CN108569831A - 一种有效的活性污泥胞外蛋白质的提取分离方法及应用 - Google Patents

一种有效的活性污泥胞外蛋白质的提取分离方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于环境工程领域，涉及活性污泥的处理方法，特别是指一种有效的活性污泥胞外蛋白质的提取分离方法及应用。本发明以阳离子交换树脂中的钠离子置换微生物细胞与EPS之间键桥接的多价态阳离子，削弱EPS与微生物间引力，最后通过离心将EPS与污泥主体分离。其次通过酸沉淀蛋白析出法，沉淀出EPS溶液中大多数蛋白质，将其分离纯化后即可进行电泳分析。提取胞外蛋白，通过胞外蛋白的表达形式判断污泥性质，用于揭示污泥特性、衰减及沉降性能的差异。

Description

一种有效的活性污泥胞外蛋白质的提取分离方法及应用
技术领域
本发明属于环境工程领域，涉及活性污泥的处理方法，特别是指一种有效的活性污泥胞外蛋白质的提取分离方法及应用。
背景技术
活性污泥结构上主要由活性微生物，EPS（胞外聚合物），吸附于EPS的尚未降解或难以降解的有机物及无机物等部分组成，由于细胞膜的选择通过性，活性污泥中大部分原核微生物及部分真核微生物只能直接利用分子量<1000的小分子物质，这就决定大多数底物首先要在细胞外经胞外酶分解，而后才能进入微生物的新陈代谢。胞外酶主要包含由活性原核生物、真核生物及后生动物在正常条件下分泌的活性蛋白及微生物死亡分解后泄露的胞内蛋白。除酶解大分子物质外，胞外蛋白在对难降解物质、广谱性抗菌药、污泥减量及常规的脱氮除磷方面均起着积极的作用。
污泥胞外蛋白质的提取是研究胞外蛋白活性及功能的前提，但胞外酶往往嵌入EPS或吸附在活性微生物细胞表面，又缺乏有效的提取方法，对污泥胞外蛋白的研究未能有效展开。因此开发一种有效提取活性污泥胞外蛋白质的方法对于活性污泥工艺的研究具有极其重要的意义。
发明内容
本发明提出一种有效的活性污泥胞外蛋白质的提取分离方法及应用，解决了现有技术中污泥胞外蛋白质的提取、胞外蛋白活性及功能的问题。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种有效的活性污泥胞外蛋白质的提取分离方法，步骤为：
（1）活性污泥中EPS的提取
a. 量取30-40ml MLSS约5000的泥水混合液置于50mL 的离心管，6000-8000 r/min离心15-30 min，弃去上清液，补充磷酸缓冲液至原液位，混合均匀后得污泥样品；
b. 将得到的污泥样品混入阳离子交换树脂得污泥样品混合液，污泥样品混合液移至混凝土搅拌器，搅拌后取上清进行离心，离心后再取上清经0.45-0.55 μm玻璃纤维滤膜过滤后，得到蛋白质/DNA比值最低的活性污泥EPS溶液；
（2）活性污泥EPS溶液中蛋白质的提取
a. 取活性污泥EPS溶液装入20ka渗析袋，将渗析袋浸泡于丙二醇溶中4-5 ℃下过夜浓缩至1-1.5 mL，将浓缩液转移至离心管内，离心后取上清液转移至新的离心管中，获得胞外EPS浓缩液；
b. 将EPS浓缩液低温下加入100%三氯乙酸溶液，使得最终浓度为10-15%，4-6 ℃静置2-4 h，10000-13000 g离心10-15 min后，弃去上清液，并以冰乙醇洗去残留的三氯乙酸，10000-13000 g离心10-15min后弃去上清液，并重复此步骤2次，置于冷冻干燥机中冻干残余乙醇，加入20µL SDS-PAGE Loading Buffer，涡旋振荡器重悬菌液后，95-100℃水浴10-20 min，使蛋白质变性，将其搁于-20℃冰箱内保存，即得活性污泥中蛋白质的混合液；
（3）活性污泥胞外蛋白质的分离
活性污泥中蛋白质的混合液通过SDS-PAGE凝胶电泳分离即完成活性污泥胞外蛋白质的提取分离。所述步骤（1）b中阳离子交换树脂为洁净001×7型阳离子交换树脂。
所述步骤（1）b中污泥样品混合液的配制，根据响应面优化数据设计混合物与阳离子交换树脂的比例，每gVSS（VSS--volatile suspended solid 可挥发性固体悬浮物）污泥样品混合液混合85-90 g阳离子交换树脂。
所述步骤（1）b中搅拌后取上清进行离心的具体操作为，400-450 r/min搅拌1-2 h后，取上清液6000-8000r/min离心20-35 min再取上清液。
所述步骤（2）a中离心的操作为，10000-11000 r/min离心5-8 min。
所述步骤（3）中SDS-PAGE凝胶电泳中用到的分离胶浓度为6-12%wt，浓缩胶浓度为4%wt，采用0.8-1%wt 的琼脂糖溶液封住胶条表面，上样量为20μL，100V恒压电泳，电泳温度保持在15-20°C，电泳时间为2-3h；电泳结束后，卸下胶片进行固定、水洗、染色、脱色及观察步骤。
所述活性污泥胞外蛋白质用于揭示污泥的酸性、衰减以及沉降性能的差异。
本发明的有益效果在于：
(1)活性污泥不同与普通土壤泥质及河底淤泥等。其主要是由活性微生物，EPS（胞外聚合物），吸附于EPS的尚未降解或难以降解的有机物及无机物等部分组成。从化学结构上来看其有机质含量较高，一般占到污泥总量的55-80%，从生物性质来看，其主要是由活体细胞组成；从物理结构来看，其主要是由丝状微生物作为支撑，胶团菌及EPS等内部填充，而形成的三维空间结构，具有独特的性质,因此诸如土壤等蛋白质的提取方法不能直接应用于活动污泥蛋白质提取当中，本发明为活性污泥蛋白质的提取提供了高效的有针对性的方法。
（2）本发明以阳离子交换树脂中的钠离子置换微生物细胞与EPS之间键桥接的多价态阳离子，削弱EPS与微生物间引力，最后通过离心将EPS与污泥主体分离。其次通过TCA蛋白沉淀法，沉淀出EPS溶液中大多数蛋白质，将其分离纯化后即可进行电泳分析；本发明提取的胞外蛋白为吸附于污泥细胞表面的EPS中的胞外蛋白，提取胞外蛋白分为两步走，包括EPS提取和胞外蛋白提取，这种方法得到的胞外蛋白所含杂质较少。
（3）本申请提取胞外蛋白，通过胞外蛋白的表达形式判断污泥性质，用于揭示污泥酸性、衰减及沉降性能的差异。
附图说明
图1为实施例1中污泥胞外蛋白质的SDS-PAGE图。
图2为实施例2中污泥胞外蛋白质的SDS-PAGE图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下提取胞外蛋白质所用污泥均来自课题组实验室。
实施例1
本发明为活性污泥胞外蛋白质的提取及纯化方法，其处理步骤为：
（1）001×7型阳离子交换树脂清洗方法：8％NaCl溶液浸泡14小时，水洗至中性；5％的HCl溶液浸泡5h，水洗至中性；用5％的NaOH溶液浸泡5h，水洗至中性，重复上述步骤清洗三次后待用。
（2）活性污泥中EPS的提取：量取30-40ml MLSS约5000的泥水混合液置于50mL 的离心管，6000r/min离心20min，弃去上清液，补充磷酸缓冲液（PBS，Phosphate Buffersolution）至原液位；混合均匀后将污泥样品混入洁净001×7型阳离子交换树脂，混合比例为88.3g阳离子交换树脂/gVSS，混合液移至混凝搅拌器，434r/min搅拌1.5h；取上清液6000r/min离心30min，取上清液以0.45μm玻璃纤维滤膜过滤，获得活性污泥EPS溶液。
（3）EPS中蛋白质的提取：量取20mEPS溶液装入20ka渗析袋中，浸泡于丙二醇溶液中4°C下过夜浓缩至1mL，将浓缩液转移至2mL离心管中，10000r/min离心5min后上清液转移至新2mL离心管中，获得胞外EPS浓缩液。浓缩液置于冷冻干燥机中冻干，加入20µL SDS-PAGE Loading Buffer，涡旋振荡器重悬菌液后，100℃水浴10min，使蛋白质变性，搁于-20°C冰箱内保存。
（4）活性污泥胞外蛋白质的分离
SDS-PAGE凝胶电泳分离胶浓度6-12%，浓缩胶浓度4%，用0.8-1% 的琼脂糖溶液封住胶条表面，电泳液采用碧云天SDS-PAGE Electrophoresis Buffer配制；上样量20μL，100V恒压电泳，电泳温度保持在15-20°C，电泳时间为2h；电泳结束后，卸下胶片，500mL考马斯亮蓝染色液染色过夜，水洗脱色过夜，定色后后扫描仪扫描检测蛋白质提取与分离效果。以下提取胞外蛋白质所用污泥均来自课题组实验室，其跑胶图如图2所示。
实施例2
（1）001×7型阳离子交换树脂清洗方法：8％NaCl溶液浸泡14小时，水洗至中性；5％的HCl溶液浸泡5h，水洗至中性；用5％的NaOH溶液浸泡5h，水洗至中性，重复上述步骤清洗三次后待用
（2）活性污泥中EPS的提取：量取30-40ml MLSS约5000的泥水混合液置于50mL 的离心管，6000r/min离心20min，弃去上清液，补充磷酸缓冲液（PBS，Phosphate Buffersolution）至原液位；混合均匀后将污泥样品混入洁净001×7型阳离子交换树脂，混合比例为88.3g阳离子交换树脂/gVSS，混合液移至混凝搅拌器，434r/min搅拌1.5h；取上清液6000r/min离心30min，取上清液以0.45μm玻璃纤维滤膜过滤，获得活性污泥EPS溶液。
（3）EPS中蛋白质的提取
量取20mEPS溶液装入20ka渗析袋中，浸泡于丙二醇溶液中4°C下过夜浓缩至1mL，将浓缩液转移至2mL离心管中，10000r/min离心5min后上清液转移至新2mL离心管中，获得胞外EPS浓缩液。低温下加入100%TCA溶液，使得最终浓度为10%，4°C静置2h，13000g离心15min后，弃去上清液，并以冰乙醇洗去残留TCA，13000g离心15min后弃去上清液，并重复此步骤2次，置于冷冻干燥机中冻干残余乙醇，加入20µL SDS-PAGE Loading Buffer，涡旋振荡器重悬菌液后，100℃水浴10min，使蛋白质变性，搁于-20°C冰箱内保存。置于冷冻干燥机中冻干，加入20µL SDS-PAGE Loading Buffer，涡旋振荡器重悬菌液后，100℃水浴10min，使蛋白质变性，搁于-20°C冰箱内保存。
（4）活性污泥胞外蛋白质的分离
SDS-PAGE凝胶电泳分离胶浓度15%，浓缩胶浓度4%，用0.8-1% 的琼脂糖溶液封住胶条表面，电泳液采用碧云天SDS-PAGE Electrophoresis Buffer配制；上样量20μL，100V恒压电泳，电泳温度保持在15-20°C，电泳时间为2h；电泳结束后，卸下胶片电泳结束后，卸下胶片，500mL考马斯亮蓝染色液染色过夜。染色完成后，水洗脱色过夜，定色后扫描仪扫描检测蛋白质提取与分离效果，结果图如图2所示。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种有效的活性污泥胞外蛋白质的提取分离方法，其特征在于，步骤为：
（1）活性污泥中EPS的提取
a. 量取30-40ml MLSS约5000的泥水混合液置于50mL 的离心管，6000-8000 r/min离心15-30 min，弃去上清液，补充磷酸缓冲液至原液位，混合均匀后得污泥样品；
b. 将得到的污泥样品混入阳离子交换树脂得污泥样品混合液，污泥样品混合液移至混凝土搅拌器，搅拌后取上清进行离心，离心后再取上清经0.45-0.55 μm玻璃纤维滤膜过滤后，得到蛋白质/DNA比值最低的活性污泥EPS溶液；
（2）活性污泥EPS溶液中蛋白质的提取
a. 取活性污泥EPS溶液装入20ka渗析袋，将渗析袋浸泡于丙二醇溶中4-5 ℃下过夜浓缩至1-1.5 mL，将浓缩液转移至离心管内，离心后取上清液转移至新的离心管中，获得胞外EPS浓缩液；
b. 将EPS浓缩液低温下加入100%三氯乙酸溶液，使得最终浓度为10-15%，4-6 ℃静置2-4 h，10000-13000 g离心10-15 min后，弃去上清液，并以冰乙醇洗去残留的三氯乙酸，10000-13000 g离心10-15min后弃去上清液，并重复此步骤2次，置于冷冻干燥机中冻干残余乙醇，加入20µL SDS-PAGE Loading Buffer，涡旋振荡器重悬菌液后，95-100℃水浴10-20 min，使蛋白质变性，将其搁于-20℃冰箱内保存，即得活性污泥中蛋白质的混合液；
（3）活性污泥胞外蛋白质的分离
活性污泥中蛋白质的混合液通过SDS-PAGE凝胶电泳分离即完成活性污泥胞外蛋白质的提取分离。
2.如权利要求1所述的有效的活性污泥胞外蛋白质的提取分离方法，其特征在于：所述步骤（1）b中阳离子交换树脂为洁净001×7型阳离子交换树脂。
3.如权利要求1所述的有效的活性污泥胞外蛋白质的提取分离方法，其特征在于：所述步骤（1）b中污泥样品混合液的配制，根据响应面优化数据设计混合物与阳离子交换树脂的比例，每gVSS污泥样品混合液混合85-90 g阳离子交换树脂。
4.如权利要求1所述的有效的活性污泥胞外蛋白质的提取分离方法，其特征在于：所述步骤（1）b中搅拌后取上清进行离心的具体操作为，400-450 r/min搅拌1-2 h后，取上清液6000-8000r/min离心20-35 min再取上清液。
5.如权利要求1所述的有效的活性污泥胞外蛋白质的提取分离方法，其特征在于：所述步骤（2）a中离心的操作为，10000-11000 r/min离心5-8 min。
6.如权利要求1所述的有效的活性污泥胞外蛋白质的提取分离方法，其特征在于：所述步骤（3）中SDS-PAGE凝胶电泳中用到的分离胶浓度为6-12%wt，浓缩胶浓度为4%wt，采用0.8-1%wt 的琼脂糖溶液封住胶条表面，上样量为20μL，100V恒压电泳，电泳温度保持在15-20°C，电泳时间为2-3h；电泳结束后，卸下胶片进行固定、水洗、染色、脱色及观察步骤。
7.如权利要求1-6任一项所述的有效的活性污泥胞外蛋白质，其特征在于：所述活性污泥胞外蛋白质用于揭示污泥的酸性、衰减以及沉降性能的差异。
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