CN108601340A - 作为用于组织学制品的固定剂的无酸乙二醛 - Google Patents
作为用于组织学制品的固定剂的无酸乙二醛 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108601340A CN108601340A CN201780010590.8A CN201780010590A CN108601340A CN 108601340 A CN108601340 A CN 108601340A CN 201780010590 A CN201780010590 A CN 201780010590A CN 108601340 A CN108601340 A CN 108601340A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- glyoxal
- solution
- purposes
- acid
- anacidity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N glyoxal Chemical compound O=CC=O LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 177
- 229940015043 glyoxal Drugs 0.000 title claims abstract description 88
- 239000000834 fixative Substances 0.000 title abstract description 34
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 29
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 claims description 19
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 claims description 15
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 claims description 15
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 14
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 claims description 9
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 7
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 claims description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 claims description 4
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 4
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 4
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 claims 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 claims 1
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 65
- 239000002253 acid Substances 0.000 abstract description 29
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 abstract description 4
- 230000008520 organization Effects 0.000 abstract description 4
- 239000003183 carcinogenic agent Substances 0.000 abstract description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 abstract description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 2
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 abstract 1
- 231100000357 carcinogen Toxicity 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 47
- HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N glyoxylic acid Chemical compound OC(=O)C=O HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 18
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 11
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 10
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 9
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 9
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 9
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 8
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 7
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 206010069755 K-ras gene mutation Diseases 0.000 description 5
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 5
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 5
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 5
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 3
- 206010052360 Colorectal adenocarcinoma Diseases 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100030708 GTPase KRas Human genes 0.000 description 3
- 101000584612 Homo sapiens GTPase KRas Proteins 0.000 description 3
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001299 aldehydes Chemical group 0.000 description 3
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 3
- IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N Acetaldehyde Chemical compound CC=O IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000006277 CDX2 Transcription Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010083123 CDX2 Transcription Factor Proteins 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Chemical compound OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical group Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 2
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010036226 antigen CYFRA21.1 Proteins 0.000 description 2
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 238000010827 pathological analysis Methods 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 125000006091 1,3-dioxolane group Chemical class 0.000 description 1
- HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)CC(S(O)(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000004434 Calcinosis Diseases 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical group [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- XZMCDFZZKTWFGF-UHFFFAOYSA-N Cyanamide Chemical compound NC#N XZMCDFZZKTWFGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- MQJKPEGWNLWLTK-UHFFFAOYSA-N Dapsone Chemical compound C1=CC(N)=CC=C1S(=O)(=O)C1=CC=C(N)C=C1 MQJKPEGWNLWLTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 1
- ZNZYKNKBJPZETN-WELNAUFTSA-N Dialdehyde 11678 Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1[C@H](C[C@H](/C(=C/O)C(=O)OC)[C@@H](C=C)C=O)NCC2 ZNZYKNKBJPZETN-WELNAUFTSA-N 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 206010027457 Metastases to liver Diseases 0.000 description 1
- -1 NaOH Chemical compound 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 235000009754 Vitis X bourquina Nutrition 0.000 description 1
- 235000012333 Vitis X labruscana Nutrition 0.000 description 1
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 description 1
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000012445 acidic reagent Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036783 anaphylactic response Effects 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 229910052788 barium Inorganic materials 0.000 description 1
- DSAJWYNOEDNPEQ-UHFFFAOYSA-N barium atom Chemical compound [Ba] DSAJWYNOEDNPEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- JHIVVAPYMSGYDF-UHFFFAOYSA-N cyclohexanone Chemical compound O=C1CCCCC1 JHIVVAPYMSGYDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000860 dapsone Drugs 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000005183 environmental health Effects 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 108700020302 erbB-2 Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229960004275 glycolic acid Drugs 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 239000010985 leather Substances 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001473 noxious effect Effects 0.000 description 1
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- RLZZZVKAURTHCP-UHFFFAOYSA-N phenanthrene-3,4-diol Chemical compound C1=CC=C2C3=C(O)C(O)=CC=C3C=CC2=C1 RLZZZVKAURTHCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KOXNXRMZJZVCJA-UHFFFAOYSA-N phenol 1,2,3-trimethylbenzene Chemical compound C1(=CC=CC=C1)O.CC=1C(=C(C=CC1)C)C KOXNXRMZJZVCJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- WQGWDDDVZFFDIG-UHFFFAOYSA-N pyrogallol Chemical compound OC1=CC=CC(O)=C1O WQGWDDDVZFFDIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000001429 visible spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
- 150000003751 zinc Chemical class 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/0231—Chemically defined matrices, e.g. alginate gels, for immobilising, holding or storing cells, tissue or organs for preservation purposes; Chemically altering or fixing cells, tissue or organs, e.g. by cross-linking, for preservation purposes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
- G01N2001/305—Fixative compositions
- G01N2001/307—Fixative compositions non-toxic, no Hg, no formaldehyde
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及用于组织学制品固定的组合物，其包含乙二醛溶液，其中已经除去通常存在于商购可获得的乙二醛中的酸。本发明的组合物提供了用于保存组织中的结构、抗原组分和核酸的最佳固定剂。无酸乙二醛具有有限的毒性，不被认为是致癌剂，并且是用于固定组织和细胞的福尔马林的有效替代物。
Description
本发明涉及用于固定组织学和细胞学制品的组合物，其包含不含酸的乙二醛溶液。
引言
目前，用含有甲醛的水溶液，并且特别是含有4％甲醛的水溶液(称为福尔马林)进行组织学组织的保存和固定。
福尔马林的使用在工业中非常广泛，用于树脂的生产和皮革的固定，并且在医学领域中，用于组织的转移，用于它们的保存(例如在博物馆中)和用于组织学的固定。这必须在石蜡包埋、组织学制品的切片和染色之前进行，以便允许组织学诊断的显微镜检查(Fox等人，Formaldehyde fixation.J.Histochem.Cytochem,33,845-853,1985)。
福尔马林在世界范围内应用：仅在意大利，消费量就达数百万升。因此，福尔马林的应用涉及技术人员和护士，以及暴露于使用福尔马林和吸入甲醛蒸气的病理学家。
长期以来已知甲醛的毒性：它是一种过敏性和有毒物质，可引起皮肤湿疹和呼吸道哮喘，并且被归类为致癌物。尽管甲醛仍然被认为是选择的固定剂这一事实(BuesaRJ.Annals of Diagnostic Pathology 12(2008)387–396))，但其使用会引起问题。
考虑到这种挥发性试剂的毒性，环保部门越来越担心，因此欧洲国家已提出从2016年开始禁止使用福尔马林，因为2014年6月5日的EC Regulation n.605/2014修改了ECRegulation n.1272/2008。该决定虽然在该试剂定义为致癌物(1B/21类)和诱变剂方面是有道理的，但可能对诊断病理学产生沉重的并且可能是不可接受的影响。对这种情况的反应目前仅限于采用旨在防止过度暴露于甲醛蒸气的保护程序，但毫无疑问，这种情况只能通过采用替代福尔马林的无毒固定剂来解决。
已经提出了许多替代福尔马林的固定剂(Buesa RJ.,上文所述；Zanini等人，Environmental Health 2012,11:59)，但是这些中无一被证明提供快速和令人满意的固定。
最初由Wicks e Suntzeff(Wicks LF和Suntzeff V.Science,98,204,1943)提出使用乙二醛(草醛)作为福尔马林替代物用于组织固定。这种双功能试剂倾向于在溶液中形成聚合物并且在蛋白质中形成分子内和分子间交联(Hopwood D.Histochemie,20,127-132,1969)。在溶液中，乙二醛产生多种水合形式，其中最常见的是在室温形成的环状二聚体1,3-二氧戊环(Dapson RW.Biotechnic&Histochemistry 2007,82(3):161_166)。乙二醛具有非常低的蒸气压，即使在相对较高的温度(25-60℃)也不会产生蒸气，因此没有蒸气吸入的风险(Anon.1986,Glyoxal,a Technical Brochure.American Cyanamid Company,Wayne,NJ.50pp.)。
已经对该物质作为组织学固定剂的应用进行了大量研究(Sabatini等人,J Cell Biol.1963Apr；17:19-58)。在US 7368132和CA 2119554中分别描述了使用乙二醛与锌盐或与醇的混合物以改善组织学固定的结果。
然而，几项研究证实，乙二醛不能保证令人满意的类似于福尔马林产生的形态保存(Buesa RJ.,Annals of Diagnostic Pathology 12(2008)387-396；Marcon等人Annalesde Pathologie 29,460-467；2009)。甚至市场上可用的许多制品作为替代福尔马林的固定剂，其中含有添加到其它物质例如乙醇、甲醇或金属(锌)中的乙二醛，但没有得到令人满意的结果，也没有一个符合组织学家的青睐。在Marcon等人的研究中，作者将基于乙二醛的多种溶液的固定特性与甲醛溶液作为参考进行了比较。比较与评估中的多种参数(形态保存，核酸保存等)相关的结果，基于乙二醛的溶液导致远比福尔马林差。作者得出结论，基于乙二醛的溶液不能被推荐，因为有害作用例如红细胞裂解(Buesa,2008；Macon等人,2009)或微钙化的溶解(U mlas J.和TuleckeMT.,Human Pathology 35,1058-62,2004)。此外，荧光原位杂交(FISH)分析导致技术上不可接受的结果(Tubbs RR,Hsi ED,Hicks D,GoldblumJ.Am J Surg Pathol 2004；28(3):417-419；Willmore-Payne C,Metzger K,LayfieldLJ.Appl Immunohistochem Mol Morphol 2007；15(1):84-87)并且提取和测序核酸证明不令人满意(Gillespie JW,Best CJ,Bichsel VE,Cole KA,Greenhut SF,Hewitt SM等人AmJ Pathol 2002；160(2):449-457)。这种效果是由商品上基于乙二醛的固定剂产生的。这些试剂的确切组成尚不清楚，但它们包含乙二醛、乙醇、甲醇和锌。
据报道所有这些专有固定剂(Shandon；Bioworld；Amresco；Anatech和Safe-FixFisherScientific)是酸性的(在pH为4的范围内)。Marcon等人(2009)和Gehin-Marcon N.(2008年6月13日讨论的论文,l’Universitède Nancy)尝试了在不同pH值的磷酸盐缓冲液中的不同的乙二醛溶液，但该研究主要是在pH值为4的乙二醛溶液中进行的。特别地，Gehrin-Marcon(2008)在她的论文中提到(讨论，第142-143页)“我们在早期的工作(试验)中已经看到，pH7的4％乙二醛是一种不良组织学固定剂，没有得到保存良好的微观解剖学。添加少量百分比的乙醇(10％)和溶液酸化(pH 4)可以获得更好的结果”。应当注意，该论文没有说明通过向pH 7缓冲液中添加商品4％乙二醛而制备的固定剂是否是在制备后立即使用或之后使用，以及是否检查了固定剂的最终pH(溶液随时间不稳定)。而且，在使用时没有给出关于溶液pH的信息。此外，酸没有从乙二醛溶液中除去。该问题将在本发明的描述中得到解决，特别是实施例5。
本发明的描述
现在已经令人惊讶地发现并且与先前的研究相反，通过除去其酸内容物，可以显著改善乙二醛作为固定剂的性质。
目前作为纯试剂(乙二醛，40wt％水溶液，代码N.128465,Sigma Aldrich,Milano)可获得的乙二醛实际上具有强酸性pH(约pH 4)，因为存在乙醛酸、草酸、羟基乙酸、乙酸和甲酸，它们是在乙二醛制备过程中和逐步制备后，由于醛部分的降解和氧化而形成的(Zhiyong Zhang,Dishun Zhao和Baoyun Xu,Journal of Chromatographic Science2013；51:893-898)。使用强碱(NaOH)可以获得这些酸的中和，或者可以使用离子交换树脂除去。由此获得的试剂，在此定义为具有定义浓度的水溶液中的无酸乙二醛(G.A.F.)，证明是组织学固定剂，其在细胞和组织的保存中具有优异的品质。
因此，本发明涉及不含酸的乙二醛作为组织学固定剂的用途。
本发明还涉及用于固定组织学组织的试剂盒，其包含“盒中袋”型容器或真空袋，其含有本发明的固定剂或其它试剂(染料、缓冲液和常用于组织学的其它试剂)。
与福尔马林相比，本发明的固定剂不仅不释放有毒蒸气(与甲醛相反)，而且还快速、迅速渗透到组织中并且产生组织和细胞特征(类似于在重要条件下存在的那些)的保存。
发明详述
术语“无酸乙二醛”是指乙二醛的水溶液，其重量浓度可在0.1％至90％，优选1.5％至50％，更优选2％至20％之间变化，其具有的pH值为7.1至8.0，优选7.2-7.4。具有pH7.3±0.2的2％溶液是特别优选的。
用作组织学和细胞学固定剂的本发明溶液可以通过用离子交换树脂除去酸内容物或通过用氨、碱性氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐例如NaOH、KOH、钠、钙、锌或钡的碳酸盐中和，由商购可获得的乙二醛40％溶液制备。
报道了消除酸的方法的实例。
通过离子交换树脂除去酸
将30g离子交换树脂Bio-Rad AG 501-X8(Bio-Rad；Milan)加入到150mL商购40％乙二醛(Sigma)溶液中。60’后，过滤该复合物，得到150mL澄清溶液。向该液体中加入蒸馏水或盐水溶液(NaCl 0.9％)至浓度为2％w/w的乙二醛。该溶液的pH达到约中性，从而证实了离子交换树脂实现了酸的去除。
通过将无酸乙二醛加入到0.1M pH 7.2的磷酸盐缓冲液中，得到2％的乙二醛溶液，其pH仍然保持在7.2。
以类似的方式，使用强碱性离子交换树脂( IRA-400氯化物形式；Sigma,Milano)，通过上述方法，实现从乙二醛溶液中完全除去酸。所述盐水溶液或磷酸盐缓冲液中的2％乙二醛溶液产生用作组织学固定剂的试剂。
相反，当将强酸商购乙二醛(Sigma)加入到pH 7.0或7.2的0.1M磷酸盐缓冲液中至终浓度为2％或4％时，所得溶液变得非常酸性，远低于中性。
通过离子交换树脂将除去酸的100mL的40％乙二醛溶液保持在室温。1周后，由于乙二醛氧化成乙醛酸，所以该溶液的pH最初为约中性逐渐降低并达到pH 4.8。
这种酸化过程导致组织的结构和成分保存不良的固定剂。
这意味着在从乙二醛溶液中除去酸后，必须防止导致酸形成的试剂氧化。
这可以通过(任选地，组合地)使用以下方法获得：a)使用防止溶液与空气接触的容器，或b)保持溶液冷冻直至使用，或c)添加抗氧化剂，例如抗坏血酸或硫化物或醇例如乙醇。
a)William Scholle于1955年提出了“盒中袋”技术，目前用于保存葡萄酒并且防止暴露在空气中。液体被引入塑料盒中，然后将袋子用塞子封闭，并且空气存在被完全消除。然后将袋子引入盒中，从那里将塞子置于外部。液体的摄取涉及袋的体积减小，但阻止了空气进入。
作为实例，将3升2％无酸乙二醛pH 7.1的溶液引入“盒中袋”(Ondulati eImballaggi del Friuli spa,Villesse,Gorizia)。从该容器中提取液体作为固定剂并且持续检查pH。6个月后，溶液的pH仍然保持在pH 7以上，因此证实不存在由于氧化的酸化。
作为替代方案，始终以防止与空气接触，从而防止乙二醛氧化为目标，将1000mL2％无酸乙二醛溶液(pH 7.3)引入塑料袋Seal-SAFE(Milestone,Soresole(BG),Italy)，然后使用装置Tissue-SAFE(Milestone)施加真空操作。6个月后，pH仍高于7，证实不存在由于氧化的酸化。
b)无酸乙二醛溶液，加入或不加入至缓冲溶液，例如磷酸盐缓冲液pH 7.2-7.4，优选7.3中，如果在-1℃至-80℃之间，优选在-20℃的温度冷冻，则维持稳定。液体一旦冷冻，则不会发生氧化和酸化，一旦解冻，则可以用于固定。
c)为了防止乙二醛氧化从而使其酸化(pH降低至中性以下，从而使固定质量变坏)，添加抗氧化剂例如抗坏血酸(Sigma)，百分比为0.01至20％，优选1％，和/或三甲基苯酚(Sigma)，百分比为0.01％至20％，优选0.1％，或醇例如乙醇(Carlo Erba,Milan)，百分比为1％至90％。
特别地，将20％无酸乙二醛在乙醇50％中的溶液维持pH约为中性数月。
此外，我们还观察到其它试剂，例如乙二醇和聚乙二醇，浓度范围为0.1％至50％，优选5％，随着时间的推移有效地防止了乙二醛溶液的酸化。
下列实施例更详细地说明本发明。
实施例1
在超过诊断目的情况下采集组织样品(来自20例大肠壁、结肠癌、乳癌)。
来自手术室的新鲜碎片具有3-4mm厚度，与目前用于诊断目的的碎片类似。将包埋入盒中的样品在室温浸入固定液中。
从同一病例中，将平行取样的样品浸入3种不同类型的固定剂中：1)磷酸盐缓冲福尔马林(PBF)(Diapat,Bergamo)，2)溶于pH 7.2的磷酸盐缓冲液中的商购2％乙二醛(Sigma,Milano)(然后检查该溶液的pH，最终pH为6.5)；3)，在pH 7.3的磷酸盐缓冲液中的2％无酸乙二醛。
在室温固定3或24小时，然后使用Leica处理器(Leica,Milano)通过醇脱水和石蜡包埋常规处理盒。
从石蜡块获得组织切片并且用苏木精-曙红平行染色。
对于以下抗原，对固定在福尔马林(制品1)和无酸乙二醛(制品3)中的碎片切片进行免疫组织化学染色：大范围细胞角蛋白；细胞角蛋白19；CDX2和Ki67。在平行切片上，还对ALK和HER2基因进行FISH染色。
结果
在显微镜检查时，在制品2中固定的组织，即在商购2％乙二醛溶液中，最终pH为6.5，显示出与文献(Dapson,2007；Buesa,2008；Macon等人,2009)中描述的乙二醛固定相关的缺点，即：上皮与间质之间收缩存在下组织的共同作用(cohartation)，红细胞裂解，清晰的细胞核，以及核酸物质的损失。
相反，固定在无酸乙二醛(制品3)中的组织显示出最佳固定，避免了上面列出的缺陷并且类似于在福尔马林(制品1)中固定的组织中获得的固定。
对于细胞角蛋白L:S:，对于细胞角蛋白19，对于CDX2和Ki67的免疫组织化学反应，在福尔马林和无酸乙二醛中固定的组织中平行进行，得到基本相同的结果。
在所有相似性中，ALK和HER2的FISH反应给出了类似的反应。
图1.结肠癌。用无酸乙二醛固定。用Haem.-Eosin染色。更好地保存细胞和组织是显而易见的。
图2.结肠癌。与上述情况相同，但在福尔马林中常规固定。固定和结构保存的相似性是显而易见的。
实施例2
根据所述方法，将使用离子交换树脂( IRA-400氯化物形式)制备的除去酸的40％乙二醛立即在-20℃冷冻。作为替代方案，将乙二醛与磷酸盐缓冲液pH 7.4混合并且在-20℃冷冻。
将这些样品保持冷冻3个月，然后解冻并且用于制备含有2％无酸乙二醛的磷酸盐缓冲液0.1M pH 7.3的固定溶液。如实施例1所述，该试剂用于固定组织。结果证实非常好的固定，因此证实冷冻防止了导致固定性质的变坏的固定剂的酸化。
实施例3
如实施例1中所述选择结肠癌的组织样品，并且固定在下列液体中：1)4％甲醛，在磷酸盐缓冲液pH 7.40.1M(Diapat,Bergamo)中，2)2％无酸乙二醛，在磷酸盐缓冲液pH7.30.1M中，3)2％无酸乙二醛，在NaCl0.9％pH 7.2-7.4中；4)2％无酸乙二醛，在磷酸盐缓冲液pH 7.30.1M中，保存在“盒中袋”容器中；5)2％无酸乙二醛，在磷酸盐缓冲液pH7.30.1M中，保持在“Seal-SAFE”袋中。
虽然在制备后立即使用固定剂N.2和3，但是固定剂N.4和5在气密条件下保持长达3个月。
结果
固定在不同类型固定剂中的样品的组织学检查，同时确认在固定剂N.2和3中固定的组织中的最佳保存，类似于在福尔马林(固定剂N.1)中固定的组织中获得的结果，这显示使用盒中袋或真空程序防止暴露在空气中，通过防止氧化和形成乙醛酸，保留了无酸乙二醛固定剂的固定特性。
图3.结肠癌的肝转移。在2％无酸乙二醛(在磷酸盐缓冲液pH 7.3 0.1M中)中固定。结构的最佳保存是显而易见的。在肝窦中可见红细胞，证实没有裂解。
图4.结肠癌。无酸乙二醛固定。在间质中，可见红细胞和嗜酸性白细胞。
实施例4
为了除去乙二醛中的酸以获得无酸乙二醛(GAF)，按照以下方法：将250g的IRA-400氯化物形式，即强碱性离子交换树脂(Sigma-Aldrich)用去离子H2O润湿，然后用NaOH 1M短时间洗涤活化。在水中洗涤几次以除去氢氧化钠后，加入150mL乙二醛。使树脂在室温作用30分钟，然后通过过滤器除去。得到的水透明液体的pH约为中性，表示除去酸的40％乙二醛(GAF)。使用2％GAF溶液作为选择的固定剂。
在0.1M磷酸盐缓冲液pH 7.3中的2％GAF溶液稳定几周，然后逐渐氧化，产生具有次优固定性质的酸性试剂。为了克服稳定性问题，制备在50％乙醇(Carlo Erba，Milan，Italy)中含有20％GAF的母液，并且在100mL溶液(母液)中加入0.1g碳酸钙(Sigma-Aldrich)。或者，乙醇被其它醇例如甲醇代替。通过在0.11M磷酸盐缓冲液pH 7.3中1:10稀释母液，获得用作GAF固定剂的最终(工作)溶液。
该研究包括一系列手术样本，这些样本从手术室新鲜到达，并且具有足够尺寸(>2cm)的病变，以允许多个并行采样。根据标准实践取样8例结肠直肠腺癌，并且在磷酸盐缓冲福尔马林(PBF)和GAF(工作溶液)中平行固定。
在RT固定过夜后，在醇中脱水并且进行石蜡包埋，进行标准程序以用自动处理器(Leica ASP 300,Leica Microsystems,Wetzlar,Germany)进行石蜡包埋。用苏木精和曙红(H&E)染色8例切片并且加工用于分子分析。
对于DNA序列的研究，从25个结肠直肠腺癌的石蜡包埋的组织块获得9个切片(5μm厚)。将并行选择和处理的样本固定在GAF和PBF中。使用1mL二甲苯将切片脱石蜡。在56℃与蛋白酶K过夜温育后，根据制造商的方案，使用MagCore自动提取仪(RBC Bioscience,NewTaipei City,Taiwan)上的MagCore Genomic DNA FFPE试剂盒从五个切片中分离DNA。
通过Qubit荧光计(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)和NanoDropSpectophotometer(ThermoFisher Scientific)上的Qubit BR测定定量DNA提取物。
使用Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)，使用DNA HS芯片上的DNA高灵敏度试剂评估DNA完整性。将样品以2ng/μL稀释，并且根据制造商的说明进行DNA长度分析。
对于直接DNA测序，使用以下PCR条件总计50ng DNA用于扩增KRAS的外显子2(246bp)：1×缓冲液，2.5mM MgCl2，0.4μM正向和反向引物(正向：5’-GGTGGAGTATTTGATAGTGTATTAACC-3’和反向：5’-AGAATGGTCCTGCACCAGTAA-3’)和0.2单位Taq聚合酶，终体积为25μL。用以下降落(touch-down)程序进行PCR反应：94℃2分钟，然后进行3个循环：94℃15秒，64℃30秒和70℃30秒；3个循环：94℃15秒，61℃30秒和72℃30秒；3个循环：94℃15秒，58℃30秒和72℃30秒；35个循环，94℃15秒，57℃30秒和72℃30秒，最终延伸70℃5分钟。通过在3％琼脂糖凝胶上电泳显现PCR模板，并且用ExoProStar(GEHealthcare，Milan，Italy)纯化用于随后的测序分析。用ExoProStar纯化最终的15ng PCR产物并且用于测序分析。使用Big Dye Version 3.1Terminator循环测序试剂盒(ThermoFisher Scientific)建立循环测序PCR反应，加入相同的扩增引物至终浓度为5pmol/μL，体积为20μL。循环条件为：25个循环，96℃10秒，50℃5秒和60℃4分钟；反应在4℃终止。使用Agencourt CleanSEQ(Beckman Coulter，California，USA)纯化循环测序产物，并且使用自动16毛细管测序仪(3730DNA Analyzer，Applied Biosystems，California，USA)对DNA进行测序。
对于焦磷酸测序，扩增KRAS外显子2并且测序，以便通过焦磷酸测序评估密码子12和13的状态，焦磷酸测序是基于“合成测序”原理的方法，使用PSQ 96(Qiagen，Hilden，Germany)。用以下引物进行DNA扩增：正向5’-GGCCTGCTGAAAATCACG-3’，反向5’生物素-GCTCTATCGTCATGGCTCT-3’(大小80bp)。在94℃变性5分钟后，DNA样品进行40个循环，94℃45秒，57℃45秒和72℃1分钟，最后在72℃伸长5分钟。将5’-生物素化的PCR产物结合到链霉亲和素包被的顺磁珠(GE Healthcare)上，用0.1mol/L NaOH变性，并且根据制造商的说明使用PyroMark Vacuum Prep Workstation(Qiagen)释放。使用Pyro Gold Reagents(Qiagen)在96孔板中进行这些反应。通过使用测序引物5’-CTTGTGGTAGTTGTAGCT-3’对引物单链DNA模板进行包含密码子12和13的区域的实时测序。使用PyroMark ID软件v 1.0(Qiagen)分析获得的热解图。
在该研究中收集的8个结肠直肠腺癌的PBF固定样品已经常规地进行以筛选KRAS突变，并且发现6个具有KRAS突变。然后对应于8个结肠直肠癌病例的平行PBF和GAF固定的样品(根据先前测试的6个KRAS突变体和2个野生型)的DNA进行直接测序，焦磷酸测序和Sequenom影响先前在PBF固定样品中鉴定的密码子12的致病性KRAS突变均在GAF固定的样品中得到证实。通过两种技术，在每个样品中检测到的特异性KRAS突变显示与在PBF固定的镜子样品中检测到的相当的突变体等位基因频率(表)。
表使用不同技术对平行样品(GAF-固定和PBF-固定)的KRAS外显子2测序分析。
GAF：无酸乙二醛；PBF：磷酸酶缓冲福尔马林；N.A.：未评估；WT：野生型；*：低突变体等位基因频率
实施例5
商购可获得的乙二醛溶液含有许多衍生自乙二醛生产和储存过程中氧化和降解过程的酸(Zhiyong Zhang，Dishun Zhao和Baoyun Xu，Journal of ChromatographicScience 2013；51：893-898)。这些酸在离子交换树脂中通过后被完全除去，但在该通过后不久，由于暴露于空气，或由于降解过程，在储存期间在固定剂中逐渐形成新的酸。
已经进行了这些酸之一(并且是最具反应性的)，即乙醛酸在这些固定剂中的含量的分析评价。
该分析在含有磷酸盐缓冲液0.1M pH 7.4的水溶液中进行，向其中加入商购的2％乙二醛(原始溶液：40％乙二醛，Sigma)。
加入少量乙二醛会降低稀释溶液的pH，因为前者存在强酸性，尽管存在缓冲液(溶液N.1：在分析前1周制备)。
2)溶液与之前完全一致，但在分析前6个月制备。由于氧化和降解导致酸的逐渐形成，该溶液的pH为强酸(pH 4.5)。
3)含有磷酸盐缓冲液pH 7.4，0.1M的水溶液，向其中加入2％通过离子交换树脂制备的无酸乙二醛。在分析前2个月制备溶液并且在-20℃保持冷冻。
4)将含有磷酸盐缓冲液pH 7.4，0.1M的水溶液加入到2％无酸乙二醛溶液中，通过离子交换树脂和10％乙醇(Carlo Erba)制备。具有抗氧化活性的乙醇的存在最终防止了试剂的氧化，从而防止了试剂的酸化。
分析条件。
用具有电导检测的离子色谱法测定4个样品中乙醛酸的含量。
基于由乙醛酸(Sigma)标准表示的对照，检查要表示乙醛酸的信号的鉴定。用相同的方法测定乙醛酸的浓度，乙醛酸可以衍生自乙二醛的直接氧化。
用于分析的装置是Dionex DX 500离子色谱仪。还使用可见UV光谱记录数据。
B.结果概述
表：4种样品中乙醛酸含量的测定结果。
[i]乙醛酸的检出限(LOD)范围为约1-2×10-3mM。
样品的吸收光谱(图5)。
考虑到2％w/w乙二醛溶液的浓度为约380mM，样品2中乙醛酸的浓度为约最初存在的乙二醛的10％。
C)结论
1)乙二醛在溶液中经历逐步氧化和酸化的变性，其在约pH 4-4.5达到平衡，这实际上是乙二醛的商购溶液的pH。在样品2中，含有2％乙二醛，6个月后pH降至pH 4.5并且显示出非常高含量的乙醛酸。
2)离子交换树脂(Amberlite)中的通道除去了酸，但很快就会形成新的乙醛酸，其水平远低于样品1(含有商购乙二醛)的水平。这表明在2％乙二醛溶液中(如在固定剂中使用的)，低于0.3mM的乙醛酸浓度只能通过用离子交换树脂除去酸来获得。事实上，样品1中乙醛酸的浓度高于上述限度。
3)通过冷冻溶液(样品3)或通过加入用作抗氧化剂的醇例如乙醇，可以获得防止导致乙醛酸形成的氧化和变性过程。
Claims (10)
1.无酸乙二醛水溶液在组织固定中的用途。
2.权利要求1的用途，其中乙二醛溶液具有0.1％-90％的重量浓度范围。
3.权利要求2的用途，其中乙二醛溶液具有2％的重量浓度。
4.权利要求1-3任一项的用途，其中溶液的pH范围为7.1-8.0。
5.权利要求1-4任一项的用途，其中溶液通过用离子交换树脂处理乙二醛商购溶液得到。
6.权利要求1-5任一项的用途，用于固定和保存用于组织学、细胞学、免疫组织化学评估和用于基因分析的人、动物和植物细胞和组织。
7.权利要求1-6任一项的用途，其中通过防止空气接触来防止溶液氧化和酸化。
8.权利要求7的用途，其中通过分配在容器“盒中袋”和/或真空容器中和/或通过任选添加抗氧化剂例如乙醇或甲醇来防止溶液氧化和酸化。
9.权利要求1-6任一项的用途，其中将溶液在-1℃至-80℃的温度保持冷冻，直至使用时为止。
10.用于组织学样品的组织学固定的试剂盒，其包含“盒中袋”类型的气密容器，所述容器包含权利要求1-8中定义的溶液和用于组织学的其它常规试剂。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ITUB2016A000829A ITUB20160829A1 (it) | 2016-02-18 | 2016-02-18 | Fissativo per preparati istologici comprendente gliossale privo di acidi |
| IT102016000016894 | 2016-02-18 | ||
| PCT/EP2017/053041 WO2017140596A1 (en) | 2016-02-18 | 2017-02-10 | Acid free glyoxal as fixative for histological preparations |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108601340A true CN108601340A (zh) | 2018-09-28 |
| CN108601340B CN108601340B (zh) | 2022-03-22 |
Family
ID=56097194
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201780010590.8A Active CN108601340B (zh) | 2016-02-18 | 2017-02-10 | 作为用于组织学制品的固定剂的无酸乙二醛 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11204305B2 (zh) |
| EP (1) | EP3416482B1 (zh) |
| JP (1) | JP6947410B2 (zh) |
| CN (1) | CN108601340B (zh) |
| CA (1) | CA3014243A1 (zh) |
| ES (1) | ES2847831T3 (zh) |
| IT (1) | ITUB20160829A1 (zh) |
| WO (1) | WO2017140596A1 (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113412104A (zh) * | 2019-01-25 | 2021-09-17 | 雷诺尼尔性能纤维有限责任公司 | 用乙二醛交联纤维素提高吸收性能 |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2021075506A (ja) * | 2019-11-13 | 2021-05-20 | 学校法人北里研究所 | 耐変色標本固定剤及びその使用 |
| IT201900024448A1 (it) * | 2019-12-18 | 2021-06-18 | Addax Biosciences S R L | Conservazione di sequenze di acidi nucleici mediante fissazione dei tessuti in formalina tamponata preparata utilizzando formaldeide deprivata di acidi |
| FR3146794A1 (fr) | 2023-03-22 | 2024-09-27 | Algoscope | Conditionnement de transport d’un prélèvement biologique dans un liquide de conservation pour examen histopathologique |
| FR3146793A1 (fr) | 2023-03-22 | 2024-09-27 | Algoscope | Procédé et dispositif d’anatomopathologie avec identification et suivi d’objets |
Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1993005650A1 (en) * | 1991-09-20 | 1993-04-01 | Camiener Gerald W | Methods and compositions with aldehyde stabilizing solution |
| US5998483A (en) * | 1991-09-20 | 1999-12-07 | Camiener; Gerald W. | Glyoxal-containing preservative compositions |
| WO2004006961A1 (en) * | 2002-07-16 | 2004-01-22 | Bio Syntech Canada Inc. | Composition for cytocompatible, injectable, self-gelling chitosan solutions for encapsulating and delivering live cells or biologically active factors |
| US20050181353A1 (en) * | 2004-02-17 | 2005-08-18 | Rao Galla C. | Stabilization of cells and biological specimens for analysis |
| CN101473812A (zh) * | 2009-01-24 | 2009-07-08 | 曹建明 | 一种用于尸体标本的防腐固定液组合物及其制备方法 |
| CN101864473A (zh) * | 2005-03-28 | 2010-10-20 | 美德美事株式会社 | 用于细胞学诊断的辅助溶液 |
| CN101965326A (zh) * | 2008-01-25 | 2011-02-02 | 科莱恩特种精细化学品法国公司 | 制备乙醛酸水溶液的方法 |
| CN102076212A (zh) * | 2008-07-01 | 2011-05-25 | 阿克马法国公司 | 用于保存人类或动物躯体的外用组合物 |
| CN102361550A (zh) * | 2009-04-07 | 2012-02-22 | 阿克马法国公司 | 用于保藏人体或者动物体的组合物 |
| CN104365579A (zh) * | 2013-08-13 | 2015-02-25 | 陆伟明 | 一种标本耐固防腐定型液 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2159975A1 (de) * | 1971-12-03 | 1973-06-07 | Veba Chemie Ag | Glyoxalhalbacetale, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung |
| US7368132B2 (en) | 2004-10-27 | 2008-05-06 | Medical Chemical Corporation | Glyoxal/zinc fixative |
| US9733162B2 (en) * | 2014-02-11 | 2017-08-15 | Ihor Turkevych | Universal system, method and solution for the acceleration of the process of fixing, dehydrating and clearing the structure of biological tissue |
| CA2972682C (en) * | 2015-01-27 | 2021-06-08 | Ventana Medical Systems, Inc. | Methods for tissue sample fixation using an extended soak in aldehyde-based fixative solutions |
-
2016
- 2016-02-18 IT ITUB2016A000829A patent/ITUB20160829A1/it unknown
-
2017
- 2017-02-10 WO PCT/EP2017/053041 patent/WO2017140596A1/en active Application Filing
- 2017-02-10 EP EP17706968.9A patent/EP3416482B1/en active Active
- 2017-02-10 ES ES17706968T patent/ES2847831T3/es active Active
- 2017-02-10 CN CN201780010590.8A patent/CN108601340B/zh active Active
- 2017-02-10 JP JP2018543152A patent/JP6947410B2/ja active Active
- 2017-02-10 CA CA3014243A patent/CA3014243A1/en active Pending
- 2017-02-10 US US16/075,149 patent/US11204305B2/en active Active
Patent Citations (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1993005650A1 (en) * | 1991-09-20 | 1993-04-01 | Camiener Gerald W | Methods and compositions with aldehyde stabilizing solution |
| US5439667A (en) * | 1991-09-20 | 1995-08-08 | Camiener; Gerald W. | Method for preserving tissue for microscopic examination using an osmotically controlled glyoxal solution |
| US5998483A (en) * | 1991-09-20 | 1999-12-07 | Camiener; Gerald W. | Glyoxal-containing preservative compositions |
| WO2004006961A1 (en) * | 2002-07-16 | 2004-01-22 | Bio Syntech Canada Inc. | Composition for cytocompatible, injectable, self-gelling chitosan solutions for encapsulating and delivering live cells or biologically active factors |
| US20050181353A1 (en) * | 2004-02-17 | 2005-08-18 | Rao Galla C. | Stabilization of cells and biological specimens for analysis |
| CN101864473A (zh) * | 2005-03-28 | 2010-10-20 | 美德美事株式会社 | 用于细胞学诊断的辅助溶液 |
| CN101965326A (zh) * | 2008-01-25 | 2011-02-02 | 科莱恩特种精细化学品法国公司 | 制备乙醛酸水溶液的方法 |
| CN102076212A (zh) * | 2008-07-01 | 2011-05-25 | 阿克马法国公司 | 用于保存人类或动物躯体的外用组合物 |
| CN101473812A (zh) * | 2009-01-24 | 2009-07-08 | 曹建明 | 一种用于尸体标本的防腐固定液组合物及其制备方法 |
| CN102361550A (zh) * | 2009-04-07 | 2012-02-22 | 阿克马法国公司 | 用于保藏人体或者动物体的组合物 |
| CN104365579A (zh) * | 2013-08-13 | 2015-02-25 | 陆伟明 | 一种标本耐固防腐定型液 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| GIANNI BUSSOLATI等: "Acid-freeglyoxalasasubstituteofformalin forstructuralandmolecularpreservationin tissuesamples", 《PLOS ONE》 * |
| NATHALIE GEHIN EPOUSE MARCON: "le glyoxal:un possible substitut du formaldehyde en anatomie pathologique", 《PROQUEST硕博士论文数据库》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113412104A (zh) * | 2019-01-25 | 2021-09-17 | 雷诺尼尔性能纤维有限责任公司 | 用乙二醛交联纤维素提高吸收性能 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20190049348A1 (en) | 2019-02-14 |
| ES2847831T3 (es) | 2021-08-04 |
| CN108601340B (zh) | 2022-03-22 |
| EP3416482A1 (en) | 2018-12-26 |
| JP2019507342A (ja) | 2019-03-14 |
| EP3416482B1 (en) | 2020-12-30 |
| WO2017140596A1 (en) | 2017-08-24 |
| JP6947410B2 (ja) | 2021-10-13 |
| CA3014243A1 (en) | 2017-08-24 |
| US11204305B2 (en) | 2021-12-21 |
| ITUB20160829A1 (it) | 2017-08-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108601340A (zh) | 作为用于组织学制品的固定剂的无酸乙二醛 | |
| Dey | Basic and advanced laboratory techniques in histopathology and cytology | |
| JP2017521642A (ja) | 細胞含有液体サンプルのための固定用組成物 | |
| EP3269813B1 (en) | A method for isolating a nucleic acid from an ffpe tissue | |
| US20220315987A1 (en) | Fully automated nucleic acid extraction methods for tissue samples | |
| US5482676A (en) | Visualization system for retrieval, identification, and positioning of biological samples for subsequent microscopic examination | |
| CA2941801C (en) | Hematoxylin precipitate cleaning method and system | |
| Cadoret et al. | Evaluation of fixation methods for demonstration of N eoparamoeba perurans infection in A tlantic salmon, S almo salar L., gills | |
| US20070054258A1 (en) | Method of removing mucus and cell treatment solution and preservative solution used therefor | |
| JP4338206B2 (ja) | 赤芽球の分類計数方法 | |
| Shariff et al. | Principles & Interpretation of Laboratory Practices in Surgical Pathology | |
| Lahr et al. | Diagnosis of papillary thyroid carcinoma is facilitated by using an RT-PCR approach on laser-microdissected archival material to detect RET oncogene activation | |
| US20070122909A1 (en) | Method of treating cells | |
| US20210310045A1 (en) | Process and composition for the stabilization of cell-free nucleic acids and cells | |
| Camus et al. | Clinical Pathology and Ancillary Diagnostics | |
| Wade | A modification of the Fite formaldehyde (Fite I) method for staining acid-fast bacilli in paraffin sections | |
| Ali Jamal et al. | The innovative safe fixative for histology, histopathology, and immunohistochemistry techniques:“Pilot study using shellac alcoholic solution fixative” | |
| Nigam | Experimental animal physiology and biochemistry | |
| Sakakibara et al. | An aspiration material preparation system: application of a new liquid-based cytology technique for fine-needle aspiration of the breast | |
| Dube et al. | Systematic comparison of quantity and quality of RNA recovered with commercial FFPE tissue extraction kits | |
| Smith et al. | Specimen handling and preparation for routine diagnostic histopathology | |
| AinswortháMitchell | Sediments in ink and in writing | |
| De Tomasi | Laboratory Hints from the Literature | |
| BR102014021725A2 (pt) | meio líquido para preservação de células de amostras de exames citológicos | |
| Ruayaree et al. | Quantitative evaluation of cellular intensity in cytologic staining over difference time period of post air-dried smear in canine mammary gland tumor. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 1260651 Country of ref document: HK |
|
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |