CN104316502A - 一种通过三维荧光光谱优化超声条件提取胞外聚合物的方法 - Google Patents
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Abstract
一种通过三维荧光光谱优化超声条件提取胞外聚合物的方法属于污水生物处理活性污泥组分分析领域。本发明通过三维荧光光谱图分析活性污泥紧密附着型胞外聚合物的提取程度及细胞破裂程度，优化超声条件。污泥在梯度离心提取黏液和松散附着型胞外聚合物后，超声提取紧密附着型胞外聚合物，离心或超声后的水样经滤膜过滤稀释后由三维荧光光谱仪分析。采用氙弧灯为激发光源，将扫描后得到的荧光强度减去水的空白荧光强度，得到样品三维荧光光谱。将扣除空白后的激发波长260～280nm与发射波长360～375nm范围内荧光数值进行平均，依靠可溶性微生物产物类蛋白物质的平均荧光强度变化，评价紧密附着型胞外聚合物提取程度和细胞破碎情况的方法。
Description
技术领域
本专利属于污水生物处理活性污泥组分分析领域，具体涉及一种用荧光分光光度仪扫描超声后提取活性污泥紧密胞外聚合物的过滤液，得到三维荧光光谱图后，评价超声细胞破碎及胞外聚合物提取程度的方法，最终选择优化后的超声条件提取污泥紧密胞外聚合物。
背景技术
在废水生化处理中，活性污泥的胞外聚合物(Extracellular Polymeric Substances，EPS)是在特定废水水质、处理工艺、反应装置的运行条件下，微生物生长代谢中分泌、吸附、溶解的包覆在细胞外部的多聚物，包括蛋白质、多糖、腐殖酸等。
EPS在污水处理中有重要作用：相互黏附，保持细胞的絮体结构或者生物膜的聚集；提供活性污泥良好的保护屏障，抵御有毒物质及恶劣环境；保持菌胶团或者生物膜的水分，影响污泥沉降、过滤与脱水性能；含有大量的酶，参与废水中污染物质的吸附与去除。所以，提取与分析活性污泥胞外聚合物的组成对指导污水生物处理有重要意义。根据EPS与污泥细胞结合的程度，分为松散附着型胞外聚合物(Loosely BoundExtracellular Polymeric Substances,LB-EPS)及紧密附着型胞外聚合物(Tightly BoundExtracellular Polymeric Substances,TB-EPS)。
分层提取活性污泥胞外聚合物的方法有多种，包括树脂提取法、热与碱提取法、梯度离心法和超声提取法等。其中，离心与超声提取无需加入其他化学试剂，操作简单，经济易行，且提取的EPS不需透析等处理即可测定，因而得到广泛应用。
不同声强、声能密度、时间的超声波作用于不同浓度的菌胶团活性污泥，可以破坏絮体结构、分散细胞，使得粘在细胞表面的物质脱落，提取紧密附着型胞外聚合物，例如各种酶(α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、蛋白酶、碱性磷酸酶和酸性磷酸酶等)。但是，超声强度与能量增大时，将破碎细菌，释放细胞内的营养物质。因此，判断超声过程中紧密附着型胞外聚合物是否提取完全及细胞是否破碎对分析活性污泥胞外聚合物十分关键。
发明内容
本发明的目的是在离心提取LB-EPS后，通过三维荧光光谱评价不同超声条件下TB-EPS的提取情况。胞外聚合物中含有的物质不同，在不同激发和发射波长下有对应的荧光反应。本发明的方法依靠某类蛋白质物质为可溶性微生物产物，其平均荧光强度变化的特征，具有评价准确，分析快速的特点。
为了实现超声提取紧密附着型胞外聚合物的目的，本发明采用以下方案：
取活性污泥混合液，在4℃以2000g的离心力离心15分钟，得到细胞黏液Slime。将Slime倒去，加入磷酸盐缓冲液至活性污泥混合液的原体积，在4℃以4000g的离心力离心15分钟，上清液即为LB-EPS。再次加入PBS至原体积后，混合均匀，在不同强度和不同时间下超声。离心或超声后的水样经0.45微米滤膜过滤稀释后由三维荧光光谱仪分析测定。
三维荧光光谱扫描测定条件：采用氙弧灯为激发光源，激发波长200～450nm，发射扫描波长220～600nm，激发和发射狭缝宽度为5～15nm，激发波长扫描间隔为0.5～10nm，扫描速度为900～1500nm/min。
超声样品后的三维荧光光谱图合成：用Wolfram 软件将样品的荧光强度减去同条件下蒸馏水的三维荧光值，合成3D-EEM图。
优化不同超声条件提取TB-EPS：将扣除空白后的激发波长260～280nm与发射波长360～375nm范围内荧光数据进行平均，得到类蛋白质可溶性微生物产物平均荧光强度。以超声强度和超声时间为平面二维坐标，平均荧光强度为纵坐标，绘制三维立体关系图。平均荧光强度突变时对应的超声条件为提取TB-EPS最佳条件。
本发明的优点是：
1、评价方式简单易行，不需要复杂的操作过程测定化学组分，仅依靠过滤后样品的三维荧光光谱分析与计算过程。
2、灵敏度高，适用于不同超声仪器和超声条件下对污泥胞外聚合物提取程度及细胞破碎情况的评价。
3、超声及判断过程中样品不添加其他物质，可以进行后续分析检测，例如：测定蛋白质总量及沉淀后再溶解进行蛋白质双向电泳，研究EPS蛋白质组学与污水处理工艺之间的联系。
附图说明
图1活性污泥分层提取EPS
图2紧密附着型胞外聚合物的荧光光谱图
图3超声时间、超声强度与平均荧光强度的关系
具体实施方式
本发明的目的在于提供一种通过三维荧光光谱优化超声提取胞外聚合物的方法，判断提取程度及细胞破碎情况的方法。
取活性污泥混合液，在冷冻离心机中4℃以2000g离心力工作15分钟，得到Slime。将Slime倾去，加入等体积磷酸盐缓冲液PBS(137mmol/L NaCl，8.10mmol/LNa2HPO4·7H2O，2.68mmol/L KCl，1.47mmol/L KH2PO4，pH为7.3)，使细胞重新悬浮之后，保持4℃以4000g离心15分钟，上清液即为LB-EPS。再次加入PBS后混合均匀，在不同强度下超声2.5-30分钟。离心或超声后的水样经0.45微米滤膜过滤，所有样品经相同倍数稀释后由三维荧光光谱仪分析检测。采用氙弧灯为激发光源，激发波长200～450nm，发射扫描波长220～600nm，激发和发射狭缝宽度为5～15nm，激发波长扫描间隔为0.5～10nm，扫描速度为900～1500nm/min。
将扫描后得到的荧光强度用减去水的空白荧光强度，合成矩阵，输出超声后的水样三维荧光光谱图。将扣除空白后的激发波长260～280nm与发射波长360～375nm范围内荧光数据进行平均，得到可溶性微生物产物的类蛋白物质平均荧光强度。
以超声强度和超声时间为平面二维坐标，平均荧光强度为纵坐标，绘制关系图。平均荧光强度突变时对应的超声条件为提取TB-EPS最佳条件。
实例1
试验污泥取自实验室连续流运行的分段进水MUCT工艺。处理水质处理北京工业大学家属区实际生活污水，溶解性COD为85.00-213.00mg·L-1，氨氮浓度57.00-74.00mg·L-1，正磷酸盐浓度为5.00-6.50mg·L-1。工艺装置的运行条件如下：水力停留时间9小时，容积负荷0.52Kg/(m3·d)，污泥龄18天，污泥回流比100％，内回流比75％。超声处理活性污泥样品时，反应器全程硝化反硝化稳定运行150天以上，氨氮平均去除率为90.8％。
取沉淀后的新鲜污泥10毫升，固体浓度15000mg/L。经2000g在4℃离心15min后，得到上清液为经0.45微米滤膜过滤，得到黏液Slime。在沉淀物中加入PBS补充到原体积后，4℃以4000g的离心力离心15min，上清液经0.45微米滤膜过滤为LB-EPS。沉淀物中再次加入PBS至10毫升后超声处理。采用美国SONICS超声破碎仪(130W，20kHz)，探头直径2mm。分别在不同强度(20％、25％、30％、35％、40％、60％、80％、100％)下各超声2.5、5、7.5、10、20、30分钟，记录超声结束时，仪器所显示的能量值。超声后的样品经0.45微米滤膜过滤后分析测定。预处理活性污泥的方法参见图1，之后进行三维荧光光谱分析。
采用脉冲氙灯作为三维荧光光谱仪的激发光源，分析过滤后经相同稀释倍数后的水样，激发波长200～400nm，发射扫描波长290～550nm，激发和发射狭缝宽度为10nm，激发波长扫描间隔为5nm，扫描速度为1200nm/min。扫描过程添加290nm滤光片，去除二级瑞丽散射。
将仪器保存的不同激发和发射波长下的荧光值在进行矩阵合成，同时减去Milli‐Q水作为空白的荧光强度，得到不同超声强度和超声时间下的3D‐EEM图，可以发现在不同超声时间和超声强度下，可溶性微生物产物的类蛋白物质有峰值(如图2)。
在Wen Chen等人发表的《Fluorescence Excitation-Emission Matrix RegionalIntegration to Quantify Spectra for Dissolved Organic Matter》文章中，Peak A附近属于可溶性微生物产物的类蛋白物质。所以，将扣除空白后的激发波长260～280nm与发射波长360～375nm范围内荧光数据进行平均，得到可溶性微生物产物的类蛋白物质平均荧光强度。
以操作的不同超声时间、超声强度与类蛋白质平均荧光强度做图可知(如图2)，当超声时间小于10分钟与超声强度小于40％的时候，可溶性微生物产物平均荧光强度基本稳定。延长超声时间或增大超声强度都会使得可溶性微生物产物的类蛋白物质平均荧光强度增大。当超声强度超过80％，荧光强度急剧增加，表示污泥有较大程度的破裂。
最终得出在超声强度在40％时，超声时间为10分钟，此时超声提取实例1使用的活性污泥提取TB‐EPS充分且细胞保持相对完整。
Claims (1)
1.一种通过三维荧光光谱优化超声条件提取胞外聚合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
取活性污泥混合液，在4℃以2000g的离心力离心15分钟，得到细胞黏液Slime；将Slime倒去，加入磷酸盐缓冲液至活性污泥混合液的原体积，在4℃以4000g的离心力离心15分钟，上清液即为LB-EPS；再次加入PBS至原体积后，混合均匀，在不同强度和不同时间下超声；离心或超声后的水样经0.45微米滤膜过滤稀释后由三维荧光光谱仪分析测定；
三维荧光光谱扫描测定条件：采用氙弧灯为激发光源，激发波长200～450nm，发射扫描波长220～600nm，激发和发射狭缝宽度为5～15nm，激发波长扫描间隔为0.5～10nm，扫描速度为900～1500nm/min；
将样品的荧光强度减去同条件下蒸馏水的三维荧光值，合成三维荧光光谱图；
优化不同超声条件提取TB-EPS：将扣除空白后的激发波长260～280nm与发射波长360～375nm范围内荧光数据进行平均，得到类蛋白质可溶性微生物产物平均荧光强度；以超声强度和超声时间为平面二维坐标，平均荧光强度为纵坐标，绘制三维立体关系图；平均荧光强度突变时对应的超声条件为提取TB-EPS最佳条件。
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