干燥(MgSO4)并蒸发。产物通过色谱法纯化(硅胶,己烷/乙酸乙酯2∶1)。
产量:0.65g(32%),黄色油状物。
1H NMR(300 MHz,CDCl3):δ0.63(6H,d),1.05(6H,d),2.25(2H,m),3.58(2H,dd),3.63(6H,s),3.64(6H,s),3.76(2H,dd),3.83(2H,t),3.98(6H,m)。13C NMR(75MHz,CDCl3):δ16.4,19.1,30.1,52.1,52.2,56.9,60.3,72.5,161.0,165.0。
b)(S,S)-2,6-二氨基-4-氧杂庚二酸二甲酯
将双[(2R,5S)-2,5-二氢-3,6-二甲氧基-2-异丙基-5-吡嗪基]甲醚(0.65g,1.49mmol)溶于甲醇(5ml)中,加入0.25M盐酸(23.8ml,5.96mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜。水/甲醇溶液用乙醚萃取。加入氨调节pH为10,将D-缬氨酸甲酯萃取到乙醚中。蒸去大部分水。残余物不用进一步纯化被用于下一步骤中。
1H NMR(300 MHz,DMSO-d6):δ3.72(6H,s),3.85(4H,m),4.23(2H,t)。13C NMR(75 MHz,CDCl3):δ52.8,53.2,68.9,168.4。
c)(S,S)-2,6-二氨基-4-氧杂庚二酸,2HCl
将上面的二甲酯在6M盐酸(5ml)中回流3小时。将溶液蒸发并冷冻干燥。
产量:420mg,白色固体。
1H NMR(300 MHz,D2O):δ3.87(2H,dd,J10.8Hz,J3.2Hz),3.95(2H,dd,J10.8HzJ4.6Hz),4.13(2H,dd,J3.2and4.6Hz)。13C NMR(75MHz,CDCl3):δ53.4,68.4,170.3。
d)(S,S)-2,6-双[(9-芴基甲氧羰基)氨基]-4-氧杂庚二酸
反应在氮气氛下进行。将(S,S)-2,6-二氨基-4-氧杂庚二酸二盐酸盐(200mg,0.75mmol)在六甲基二硅氮烷(10ml)和氯化三甲基甲硅烷(1ml)中的悬浮液在120℃加热3小时,得到一澄清溶液。真空除去过量甲硅烷基化试剂,残余物溶于无水二氯甲烷(5ml)中。将溶液冷却到0℃并加入9-芴基氯甲酸酯(425mg,1.65mol)的无水二氯甲烷(2ml)溶液。混合物搅拌2小时,然后蒸发。残余物溶于THF(5ml)中,加入1ml 0.1M盐酸。将混合物搅拌15分钟然后蒸发。残余物溶于乙酸乙酯。有机相用水洗涤,干燥(MgSO4)并蒸发。产物通过柱色谱纯化(硅胶,氯仿/甲醇/乙酸85∶10∶5)。
产量:310mg(65%),白色固体。
1H NMR*300MHz,DMSO-d6):δ3.7(4H,m),4.1(2H,m),4.25(6H,m),7.2-7.4(10H,m),7.7(4H,d),7.8(4H,d)。
实施例15
(S,S)-2,7-二氨基-4-氮杂辛二酸
a)(S,S-27-双(叔丁氧羰基氨基)-4-氮杂辛二酸
将(S)-4-氨基-2-叔丁氧羰基氨基丁酸(1.03g,4.70mmol)的乙腈(50ml)溶液加到(S)-叔丁氧羰基一丝氨酸-β-内酯(0.80g,4.27mmol)的乙腈(50ml)和脱气H2O(50ml)溶液中。搅拌下滴加1M NaHCO3使pH保持在5.5。混合物在室温下搅拌5天。通过加入NaHCO3控制pH并通过TLC监测反应。蒸掉溶剂,残余物用氯仿(5ml)研制,向其中加入乙酸使pH为5。将氯仿溶液蒸发,经硅胶色谱纯化后分离得到产物。
产率:0.92g(53%),白色固体。1H NMR(DMSO-d6,300MHz):δ7.33(d,J6.3Hz;1H),6.27(d,J5.7Hz;1H),4.42(d,J7.5Hz;1H),4.15(dd,J110.5Hz,J23.9Hz;1H),4.01(d,J6.3Hz;1H),3.87(br s;1H),2.78(br s;1H),1.78-2.21(m;4H),1.36and1.35(2,s;18H)。13C NMR(DMSO-d6,75.43MHz):δ174.95,155.74,155.25,79.58,78.22,78.04,62.97,56.42,56.00,51.17,48.99,38.14,28.62,28.46。C17H31N3O8(405.45)。
b)(S,S)-2,7-双(叔丁氧羰基氨基)-4,-苄氧羰基-4-氮杂辛二酸
在0℃将1M NaHCO3(5.9ml,5.92mmol)和苄氧羰基氯(0.5g,0.42ml,2.96mmol)加到(S,S)-2,7-双(叔丁氧羰基氨基)-4-氮杂辛二酸(0.6g,1.48mmol)的二噁烷(40ml)和水(30ml)的溶液中。混合物在0℃搅拌3小时,在室温搅拌6小时,蒸煮,残余物用氯仿(5ml)研制,并用乙酸调节pH为5。将氯仿溶液蒸发,经硅胶色谱纯化(CHCl3∶MeOH4∶1)后分离得到产物。
产量:0.39g(50%),白色固体。
1H NMR(DMSO-d6,300 MHz):δ7.21-7.37(m,5H),7.18(d,J7.8Hz;1H),6.23(d,J6.3Hz;1H),4.98(s,2H),4.43(dd,J10.8Hz,J3.3Hz;1H),4.09(dd,J10.2Hz,J6.3Hz;1H),3.88-4.02(m;2H),3.01(d,J5.7Hz;2H),1.74-1.88(m,1H),1.59-1.72(m;1H),1.35and1.33(2d;18H)。13C NMR(DMSO-d6,75.43MHz):δ177.42,177.38,161.20,160.63,160.16,142.20,133.48,132.91,132.78,83.55,83.14,70.76,70.40,59.39,56.44,53.61,42.30,36.01,33.28。
C25H37N3O10(539.58)
c)(S,S)-2,7-二氨基-4-苄氧羰基-4-氮杂辛二酸
将(S,S)-2,7-双(叔丁氧羰基氨基)-4-苄氧羰基-4-氮杂辛二酸(0.29g,0.37mmol)溶于TFA(10ml)中,溶液在室温搅拌2小时,蒸除TFA,得到标题化合物,不用进一步纯化而将其用于下面的步骤中。
d)(S,S)-苄氧羰基-2,7-双(9-芴基甲氧羰基)-4-氮杂辛二酸
将)S,S)-2,7-二氨基-4-苄氧羰基-4-氮杂辛二酸(0.2g,0.37mmol)溶于二噁烷(10ml)和水(10ml)中,在0℃搅拌下加入9-芴基甲基氯甲酸酯(0.29g,1.11mmol)和1M NaHCO3(2.96ml,2.96mmol),在室温继续搅拌10小时,蒸发溶剂。残余固体用氯仿(5ml)研制,同时加入乙酸使pH保持在pH5。随后将溶液蒸发,经硅胶色谱纯化(AcOEt∶∶己烷AcOH 10∶10∶1)后分离得到产物。
产量:0.1g(35%),为白色固体。
1H NMR(DMSO-d6,300 MHz):δ7.21-7.44,7.61-7.91(m;22H),6.88(d,J6.3Hz;1H),4.96(s;2H),4.56(dd,J10.8Hz,J3.3Hz;1H),3.94-4.28(m,8H),3.08(d,J5.7Hz;2H),1.86-1.98(m,1H),1.69-1.82(m,1H)。13C NMR(DMSO-s6,75.43MHz):δ172.98,172.49,156.49,156.04,144.32,144.24,144.17,142.97,141.07,139.81,137.82,137.55,129.30,128.66,128.06,127.99,127.66,127.46,125.68,121.75,120.39,110.06,66.22,65.60,55.26,52.20,47.08,47.04,36.63,37.74。
C45H41N3O10783.83)。
肽类的固相合成
固相肽合成主要根据芴基甲氧羰基(fmoc)聚酰胺策略的原则进行(Atherton&Sheppard,Solid phase peptide synthesis;a practical approach Oxford;IRL Press at Oxford University Press,1989)。使用买到的合成树脂;对于或用手工或用半自动仪(Labortec Peptide Synthesizer 5P 650)进行的间歇合成,这些树脂是带有不稳定酸的聚苯乙烯(wang,J.Am.Chem.Soc.,95,1328-1333,1973)或带有酸性超不稳定键合剂的聚苯乙烯(Merger等人,Tetrahedron Letters29,4005-4008,1988)。此外,肽类也可以全自动方式在流动树脂上用LKB Biolynx 4170 Automated peptide synthesizer来合成(Atherton等人,J.Chem.Soc.,Chem.Commun.,1151-2,1981)。买来的合成树脂已经含有保护的所需C-末端Fmoc-氨基酸残基。用侧链保护的Fmoc-氨基酸五氟苯酯来进行各种链增长(Kisfaludy&Schaen,Synthesis,325-327,1983),其中使用二环己基碳二亚胺(DCC)/1-羟基苯并三唑(HOBt)进行活化(Koening&Geiger,Chem.Ber.103,2034-2040,1970)或用偶合剂PyBOP(Coste等人,Tetrahedron Lett.,31,205-208,1990)赖氨酸侧链氨基用叔丁氧羰基保护,谷氨酸和天冬氨酸的侧链羧基被保护为叔丁基酯。
带有所需的N-去保护C-末端残基的合成树脂籍助于DCC和HOBt用半当量Fmoc-保护的二氨基二羧酸酰化。反应完成后洗掉过量的试剂。然后将肽基树脂再用DCC/HOBt处理,以便使已经游离的羧基稳定。此步骤之后,将树脂用甲醇洗涤,以便使任何不能与树脂键连氨基连接的羧基失活。最后通过乙酰代反应掩蔽过量氨基。然后按常规继续进行肽合成。
在所需顺序完全固相合成之后,用三氟乙酸(其中已加入适当的清除剂化学品)使肽类从合成树脂上断裂下来,同时伴有侧链去保护作用(King等人,Int.J.Peptide Protein Res.,36255-268,1990)。蒸发后,通过用乙醚沉淀分离肽类并干燥。通过制备性反相高效液相色谱进行纯化。
表1
对具有通式(Pyr-Glu-Asp)2-桥残基-(Lys-OH)2的肽类的分析数据
桥残基类型 HPLC方法b纯度cFAB-MS
(保留时间,分) (%) [M+H]+
C-6 10-40-20(16) 95 1199.5
C-5 0-30-20(17) 95 1185
C-1
C-0(内消旋) 0-20-20(19) 98 1115.4
C-0(异构体1) 0-20-20(19) 98 1115.4
C-0(异构体2) 0-20-20(19) 97 1115.4
C-4-反式烯 0-30-20(12) 98 1169.4
C-4-顺式烯 10-40-20(13) 100 1170.6
C-4-炔 0-30-20(19) 98 1167.5
C-4-连乙二醇(异构体1) 0-30-20(14) 98 1203.2
C-4-连乙二醇(异构体2) 0-30-20(13) 98 1203.4
C-4-连乙二醇(异构体3)
C-3-胺
C-3-醚
a 指实施例
b 该方法以经过一段时间流动相B在A中的梯度表示,例如10-40-20是指以梯度10开始,经过20分钟以40%B结束。流动相:A)0.1%TFA,B)在40%MeCN中的0.1%TFA。柱:Vydac TP 54,C18,0.46×25cm,5μm粒度,100A孔隙;流速1ml/min
c 指HPLC色谱图峰的积分(λ=215nm)。
表2
对具有通式(Pyr-Glu-Asp)2-桥残基-(Lys-OH)2的肽类的氨基酸分析数据
桥残基类型 Asp测定 Glu测定 Lys测定
(理论) (理论) (理论)
C-6 1.0(1) 2.15(2) 0.93(1)
C-5 1.0(1) 2.18(2) 0.94(1)
C-1
C-0(内消旋) 1.0(1) 2.15(2) 0.93(1)
C-0(异构体1) 1.0(1) 2.18(2) 0.93(1)
C-0(异构体2)
C-4-(反式烯) 1.0(1) 2.15(2) 0.93(1)
C-4-顺式烯 1.0(1) 2.17(2) 0.93(1)
C-4-Yne 1.0(1) 2.17(2) 0.95(1)
C-4-连乙二醇(异构体1) 1.0(1) 2.15(2) 0.93(1)
C-4-连乙二醇(异构体2)
C-4-连乙二醇(异构体3)
C-3-胺
C-3-醚
a 指实施例
实施例16
肽合成:(pGlu-Glu-Asp)2-(E)-DH2(Lys)2
用Latortec Peptide Synthesizer合成肽。将Fmoc-Lys(Boc)-Sasrin聚合物(1.0g,0.6mmol;Bachem,A.G.;取代度0.6mmol/g)装入100ml反应瓶中。向此聚合物中加入在DMF(20ml)中的Fmoc-DHs(150mg,0.23mmol)、DCC(290mg,1.4mmol)和HOBt(211mg,1.4mmol),使反应进行9小时。再加入DCC(1.4mmol)和HOBt(1.4mmol),使反应再进行2小时。然后用CH2Cl2、30%MeOH的CH2Cl2溶液和DMF洗涤聚合物。将聚合物上的游离氨基用10%Ac2O的DMF溶液乙酰化(3次经1小时;Kaiser试验结果为负)。
其余合成按照标准方案进行,用Fmoc-Asp(OuBu)-Opfp(1.33g,2.3mmol)、Fmoc-Glu(OtBu)-Opfp(1.35g,2.3mmol)和pGlu-五氯苯基酯(0.86g,2.3mmol)。在每一偶联步骤中加入HOBt(350mg,2.3mmol),使反应进行1小时。通过负Kaiser试验确定偶联反应的完成。用Fmoc-氨基酸偶联后,用DMF洗涤聚合物,通过20%哌啶的DMF溶液使保护基断裂,再用DMF洗涤聚合物。在最终偶联之后,将聚合物用MeOH/CH2Cl2和CH2Cl2洗涤。干燥过的聚合物-肽的重量为1g。通过TFA∶CH2Cl21∶1使肽从聚合物上裂解下来,溶液被冷冻干燥,残余物溶于水,过滤(0.45μ),将滤液冷冻干燥;得到430mg产物。为进一步纯化将100mg该产物溶于水(0.5ml),使其经过制备性HPLC,用2.1×15cm Beckman Ultrasphere ODS及溶液A 0.1% TFA水溶液,B 0.1% TFA在MeCN∶H2O 40∶60中。梯度是0-15%B,120分钟,流速5ml/分钟。冷冻干燥后得到19mg纯品肽(>95%)。FAB-MS:[M+H]1169.3。
HOBt=羟基苯并三唑
pfp=五氟苯基
Fmoc=9-芴基甲氧羰基
Boc=叔丁氧羰基
DCC=二环己基碳二亚胺
(E)-DHs=(S,S)-2,7-二氨基-(E)-辛-4-烯-1,8-二酸。
Claims (23)
1、肽化合物,它包括两条单链血调节肽类,此肽类通过碳碳键或通过二价桥基-A-在上述每一肽类的等同位置上的非末端氨基酸的Cα原子处连接在一起,其中-A-为C1-6碳链,它i)a)被基团-RA、-ORA、-SRA、-NRARA和-COORA或被卤原子如氟、氯、溴或碘单或多取代(其中每个RA独立地代表氢原子或可被单或多羟基化的C1-6烷基、链烷酰基或烷氧基烷基),和/或b)被一个或多个双重或三重碳碳键隔开,和/或c)被一个或多个基团-Z-隔开,其中每个-Z-独立地为-O-、-CO-、
或-NRB-(其中每个RB独立地为氢原子或C1-6烷基或C6-10芳基),或其中一个或多个取代基或不饱和碳碳键存在于-A-中,-Z-也可以是-S-,或
ii)(CH2)Y,其中Y是1、5或6,
所述的每一Cα原子缺少天然的α-侧链。
2、根据权利要求1的肽化合物,其中所述桥基-A-是不饱和的。
3、根据权利要求2的肽化合物,其中所述桥基-A-选自
-CH2-
-CH2CH2CH2CH2CH2-
-CH2-CH2CH2CH2CH2CH2-
-HC=CH-
-HC=C=CH-
-CH2-CH=CH-CH2-
-CH2-C≡C-CH2-
-CH2-CH=CH-CH-CH-CH2-
-CH2-CH2-C≡C-CH2-CH2-
-CH2-C≡C-C≡C-CH2-
-CH2-O-CH2-
-CH2-NH-CH2CH2-
-CH2CH2-CO-CH2CH2-
-CH2-CH=CH-CH2-S-CH2-
-CH2-C≡C-CH2-NH-CH2CH2-或
-CH2-CH=CH-CH(COOH)CH2-
4、根据权利要求3的肽化合物,其中所述桥基-A-选自(E)-亚丁-2-烯基,
(Z)-亚丁-2-烯基,
亚丁-2-炔基,
亚甲基,
亚正戊基,和
亚正己基。
6、根据权利要求5的肽化合物,其中式Ⅰ肽键中n代表0。
7、根据权利要求5和6的任一权利要求的肽化合物,其中式Ⅰ肽键中m代表0。
8、根据任一权利要求5至7的肽化合物,其中所述桥基-A-被连到式Ⅰ的氨基酸Rd的Cα原子上。
9、根据任一权利要求5至8的式Ⅱ肽化合物:
其中-A-如权利要求1所定义,Ra、Rb、Rc、Re、Rf和n如权利要求5所定义。
10、根据任一权利要求1至9的下式肽化合物:
其中-A-如权利要求1所定义。
11、药物组合物,包括任一权利要求1至10中的肽化合物及药物载体或赋形剂。
12、任一权利要求1至10中的肽化合物用于刺激细胞分裂。
13、任一权利要求1至10中的肽化合物用于刺激骨髓组织生成或骨髓再生。
14、任一权利要求1至10中的肽化合物在制备刺激细胞分裂的药物中的用途。
15、根据权利要求14在制备刺激骨髓组织生成或骨髓再生的药物中的用途。
16、任一权利要求1至10中的肽化合物对刺激细胞分裂的用途。
17、根据权利要求16对刺激骨髓组织生成或骨髓再生的用途。
18、刺激病人细胞分裂的方法,该方法包括给所述病人服用有效量的任一权利要求1至10中的肽化合物。
19、根据权利要求18的方法,其中骨髓组织生成细胞或骨髓细胞的分裂受到刺激。
20、任一权利要求1至10中肽化合物的制备方法,包括使其部分或完全保护的衍生物去保护。
21、任一权利要求1至10中肽化合物的制备方法,该方法包括:
a)将双内酰亚胺醚金属取代并随后烷基化,生成双内酰亚胺二肽醚;
b)将步骤(a)的双内酰亚胺醚水解,生成桥连α,α′-二氨基酸;
c)在肽链中引入其余的氨基酸;
d)将任何保护的基团去保护。
22、下式桥连α,α′-氨基酸
其中-A-如权利要求1所定义。
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