CN108601340B - 作为用于组织学制品的固定剂的无酸乙二醛 - Google Patents

作为用于组织学制品的固定剂的无酸乙二醛 Download PDF

Info

Publication number
CN108601340B
CN108601340B CN201780010590.8A CN201780010590A CN108601340B CN 108601340 B CN108601340 B CN 108601340B CN 201780010590 A CN201780010590 A CN 201780010590A CN 108601340 B CN108601340 B CN 108601340B
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
glyoxal
acid
fixation
histological
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201780010590.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108601340A (zh
Inventor
G·布索拉蒂
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Addax Biosciences SRL
Original Assignee
Addax Biosciences SRL
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Addax Biosciences SRL filed Critical Addax Biosciences SRL
Publication of CN108601340A publication Critical patent/CN108601340A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108601340B publication Critical patent/CN108601340B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/0231—Chemically defined matrices, e.g. alginate gels, for immobilising, holding or storing cells, tissue or organs for preservation purposes; Chemically altering or fixing cells, tissue or organs, e.g. by cross-linking, for preservation purposes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
    • G01N2001/305—Fixative compositions
    • G01N2001/307—Fixative compositions non-toxic, no Hg, no formaldehyde

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Sampling And Sample Adjustment (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及用于组织学制品固定的组合物，其包含乙二醛溶液，其中已经除去通常存在于商购可获得的乙二醛中的酸。本发明的组合物提供了用于保存组织中的结构、抗原组分和核酸的最佳固定剂。无酸乙二醛具有有限的毒性，不被认为是致癌剂，并且是用于固定组织和细胞的福尔马林的有效替代物。

Description

作为用于组织学制品的固定剂的无酸乙二醛
本发明涉及用于固定组织学和细胞学制品的组合物，其包含不含酸的乙二醛溶液。
引言
目前，用含有甲醛的水溶液，并且特别是含有4％甲醛的水溶液(称为福尔马林)进行组织学组织的保存和固定。
福尔马林的使用在工业中非常广泛，用于树脂的生产和皮革的固定，并且在医学领域中，用于组织的转移，用于它们的保存(例如在博物馆中)和用于组织学的固定。这必须在石蜡包埋、组织学制品的切片和染色之前进行，以便允许组织学诊断的显微镜检查(Fox等人，Formaldehyde fixation.J.Histochem.Cytochem,33,845-853,1985)。
福尔马林在世界范围内应用：仅在意大利，消费量就达数百万升。因此，福尔马林的应用涉及技术人员和护士，以及暴露于使用福尔马林和吸入甲醛蒸气的病理学家。
长期以来已知甲醛的毒性：它是一种过敏性和有毒物质，可引起皮肤湿疹和呼吸道哮喘，并且被归类为致癌物。尽管甲醛仍然被认为是选择的固定剂这一事实(BuesaRJ.Annals of Diagnostic Pathology 12(2008)387–396))，但其使用会引起问题。
考虑到这种挥发性试剂的毒性，环保部门越来越担心，因此欧洲国家已提出从2016年开始禁止使用福尔马林，因为2014年6月5日的EC Regulation n.605/2014修改了ECRegulation n.1272/2008。该决定虽然在该试剂定义为致癌物(1B/21类)和诱变剂方面是有道理的，但可能对诊断病理学产生沉重的并且可能是不可接受的影响。对这种情况的反应目前仅限于采用旨在防止过度暴露于甲醛蒸气的保护程序，但毫无疑问，这种情况只能通过采用替代福尔马林的无毒固定剂来解决。
已经提出了许多替代福尔马林的固定剂(Buesa RJ.,上文所述；Zanini等人，Environmental Health 2012,11:59)，但是这些中无一被证明提供快速和令人满意的固定。
最初由Wicks e Suntzeff(Wicks LF和Suntzeff V.Science,98,204,1943)提出使用乙二醛(草醛)作为福尔马林替代物用于组织固定。这种双功能试剂倾向于在溶液中形成聚合物并且在蛋白质中形成分子内和分子间交联(Hopwood D.Histochemie,20,127-132,1969)。在溶液中，乙二醛产生多种水合形式，其中最常见的是在室温形成的环状二聚体1,3-二氧戊环(Dapson RW.Biotechnic&Histochemistry 2007,82(3):161_166)。乙二醛具有非常低的蒸气压，即使在相对较高的温度(25-60℃)也不会产生蒸气，因此没有蒸气吸入的风险(Anon.1986,Glyoxal,a Technical Brochure.American Cyanamid Company,Wayne,NJ.50pp.)。
已经对该物质作为组织学固定剂的应用进行了大量研究(Sabatini等人,J Cell Biol.1963Apr；17:19-58)。在US 7368132和CA 2119554中分别描述了使用乙二醛与锌盐或与醇的混合物以改善组织学固定的结果。
然而，几项研究证实，乙二醛不能保证令人满意的类似于福尔马林产生的形态保存(Buesa RJ.,Annals of Diagnostic Pathology 12(2008)387-396；Marcon等人Annalesde Pathologie 29,460-467；2009)。甚至市场上可用的许多制品作为替代福尔马林的固定剂，其中含有添加到其它物质例如乙醇、甲醇或金属(锌)中的乙二醛，但没有得到令人满意的结果，也没有一个符合组织学家的青睐。在Marcon等人的研究中，作者将基于乙二醛的多种溶液的固定特性与甲醛溶液作为参考进行了比较。比较与评估中的多种参数(形态保存，核酸保存等)相关的结果，基于乙二醛的溶液导致远比福尔马林差。作者得出结论，基于乙二醛的溶液不能被推荐，因为有害作用例如红细胞裂解(Buesa,2008；Macon等人,2009)或微钙化的溶解(U mlas J.和TuleckeMT.,Human Pathology 35,1058-62,2004)。此外，荧光原位杂交(FISH)分析导致技术上不可接受的结果(Tubbs RR,Hsi ED,Hicks D,GoldblumJ.Am J Surg Pathol 2004；28(3):417-419；Willmore-Payne C,Metzger K,LayfieldLJ.Appl Immunohistochem Mol Morphol 2007；15(1):84-87)并且提取和测序核酸证明不令人满意(Gillespie JW,Best CJ,Bichsel VE,Cole KA,Greenhut SF,Hewitt SM等人AmJ Pathol 2002；160(2):449-457)。这种效果是由商品上基于乙二醛的固定剂产生的。这些试剂的确切组成尚不清楚，但它们包含乙二醛、乙醇、甲醇和锌。
据报道所有这些专有固定剂(
Figure BDA0001759469610000031
Shandon；
Figure BDA0001759469610000032
Bioworld；
Figure BDA0001759469610000033
Amresco；
Figure BDA0001759469610000034
Anatech和Safe-Fix
Figure BDA0001759469610000035
FisherScientific)是酸性的(在pH为4的范围内)。Marcon等人(2009)和Gehin-Marcon N.(2008年6月13日讨论的论文,l’Universitède Nancy)尝试了在不同pH值的磷酸盐缓冲液中的不同的乙二醛溶液，但该研究主要是在pH值为4的乙二醛溶液中进行的。特别地，Gehrin-Marcon(2008)在她的论文中提到(讨论，第142-143页)“我们在早期的工作(试验)中已经看到，pH7的4％乙二醛是一种不良组织学固定剂，没有得到保存良好的微观解剖学。添加少量百分比的乙醇(10％)和溶液酸化(pH 4)可以获得更好的结果”。应当注意，该论文没有说明通过向pH 7缓冲液中添加商品4％乙二醛而制备的固定剂是否是在制备后立即使用或之后使用，以及是否检查了固定剂的最终pH(溶液随时间不稳定)。而且，在使用时没有给出关于溶液pH的信息。此外，酸没有从乙二醛溶液中除去。该问题将在本发明的描述中得到解决，特别是实施例5。
本发明的描述
现在已经令人惊讶地发现并且与先前的研究相反，通过除去其酸内容物，可以显著改善乙二醛作为固定剂的性质。
目前作为纯试剂(乙二醛，40wt％水溶液，代码N.128465,Sigma Aldrich,Milano)可获得的乙二醛实际上具有强酸性pH(约pH 4)，因为存在乙醛酸、草酸、羟基乙酸、乙酸和甲酸，它们是在乙二醛制备过程中和逐步制备后，由于醛部分的降解和氧化而形成的(Zhiyong Zhang,Dishun Zhao和Baoyun Xu,Journal of Chromatographic Science2013；51:893-898)。使用强碱(NaOH)可以获得这些酸的中和，或者可以使用离子交换树脂除去。由此获得的试剂，在此定义为具有定义浓度的水溶液中的无酸乙二醛(G.A.F.)，证明是组织学固定剂，其在细胞和组织的保存中具有优异的品质。
因此，本发明涉及不含酸的乙二醛作为组织学固定剂的用途。
本发明还涉及用于固定组织学组织的试剂盒，其包含“盒中袋”型容器或真空袋，其含有本发明的固定剂或其它试剂(染料、缓冲液和常用于组织学的其它试剂)。
与福尔马林相比，本发明的固定剂不仅不释放有毒蒸气(与甲醛相反)，而且还快速、迅速渗透到组织中并且产生组织和细胞特征(类似于在重要条件下存在的那些)的保存。
发明详述
术语“无酸乙二醛”是指乙二醛的水溶液，其重量浓度可在0.1％至90％，优选1.5％至50％，更优选2％至20％之间变化，其具有的pH值为7.1至8.0，优选7.2-7.4。具有pH7.3±0.2的2％溶液是特别优选的。
用作组织学和细胞学固定剂的本发明溶液可以通过用离子交换树脂除去酸内容物或通过用氨、碱性氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐例如NaOH、KOH、钠、钙、锌或钡的碳酸盐中和，由商购可获得的乙二醛40％溶液制备。
报道了消除酸的方法的实例。
通过离子交换树脂除去酸
将30g离子交换树脂Bio-Rad AG 501-X8(Bio-Rad；Milan)加入到150mL商购40％乙二醛(Sigma)溶液中。60’后，过滤该复合物，得到150mL澄清溶液。向该液体中加入蒸馏水或盐水溶液(NaCl 0.9％)至浓度为2％w/w的乙二醛。该溶液的pH达到约中性，从而证实了离子交换树脂实现了酸的去除。
通过将无酸乙二醛加入到0.1M pH 7.2的磷酸盐缓冲液中，得到2％的乙二醛溶液，其pH仍然保持在7.2。
以类似的方式，使用强碱性离子交换树脂(
Figure BDA0001759469610000041
IRA-400氯化物形式；Sigma,Milano)，通过上述方法，实现从乙二醛溶液中完全除去酸。所述盐水溶液或磷酸盐缓冲液中的2％乙二醛溶液产生用作组织学固定剂的试剂。
相反，当将强酸商购乙二醛(Sigma)加入到pH 7.0或7.2的0.1M磷酸盐缓冲液中至终浓度为2％或4％时，所得溶液变得非常酸性，远低于中性。
通过离子交换树脂将除去酸的100mL的40％乙二醛溶液保持在室温。1周后，由于乙二醛氧化成乙醛酸，所以该溶液的pH最初为约中性逐渐降低并达到pH 4.8。
这种酸化过程导致组织的结构和成分保存不良的固定剂。
这意味着在从乙二醛溶液中除去酸后，必须防止导致酸形成的试剂氧化。
这可以通过(任选地，组合地)使用以下方法获得：a)使用防止溶液与空气接触的容器，或b)保持溶液冷冻直至使用，或c)添加抗氧化剂，例如抗坏血酸或硫化物或醇例如乙醇。
a)William Scholle于1955年提出了“盒中袋”技术，目前用于保存葡萄酒并且防止暴露在空气中。液体被引入塑料盒中，然后将袋子用塞子封闭，并且空气存在被完全消除。然后将袋子引入盒中，从那里将塞子置于外部。液体的摄取涉及袋的体积减小，但阻止了空气进入。
作为实例，将3升2％无酸乙二醛pH 7.1的溶液引入“盒中袋”(Ondulati eImballaggi del Friuli spa,Villesse,Gorizia)。从该容器中提取液体作为固定剂并且持续检查pH。6个月后，溶液的pH仍然保持在pH 7以上，因此证实不存在由于氧化的酸化。
作为替代方案，始终以防止与空气接触，从而防止乙二醛氧化为目标，将1000mL2％无酸乙二醛溶液(pH 7.3)引入塑料袋Seal-SAFE(Milestone,Soresole(BG),Italy)，然后使用装置Tissue-SAFE(Milestone)施加真空操作。6个月后，pH仍高于7，证实不存在由于氧化的酸化。
b)无酸乙二醛溶液，加入或不加入至缓冲溶液，例如磷酸盐缓冲液pH 7.2-7.4，优选7.3中，如果在-1℃至-80℃之间，优选在-20℃的温度冷冻，则维持稳定。液体一旦冷冻，则不会发生氧化和酸化，一旦解冻，则可以用于固定。
c)为了防止乙二醛氧化从而使其酸化(pH降低至中性以下，从而使固定质量变坏)，添加抗氧化剂例如抗坏血酸(Sigma)，百分比为0.01至20％，优选1％，和/或三甲基苯酚(Sigma)，百分比为0.01％至20％，优选0.1％，或醇例如乙醇(Carlo Erba,Milan)，百分比为1％至90％。
特别地，将20％无酸乙二醛在乙醇50％中的溶液维持pH约为中性数月。
此外，我们还观察到其它试剂，例如乙二醇和聚乙二醇，浓度范围为0.1％至50％，优选5％，随着时间的推移有效地防止了乙二醛溶液的酸化。
下列实施例更详细地说明本发明。
实施例1
在超过诊断目的情况下采集组织样品(来自20例大肠壁、结肠癌、乳癌)。
来自手术室的新鲜碎片具有3-4mm厚度，与目前用于诊断目的的碎片类似。将包埋入盒中的样品在室温浸入固定液中。
从同一病例中，将平行取样的样品浸入3种不同类型的固定剂中：1)磷酸盐缓冲福尔马林(PBF)(Diapat,Bergamo)，2)溶于pH 7.2的磷酸盐缓冲液中的商购2％乙二醛(Sigma,Milano)(然后检查该溶液的pH，最终pH为6.5)；3)，在pH 7.3的磷酸盐缓冲液中的2％无酸乙二醛。
在室温固定3或24小时，然后使用Leica处理器(Leica,Milano)通过醇脱水和石蜡包埋常规处理盒。
从石蜡块获得组织切片并且用苏木精-曙红平行染色。
对于以下抗原，对固定在福尔马林(制品1)和无酸乙二醛(制品3)中的碎片切片进行免疫组织化学染色：大范围细胞角蛋白；细胞角蛋白19；CDX2和Ki67。在平行切片上，还对ALK和HER2基因进行FISH染色。
结果
在显微镜检查时，在制品2中固定的组织，即在商购2％乙二醛溶液中，最终pH为6.5，显示出与文献(Dapson,2007；Buesa,2008；Macon等人,2009)中描述的乙二醛固定相关的缺点，即：上皮与间质之间收缩存在下组织的共同作用(cohartation)，红细胞裂解，清晰的细胞核，以及核酸物质的损失。
相反，固定在无酸乙二醛(制品3)中的组织显示出最佳固定，避免了上面列出的缺陷并且类似于在福尔马林(制品1)中固定的组织中获得的固定。
对于细胞角蛋白L:S:，对于细胞角蛋白19，对于CDX2和Ki67的免疫组织化学反应，在福尔马林和无酸乙二醛中固定的组织中平行进行，得到基本相同的结果。
在所有相似性中，ALK和HER2的FISH反应给出了类似的反应。
图1.结肠癌。用无酸乙二醛固定。用Haem.-Eosin染色。更好地保存细胞和组织是显而易见的。
图2.结肠癌。与上述情况相同，但在福尔马林中常规固定。固定和结构保存的相似性是显而易见的。
实施例2
根据所述方法，将使用离子交换树脂(
Figure BDA0001759469610000071
IRA-400氯化物形式)制备的除去酸的40％乙二醛立即在-20℃冷冻。作为替代方案，将乙二醛与磷酸盐缓冲液pH 7.4混合并且在-20℃冷冻。
将这些样品保持冷冻3个月，然后解冻并且用于制备含有2％无酸乙二醛的磷酸盐缓冲液0.1M pH 7.3的固定溶液。如实施例1所述，该试剂用于固定组织。结果证实非常好的固定，因此证实冷冻防止了导致固定性质的变坏的固定剂的酸化。
实施例3
如实施例1中所述选择结肠癌的组织样品，并且固定在下列液体中：1)4％甲醛，在磷酸盐缓冲液pH 7.40.1M(Diapat,Bergamo)中，2)2％无酸乙二醛，在磷酸盐缓冲液pH7.30.1M中，3)2％无酸乙二醛，在NaCl0.9％pH 7.2-7.4中；4)2％无酸乙二醛，在磷酸盐缓冲液pH 7.30.1M中，保存在“盒中袋”容器中；5)2％无酸乙二醛，在磷酸盐缓冲液pH7.30.1M中，保持在“Seal-SAFE”袋中。
虽然在制备后立即使用固定剂N.2和3，但是固定剂N.4和5在气密条件下保持长达3个月。
结果
固定在不同类型固定剂中的样品的组织学检查，同时确认在固定剂N.2和3中固定的组织中的最佳保存，类似于在福尔马林(固定剂N.1)中固定的组织中获得的结果，这显示使用盒中袋或真空程序防止暴露在空气中，通过防止氧化和形成乙醛酸，保留了无酸乙二醛固定剂的固定特性。
图3.结肠癌的肝转移。在2％无酸乙二醛(在磷酸盐缓冲液pH 7.3 0.1M中)中固定。结构的最佳保存是显而易见的。在肝窦中可见红细胞，证实没有裂解。
图4.结肠癌。无酸乙二醛固定。在间质中，可见红细胞和嗜酸性白细胞。
实施例4
为了除去乙二醛中的酸以获得无酸乙二醛(GAF)，按照以下方法：将250g的
Figure BDA0001759469610000081
IRA-400氯化物形式，即强碱性离子交换树脂(Sigma-Aldrich)用去离子H2O润湿，然后用NaOH 1M短时间洗涤活化。在水中洗涤几次以除去氢氧化钠后，加入150mL乙二醛。使树脂在室温作用30分钟，然后通过过滤器除去。得到的水透明液体的pH约为中性，表示除去酸的40％乙二醛(GAF)。使用2％GAF溶液作为选择的固定剂。
在0.1M磷酸盐缓冲液pH 7.3中的2％GAF溶液稳定几周，然后逐渐氧化，产生具有次优固定性质的酸性试剂。为了克服稳定性问题，制备在50％乙醇(Carlo Erba，Milan，Italy)中含有20％GAF的母液，并且在100mL溶液(母液)中加入0.1g碳酸钙(Sigma-Aldrich)。或者，乙醇被其它醇例如甲醇代替。通过在0.11M磷酸盐缓冲液pH 7.3中1:10稀释母液，获得用作GAF固定剂的最终(工作)溶液。
该研究包括一系列手术样本，这些样本从手术室新鲜到达，并且具有足够尺寸(>2cm)的病变，以允许多个并行采样。根据标准实践取样8例结肠直肠腺癌，并且在磷酸盐缓冲福尔马林(PBF)和GAF(工作溶液)中平行固定。
在RT固定过夜后，在醇中脱水并且进行石蜡包埋，进行标准程序以用自动处理器(Leica ASP 300,Leica Microsystems,Wetzlar,Germany)进行石蜡包埋。用苏木精和曙红(H&E)染色8例切片并且加工用于分子分析。
对于DNA序列的研究，从25个结肠直肠腺癌的石蜡包埋的组织块获得9个切片(5μm厚)。将并行选择和处理的样本固定在GAF和PBF中。使用1mL二甲苯将切片脱石蜡。在56℃与蛋白酶K过夜温育后，根据制造商的方案，使用MagCore自动提取仪(RBC Bioscience,NewTaipei City,Taiwan)上的MagCore Genomic DNA FFPE试剂盒从五个切片中分离DNA。
通过Qubit荧光计(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)和NanoDropSpectophotometer(ThermoFisher Scientific)上的Qubit BR测定定量DNA提取物。
使用Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)，使用DNA HS芯片上的DNA高灵敏度试剂评估DNA完整性。将样品以2ng/μL稀释，并且根据制造商的说明进行DNA长度分析。
对于直接DNA测序，使用以下PCR条件总计50ng DNA用于扩增KRAS的外显子2(246bp)：1×缓冲液，2.5mM MgCl2，0.4μM正向和反向引物(正向：5’-GGTGGAGTATTTGATAGTGTATTAACC-3’和反向：5’-AGAATGGTCCTGCACCAGTAA-3’)和0.2单位Taq聚合酶，终体积为25μL。用以下降落(touch-down)程序进行PCR反应：94℃2分钟，然后进行3个循环：94℃15秒，64℃30秒和70℃30秒；3个循环：94℃15秒，61℃30秒和72℃30秒；3个循环：94℃15秒，58℃30秒和72℃30秒；35个循环，94℃15秒，57℃30秒和72℃30秒，最终延伸70℃5分钟。通过在3％琼脂糖凝胶上电泳显现PCR模板，并且用ExoProStar(GEHealthcare，Milan，Italy)纯化用于随后的测序分析。用ExoProStar纯化最终的15ng PCR产物并且用于测序分析。使用Big Dye Version 3.1Terminator循环测序试剂盒(ThermoFisher Scientific)建立循环测序PCR反应，加入相同的扩增引物至终浓度为5pmol/μL，体积为20μL。循环条件为：25个循环，96℃10秒，50℃5秒和60℃4分钟；反应在4℃终止。使用Agencourt CleanSEQ(Beckman Coulter，California，USA)纯化循环测序产物，并且使用自动16毛细管测序仪(3730DNA Analyzer，Applied Biosystems，California，USA)对DNA进行测序。
对于焦磷酸测序，扩增KRAS外显子2并且测序，以便通过焦磷酸测序评估密码子12和13的状态，焦磷酸测序是基于“合成测序”原理的方法，使用PSQ 96(Qiagen，Hilden，Germany)。用以下引物进行DNA扩增：正向5’-GGCCTGCTGAAAATCACG-3’，反向5’生物素-GCTCTATCGTCATGGCTCT-3’(大小80bp)。在94℃变性5分钟后，DNA样品进行40个循环，94℃45秒，57℃45秒和72℃1分钟，最后在72℃伸长5分钟。将5’-生物素化的PCR产物结合到链霉亲和素包被的顺磁珠(GE Healthcare)上，用0.1mol/L NaOH变性，并且根据制造商的说明使用PyroMark Vacuum Prep Workstation(Qiagen)释放。使用Pyro Gold Reagents(Qiagen)在96孔板中进行这些反应。通过使用测序引物5’-CTTGTGGTAGTTGTAGCT-3’对引物单链DNA模板进行包含密码子12和13的区域的实时测序。使用PyroMark ID软件v 1.0(Qiagen)分析获得的热解图。
在该研究中收集的8个结肠直肠腺癌的PBF固定样品已经常规地进行
Figure BDA0001759469610000101
以筛选KRAS突变，并且发现6个具有KRAS突变。然后对应于8个结肠直肠癌病例的平行PBF和GAF固定的样品(根据先前测试的6个KRAS突变体和2个野生型)的DNA进行直接测序，焦磷酸测序和Sequenom
Figure BDA0001759469610000102
影响先前在PBF固定样品中鉴定的密码子12的致病性KRAS突变均在GAF固定的样品中得到证实。通过两种技术，在每个样品中检测到的特异性KRAS突变显示与在PBF固定的镜子样品中检测到的相当的突变体等位基因频率(表)。
表使用不同技术对平行样品(GAF-固定和PBF-固定)的KRAS外显子2测序分析。
Figure BDA0001759469610000111
GAF：无酸乙二醛；PBF：磷酸酶缓冲福尔马林；N.A.：未评估；WT：野生型；*：低突变体等位基因频率
实施例5
商购可获得的乙二醛溶液含有许多衍生自乙二醛生产和储存过程中氧化和降解过程的酸(Zhiyong Zhang，Dishun Zhao和Baoyun Xu，Journal of ChromatographicScience 2013；51：893-898)。这些酸在离子交换树脂中通过后被完全除去，但在该通过后不久，由于暴露于空气，或由于降解过程，在储存期间在固定剂中逐渐形成新的酸。
已经进行了这些酸之一(并且是最具反应性的)，即乙醛酸在这些固定剂中的含量的分析评价。
该分析在含有磷酸盐缓冲液0.1M pH 7.4的水溶液中进行，向其中加入商购的2％乙二醛(原始溶液：40％乙二醛，Sigma)。
加入少量乙二醛会降低稀释溶液的pH，因为前者存在强酸性，尽管存在缓冲液(溶液N.1：在分析前1周制备)。
2)溶液与之前完全一致，但在分析前6个月制备。由于氧化和降解导致酸的逐渐形成，该溶液的pH为强酸(pH 4.5)。
3)含有磷酸盐缓冲液pH 7.4，0.1M的水溶液，向其中加入2％通过离子交换树脂制备的无酸乙二醛。在分析前2个月制备溶液并且在-20℃保持冷冻。
4)将含有磷酸盐缓冲液pH 7.4，0.1M的水溶液加入到2％无酸乙二醛溶液中，通过离子交换树脂和10％乙醇(Carlo Erba)制备。具有抗氧化活性的乙醇的存在最终防止了试剂的氧化，从而防止了试剂的酸化。
分析条件。
用具有电导检测的离子色谱法测定4个样品中乙醛酸的含量。
基于由乙醛酸(Sigma)标准表示的对照，检查要表示乙醛酸的信号的鉴定。用相同的方法测定乙醛酸的浓度，乙醛酸可以衍生自乙二醛的直接氧化。
用于分析的装置是Dionex DX 500离子色谱仪。还使用可见UV光谱记录数据。
B.结果概述
表：4种样品中乙醛酸含量的测定结果。
Figure BDA0001759469610000121
[i]乙醛酸的检出限(LOD)范围为约1-2×10-3mM。
样品的吸收光谱(图5)。
考虑到2％w/w乙二醛溶液的浓度为约380mM，样品2中乙醛酸的浓度为约最初存在的乙二醛的10％。
C)结论
1)乙二醛在溶液中经历逐步氧化和酸化的变性，其在约pH 4-4.5达到平衡，这实际上是乙二醛的商购溶液的pH。在样品2中，含有2％乙二醛，6个月后pH降至pH 4.5并且显示出非常高含量的乙醛酸。
2)离子交换树脂(Amberlite)中的通道除去了酸，但很快就会形成新的乙醛酸，其水平远低于样品1(含有商购乙二醛)的水平。这表明在2％乙二醛溶液中(如在固定剂中使用的)，低于0.3mM的乙醛酸浓度只能通过用离子交换树脂除去酸来获得。事实上，样品1中乙醛酸的浓度高于上述限度。
3)通过冷冻溶液(样品3)或通过加入用作抗氧化剂的醇例如乙醇，可以获得防止导致乙醛酸形成的氧化和变性过程。

Claims (13)

1.无酸乙二醛水溶液在组织固定中的用途，其中乙二醛溶液具有2％的重量浓度。
2.权利要求1的用途，其中溶液的pH范围为7.1-8.0。
3.权利要求1的用途，其中溶液通过用离子交换树脂处理乙二醛商购溶液得到。
4.权利要求2的用途，其中溶液通过用离子交换树脂处理乙二醛商购溶液得到。
5.权利要求1的用途，用于固定和保存用于组织学、细胞学、免疫组织化学评估和用于基因分析的人、动物和植物细胞和组织。
6.权利要求2的用途，用于固定和保存用于组织学、细胞学、免疫组织化学评估和用于基因分析的人、动物和植物细胞和组织。
7.权利要求3的用途，用于固定和保存用于组织学、细胞学、免疫组织化学评估和用于基因分析的人、动物和植物细胞和组织。
8.权利要求4的用途，用于固定和保存用于组织学、细胞学、免疫组织化学评估和用于基因分析的人、动物和植物细胞和组织。
9.权利要求1-8任一项的用途，其中通过防止空气接触来防止溶液氧化和酸化。
10.权利要求1-8任一项的用途，其中通过分配在容器“盒中袋”和/或真空容器中和/或通过添加抗氧化剂来防止溶液氧化和酸化。
11.权利要求10的用途，其中抗氧化剂是乙醇或甲醇。
12.权利要求1-8任一项的用途，其中将溶液在-1℃至-80℃的温度保持冷冻，直至使用时为止。
13.用于组织学样品的组织学固定的试剂盒，其包含“盒中袋”类型的气密容器，所述容器包含权利要求1-11任一项 中定义的溶液和用于组织学的其它常规试剂。
CN201780010590.8A 2016-02-18 2017-02-10 作为用于组织学制品的固定剂的无酸乙二醛 Active CN108601340B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ITUB2016A000829A ITUB20160829A1 (it) 2016-02-18 2016-02-18 Fissativo per preparati istologici comprendente gliossale privo di acidi
IT102016000016894 2016-02-18
PCT/EP2017/053041 WO2017140596A1 (en) 2016-02-18 2017-02-10 Acid free glyoxal as fixative for histological preparations

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108601340A CN108601340A (zh) 2018-09-28
CN108601340B true CN108601340B (zh) 2022-03-22

Family

ID=56097194

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780010590.8A Active CN108601340B (zh) 2016-02-18 2017-02-10 作为用于组织学制品的固定剂的无酸乙二醛

Country Status (8)

Country Link
US (1) US11204305B2 (zh)
EP (1) EP3416482B1 (zh)
JP (1) JP6947410B2 (zh)
CN (1) CN108601340B (zh)
CA (1) CA3014243A1 (zh)
ES (1) ES2847831T3 (zh)
IT (1) ITUB20160829A1 (zh)
WO (1) WO2017140596A1 (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10501891B1 (en) * 2019-01-25 2019-12-10 Rayonier Performance Fibers, L.L.C. Crosslinking cellulose with Glyoxal to improve absorption properties
JP2021075506A (ja) * 2019-11-13 2021-05-20 学校法人北里研究所 耐変色標本固定剤及びその使用
IT201900024448A1 (it) * 2019-12-18 2021-06-18 Addax Biosciences S R L Conservazione di sequenze di acidi nucleici mediante fissazione dei tessuti in formalina tamponata preparata utilizzando formaldeide deprivata di acidi
FR3146794A1 (fr) 2023-03-22 2024-09-27 Algoscope Conditionnement de transport d’un prélèvement biologique dans un liquide de conservation pour examen histopathologique
FR3146793A1 (fr) 2023-03-22 2024-09-27 Algoscope Procédé et dispositif d’anatomopathologie avec identification et suivi d’objets

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101473812A (zh) * 2009-01-24 2009-07-08 曹建明 一种用于尸体标本的防腐固定液组合物及其制备方法
CN101965326A (zh) * 2008-01-25 2011-02-02 科莱恩特种精细化学品法国公司 制备乙醛酸水溶液的方法
CN102076212A (zh) * 2008-07-01 2011-05-25 阿克马法国公司 用于保存人类或动物躯体的外用组合物
CN104365579A (zh) * 2013-08-13 2015-02-25 陆伟明 一种标本耐固防腐定型液

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2159975A1 (de) * 1971-12-03 1973-06-07 Veba Chemie Ag Glyoxalhalbacetale, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
AU669673B2 (en) * 1991-09-20 1996-06-20 Gerald W. Camiener Methods and compositions with aldehyde stabilizing solution
US5998483A (en) * 1991-09-20 1999-12-07 Camiener; Gerald W. Glyoxal-containing preservative compositions
US20060127873A1 (en) * 2002-07-16 2006-06-15 Caroline Hoemann Composition for cytocompatible, injectable, self-gelling chitosan solutions for encapsulating and delivering live cells or biologically active factors
US20050181353A1 (en) * 2004-02-17 2005-08-18 Rao Galla C. Stabilization of cells and biological specimens for analysis
US7368132B2 (en) 2004-10-27 2008-05-06 Medical Chemical Corporation Glyoxal/zinc fixative
WO2006104333A1 (en) * 2005-03-28 2006-10-05 Medimex Co., Ltd Tumor screening system, collection vial for liquid based cytology, brush for liquid based cytology of cervix carcinoma and supporting solution for cytological diagnosis
FR2943889B1 (fr) * 2009-04-07 2011-04-29 Arkema France Compositions pour la conservation du corps humain ou animal.
US9733162B2 (en) * 2014-02-11 2017-08-15 Ihor Turkevych Universal system, method and solution for the acceleration of the process of fixing, dehydrating and clearing the structure of biological tissue
CA2972682C (en) * 2015-01-27 2021-06-08 Ventana Medical Systems, Inc. Methods for tissue sample fixation using an extended soak in aldehyde-based fixative solutions

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101965326A (zh) * 2008-01-25 2011-02-02 科莱恩特种精细化学品法国公司 制备乙醛酸水溶液的方法
CN102076212A (zh) * 2008-07-01 2011-05-25 阿克马法国公司 用于保存人类或动物躯体的外用组合物
CN101473812A (zh) * 2009-01-24 2009-07-08 曹建明 一种用于尸体标本的防腐固定液组合物及其制备方法
CN104365579A (zh) * 2013-08-13 2015-02-25 陆伟明 一种标本耐固防腐定型液

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
le glyoxal:un possible substitut du formaldehyde en anatomie pathologique;Nathalie GEHIN epouse MARCON;《proquest硕博士论文数据库》;20080613;第70页第1.2.1节，第76页第4.2.3节，第96页第4.1.1节，第116页第4.3节，第129-131页第7节 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20190049348A1 (en) 2019-02-14
ES2847831T3 (es) 2021-08-04
EP3416482A1 (en) 2018-12-26
JP2019507342A (ja) 2019-03-14
EP3416482B1 (en) 2020-12-30
CN108601340A (zh) 2018-09-28
WO2017140596A1 (en) 2017-08-24
JP6947410B2 (ja) 2021-10-13
CA3014243A1 (en) 2017-08-24
US11204305B2 (en) 2021-12-21
ITUB20160829A1 (it) 2017-08-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108601340B (zh) 作为用于组织学制品的固定剂的无酸乙二醛
ES2617147T3 (es) Preservación de ácidos nucleicos fetales en plasma materno
JP6750178B2 (ja) 生物試料の安定化
EP2580348B1 (en) Method for determination of target cells or tissue for extraction of biomolecules from non-formalin-fixed biological samples
CA2733246C (en) Method of evaluating oral cancer risk in human
JP6329072B2 (ja) 細胞外核酸の安定化および単離
JP5566111B2 (ja) Ｒｎａ回収方法
Legres et al. Beyond laser microdissection technology: follow the yellow brick road for cancer research
EP2338989A1 (en) Method for preparing fecal sample, fecal sample preparation solution, and feces collection kit
JP5514573B2 (ja) 固形組織のｒｎａおよび形態の保存
JP7548904B2 (ja) 尿安定化
JPWO2010064634A1 (ja) 糞便試料の調製方法、糞便試料調製用溶液、及び採便用キット
EP3269813B1 (en) A method for isolating a nucleic acid from an ffpe tissue
JP2010008106A (ja) 糞便処理容器及び糞便処理方法
US5482676A (en) Visualization system for retrieval, identification, and positioning of biological samples for subsequent microscopic examination
Iwamura et al. A qualitative study of compact bone microstructure and nuclear short tandem repeat obtained from femur of human remains found on the ground and exhumed 3 years after death
JP2008256389A (ja) 乾燥処理がなされた糞便試料及び糞便試料の調製方法、及び、該糞便試料を用いた核酸又はタンパク質の抽出並びに検出方法
Huang et al. [5] Optimized tissue processing and staining for laser capture microdissection and nucleic acid retrieval
Shariff et al. Principles & Interpretation of Laboratory Practices in Surgical Pathology
Garner Methods for diagnosing inclusion body disease in snakes.
Zhi et al. Comparison between the effectiveness of polymerase chain reaction and in situ hybridization in detecting the presence of pathogenic fungi by using the preserved DNA in formalin-fixed and paraffin-embedded tissues
Camus et al. Clinical Pathology and Ancillary Diagnostics
Loibner et al. Protocol for HER2 FISH using a non-cross-linking, formalin-free tissue fixative to combine advantages of cryo-preservation and formalin fixation
US20070122909A1 (en) Method of treating cells
Smith et al. Specimen handling and preparation for routine diagnostic histopathology

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1260651

Country of ref document: HK

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant