CN1086205C - 一种丙氨酸氨基转移酶测定试剂盒 - Google Patents
一种丙氨酸氨基转移酶测定试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种丙氨酸氨基转移酶测定试剂盒,包括酶试剂、基质液、丙氨酸氨基转移酶、参考血清、参考血清复溶液以及试条,其特征在于:酶试剂的组成为:丙酮酸氧化酶3IU/L,过氧化物酶3IU/L,维生素C氧化酶5IU/L,黄素腺嘌呤二核苷酸36μmol/L;基质液的组成为:L-丙氨酸0.50mol/L,α-酮戊二酸0.003mol/L,显色剂,亚铁氰化钾0.0168g/L;试条主要有转运膜和反应膜组成,转运膜覆盖在反应膜的一半处。
Description
本发明涉及一种丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定试剂盒(全血微量试条),它属于生物化学法用于医学检验。分类号属于IPC G01N33/48。
丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase ALT)一直是临床上最常用的、诊断价值最高的酶,是肝细胞受损后首先能检出的肝功能异常指标之一,而血清ALT作为肝损害的标志酶沿用至今。ALT的测定是在ALT催化反应基础上进行的。
L-丙氨酸+α-酮戊二酸ALT L-谷氨酸+丙酮酸
通过测定生成物之一的丙酮酸来测定ALT。目前,临床上所采用的测定方法主要有两类:一类叫动力学法,主要有酶偶联连续监测法;另一类叫终点法,主要有赖氏比色法和丙酮酸氧化酶比色法。下面就这三个方法的测定原理和操作方法做一扼述。
1、酶偶联连续监测法
该法问世于八十年代,被国际临床化学联合会和我国卫生部临检中心推荐为临床测定ALT的参考或标准方法,该法的测定原理为:在ALT催化反应体系中加入乳酸脱氢酶(LDH)和还原辅酶I(NADH)。当转氨酶反应产生丙酮酸后,续发下列反应:
丙酮酸+NADH+H+ LDH L-乳酸+NAD+
在此偶联反应中,NADH的氧化速率与标本中酶活性呈正比,在340mm处监测吸光度的下降速率(-ΔA/min),计算出ALT的活性单位。操作步骤为:血清100μl,加入试剂I(100mol/L Tris缓冲液,500m mol/L L-丙氨酸,0.18mmol/L NADH,1200u/L LDH,pH7.3)1000μl,混匀,37℃温育5分钟后,加入试剂II(15m mol/Lα-酮戊二酸)100μl,混匀,启动LAT催化反应。在波长340nm,比色杯光径1.0cm,延滞期30秒,连续监测吸光度下降速率约60秒。测定所用仪器是自动生化分析仪,并有商品试剂盒供应。计算方法为:
=ΔA/min×1929
式中6220为NADH在340nm的摩尔吸光度,血清稀释倍数为12。
2、赖氏比色法
该法应用较早,七十年代作为全国推荐方法,至今许多基层医疗单位仍在广泛使用。该法的测定原理为:ALT的催化反应经30分钟后,加入214一二硝基苯肼终止反应,并与反应液中的二种α-酮酸反应生成相应的214-二硝基苯腙。在碱性条件下,两种苯腙的吸收光谱曲线有差别,在500-520nm处差异最大,以等摩尔浓度计算,丙酮酸苯腙的呈色强度约为α-酮戊二酸苯腙的三倍,据此可以算出丙酮酸的生成量。操作步骤为:在操作前取适量的底物溶液,(DL-丙氨酸200m mol/L,α-酮戊二酸2m mol/L,pH7.4)在37℃水浴箱内预温5min后使用。具体操作按下表进行。
混匀后,在37℃水浴箱中保温30分钟
加入物 测定管 对照管 |
血清(ml) 0.1 0.1 |
底物溶液(ml) 0.5 |
2,4二硝基苯肼溶液(ml) 0.5 0.5 |
底物溶液(ml) 0.5 |
各管混匀后,置37℃水浴保温20分钟,然后每管加入0.4mol/L氢氧化钠溶液5ml,室温放置5分钟,在波长505nm处以蒸馏水调零点,测定各管吸光度。测定管史光度减去样本对照管吸光度后,从标准曲线查得ALT活力。测定所用仪器为分光光度计。标准曲线的测定如下:
①按下表向各管加入相应试剂管号 0 1 2 3 40.1mol/L磷酸盐 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10缓冲液(ml)2m mol/L丙酮酸标准液(ml) 0 0.05 0.10 0.15 0.20底物缓冲液(ml) 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30相当于酶活力(卡门车位) 0 28 57 97 150
②各管加入2,4二硝基苯肼溶液0.5ml,混匀,37℃20分钟后加入0.4mo l/L氢氧化钠溶液5.0ml。
③混匀,放置5分钟后用分光光度计在波长505nm处,以蒸馏水调零后,读取各管的吸光度。各管吸光度均减去“0”号管吸光度,所得差值与对应的卡门酶活力单位作图。
3、丙酮酸氧化酶比色法
将该法用于ALT测定,日本是在七十年代末,我国是在九十年初.该法的测定原理为:在一定反应条件下ALT催化反应所产生的丙酮酸在黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和硫胺素焦磷酸(TPP)存在下,被丙酮酸氧化酶(PYOD)氧化产生过氧化氢,后者在过氧化物酶(POD)及4-氨基安替比林(4AA)、2,4一二氯苯酚存在下,形成醌亚胺而显红色,颜色的深浅与ALT活性成正比。反应式如下:
该法的操作步骤为:在空白、测定和校准管中分别加入蒸馏水、血清、校准血清各25μl,于37℃水浴预温,加入经预温至37℃的酶反应液100ul,准15分钟时加入终止剂1.5ml,混匀,于510nm比色,以空白管校零,读取各管吸光度。计算:
测定所用的仪器是分光光度计。反应试剂为:以pH7.0磷酸缓冲液配制,每升含:L-丙氨酸500m mol,α-酮戊二酸10m mol,2,4-二氯苯酚6m mol,亚铁氰化钾15μmol,丙酮酸氧化酶3000u,过氧化物酶3000u,4-氨基安替比林0.5m mol,FAD 36μmol,TPP 10μmol。终止剂为:100m mol/L EDTA-Na2溶液。与该法相配套的试剂盒子近年已经上市,该法在国外还用于干化学检测技术。
本发明的目的是克服现有技术缺点提供一种丙氨酸氨基转移酶测定试剂盒。
在我国肝病发病率较高,为了预防与及时地诊治肝病,医疗卫生部门每年都在一定范围内进行肝功普查。卫生部妇幼所颁布的托幼条例规定,凡入托入园儿童必须进行肝功能检查,在临床上众多的肝功能检查项目及方法中,酶学测定是肝病诊断、鉴别诊断、预后判断及疗效评价的重要依据。肝脏是机体内含酶最丰富的器官,当肝脏受损时,可因通透性增加、细胞坏死等,使血清酶量发生变化,ALT的变化很具特征性。酶偶联连续监测法、赖氏比色法和丙酮酸氧化酶比色法用于临床医学检查是成功的,但它们用于ALT的筛查工作则不够简便,主要因原有以下几点:其一血样采集不够简便,需静脉取血;其二必须使用分析仪器进行测定,有的需要昂贵仪器,且结果的判断不够直观,均需计算;其三赖氏比色法由于方法学上的限制,酶反应不够完全,测定结果不够准确,连续监测法由于仪器种类繁多,试剂来源不统一,造成测定结果的不一致性,室间可比性较差。针对目前所应用的方法在筛查工作中存在的问题,本发明人研制了一种以全血干化学技术为基础,以丙酮酸氧化酶法为原理的微量快速试条法。该法将试条法与丙酮酸氧化酶法相结合,兼具二者的优点,既具试条法的操作简便,结果判断直观的特点,又具丙酮酸氧化酶法的灵敏度高,结果准确的特点。与上述三种方法相比,该法血样易获取,采集末稍微量血即可,测定不需使用特殊的仪器,测定速度快。与国外的干化学法相比,干化学法虽可随机取样,但在血样采集后必须立即放入仪器进行操作,且干化学血液分析仪每次只能测试一份样品,仪器价格昂贵,常用于急症病人的监测,该法既可随机取样单个操作,更适合批量标本集中采样,成批进行测定,为群体普查如儿童入托入园、新兵入伍、婚检以及边远贫困地区的肝功能筛查工作提供了理想的测定方法,也为设备条件差和技术力量薄弱的基层卫生单位提供了一种方便,可靠的ALT检测方法。
本发明的目的是这样实现的:一种丙氨酸氨基转移酶测定试剂盒,包括酶试剂、基质液、丙氨酸氨基转移酶参考血清、参考血清复溶液以及试条,其特征在于:酶试剂的组成为:丙酮酸氧化酶3IU/L,过氧化物酶3IU/L,维生素C氧化酶5IU/L,黄素腺嘌呤二核苷酸36μmol/L;基质液的组成为:L-丙氨酸0.50mol/L,α-酮戊二酸0.003mol/L,2,4-二氯苯酚6mmol/L,4-氨基安替比林0.5mmol/L,亚铁氰化钾0.0168g/L;试条主要有转运膜和反应膜组成,转运膜(4)覆盖反应膜(2)并与之相连。还包括样品稀释液,组成为:氯化钠0.154mol/L,磷酸二氢钠273.9mg/L,磷酸氢二钠1.52g/L。还包括滴瓶,一次性定量采血管和酶标反应板。试条还包括底片、垫片和同心孔,底片(7)上放有垫片(6),在底片和垫片的前部有一同心孔(5),同心孔上盖有反应膜(2)。试条还包括保护膜和加样孔,保护膜(1)包在转运膜(4)上,其上有一加样孔(3)。
一种利用丙氨酸氨基转移酶测定试剂盒测定丙氨酸氨基转移酶的方法,包括以下步骤:
(1)将基质液加入酶试剂中,放置3-5分钟后再轻轻摇匀使之溶解完全,配置成酶工作液,严禁倒置,
(2)用参考血清复溶液溶解参考血清,配置出ALT含量为60U/L的参考血清,
(3)采取末稍血30μl,加到试条加样孔中,待血液全部渗入后,再向加样孔中加入样品稀释液1滴,放置2-3分钟,
(4)剥去保护膜,可见稀释血清已转运到反应膜上,用镊子从试条背面小孔处向上剥反应膜使翘起,再用镊子从试条正面取下反应膜放入酶标板反应孔中,
(5)取参考血清30μl代替全血,加到试条加样孔中,其他过程与步骤(3)和(4)相同,
(6)同时在样品及参考血清酶标板的每一反应孔中均加入酶工作液1滴,充分混合,酶标板立即置37℃恒温水浴箱支架上,保温15分钟,
(7)将酶标板从恒温水浴箱取出,对照参考血清孔颜色判定结果,凡比参考血清反应孔颜色深者即为阳性,应再作定量测定。
图1为试条的主视图。
图2为试条的剖视图。
图3为转运膜的示意图。
图4为底片的示意图。
图5为ALT标准色板。
图号说明:
1-保护膜、2-反应膜、3-小孔、4-转运膜、5-同心孔、6-垫片、7-底片。
1、丙酮酸氧化酶试条法的检测原理。
该试剂盒主要由试条和试剂两部分组成。试条主要由转运膜和反应膜组成。该法的检测原理为:将微量全血滴在转运膜上,转运膜将全血快速转移分离血清,将血清转移至反应膜上,然后在反应膜上直接滴加酶工作液,经15分钟保温进行丙酮酸氧化酶法的一系列反应而呈红色,与标准色板对照,或与参考血清按同法操作所显颜色相比较,判断结果是否正常。
试条的结构特征,组成和技术特征如下(参见附图1-4):
转运膜为过滤纸,反应膜为PFO2纸(即6902-M型医用纸,产地天津),保护膜为铝箔纸,其上有一加样孔;垫片和底片均为塑料板。试条结构为:在底片7上放有一垫片6,在底片和垫片的前部有一同心孔5,同心孔上盖有一反应膜2,反应膜与转运膜4相连接,转运膜覆盖在反映膜上,其弧形顶端与反映膜的圆心相吻接,保护膜1包在前部,右部上端有一小孔3为加样孔。
底片的作用是起支撑作用,同时为了手持操作方便;垫片是为了垫高同心孔,并维持一定的柔软性;同心孔是接收过量的反应液;转运膜的作用是将反应物转移到反应膜上,其技术特征是在短时间内使血球与血清迅速分离,阻滞血球扩散并沉积在转运膜基底部,血清定向快速转移至反应膜,并无溶血现象,转运膜本身不吸附被测成分,反应膜的作用是特异吸附反应物,对反应膜的技术要求是质地疏松,均匀一致,具有一定的紧度、厚度,保证一定的容血量,扩散速度快、渗透性好。
2、试剂盒组成
A、样品稀释液
B、酶试剂
C、基质液
D、ALT参考血清
E、滴瓶
F、参考血清复溶液
G、一次性定量采血管
H、试条
I、酶标反应板
3、试剂盒的制造
(1)试剂的制造
A.样品稀释液的配方
氯化钠:0.154mol/L
磷酸二氢钠:273.9mg/L
磷酸氢二钠:2.51g/L
B.酶试剂的配方
丙酮酸氧化酶:3IU/L
过氧化物酶:3IU/L
维生素C氧化酶:5IU/L
黄素腺嘌呤二核苷酸:36μmol/L
C.基质液的配方
L-丙氨酸:0.5mol/L
α-酮戊二酸:0.003mol/L
2,4-二氯苯酚:6m mol/L
4-氨基安替比林:0.5m mol/L
亚铁氰化钾:0.0168g/L
(2)试条的制造
基底材料切割→贴垫片→冲孔→贴反应膜
转运膜→贴保护膜→切成试条→包装入袋。
4、试剂盒的使用方法
配制酶工作液:用基质液(C)3.5ml加入酶试剂(B)中复溶成酶工作液,放置3-5分钟后再轻轻摇匀使之溶解完全。严禁倒置,溶解后将酶工作液倒入丙氨酸氨基转移酶滴瓶(E)中备用。
配制参考血清:用参考血清复溶液(F)-ml复溶参考血清(D),配制出参考血清ALE=60U/L。
方法一、适用于群体检测
①用定量采血管取末稍血30μl,加到试条加样孔中。
②待血液全部渗入后(约2-3分钟)再从加样孔中加入样品稀释液(A)1滴(约25μl),放置2-3分钟。
③剥去保护膜,可见稀释血清已转运到反应膜上,用镊子从试条背面小孔处向上拨反应膜使翘起。再用镊子从试条正面取下反应膜放入酶标板反应孔中。
④ALT参考反应膜的制备:取参考血清30μl代替全血,加到试条加样孔中,其它过程同②、③。
⑤同时在标本及参考血清酶标板每一反应孔中均加入酶工作液1滴(约25μl)充分混合,酶标板立即置37℃恒温水浴箱支架上,保温20分钟。
⑥结果观察:从恒温水箱取出后,对照参考血清孔颜色判读结果。凡比参考血清反应孔颜色浅者为ALT正常,与参考血清颜色相近者视为弱阳性,凡比参考血清反应孔颜色明显深者即视为阳性应再做定量测定。也可以对照标准色板判读结果。
方法二、适用于门诊单项检查
①用定量采血管取末稍备30μl,加到试条加样孔中。
②待血液全部渗入后(约2-3分钟)再从加样孔中加入样品稀释液(A)③1滴(约25μl)放置2-3分钟。
③剥去保护膜,可见稀释血清已转运到反应膜上,用镊子去掉转运膜,借助试条上端及中端不干胶将试条贴在塑料反应托架上,使反应膜正置托架空隙处。
④在反应膜上滴加酶工作液1滴(约25μl)立即置37℃恒温水浴箱托架上,准时计时,反应20分钟。
⑤结果判断:取出试条,观察反应膜颜色变化,并对照色板判读结果。凡比45u颜色浅为正常,深者即视为阳性,应进一步测定。
该产品对ALT的检测效果可以从以下几个方面评价:
1.重现性
①同一份血清同时做20次,结果色泽变化一致,同一份混合血清分别做20次,结果色泽变化一致。
②取酶偶联连续监测法测得酶活力分别为32、54和120U血清分别加入经生理盐水洗涤三次的“O”型血球,按血清61%、血球39%比例配成全血血样。按上述试条法的方法一操作,同时测定10次,每份测3条,各条结果颜色变化一致。以上样本分次测定10次,每份测2条,结果颜色变化一致。
重现性试验的结果表明,试条法具有良好的重现性。
2.对比实验
试条法与酶偶联连续监测法对比:选择样本100份,用连续监测法测定ALT活力,其中45例介于10-50U,35例介于50-100U,25例介于100-400U,向血清中加入经生理盐水洗涤三次“O”型血球,按血清61%、血球39%配成全血。经用试条法测试,符合率为100%。结果表明:试条法的测定结果与连续监测法基本一致,试条法具有良好的准确性。
3.稳定性试验
该项试验主要考察试剂的稳定性,分为两个部分的内容:
①对连续三个批号的产品在一年内稳定性的考察,实验数据资料如下:
产品稳定性实验数据资料一
从连续三批(批号:960901,960902,960903)产品中随机抽样,每批抽3盒,每盒测定5次,观察不同时间:
1)酶试剂复溶时间;
2)复溶后清晰度;
3)空白值;
4)参考血清反应膜变化;
5)值控血清(正常值、病理值)实测结果。
逐项进行检测,并将结果与制检规程中质控标准相比较,以确定试剂的开瓶后有效期限。制检规程中的质控标准见表1,稳定性实验数据资料见表2。
表1.制检质控标准:
酶试剂复溶时间 | <10分钟 | |
复溶后清晰度 | 澄清 | |
试剂空白 | 反应膜基本不显色 | |
参考血清反应膜变化 | 呈色明显,易判别 | |
质控血清测定结果 | 正常值 | 应比参考反应膜呈色浅,易分辨 |
病理值 | 应比参考反应膜呈色深,易分辨 |
表2.批号,960901
项目 | 结果 | |
96.10.10 97.01.09 97.05.09 97.08.08 97.10.09 | ||
酶试剂复溶时间 | 2 2 2 2 2 | |
复溶后清晰度 | 澄清 澄清 澄清 澄清 澄清 | |
试剂空白 | 不显色 不显色 不显色 不显色 不显色 | |
参考血清反应膜变化 | 明显易判别 明显易判别 明显易判别 明显易判别 明显易判别 | |
测定结果 | 正常值 | 浅易分辨 浅易分辨 浅易分辨 浅易分辨 浅易分辨 |
病理值 | 深易分辨 深易分辨 深易分辨 深易分辨 深易分辨 |
注:测定的正常值、病理值血清为BOEHRINGER MANNHEIM公司产品,批号分别为I8963710和I8789408。
表2.批号:960902
项目 | 结果 | |
96.10.10 97.01.09 97.05.09 97.08.08 97.10.09 | ||
酶试剂复溶时间 | 2 2 2 2 2 | |
复溶后清晰度 | 澄清 澄清 澄清 澄清 澄清 | |
试剂空白 | 不显色 不显色 不显色 不显色 不显色 | |
参考血清反应膜变化 | 明显易判别 明显易判别 明显易判别 明显易判别 明显易判别 | |
测定结果 | 正常值 | 浅易分辨 浅易分辨 浅易分辨 浅易分辨 浅易分辨 |
病理值 | 深易分辨 深易分辨 深易分辨 深易分辨 深易分辨 |
注:测定的正常值、病理值血清为BOEHRINGER MANNHEIM公司产品,批号分别为I8963710和I8789408。
表3.批号:960903
项目 | 结果 | |
96.10.10 97.01.09 97.05.09 97.08.08 97.10.09 | ||
酶试剂复溶时间 | 2 2 2 2 2 | |
复溶后清晰度 | 澄清 澄清 澄清 澄清 澄清 | |
试剂空白 | 不显色 不显色 不显色 不显色 不显色 | |
参考血清反应膜变化 | 明显易判别 明显易判别 明显易判别 明显易判别 明显易判别 | |
测定结果 | 正常值 | 浅易分辨 浅易分辨 浅易分辨 浅易分辨 浅易分辨 |
病理值 | 深易分辨 深易分辨 深易分辨 深易分辨 深易分辨 |
注:测定的正常值、病理值血清为BOEHRINGER MANNHEIM公司产品,批号分别为I8963710和I8789408。结果表明,该产品放置一年内基本稳定。
②用户使用时配制酶工作液的稳定性考察,实验数据资料如下:产品稳定性实验数据资料二
从连续三批(批号:970801,970802,970803)产品中随机抽样,每批抽2盒,每盒测定5次,观察试剂复溶后在冰箱2-8℃保存和室温保存不同时间。
(1)空白值;
(2)参考血清反应膜变化;
(3)质控血清(正常值、病理值)实测结果
逐项进行检测,并将结果与制检规程中质控标准相比较,以确定试剂的开瓶后有效期限。制检规程中的质控标准见表1,稳定性实验数据资料见表2。
表1、制检质控标准:
表2、批号:970801 开瓶后2-8℃保存
试剂空白 | 反应膜基本不显色 | |
参考血清反应膜变化 | 呈色明显,易判别 | |
质控血清测定结果 | 正常值 | 应比参考反应膜呈色浅,易分辨 |
病理值 | 应比参考反应膜呈色深,易分辨 |
项目 | 结果 | |
9.9 10.9 11.9 12.9 12.16 | ||
试剂空白 | 不显色 不显色 不显色 不显色 不显色 | |
参考血清反应膜变化 | 明显易判别 明显易判别 明显易判别 明显易判别 明显易判别 | |
测定结果 | 正常值 | 浅易分辨 浅易分辨 浅易分辨 浅易分辨 浅易分辨 |
病理值 | 深易分辨 深易分辨 深易分辨 深易分辨 深易分辨 |
注:
1.试验时间为1997年10月;9.9表示9日上午9时;12.16表示12日下午16时。
2.测定的正常值、病理值血清为BM公司产品,批号分别为18962710和18789408。
表2、批号:970801 开瓶后室温保存
项目 | 结果 | |
9.9 9.13 9.15 9.17 9.18 | ||
试剂空白 | 不显色 不显色 不显色 不显色 不显色 | |
参考血清反应膜变化 | 明显易判别 明显易判别 明显易判别 明显易判别 明显易判别 | |
测定结果 | 正常值 | 浅易分辨 浅易分辨 浅易分辨 浅易分辨 浅易分辨 |
病理值 | 深易分辨 深易分辨 深易分辨 深易分辨 深易分辨 |
注:
1.试验时间为1997年10月;9.9表示9日上午9时。
2.测定的正常值、病理值血清为BM公司产品,批号分别为18962710和18789408。
表2、批号:970802 开瓶后2-8℃保存
项目 | 结果 | |
9.9 10.9 11.9 12.9 12.16 | ||
试剂空白 | 不显色 不显色 不显色 不显色 不显色 | |
参考血清反应膜变化 | 明显易判别 明显易判别 明显易判别 明显易判别 明显易判别 | |
测定结果 | 正常值 | 浅易分辨 浅易分辨 浅易分辨 浅易分辨 浅易分辨 |
病理值 | 深易分辨 深易分辨 深易分辨 深易分辨 深易分辨 |
注:
1.试验时间为1997年10月;9.9表示9日上午9时;12.16表示12日下午16时。
2.测定的正常值、病理值血清为BM公司产品,批号分别为18962710和18789408。
表2、批号:970808 开瓶后室温保存
项目 | 结果 | |
9.9 9.13 9.15 9.17 9.18 | ||
试剂空白 | 不显色 不显色 不显色 不显色 不显 | |
参考血清反应膜变化 | 明显易判别 明显易判别 明显易判别 明显易判别 明显易判别 | |
测定结果 | 正常值 | 浅易分辨 浅易分辨 浅易分辨 浅易分辨 浅易分辨 |
病理值 | 深易分辨 深易分辨 深易分辨 深易分辨 深易分辨 |
注:
1.试验时间为1997年10月;9.9表示9日上午9时。
2.测定的正常值、病理值血清为BM公司产品,批号分别为18962710和18789408。
表2、批号:970803 开瓶后2-8℃保存
项目 | 结果 | |
9.9 10.9 11.9 12.9 12.16 | ||
试剂空白 | 不显色 不显色 不显色 不显色 不显色 | |
参考血清反应膜变化 | 明显易判别 明显易判别 明显易判别 明显易判别 明显易判别 | |
测定结果 | 正常值 | 浅易分辨 浅易分辨 浅易分辨 浅易分辨 浅易分辨 |
病理值 | 深易分辨 深易分辨 深易分辨 深易分辨 深易分辨 |
注:
1.试验时间为1997年10月;9.9表示9日上午9时;12.16表示12日下午16时。
2.测定的正常值、病理值血清为BM公司产品,批号分别为18962710和18789408。
表2、批号:970803 开瓶后室温保存
项目 | 结果 | |
9.9 9.13 9.15 9.17 9.18 | ||
试剂空白 | 不显色 不显色 不显色 不显色 不显色 | |
参考血清反应膜变化 | 明显易判别 明显易判别 明显易判别 明显易判别 明显易判别 | |
测定结果 | 正常值 | 浅易分辨 浅易分辨 浅易分辨 浅易分辨 浅易分辨 |
病理值 | 深易分辨 深易分辨 深易分辨 深易分辨 深易分辨 |
注:
1.试验时间为1997年10月;9.9表示9日上午9时。
2.测定的正常值、病理值血清为BM公司产品,批号分别为18962710和18789408。结果表明:酶工作液2-8℃保存,可稳定8天,室温可稳定8小时。
实施例
该产品经天津肝病研究所、天津儿童保健所、天津市第三中心医院和天津市天和医院的临床使用,认为试条法操作简便、结果可靠,是ALT分析和筛选试验的理想方法。该法与酶偶联连续监测法及赖氏法呈良好的相关性。四家医院的临床使用考核资料如下:
丙氨酸氨基转移酶(ALT)微量快速试剂盒应用报告
一、材料和方法:
1、对象:1996-1997年6月在门诊及查体工作中应用,共检测2780人份。
2、试剂:使用北京远东协和生物技术公司丙氨酸微量快速试剂盒。
3、方法:受检者均从末梢取血。取30ul全血,加到试条加样孔中,待2分钟转移,加样品稀释液一滴,37℃保温15分钟,取出对照标准色板观察结果。
二、结果:
1、定性实验:ALT<40u/L或<20赖氏单位为正常;
ALT>40u/L或>20赖氏单位为阳性,
2、在受检的2780人中,定性实验阳性者共31人,占1.11%,对定性阳性者用连续监测法做对照实验,结果ALT均大于40u/L(范围:42-215u/L)。两种方法结果一致。
三、结论:
北京远东协和生物技术公司生产的丙氨酸氨基转移酶试剂盒用血量少、简便、快速、准确,可用于ALT肝功能实验初筛检查。
丙氨酸氨基转移酶(ALT)四种实验方法对比观察
丙氨酸氨基转移酶(ALT)实验方法大致有以下四种:
1.ALT酶偶联连续监测法(简称方法1);
2.ALT赖氏法(方法2);
3.丙酮酸氧化酶法(方法3);
4.ALT微量快速试条法(方法4)。拟对四种实验方法进行对比,并在普查中实际应用,报告如下:
一、实验方法和材料:
1、ALT测定方法:①酶偶联连续监测法TOSHIBA TBA-40
中生药盒
②赖氏法北化药盒用HITACHI-220A紫外分光
光度计比色
③丙酮酸氧化酶法北京远东协和药盒BIO-RAD450
酶标仪比色
④微量快速试条法北京远东协和药盒
2、观察对象:
(1)任选肝炎门诊血清标本71例,其中有ALT正常和异常者。
(2)在华北电建1060名职工查体中分别取静脉血按方法1、4进行试验,方法4用血清代替全血按试条法做转移,以反应膜测定ALT活力,做筛选实验。
二、结果:
1.正常参考值:
(1)国际单位表示ALT<40u/L为正常;ALT≥40u/L为阳性;
(2)赖氏单位表示ALT<20“u”为正常;ALT≥20“u”为阳性;
2.按四种测定方法对71例标本进行检测,同时与北京远东协和公司方法3药盒做相关检验:
(1)方法1与方法3∶r=0.9823,Y=10.1789+1.0462X;
(2)方法2与方法3∶r=0.9719,Y=4.5031+0.4464X;
(3)方法1ALT≥40u/L有34例(范围40.3-328u/L),以方法4做筛选实验结果均为阳性;
(4)国际单位值(u/L)与赖氏单位值(U)之比为2.05∶1。
3.华北电建1060名职工查体结果,方法1异常者122例,占11.51%。用方法4做筛选实验也均为阳性。其中有5例方法1为35-40u/L,方法4判为阳性。主要是为防止漏诊。
三、结论:
1、丙酮酸氧化酶法测定ALT与传统的酶偶联连续监测法和赖氏法有较好的相关关系。该法用血量少、操作简便、结果准确,开辟了一种ALT终点分析的可靠方法。
2、丙酮酸氧化酶法为一种终点分析方法,其测得单位值与传统的赖氏法单位值比较为2.05∶1;此值的确定对酶的连续监测法和终点分析方法结果进行对比提供了依据。
3、微量快速试条法,只需末梢血一滴快速测定,可作为ALT检测的一种筛选方法。尤其适合于儿童和成人的普查应用。
4、华北电建普查结果表明,在某些集体作业工作生活的人群中,吃、住在一起,卫生条件难以保证,极易造成肝炎传播。提示此类人群应加强监测,以做到对肝炎的早期防治。
Claims (4)
1.一种丙氨酸氨基转移酶测定试剂盒,包括酶试剂、基质液、丙氨酸氨基转移酶、参考血清、参考血清复溶液以及试条,其特征在于:酶试剂的组成为:丙酮酸氧化酶3IU/L,过氧化物酶3IU/L,维生素C氧化酶5IU/L,黄素腺嘌呤二核苷酸36μmol/L;基质液的组成为:L-丙氨酸0.50mol/L,α-酮戊二酸0.003mol/L,显色剂,亚铁氰化钾0.0168g/L;试条主要有转运膜和反应膜组成,试条还包括底片、垫片和同心孔,底片(7)上放有垫片(6),在底片和垫片的前部有一同心孔(5),同心孔上盖有反应膜(2);还包括样品稀释液,组成为:氯化钠0.154mol/L,磷酸二氢钠273.9mg/L,磷酸氢二钠1.52g/L;还包括滴瓶,一次性定量采血管和酶标反应板。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于所述的显色剂为2,4-二氯苯酚6mmol/L和4-氨基安替比林0.5mmol/L。
3.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于试条还包括保护膜和加样孔,保护膜(1)包在转运膜(4)上,保护膜(1)上有一加样孔(3)。
4.一种利用权利要求1所述的试剂盒测定丙氨酸氨基转移酶的方法,包括以下步骤:
(1)将基质液加入酶试剂中,放置3-5分钟后再轻轻摇匀使之溶解完全,配置成酶工作液,严禁倒置,
(2)用参考血清复溶液溶解参考血清,配置出ALT含量为60IU/L的参考血清,
(3)采取末稍血30μl,加到试条加样孔中,待血液全部渗入后,再向加样孔中加入样品稀释液1滴,放置2-3分钟,
(4)剥去保护膜,可见稀释血清已转运到反应膜上,用镊子从试条背面小孔处向上剥反应膜使翘起,再用镊子从试条正面取下反应膜放入酶标板反应孔中,
(5)取参考血清30μl代替全血,加到试条加样孔中,其他过程与步骤(3)和(4)相同,
(6)同时在样品及参考血清酶标板的每一反应孔中均加入酶工作液1滴,充分混合,酶标板立即置37℃恒温水浴箱支架上,保温15分钟,
(7)将酶标板从恒温水浴箱取出,对照参考血清孔颜色判定结果,凡比参考血清反应孔颜色浅者为丙氨酸氨基转移酶正常,与参考血清颜色相近者视为弱阳性,凡比参考血清反应孔颜色明显深者即视为阳性应再做定量测定;也可以对照标准色板判读结果。
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