CN108588057A

CN108588057A - 热稳定性提高的低温淀粉酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN108588057A
Application number: CN201810226736.9A
Authority: CN
Inventors: 田�健; 伍宁丰; 闫亚茹; 李庆宾; 初晓宇
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2018-03-19
Filing date: 2018-03-19
Publication date: 2018-09-28
Anticipated expiration: 2038-03-19
Also published as: CN108588057B

Abstract

本发明公开了热稳定性提高的低温淀粉酶突变体及其应用。本发明将低温淀粉酶进行定点突变最终筛选得到了热稳定性显著提高的3个低温淀粉酶突变体，其氨基酸序列分别为SEQ ID No.3、SEQ ID No.4或SEQ ID No.5所示；Tm值测定结果表明三个突变体的Tm值均比野生型淀粉酶有明显提升，其中SEQ ID No.5所示突变体的Tm值相比野生型提高了4.77℃；残余酶活力比较试验结果发现，三个突变体的残余酶活力相比野生型淀粉酶分别提高了1.6倍，2.4倍和2.6倍；酶动力学参数测定结果表明，本发明低温淀粉酶突变体不仅可显著提高淀粉酶的热稳定性还可有效提高淀粉酶的催化效率。

Description

热稳定性提高的低温淀粉酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及淀粉酶突变体，尤其涉及热稳定性提高的低温淀粉酶突变体，本发明进一步涉及该低温突变体的应用，属于淀粉酶突变体领域。

背景技术

淀粉酶是一种十分重要的酶制剂，大量应用于淀粉转化、洗涤行业、燃料乙醇生产、食品工业、发酵、造纸、纺织品工业和医药行业等，占了整个酶制剂市场份额的30％。α-淀粉酶根据最适反应pH值的不同，分为酸性淀粉酶、中性淀粉酶和碱性淀粉酶。

α-淀粉酶能够水解淀粉分子内部α-1,4-葡萄糖苷键，水解产物为糊精、麦芽寡糖、麦芽糖和葡萄糖，在食品、纺织、医药和饲料等工业领域广泛应用。碱性淀粉酶在强碱性条件下水解淀粉的潜力，使其可以应用于淀粉加工、纺织退浆以及用于自动洗衣机的洗涤剂添加等工业领域。为了满足印染行业连续化生产的要求，需要淀粉酶能够在高温下使用，但是目前大多数淀粉酶在高温下的稳定性较差。

定点突变和定向进化是提高工业用酶热稳定性的两种主要手段。定向进化虽然不需要准确的酶分子结构信息，但是需要建立一种能够从大量的突变株中快速简便的筛选到优势菌株的方法。而定点突变，与定向进化相比，是一种更迅速、直接且节约成本的提高酶热稳定性的方法。

因此，对低温淀粉酶进行分子改造，筛选得到更适合工业化应用的热稳定性提高的低温淀粉酶突变体，对于淀粉酶的工业应用将具有重要的意义。

发明内容

本发明主要目的是野生型低温淀粉酶进行定点突变以期筛选得到热稳定性显著提高的淀粉酶突变体；

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明为了得到热稳定性显著提高的淀粉酶突变体，采用NAMD 2.12在CHARMM22磁力场下对野生型低温淀粉酶(SEQ ID No.1)蛋白进行分子动力学模拟，利用FoldX软件计算突变体对蛋白质解折叠自由能的影响，筛选出对蛋白质热稳定性有正效应的点，然后再进行多序列比对，把位于保守区和距离活性中心比较近的突变位点排除掉，最终筛选得到了3个热稳定性显著提高的低温淀粉酶突变体，即：S255K是将SEQ ID No.2所示的野生型低温淀粉酶的第255位丝氨酸突变为赖氨酸得到的淀粉酶突变体，其氨基酸序列为SEQ IDNo.3所示；S340P是将SEQ ID No.2 所示的野生型低温淀粉酶的第340位丝氨酸突变为脯氨酸得到的淀粉酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID No.4所示；S255K/S340P是将SEQ ID No.2所示的野生型低温淀粉酶的第255位丝氨酸突变为赖氨酸以及将第 340位丝氨酸突变为脯氨酸得到的淀粉酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID No.5所示。

本发明还涉及编码SEQ ID No.3、SEQ ID No.4或SEQ ID No.5所示氨基酸的基因以及含有这些基因的表达载体以及宿主细胞。

本发明进一步涉及用编码SEQ ID No.3、SEQ ID No.4或SEQ ID No.5 所示氨基酸的基因制备淀粉酶突变体的方法。

本领域人员可以采用本领域的常规方法制备所述的淀粉酶突变体，譬如，采用表达载体，以酶的形式表达；具体的，将编码SEQ ID No.3、 SEQ ID No.4或SEQ ID No.5所示氨基酸的基因与表达载体可操作的连接得到重组表达载体，将该重组表达载体导入到宿主细胞中诱导酶的表达，收集并纯化所表达的产物即可。

其中，表达载体的选择取决于所要导入的宿主细胞的种类，所述的表达载体通常包括启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始信号和可选的各种激活基因或抑制基因表达的序列。

本发明的表达载体中也可含有适当的转录终止子，此外，还可含有选择标记。

本发明中所述的宿主细胞可以是哺乳动物细胞、昆虫细胞、细菌、真菌(包括酵母)细胞等；优选为细菌、真菌(包括酵母)细胞；其中，所述的细菌可以是革兰氏阴性细胞(譬如大肠杆菌细胞)或革兰氏阳性细胞等。

本发明把野生型淀粉酶和三个突变体在BL21(DE3)中成功表达并纯化，然后用SDS-PAGE电泳检测，结果表明蛋白分子量大小与理论大小一致，约为55kDa，而且条带比较单一纯度达到95％以上，说明可以用于后续一系列酶学性质的研究。

为了研究S255K，S340P和S255K/S340P这三个淀粉酶突变体的最适温度是否和野生型淀粉酶不同，本发明测定了野生型淀粉酶和三个淀粉酶突变体在不同温度条件下的相对酶活力。试验结果发现，三个淀粉酶突变体和野生型淀粉酶的最适温度相同，均为30℃，并且它们在0℃仍然保持20％左右的酶活，但是在50℃时基本上丧失活性，这表明野生型淀粉酶和三个淀粉酶突变体都具备典型的低温淀粉酶的性质，即：低温下的高活性和高温下的热不稳定性。

本发明检测了S255K，S340P和S255K/S340P这三个淀粉酶突变体的最适pH值是否随着氨基酸的替换而发生变化，本发明测定了野生型淀粉酶和三个淀粉酶突变体在不同pH条件下的相对酶活力。测定结果发现，三个淀粉酶突变体的最适pH没有发生变化，它们的最适pH和野生型淀粉酶一样均为7.0，属于中性低温淀粉酶，酸性和碱性条件均对野生型淀粉酶和淀粉酶突变体的活性有较大的影响。

为了分析突变对野生型热稳定性的影响，本发明使用差示扫描量热仪(DSC)对野生型淀粉酶及三个突变体的Tm值进行测定。测定结果发现，三个突变体S255K、S340P和S255K/S340P的Tm值均比野生型淀粉酶有所提升，其中突变体S255K的Tm值提升了1.52℃，突变体S340P 的Tm值提升了3.38℃，突变体S255K/S340P的Tm值提高了4.77℃。

为了进一步比较野生型淀粉酶和三个淀粉酶突变体的热稳定性差异，本发明把野生型淀粉酶和三个淀粉酶突变体的酶液在40℃下保温然后比较它们的残余酶活力；比较结果发现，在40℃下保温40min后三个突变体S255K，S340P和S255K/S340P的残余酶活力分别是46％，69％和76％，分别是野生型淀粉酶残余酶活力的1.6倍，2.4倍和2.6倍左右；保温80min后，三个突变体S255K，S340P和S255K/S340P的残余酶活力分别是46％，69％和76％，分别提高了1.6倍，2.4倍和2.6倍左右。这表明将野生型淀粉酶进行双点突变后(S255K和S340P)对热稳定性的提高作用效果更明显，说明S255K和S340P对野生型热稳定性的影响是有协同效应的，该实验结果和Tm值的测定结果相一致，其中，S255K， S340P和S255K/S340P的热稳定性都比野生型好，并且热稳定性是依次提高的。

进一步的，本发明在淀粉酶的最适pH 7.0及最适温度30℃的条件下测定了野生型淀粉酶及三条淀粉酶突变体的动力学参数；测定结果发现，三个淀粉酶突变体的Km、Kcat和Kcat/Km与野生型相比都有不同程度的提高；其中，S255K，S340P和S255K/S340P的Km与野生型相比分别提高了158％，41％和37％，这表明S255K，S340P和S255K/ S340P的氨基酸突变使得淀粉酶分子对底物的亲和力下降，但是S255K， S340P和S255K/S340P的催化效率常数(Kcat)分别是野生型的4.86倍、 2.91倍和3.74倍，最终，淀粉酶突变体S255K，S340P和S255K/S340P 的Kcat/Km与野生型相比分别提高了88％，105％和173％。这表明 S255K和S340P的氨基酸突变不仅可以提高野生型淀粉酶的热稳定性还可以提高淀粉酶的催化效率，并且它们的组合突变S255K/S340P在热稳定性的提高方面和催化效率的提高方面均有显著的协同增强效应。

工业应用

本发明所提供的三个淀粉酶突变体在热稳定性上比野生型淀粉酶有明显提高并且对淀粉酶的催化效率也有明显提高，因此，本发明的三个淀粉酶突变体在食品、纺织、医药和饲料等工业领域具有广泛的应用前景，能够应用于淀粉加工、纺织退浆以及用于自动洗衣机的洗涤剂添加等方面，譬如：将本发明的淀粉酶突变体作为添加剂掺入到洗涤剂或表面去污剂中(在中性pH值左右)，能够有效改善洗涤剂或表面去污剂的去污能力；或者用于纺织品工业中的织物脱浆，促进去除编织中在纬线上作为保护性涂盖层的含淀粉胶料。

附图说明

图1纯化后的野生酶及突变酶的SDS-PAGE电泳图；M.蛋白质标准分子量；1.WT；2.S255K；3.S340P；4.S255K/S340P。

图2温度对野生型和突变体酶活力的影响。

图3pH对野生型和突变体酶活力的影响。

图4野生型和突变体酶在40℃下的热稳定性实验结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

试验例1基于分子动力学模拟确定突变位点的试验

分子动力学模拟(MDS)就是通过计算机对原子核和电子所构成的多体系中的微观粒子之间的相互作用和运动进行模拟，把每一个原子核视为在全部其它原子核和电子所构成的经验势场的作用下按照牛顿定律进行运动，进而得到体系中粒子的运动轨迹，再按照统计物理的方法计算得出物质的结构和性质等宏观性能。

本试验利用NAMD 2.12在CHARMM22磁力场下进行分子动力学模拟。为了获得正突变体，本试验利用FoldX软件计算突变体对低温淀粉酶蛋白质解折叠自由能的影响，筛选出对低温淀粉酶蛋白质热稳定性有正效应的点。然后再进行多序列比对，把位于保守区和距离活性中心比较近的突变位点排除掉，最终筛选得到了3个热稳定性提高的低温淀粉酶突变体，即：S255K，S340P和S255K/S340P。其中，S255K是将SEQ ID No.2 所示的野生型低温淀粉酶的第225位丝氨酸突变为赖氨酸得到的淀粉酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID No.3所示；S340P是将SEQ ID No.2所示的野生型低温淀粉酶的第340位丝氨酸突变为脯氨酸得到的淀粉酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID No.4所示；S255K/S340P是将SEQ ID No.2所示的野生型低温淀粉酶的第225位丝氨酸突变为赖氨酸以及将第 340位丝氨酸突变为脯氨酸得到的淀粉酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID No.5所示。

试验例2 AHA及其突变体最适温度的测定试验

本发明将试验例1筛选得到三个热稳定性提高的正突变体以及野生型淀粉酶在BL21(DE3)中成功表达并纯化，然后用SDS-PAGE电泳检测 (图1)，结果表明蛋白分子量大小与理论大小一致，约为55kDa，而且条带比较单一纯度达到95％以上，可以用于后续一系列酶学性质的研究。

为了研究S255K，S340P和S255K/S340P三个淀粉酶突变体的最适温度是否和野生型不同，本试验测定了野生型和三个淀粉酶突变体在不同温度条件下的相对酶活力。

测定结果测定为图2所示，从图2可见，三个淀粉酶突变体和野生型淀粉酶的最适温度相同，均为30℃，并且它们在0℃仍然保持20％左右的酶活，但是在50℃时基本上丧失活性，这表明野生型和三个淀粉酶突变体都具备典型的低温淀粉酶的性质：低温下的高活性和高温下的热不稳定性。

试验例3 AHA及其淀粉酶突变体最适pH值的测定试验

为了分析S255K，S340P和S255K/S340P三个淀粉酶突变体的最适pH是否随着氨基酸的替换而发生变化，本试验测定了野生型和突变酶在不同pH条件下的相对酶活力。

α-淀粉酶活力的测定：

低温淀粉酶酶活力的测定方法采用DNS法，参照文献并做了改进。在酶活管中加入450μL 1％可溶性淀粉(可溶性淀粉溶于pH7.0柠檬酸- 磷酸氢二钠缓冲液并含有终浓度为5mM的钙离子)，在30℃水浴锅中预热3min，加入50μL稀释适当倍数的酶液于反应体系，30℃反应 10min，反应结束后加入1.5mL DNS溶液，沸水煮5min使其显色，然后在冰水混合物迅速冷却，使用MD的酶标仪在550nm测定光吸收值。

酶活力单位定义：在一定条件下，每分钟释放出1μmol还原糖所需的酶量。

野生型及其突变体最适pH的测定：

将纯化后的低温淀粉酶及其突变体进行适当的稀释后，分别加入到不同的pH缓冲液，即：pH5、pH5.6、pH6、pH6.6、pH7、pH7.6、pH8.6、 pH9，配制的淀粉底物中，在最适反应温度30℃下反应，测定其最适反应pH，以最高酶活力为100％，计算各温度下的相对酶活，得到最适反应温度。

测定结果如图3所示。根据图3可见，三条淀粉酶突变体的最适pH 没有发生变化，它们的最适pH值和野生型淀粉酶一样均为7.0，属于中性低温淀粉酶，酸性和碱性条件均对野生型和三个淀粉酶突变体的活性有较大的影响。

试验例4 AHA及其突变体热稳定性测定试验

为了分析突变对野生型热稳定性的影响，本试验使用差示扫描量热仪(DSC)对野生型及三个淀粉酶突变体的Tm值进行测定。

野生型淀粉酶及其淀粉酶突变体Tm的测定方法：

用pH 7.4的20mMTris-Cl将纯化后的野生型淀粉酶及淀粉酶突变体稀释到相同的蛋白浓度，利用差示扫描量热仪(DSC)测定其Tm。温度变化范围为10℃～70℃，升温速度为100℃·h^-1。

测定结果如表1所示。

表1各突变体与野生型的Tm值

从表1的测定结果可见，突变体S255K、S340P和S255K/S340P的 Tm值均比野生型有所提升，其中突变体S255K的Tm值提升了1.52℃，突变体S340P的Tm值提升了3.38℃，突变体S255K/S340P的Tm值提高了4.77℃。

除了把野生型淀粉酶(SEQ ID No.2)第255位的丝氨酸替换为赖氨酸，把340位的丝氨酸替换为脯氨酸外，本试验还选择了其它5个有代表性的氨基酸，分别在野生型淀粉酶(SEQ ID No.2)第255和340两个位点的丝氨酸替换为其它的氨基酸，替换后的这5个氨基酸分别是：丙氨酸、谷氨酸、亮氨酸、精氨酸和酪氨酸。

替换后的Tm测定结果如下表2所示，结果表明这些淀粉酶突变体的热稳定性相比于野生型未得到明显提高。

表2突变体与野生型的Tm值

为了进一步比较野生型和三个淀粉酶突变体的热稳定性的差异，本试验把野生型和三个淀粉酶突变体的酶液在40℃下保温然后比较它们的残余酶活力。

测定结果如图4所示，从图4可见，在40℃下保温40min后三个突变体S255K，S340P和S255K/S340P的残余酶活力分别是46％，69％和76％，分别是野生型残余酶活力的1.6倍，2.4倍和2.6倍左右；保温80min后，三个突变体S255K，S340P和S255K/S340P的残余酶活力分别是46％，69％和76％，分别提高了1.6倍，2.4倍和2.6倍左右。还可以看出双点突变对热稳定性的提高作用效果更明显，说明S255K和 S340P对野生型热稳定性的影响是有协同效应的。

这个实验结果和Tm值的测定结果是一致的，S255K，S340P和 S255K/S340P的热稳定性都比野生型好，并且热稳定性是依次提高的。

试验例5 AHA及其突变体动力学参数测定试验

在本试验中，野生型淀粉酶及三个淀粉酶突变体的动力学参数是在酶的最适pH7.0及最适温度30℃的条件下测定的。

野生型淀粉酶及淀粉酶突变体动力学参数的测定方法：

在野生型及其突变体的最适温度和最适pH条件下测定它们的动力学参数。我们配制了一系列浓度梯度的淀粉底物：0、1.0、2.0、3.0、 4.0、5.0、6.0、8.0、10.0、12.0和14.0mgmL-1。在不同的浓度下进行酶活力测定。最后用软件GraphPad Prism(GraphPad SoftwareInc.，La Jolla，CA，USA)拟合催化曲线并计算Km和Kcat。

测定结果为表3所示。

表3野生型淀粉酶和突变酶的酶学动力学参数

从表3的测定结果可见，三个突变体的Km、Kcat和Kcat/Km与野生型相比都有不同程度的明显提高；其中，S255K，S340P和S255K/ S340P的Km与野生型相比分别提高了158％，41％和37％。这表明S255K，S340P和S255K/S340P的氨基酸突变使得淀粉酶分子对底物的亲和力下降。但是S255K，S340P和S255K/S340P的催化效率常数 (Kcat)分别是野生型的4.86倍、2.91倍和3.74倍。最终，突变体S255K， S340P和S255K/S340P的Kcat/Km与野生型相比分别提高了88％， 105％和173％。这表明S255K和S340P的氨基酸突变不仅可以提高野生型酶的热稳定性还可以提高酶的催化效率，并且它们的组合突变S255K/ S340P在热稳定性的提高方面和催化效率的提高方面都有协同效应。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 热稳定性提高的低温淀粉酶突变体及其应用

<130> BJ-2002-180117A

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1344

<212> DNA

<213> 淀粉酶

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1344)

<400> 1

acg cca acg aca ttc gtt cac ctt ttt gag tgg aac tgg cag gat gtc 48

Thr Pro Thr Thr Phe Val His Leu Phe Glu Trp Asn Trp Gln Asp Val

1 5 10 15

gcg cag gag tgc gag cag tat ctc ggg ccg aaa ggt tat gcc gcg gtg 96

Ala Gln Glu Cys Glu Gln Tyr Leu Gly Pro Lys Gly Tyr Ala Ala Val

20 25 30

cag gtt tcg cca cca aat gaa cac atc acc ggt agc cag tgg tgg acg 144

Gln Val Ser Pro Pro Asn Glu His Ile Thr Gly Ser Gln Trp Trp Thr

35 40 45

cgt tat caa ccc gtc agt tac gaa ttg caa tca cgc ggc ggt aac cgc 192

Arg Tyr Gln Pro Val Ser Tyr Glu Leu Gln Ser Arg Gly Gly Asn Arg

50 55 60

gcg cag ttt atc gac atg gtt aac aga tgt tca gca gca ggt gtt gat 240

Ala Gln Phe Ile Asp Met Val Asn Arg Cys Ser Ala Ala Gly Val Asp

65 70 75 80

atc tat gtt gat acg cta ata aat cat atg gct gcc ggt tcg ggc aca 288

Ile Tyr Val Asp Thr Leu Ile Asn His Met Ala Ala Gly Ser Gly Thr

85 90 95

ggt acg gcg ggt aat agc ttc ggt aat aaa tca ttt ccg atc tat tcg 336

Gly Thr Ala Gly Asn Ser Phe Gly Asn Lys Ser Phe Pro Ile Tyr Ser

100 105 110

ccg cag gac ttc cat gag tcc tgc aca atc aat aat agt gat tac ggt 384

Pro Gln Asp Phe His Glu Ser Cys Thr Ile Asn Asn Ser Asp Tyr Gly

115 120 125

aac gat cgc tat cgg gtt caa aac tgc gaa ctg gtt ggg ctg gct gat 432

Asn Asp Arg Tyr Arg Val Gln Asn Cys Glu Leu Val Gly Leu Ala Asp

130 135 140

ctc gat acg gcc agt aac tat gtt caa aac acc att gct gct tat atc 480

Leu Asp Thr Ala Ser Asn Tyr Val Gln Asn Thr Ile Ala Ala Tyr Ile

145 150 155 160

aac gat cta cag gcg att ggc gtg aaa gga ttc cgc ttt gac gcc agc 528

Asn Asp Leu Gln Ala Ile Gly Val Lys Gly Phe Arg Phe Asp Ala Ser

165 170 175

aaa cac gtt gcg gcc tcc gat att cag tcg ctg atg gcg aaa gtc aac 576

Lys His Val Ala Ala Ser Asp Ile Gln Ser Leu Met Ala Lys Val Asn

180 185 190

ggt agt ccg gtt gtg ttc cag gaa gtc atc gac cag ggc ggt gaa gcg 624

Gly Ser Pro Val Val Phe Gln Glu Val Ile Asp Gln Gly Gly Glu Ala

195 200 205

gtc ggt gcc agc gaa tat ctc tcc acc ggg ctg gtc acg gag ttc aaa 672

Val Gly Ala Ser Glu Tyr Leu Ser Thr Gly Leu Val Thr Glu Phe Lys

210 215 220

tac tcc acg gaa ctg ggc aat act ttc cgt aac ggt tcg ctg gca tgg 720

Tyr Ser Thr Glu Leu Gly Asn Thr Phe Arg Asn Gly Ser Leu Ala Trp

225 230 235 240

tta tct aac ttt ggt gaa ggc tgg gga ttt atg cct tcc tca tct gcg 768

Leu Ser Asn Phe Gly Glu Gly Trp Gly Phe Met Pro Ser Ser Ser Ala

245 250 255

gtt gtg ttt gtt gat aac cac gac aac cag cgc ggt cac ggc ggc gca 816

Val Val Phe Val Asp Asn His Asp Asn Gln Arg Gly His Gly Gly Ala

260 265 270

ggt aac gtc atc acc ttt gaa gac ggt cgt ctt tac gat ctg gct aac 864

Gly Asn Val Ile Thr Phe Glu Asp Gly Arg Leu Tyr Asp Leu Ala Asn

275 280 285

gtc ttt atg ctg gcg tat cct tat ggt tat ccg aaa gtg atg tca tct 912

Val Phe Met Leu Ala Tyr Pro Tyr Gly Tyr Pro Lys Val Met Ser Ser

290 295 300

tat gac ttc cac ggc gat acc gac gcc ggc ggg ccg aac gtt ccg gta 960

Tyr Asp Phe His Gly Asp Thr Asp Ala Gly Gly Pro Asn Val Pro Val

305 310 315 320

cac aat aac ggc aat ctt gag tgt ttt gcc agt aac tgg aag tgt gaa 1008

His Asn Asn Gly Asn Leu Glu Cys Phe Ala Ser Asn Trp Lys Cys Glu

325 330 335

cat cgc tgg tcg tat atc gcc ggc ggc gtt gat ttc cgt aat aac acc 1056

His Arg Trp Ser Tyr Ile Ala Gly Gly Val Asp Phe Arg Asn Asn Thr

340 345 350

gcc gac aac tgg gcg gtg acc aac tgg tgg gac aac acc aat aat cag 1104

Ala Asp Asn Trp Ala Val Thr Asn Trp Trp Asp Asn Thr Asn Asn Gln

355 360 365

atc tcc ttc ggt cgc ggt tcc tcc ggt cat atg gcg att aac aaa gaa 1152

Ile Ser Phe Gly Arg Gly Ser Ser Gly His Met Ala Ile Asn Lys Glu

370 375 380

gac tcc acg cta act gcg acg gta caa acc gac atg gca agc ggg cag 1200

Asp Ser Thr Leu Thr Ala Thr Val Gln Thr Asp Met Ala Ser Gly Gln

385 390 395 400

tat tgc aat gtg ctg aaa ggt gag ctt tct gct gat gcc aaa tcc tgc 1248

Tyr Cys Asn Val Leu Lys Gly Glu Leu Ser Ala Asp Ala Lys Ser Cys

405 410 415

tcc ggt gaa gtc atc acc gtt aac agt gac ggc act atc aat ctc aat 1296

Ser Gly Glu Val Ile Thr Val Asn Ser Asp Gly Thr Ile Asn Leu Asn

420 425 430

atc ggc gca tgg gat gcg atg gcg att cat aaa aat gcc aag ctc aac 1344

Ile Gly Ala Trp Asp Ala Met Ala Ile His Lys Asn Ala Lys Leu Asn

435 440 445

<210> 2

<211> 448

<212> PRT

<213> 淀粉酶

<400> 2

Thr Pro Thr Thr Phe Val His Leu Phe Glu Trp Asn Trp Gln Asp Val

1 5 10 15

Ala Gln Glu Cys Glu Gln Tyr Leu Gly Pro Lys Gly Tyr Ala Ala Val

20 25 30

Gln Val Ser Pro Pro Asn Glu His Ile Thr Gly Ser Gln Trp Trp Thr

35 40 45

Arg Tyr Gln Pro Val Ser Tyr Glu Leu Gln Ser Arg Gly Gly Asn Arg

50 55 60

Ala Gln Phe Ile Asp Met Val Asn Arg Cys Ser Ala Ala Gly Val Asp

65 70 75 80

Ile Tyr Val Asp Thr Leu Ile Asn His Met Ala Ala Gly Ser Gly Thr

85 90 95

Gly Thr Ala Gly Asn Ser Phe Gly Asn Lys Ser Phe Pro Ile Tyr Ser

100 105 110

Pro Gln Asp Phe His Glu Ser Cys Thr Ile Asn Asn Ser Asp Tyr Gly

115 120 125

Asn Asp Arg Tyr Arg Val Gln Asn Cys Glu Leu Val Gly Leu Ala Asp

130 135 140

Leu Asp Thr Ala Ser Asn Tyr Val Gln Asn Thr Ile Ala Ala Tyr Ile

145 150 155 160

Asn Asp Leu Gln Ala Ile Gly Val Lys Gly Phe Arg Phe Asp Ala Ser

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Claims

1.低温淀粉酶突变体，其特征在于，将SEQ ID No.2所示的野生型低温淀粉酶的第340位丝氨酸突变为脯氨酸，其氨基酸序列为SEQ ID No.4所示。

2.按照权利要求1所述的低温淀粉酶突变体，其特征在于，进一步将SEQ ID No.2所示的野生型低温淀粉酶的第255位丝氨酸突变为赖氨酸，其氨基酸序列为SEQ ID No.5所示。

3.低温淀粉酶突变体，其特征在于，将SEQ ID No.2所示的野生型低温淀粉酶的第255位丝氨酸突变为赖氨酸，其氨基酸序列为SEQ ID No.3所示。

4.编码权利要求1所述低温淀粉酶突变体的基因。

5.编码权利要求2所述低温淀粉酶突变体的基因。

6.编码权利要求3所述低温淀粉酶突变体的基因。

7.含有权利要求4-6任何一项所述基因的表达载体。

8.权利要求4-6任何一项所述基因在制备淀粉酶中的用途。

9.权利要求1-3任何一项所述低温淀粉酶突变体作为洗涤剂的添加剂的用途。

10.权利要求1-3任何一项所述低温淀粉酶突变体在织物脱浆中的用途。