CN103304626A

CN103304626A - 一种分级提取蓝藻胞外聚合物的方法

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Publication number: CN103304626A
Application number: CN2013102483030A
Authority: CN
Inventors: 江和龙; 徐华成
Original assignee: Nanjing Institute of Geography and Limnology of CAS
Current assignee: Nanjing Institute of Geography and Limnology of CAS
Priority date: 2013-06-20
Filing date: 2013-06-20
Publication date: 2013-09-18
Anticipated expiration: 2033-06-20
Also published as: CN103304626B

Abstract

本发明涉及一种分级提取蓝藻胞外聚合物的方法，包括先通过中低速离心剪切获得可溶性及松散结合型胞外聚合物，再采用微碱热浴结合高速离心剪切提取紧密结合型胞外聚合物。理化分析结果表明，可溶性及松散结合型胞外聚合物有机物含量较少，而紧密结合型胞外聚合物包含大量有机物。三维荧光及红外光谱结果揭示，可溶性胞外聚合物主要由多糖、蛋白类及腐殖类物质组成，而松散结合型及紧密结合型胞外聚合物仅由多糖及蛋白类物质组成。本发明提出一种分级提取蓝藻胞外聚合物的操作方法，具有操作简单、蓝藻菌体无破损、絮体分级分析等优点，对蓝藻胞外聚合物的工业化应用具有较强的指导意义。

Description

一种分级提取蓝藻胞外聚合物的方法

技术领域

本发明涉及一种蓝藻胞外聚合物的提取方法，特别是该法能实现胞外聚合物的分级提取操作，从而获得具有不同有机组分及含量的蓝藻胞外聚合物，属于生物工程技术领域。

背景技术

近年来，随着人类活动及富营养化程度的加剧，湖泊蓝藻水华频繁爆发，给人类健康及生态环境造成恶劣影响。蓝藻胞外聚合物是在蓝藻细胞生长繁殖过程中产生的一系列大分子有机物的统称，主要来源于细胞分泌、细胞溶解、细胞吸附及外来物质等。蓝藻胞外聚合物通过粘附蓝藻单个菌体形成蓝藻群体，从而促进蓝藻水华的发生。据统计，蓝藻胞外聚合物主要由多糖、蛋白质、脂类、腐殖质等物质组成，胞外聚合物约占蓝藻细胞有机组分的90%以上，属高有机质含量生物质。

目前，国内外对蓝藻胞外聚合物的研究多集中于将胞外聚合物作为一个整体来分析其含量。国内方面，雷腊梅（营养条件对水华蓝藻铜绿微囊藻的胞外多糖产生的影响，中山大学学报，2007, 46, 84-87）将藻细胞在8000rpm条件下离心15min中从而获得胞外聚合物；梅秋红[铜绿微囊藻(Microcystic aeruginosa car. major)胞外多糖的分离、纯化及理化性质，2005, 17, 322-326]将藻液pH调至8.0并于80^oC提取2h从而获得胞外多聚物。国外方面，Sudhamani（Carbohydrate Polymers, 2004,56, 423-427）在15000g条件下对藻细胞进行离心操作20min从而获得胞外多聚物。虽然胞外聚合物研究较多，但是不同研究者所获得的结果可比性较差，部分原因是由于他们所采用的提取操作条件差异较大，另一个重要原因是由于他们均将胞外聚合物视为一个整体，没有对胞外聚合物实行分级提取操作。

实际上，蓝藻胞外聚合物为多层动态空间絮体结构，根据其与细胞结合紧密程度可分为可溶性胞外聚合物和结合型胞外聚合物，而结合型胞外聚合物又可分为松散结合型和紧密结合型胞外聚合物。

因此，对蓝藻胞外聚合物实行分级提取操作技术，一方面可加深对蓝藻胞外聚合物絮体结构的理解，另一方面可指导技术人员根据需要而获得不同级层的蓝藻胞外聚合物。但目前尚未见分级提取蓝藻胞外聚合物的相关报道。

发明内容

传统对蓝藻胞外聚合物的提取均是将胞外聚合物作为一个整体进行提取操作，无法获得具有特定组分及功能特征的胞外聚合物。本发明的目的在于克服上述缺陷，提供一种分级提取蓝藻胞外聚合物的操作方法，该方法具有操作简单、蓝藻菌体无破损、絮体分级分析等优点，对蓝藻胞外聚合物的工业化应用具有较强的指导意义。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：

（1）蓝藻胞外聚合物分级提取

取蓝藻细胞，经低温低速离心浓缩后取上清液即为可溶性胞外聚合物，备用；沉淀物加入NaCl缓冲溶液至原体积，低温中速离心浓缩，取上清液即为松散结合型胞外聚合物，备用；沉淀物加入NaCl缓冲溶液至原体积，在弱碱及热浴环境下进行机械力搅拌，再经低温高速离心浓缩，取上清液即为紧密结合型胞外聚合物。

（2）胞外聚合物各级组分纯化

将可溶性胞外聚合物、松散结合型胞外聚合物和紧密结合型胞外聚合物分别经滤膜过滤及低压浓缩后，再进行乙醇沉淀，沉淀物经透析脱盐及冷冻干燥，即得纯化的蓝藻胞外聚合物。

所述的蓝藻为室内培养的蓝绿藻或野外水体蓝藻。

本发明所述的各组分胞外聚合物具有不同的多糖、蛋白质及腐殖质类物质含量，并且所包含的羧基、羟基、酚基等官能团含量差异明显。所以，各组分胞外聚合物具有不同的吸附、络合污染物的能力。

所述步骤1中低温低速离心的温度为0~4℃、离心力为1500~2500g，离心时间为10~15min；所述低温中速离心的温度为0~4℃、离心力为4500~5000g，离心时间为10~15min；所述的低温高速离心的温度为0~4℃、离心力为15000~17000g，离心时间为10~15min。

优选所述步骤1中低温低速离心的温度为2~3℃，离心力为2200~2300g；所述低温中速离心的温度为2~3℃，离心力为4750~4800g；所述的低温高速离心的温度为2~3℃，离心力为15500~16500g。

本发明所述的NaCl缓冲溶液为质量浓度为0.04~0.1%的NaCl溶液，优选质量浓度为0.05~0.08%的NaCl溶液。

本发明所述的弱碱及热浴环境是指沉淀物加入NaCl缓冲溶液至原体积后，向其中加入质量分数为35~45%的NaOH或KOH溶液，使提取液的pH值维持在8~9；于温度为55~65℃的热水浴中热浴25~35min，并进行机械力搅拌，搅拌速度为30~80rpm。

所述步骤2中的滤膜是指孔径小于8μm微孔滤膜；所述的低压浓缩的压力为0.8~1.0MPa，浓缩温度不超过60℃，浓缩至原体积的1/3~1/5，优选孔径为0.45μm的微孔滤膜。

所述的乙醇沉淀是指向胞外聚合物浓缩液中添加4~5倍体积的无水乙醇，0~4℃静置沉降24h以上，优选24-48h。

所述的透析脱盐是指采用分子量<14000Da的透析袋去除小分子有机物及无机盐离子杂质，透析时间>60h，透析温度为0~4℃。优选分子量为8000~10000Da的透析袋，透析时间为72-96h。

所述的冷冻干燥中，干燥压力<0. 2MPa，干燥温度为-40~-60℃，确保干燥期间胞外聚合物组分的稳定性。

本发明与现有技术相比，具有如下优点：

1、通过蓝藻胞外聚合物的分级提取操作及组分测定，可加深对蓝藻胞外聚合物絮体结构的理解，并可获得不同级层的蓝藻胞外聚合物。

2、本发明提取效率较高，且不破坏菌体细胞，为环境友好型提取方法。微碱溶液的应用提高了带负电荷胞外聚合物分子间排斥力作用，使得胞外聚合物絮体有效解聚；温和的热浴条件使得胞外聚合物絮体从细胞壁有效脱落，在保证细胞完整性的同时，最大程度提高了胞外聚合物的产量。

3、本发明不仅可以用于蓝藻胞外聚合物的分级提取操作，也可用于其他微生物菌体胞外聚合物组分的分级提取操作。

附图说明

图1 本发明蓝藻胞外聚合物分级提取的操作方法示意图。

图2 蓝藻胞外聚合物各层FTIR图谱。

图3 蓝藻胞外聚合物各层三维荧光图谱。

具体实施方式

实施例1

取夏季太湖蓝藻水体样品，蓝藻生物量为0.8g/L,蓝藻水样采集后置于4℃冰箱内，并于12h内进行胞外聚合物分级提取操作。具体操作步骤如下：

（1）：蓝藻可溶性及松散结合型胞外聚合物的提取

取一定量（50ml）的蓝藻水样在4℃条件下以2500g离心力离心操作15min，收集的上清液即为SL–EPS；固体样品加入0.05%NaCl缓冲溶液至原体积，在4℃条件下以4500g离心力离心操作15min，收集的上清液即为LB–EPS；固体样品加入0.05%NaCl缓冲溶液至原体积，进行下一步操作。

（2）：蓝藻紧密结合型胞外聚合物的提取

采用40%的NaOH溶液调节待提取的藻细胞至pH至为9.0，平衡10min，再将待提取藻液置于60℃恒温热水反应30min。取出立即冷却，并于4℃条件下以15000g离心力离心操作15min，收集的上清液即为TB–EPS。

（3）：胞外聚合物纯化

收集的SL–EPS，LB–EPS及TB–EPS分别经0.45μm滤膜过滤后并浓缩至原体积的1/4，采用4倍体积无水乙醇沉淀24h，沉淀物经分子量14000Da的透析袋透析72h后（透析温度为4℃），透析袋内物质进行冷冻干燥，获得较纯化的SL–EPS，LB–EPS及TB–EPS。各组分EPS的得率达到95%，且纯化后有机物含量均高达97%以上。

理化分析结果表明：本发明所述的蓝藻胞外聚合物各层有机物含量差异明显，大部分有机物分布在TB–EPS层中，仅有少量的有机物分布在SL–EPS及LB–EPS层中。如表1所示，约38.91 mg/g dry cell的蛋白质和60.75 mg/g dry cell的多糖分布在TB–EPS层中，而仅有4.40mg/g dry cell的蛋白质和1.58mg/g dry cell的多糖分布在SL–EPS和LB–EPS层中。另外，在SL–EPS及LB–EPS层中，蛋白质/多糖的比值均大于1.55，而在TB–EPS层中，蛋白质/多糖的比值仅为0.64。也就是说，在蓝藻可溶性及松散结合型胞外聚合物中，蛋白质是主要有机组成部分；而在蓝藻紧密结合型胞外聚合物中，多糖成为主要有机组成部分。

表1 蓝藻EPS各层有机物含量比较

实施例2

取秋季太湖蓝藻水体样品，蓝藻生物量为0.5g/L,蓝藻水样采集后置于4℃冰箱内，并于12h内进行胞外聚合物分级提取操作。具体操作步骤如下：

（1）：蓝藻可溶性及松散结合型胞外聚合物的提取

取一定量（50ml）的蓝藻水样在4℃条件下以2000g离心力离心操作15min，收集的上清液即为SL–EPS；固体样品加入0.07%NaCl缓冲溶液至原体积，在4℃条件下以5000g离心力离心操作15min，收集的上清液即为LB–EPS；固体样品加入0.07%NaCl缓冲溶液至原体积，进行下一步操作。

（2）：蓝藻紧密结合型胞外聚合物的提取

采用35%的KaOH溶液调节待提取的藻细胞至pH至为8.5，平衡10min，再将待提取藻液置于55℃恒温热水反应26min。取出立即冷却，并于4℃条件下以16000g离心力离心操作15min，收集的上清液即为TB–EPS。

（3）：胞外聚合物纯化

收集的SL–EPS，LB–EPS及TB–EPS分别经0.45μm滤膜过滤并浓缩至原体积的1/3，采用5倍体积无水乙醇沉淀24h，沉淀物经分子量10000Da的透析袋透析72h后（透析温度为0℃），透析袋内物质进行冷冻干燥，获得较纯化的SL–EPS，LB–EPS及TB–EPS。各组分EPS的得率达到95%，且纯化后有机物含量均高达97%以上。

图2为蓝藻胞外聚合物各层的FTIR图谱，由图可知，在3400cm-1和1650 cm-1处均有明显的吸收峰，表明蛋白质类物质的存在；而1380 cm-1、1100 cm-1及1040 cm-1处的吸收峰则表明多糖物质的存在。

实施例3

室内培养铜绿微囊藻，获得铜绿微囊藻培养液，经测定藻类生物量为0.15g/L。样品分别进行如下操作步骤：

取一定量（50ml）的培养液样品在4℃条件下以2500g离心力离心操作15min，收集的上清液即为SL–EPS；固体样品加入0.08%NaCl缓冲溶液至原体积，在4℃条件下以4500g离心力离心操作15min，收集的上清液即为LB–EPS；固体样品加入0.08%NaCl缓冲溶液至原体积，进行下一步操作。

（2）：蓝藻紧密结合型胞外聚合物的提取

采用40%的KaOH溶液调节待提取的藻细胞至pH至为8.0，平衡10min，再将待提取藻液置于55^oC恒温热水反应30min。取出立即冷却，并于4℃条件下以17000g离心力离心操作15min，收集的上清液即为TB–EPS。

（3）：胞外聚合物纯化

收集的SL–EPS，LB–EPS及TB–EPS分别经0.45μm滤膜过滤并浓缩至原体积的1/5，采用4倍体积无水乙醇沉淀24h，沉淀物经分子量14000Da的透析袋透析72h后（透析温度为2℃），透析袋内物质进行冷冻干燥，获得较纯化的SL–EPS，LB–EPS及TB–EPS。各组分EPS的得率达到95%，且纯化后有机物含量均高达97%以上。

图3为蓝藻胞外聚合物各层三维荧光图谱。由图可知，蓝藻胞外聚合物各层均含有两个荧光峰，但峰的位置差异性较大。SL–EPS中含有peak A和peak C两个峰，而LB–EPS 和TB–EPS中均还有peak A和peak B两个峰。由于Peak A和peak B指示蛋白类物质，而peak C的出现表征腐殖类物质的存在。结合表1及图2可知，蓝藻胞外聚合物中，可溶性胞外聚合物主要由多糖、蛋白类及腐殖类物质组成，而松散结合型及紧密结合型胞外聚合物仅由多糖及蛋白类物质组成。

实施例4

与实施例1相比，区别点仅在于：步骤1、2中低温低速离心的温度为0℃、离心力为1500g，离心时间为10min；所述低温中速离心的温度为0℃、离心力为5000g，离心时间为10min；所述的低温高速离心的温度为0℃、离心力为17000g，离心时间为10min。所述的NaCl缓冲溶液为质量浓度为0.06%的NaCl溶液。

实施例5

与实施例1相比，区别点仅在于：步骤1、2中低温低速离心的温度为2℃、离心力为1800g，离心时间为12min；所述低温中速离心的温度为3℃、离心力为4800g，离心时间为11min；所述的低温高速离心的温度为2℃、离心力为16000g，离心时间为13min。所述的NaCl缓冲溶液为质量浓度为0.08%的NaCl溶液。

实施例6

与实施例1相比，区别点仅在于：步骤3中，收集的SL–EPS，LB–EPS及TB–EPS分别经0.6μm滤膜过滤后，采用4倍体积无水乙醇在4℃静置沉降28h，沉淀物经分子量10000Da的透析袋透析78h后，透析袋内物质进行冷冻干燥，获得较纯化的SL–EPS，LB–EPS及TB–EPS。

实施例7

与实施例1相比，区别点仅在于：步骤3中，收集的SL–EPS，LB–EPS及TB–EPS分别经0.6μm滤膜过滤后，采用4.5倍体积无水乙醇在0℃静置沉降32h，沉淀物经分子量9000Da的透析袋透析96h后，透析袋内物质进行冷冻干燥，获得较纯化的SL–EPS，LB–EPS及TB–EPS。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种分级提取蓝藻胞外聚合物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）蓝藻胞外聚合物分级提取

取蓝藻细胞，经低温低速离心浓缩后取上清液即为可溶性胞外聚合物，备用；沉淀物加入NaCl缓冲溶液至原体积，低温中速离心浓缩，取上清液即为松散结合型胞外聚合物，备用；沉淀物加入NaCl缓冲溶液至原体积，在弱碱及热浴环境下进行机械力搅拌，再经低温高速离心浓缩，取上清液即为紧密结合型胞外聚合物；

（2）：胞外聚合物各级组分纯化

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的蓝藻为室内培养的蓝绿藻或野外水体蓝藻。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1中低温低速离心的温度为0~4℃、离心力为1500~2500g，离心时间为10~15min；所述低温中速离心的温度为0~4℃、离心力为4500~5000g，离心时间为10~15min；所述的低温高速离心的温度为0~4℃、离心力为15000~17000g，离心时间为10~15min。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤1中低温低速离心的温度为2~3℃，离心力为2200~2300g；所述低温中速离心的温度为2~3℃，离心力为4750~4800g；所述的低温高速离心的温度为2~3℃，离心力为15500~16500g。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的NaCl缓冲溶液为质量浓度为0.04~0.1%的NaCl溶液。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于：所述的弱碱及热浴环境是指沉淀物加入NaCl缓冲溶液至原体积后，向其中加入质量分数为35~45%的NaOH或KOH溶液，使提取液的pH值维持在8~9；于温度为55~65℃的热水浴中热浴25~35min，并进行机械力搅拌，搅拌速度为30~80rpm。

7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤2中的滤膜是指孔径小于8μm微孔滤膜；所述的低压浓缩的压力为0.8~1.0MPa，浓缩温度不超过60℃，浓缩至原体积的1/3~1/5。

8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于：所述的乙醇沉淀是指向胞外聚合物浓缩液中添加4~5倍体积的无水乙醇，0~4℃静置沉降24h以上。

9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于：所述的透析脱盐是指采用分子量<14000Da的透析袋去除小分子有机物及无机盐离子杂质，透析时间>60h，透析温度为0~4℃。

10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于：所述的冷冻干燥中，干燥压力<0. 2MPa，干燥温度为-40~-60℃。