CN110451762A - 一种活性污泥胞外聚合物的提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于污水生物技术领域，尤其涉及一种活性污泥胞外聚合物的提取方法，包括：活性污泥预处理，S‑EPS提取处理，LB‑EPS提取处理，离子型TB‑EPS提取处理，疏水型TB‑EPS提取处理。本发明提供的活性污泥胞外聚合物的提取方法，通过优化EPS提取的液相环境、筛选不同提取方法组合、选用无机离子提取剂、筛选不同种类的表面活性剂将活性污泥中S‑EPS、LB‑EPS、离子型TB‑EPS以及疏水型TB‑EPS这四种不同类型的EPS分别依次提取，对不同类型的EPS提取效率高、纯度高、对细胞破损小，且采用的无机离子提取剂对胞外聚合物改变程度小、绿色环保、定量精准。

Description

一种活性污泥胞外聚合物的提取方法
技术领域
本发明属于污水生物技术领域，尤其涉及一种活性污泥胞外聚合物的提取方法。
背景技术
微生物聚集体广泛存在于自然和人工的某些水生系统中。在污水处理领域，微生物聚集体的存在不仅能提高泥水分离效率，保证良好出水，而且能赋予游离细菌所不能提供的微型生态系统，能使众多不同类型的细菌处在其适宜的生态位，进而对不同类型的污染物进行去除。胞外聚合物(Extracellular Polymeric Substances，EPS)是：一类由微生物细胞在特定环境条件下产生的聚合态高分子化合物，其成分涵盖蛋白质、多糖、腐殖质、核酸、脂质及糖醛酸等多种有机大分子。EPS占据活性污泥总有机碳的85％～90％，对活性污泥的聚集过程有着突出的贡献。EPS覆盖在微生物细胞表面，通过疏水作用、静电作用、氢键及离子桥连作用等，将微生物细胞聚集起来，形成一个大的三维结构体；同时，EPS还填充在这个三维结构体的内部空隙之中，维持着这个巨大三维结构的完整性和稳定性。EPS对微生物聚集体的物化性质具有显著影响，包括结构、表面电荷、絮凝、沉降性质、脱水性能和吸附能力等。EPS在活性污泥中以多种形式存在，随着EPS形式的改变，其对污泥聚集过程的影响也存在较大差异。根据EPS在微生物聚集体中不同的结合程度和存在形式，主要可分为：溶解型EPS(Soluble EPS，S-EPS)和结合性EPS(Bound EPS，B-EPS)。其中，S-EPS含量较低，可溶解；B-EPS为双层结构，外层为松散结合型EPS(Loosely Bound EPS，LB-EPS)，其结构松散且分散到水溶液中，无明显边缘；内层为紧密结合型EPS(Tightly Bound EPS，TB-EPS)，其与细胞结合紧密且边界明显。由于EPS复杂的组分、动态的变化以及多种结合形式，给确定EPS在活性污泥聚集中的功能带来了极大的困扰；并且，不同形式或种类的EPS对污泥聚集过程影响差异的形成原因尚未明确，还需要进一步的功能分析研究，而一种准确可靠的提取不同形式或种类EPS的方法就显得尤为重要。
目前，很多EPS提取方法被开发，按照提取方式可以分为物理提取法、化学提取法、物理化学结合提取法。其中，物理提取法，主要借助剪切外力作用将结合较为松散的EPS从细胞剥离下来，但这种提取方法提取量不高。化学提取法，比如碱法、阳离子交换树脂(Cation Exchange Resin，CER)等，主要依据EPS基质中聚合物结合的作用力(氢键、疏水作用、静电力、范德华力等)来提取。通常，单种提取方法只能提取单种EPS且成分差异较大，如CER法仅能提取钙镁离子结合型的EPS，且能检测到多种有机荧光剂，但不能获得大分子量的EPS；碱法可以提取各种大分子量EPS，往往引起分子量曲线的变化。另外现有化学提取法往往较为严苛，易造成胞内物质泄漏。EPS提取方法虽然种类较多，但无统一的提取步骤，并存在产率较低、涵盖种类不全、提取过程可能会改变或破坏EPS成分等问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种活性污泥胞外聚合物的提取方法，旨在解决现有EPS提取方法虽然种类较多，但无统一的提取步骤，并存在产率较低、涵盖种类不全、提取过程可能会改变或破坏EPS成分等技术问题。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种活性污泥胞外聚合物的提取方法，包括以下步骤：
获取活性污泥；
采用离心法对所述活性污泥进行提取，分离得到S-EPS上清液和第一污泥沉降物；
对所述第一污泥沉降物依次进行水浴加热处理和高速离心处理，分离得到LB-EPS上清液和第二污泥沉降物；
获取Na2S·9H2O和NH4F，将所述Na2S·9H2O添加到所述第二污泥沉降物中混合处理后，添加所述NH4F进行处理，分离得到离子型TB-EPS上清液和第三污泥沉降物；
获取十二烷基硫酸钠，将所述十二烷基硫酸钠添加到所述第三污泥沉降物中并进行混合处理，分离得到疏水型TB-EPS上清液。
优选地，将所述Na2S·9H2O添加到所述第二污泥沉降物中混合处理的步骤包括：
按所述Na2S·9H2O的质量与所述第二污泥沉降物中有机物干重的比例为1：(3.3～5)，将所述Na2S·9H2O添加到所述第二污泥沉降物的重悬液中，在转速为300rpm～500rpm、温度为4℃、充满氮气且避光的密闭条件下，处理0.8h～1.2h，得到第一混合物。
优选地，添加所述NH4F进行处理的步骤包括：
按所述NH4F的质量与所述第二污泥沉降物中有机物干重的比例为1：(5.3～6.2)，将所述NH4F添加到所述第一混合物中，在转速为500rpm～800rpm、温度为4℃的条件下，处理0.8h～1.2h，分离得到所述离子型TB-EPS上清液和所述第三污泥沉降物。
优选地，将所述十二烷基硫酸钠添加到所述第三污泥沉降物中并进行混合处理的步骤包括：
按所述十二烷基硫酸钠的质量和所述第三污泥沉降物中有机物干重的比例为1：(4.7～9.5)，将所述十二烷基硫酸钠添加到所述第三污泥沉降物的重悬液中，在转速为500rpm～700rpm、温度为4℃的条件下，处理0.5h～1h，分离得到所述疏水型TB-EPS上清液。
优选地，对所述第一污泥沉降物依次进行水浴加热处理和高速离心处理的步骤包括：
将所述第一污泥沉降物的重悬液在温度为70℃～80℃的水浴中加热处理3min～8min，然后在离心力为10000×g～15000×g、温度为4℃的条件下，离心10min～20min，分离得到所述LB-EPS上清液和所述第二污泥沉降物。
优选地，所述采用离心法对所述活性污泥进行提取的步骤包括：
将所述活性污泥的重悬液在离心力为4000×g～8000×g、温度为4℃的条件下，离心8min～15min，分离得到所述S-EPS上清液和所述第一污泥沉降物。
优选地，所述活性污泥的重悬液、所述第一污泥沉降物的重悬液、所述第二污泥沉降物的重悬液和所述第三污泥沉降物的重悬液中采用的重悬液为浓度为0.1mol/L，pH为7.0，NaCl浓度为0.3mol/L～2mol/L的PBS缓冲液。
优选地，所述PBS缓冲液的制备步骤包括：在39mL的0.1mol/LNaH2PO4·2H2O溶液中加入1.75g～11.69g的NaCl，待NaCl溶解后，与61mL的0.1mol/L Na2HPO4·12H2O混合均匀后定容至100mL，即获得浓度为0.1mol/L，pH为7.0的PBS缓冲液。
优选地，包括以下步骤：
获取活性污泥；
在离心力为5000×g、温度为4℃的条件下，对所述活性污泥离心10min，分离得到所述S-EPS上清液和所述第一污泥沉降物；
将所述第一污泥沉降物，在温度为80℃的水浴中加热处理5min，然后在离心力为13000×g、温度为4℃的条件下，离心15min，分离得到所述LB-EPS上清液和所述第二污泥沉降物；
按所述Na2S·9H2O的质量与所述第二污泥沉降物中有机物干重的比例为1：4，将所述Na2S·9H2O添加到所述第二污泥沉降物的重悬液中，在转速为400rpm、温度为4℃、充满氮气且避光的密闭条件下，处理1h；然后按所述NH4F的质量与所述第二污泥沉降物中有机物干重的比例为1：5.9，添加所述NH4F，在转速为600rpm、温度为4℃的条件下，处理1h，分离得到所述离子型TB-EPS上清液和所述第三污泥沉降物；
按所述十二烷基硫酸钠的质量和所述第三污泥沉降物中有机物干重的质量比例为1：7.1，将所述十二烷基硫酸钠添加到所述第三污泥沉降物的重悬液，在转速为600rpm、温度为4℃的条件下，处理45min，分离得到所述疏水型TB-EPS上清液。
优选地，所述活性污泥胞外聚合物的提取方法还包括步骤：对所述S-EPS上清液、所述LB-EPS上清液、所述离子型TB-EPS上清液和所述疏水型TB-EPS上清液进行抽滤处理，去除上清液中的细胞。
本发明提供的活性污泥胞外聚合物的提取方法，对活性污泥通过离心法提取出活性污泥中S-EPS，然后通过水浴加热和高速离心提取出LB-EPS，再通过Na2S·9H2O与NH4F联合使用提取离子型TB-EPS。活性污泥TB-EPS中的酸性基团与金属离子主要通过桥连作用促进污泥细胞的聚集。硫化钠能创造碱性环境，有利于TB-EPS中与酸性基团相结合的金属离子的电离释放。然后，硫离子与氟离子主要通过沉淀结合的方式将释放出的铁钙镁铝四种金属离子去除。其中，NH4F对钙镁铝离子均具有一定的减量作用，尤其是铝离子；Na2S·9H2O对铁离子具有较好的减量作用。由于金属离子被去除，离子桥连作用被破坏，这有利于将污泥中离子型TB-EPS提取出来。最后通过投加十二烷基硫酸钠提取出疏水型TB-EPS。本发明实施例提供的活性污泥胞外聚合物的提取方法，通过筛选提取方法组合提高LB-EPS的产量；通过选用不同的无机离子提取剂获取离子型TB-EPS；通过筛选不同种类的表面活性剂对疏水型TB-EPS进行提取并对EPS提取的液相环境进行优化。这一系列的提取过程可将活性污泥中S-EPS、LB-EPS、离子型TB-EPS以及疏水型TB-EPS等不同类型的EPS分别依次提取，对不同类型的EPS提取效率高、纯度高、对细胞破损小，且采用的无机离子提取剂对胞外聚合物改变程度小、绿色环保、定量精准。
附图说明
图1是本发明实施例提供的不同浓度NaCl提取的EPS的各组分含量。
图2是本发明实施例提供的不同提取方法下LB-EPS的各组分含量。
图3是本发明实施例提供的不同离子提取剂提取的离子型TB-EPS的各组分含量。
图4是本发明实施例提供的不同提取顺序及时间提取离子型TB-EPS的各组分含量。
图5是本发明实施例提供的提取离子型TB-EPS前后污泥中四种金属离子的含量。
图6是本发明实施例提供的不同表面活性剂提取的疏水型TB-EPS的各组分含量。
图7是本发明实施例提供的不同表面活性剂提取疏水型TB-EPS前后污泥的表面疏水性。
图8是本发明实施例提供的不同质量体积比的十二烷基硫酸钠提取的疏水型TB-EPS的各组分含量。
图9是本发明实施例提供的按不同提取顺序提取的TB-EPS的各组分含量。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和技术效果更加清楚，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。结合本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
本发明实施例说明书中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本发明实施例说明书相关组分的含量按比例放大或缩小均在本发明实施例说明书公开的范围之内。具体地，本发明实施例说明书中所述的重量可以是μg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。
本发明实施例提供了一种活性污泥胞外聚合物的提取方法，包括以下步骤：
S10.获取活性污泥；
S20.采用离心法对所述活性污泥进行提取，分离得到S-EPS上清液和第一污泥沉降物；
S30.对所述第一污泥沉降物依次进行水浴加热处理和高速离心处理，分离得到LB-EPS上清液和第二污泥沉降物；
S40.获取Na2S·9H2O和NH4F，将所述Na2S·9H2O添加到所述第二污泥沉降物中混合处理后，添加所述NH4F进行处理，分离得到离子型TB-EPS上清液和第三污泥沉降物；
S50.获取十二烷基硫酸钠，将所述十二烷基硫酸钠添加到所述第三污泥沉降物中并进行混合处理，分离得到疏水型TB-EPS上清液。
本发明实施例提供的活性污泥胞外聚合物的提取方法，对活性污泥通过离心法提取出活性污泥中S-EPS，然后通过水浴加热和高速离心提取出LB-EPS，再通过Na2S·9H2O与NH4F联合使用提取离子型TB-EPS。活性污泥TB-EPS中的酸性基团与金属离子主要通过桥连作用促进污泥细胞的聚集。硫化钠能创造碱性环境，有利于TB-EPS中与酸性基团相结合的金属离子的电离释放。然后，硫离子与氟离子主要通过沉淀结合的方式将释放出的铁钙镁铝四种金属离子去除。其中，NH4F对钙镁铝离子均具有一定的减量作用，尤其是铝离子；Na2S·9H2O对铁离子具有较好的减量作用。由于金属离子被去除，离子桥连作用被破坏，这有利于将污泥中离子型TB-EPS提取出来。最后通过投加十二烷基硫酸钠(SDS)提取出疏水型TB-EPS。本发明实施例提供的活性污泥胞外聚合物的提取方法，通过筛选提取方法组合提高LB-EPS的产量；通过选用不同的无机离子提取剂获取离子型TB-EPS；通过筛选不同种类的表面活性剂对疏水型TB-EPS进行提取并对EPS提取的液相环境进行优化。这一系列的提取过程可将活性污泥中S-EPS、LB-EPS、离子型TB-EPS以及疏水型TB-EPS等不同类型的EPS分别依次提取，对不同类型的EPS提取效率高、纯度高、对细胞破损小，且采用的无机离子提取剂对胞外聚合物改变程度小、绿色环保、定量精准。
具体地，上述步骤S10，获取活性污泥。在一些实施例中通过对活性污泥进行预处理，并使活性污泥分散，更有利于后续的提取处理。
在一些实施例中，所述预处理的步骤包括：S11.将所述活性污泥的重悬液，在离心力为3000×g～3500×g、温度为4℃的条件下，离心处理8min～15min，舍弃上清液。再用重悬液将污泥沉淀清洗2～3次后分散并重悬。本发明实施例对活性污泥的重悬液在离心力为3000×g～3500×g、温度为4℃的条件下，进行离心清洗处理2～3次，舍弃上清液去除活性污泥中的杂质物质，然后将污泥沉淀振荡分散，再用重悬液重悬分散后的污泥沉淀，即得到预处理后的活性污泥。
在一些实施例中，将活性污泥在高速冷冻离心机中，于4℃、3220×g条件下，离心10min，舍弃上清液，污泥沉淀用重悬液清洗2次分散摇匀后，用重悬液重悬至原体积供后续提取处理。
作为优选实施例，本发明实施例采用的重悬液为浓度为0.1mol/L，pH为7.0，NaCl浓度为0.3mol/L～2mol/L的PBS缓冲液。本发明实施例采用浓度为0.1mol/L，pH为7.0，NaCl浓度为0.3mol/L～2mol/L的PBS缓冲液作为重悬液，该重悬液具有盐平衡作用和调节pH的作用，对活性污泥中的EPS具有较好的释放作用。本发明实施例采用的重悬液用于对离心沉淀物进行洗涤、分散、混匀，并重悬至原体积，为活性污泥提供液相环境，不仅能保证活性污泥中细胞的相对完整，同时能通过离子交换的方式促进EPS的释放，对多种EPS提取方式均适用。本发明活性污泥EPS的提取方法中均采用该重悬液对活性污泥进行重悬。
作为优选实施例，所述重悬液为浓度为0.1mol/L，pH为7.0，NaCl浓度为1.5mol/L的PBS缓冲液。如附图1所示，本发明实施例对重悬液中NaCl浓度对提取EPS的提取效果和细胞破损程度的影响进行研究，以此来考察最佳盐提取浓度作为液相环境在各提取方式中适用的广泛性和可行性。研究结果表明，在1.5mol/L的NaCl溶液中的EPS提取量最高(116.05mg/L)，远高于不加NaCl的空白组。当盐溶液浓度在0.3mol/L～1.5mol/L时，随着盐浓度的不断提高，蛋白质与多糖提取量不断提升；在2mol/L时，蛋白质与多糖提取量均出现下降。同时随着盐溶液浓度的升高，eDNA提取量始终较低，说明细胞完整度得到保证(以eDNA/EPS作为细胞完整度的衡量标准，2％～15％的eDNA/EPS表明细胞相对完整)。
在一些实施例中，所述PBS缓冲液的制备步骤包括：39mL的0.1mol/LNaH2PO4·2H2O溶液中加入1.75g～11.69g的NaCl，待NaCl溶解后，与61mL的0.1mol/L Na2HPO4·12H2O混合均匀后定容至100mL，即获得浓度为0.1mol/L，pH为7.0的PBS缓冲液。
具体地，上述步骤S20中，采用离心法对所述活性污泥进行S-EPS处理，分离得到S-EPS上清液和第一污泥沉降物。本发明实施例采用离心法对活性污泥进行S-EPS提取后，离心分离得到S-EPS上清液和所述第一污泥沉降物。
作为优选实施例，所述采用离心法对所述活性污泥进行S-EPS处理的步骤包括：S21.将所述活性污泥的重悬液在离心力为4000×g～8000×g、温度为4℃的条件下，离心8min～15min，分离得到所述S-EPS上清液和所述第一污泥沉降物。本发明实施例在离心力为4000×g～8000×g、温度为4℃的条件下，离心处理8min～15min，即可分离得到S-EPS上清液和第一污泥沉降物，S-EPS上清液可进一步经0.22μm滤膜抽滤去除上清液中的细胞，第一污泥沉降物供后续进一步提取处理。
在一些实施例中，提取S-EPS离心力可以是5000×g、6000×g或7000×g；离心时间可以是8min、9min、10min、11min、13min或15min。在一些具体实施例中，将所述活性污泥的重悬液在离心力为5000×g、温度为4℃的条件下，离心10min，分离得到所述S-EPS上清液和所述第一污泥沉降物，S-EPS上清液再经0.22μm滤膜抽滤去除细胞。
具体地，上述步骤S30中，对所述第一污泥沉降物依次进行水浴加热处理和高速离心处理，分离得到LB-EPS上清液和第二污泥沉降物。本发明实施例通过水浴加热处理和高速离心处理对第一污泥沉降物进行提取，可从第一污泥沉降物中提取出LB-EPS，提取效率高，同时避免TB-EPS的提取。
作为优选实施例，对所述第一污泥沉降物依次进行水浴加热处理和高速离心处理的步骤包括：S31.将所述第一污泥沉降物的重悬液在温度为70℃～80℃的水浴中加热处理3min～8min，然后在离心力为10000×g～15000×g、温度为4℃的条件下，离心10min～20min，分离得到所述LB-EPS上清液和所述第二污泥沉降物，所述LB-EPS上清液可进一步经0.22μm滤膜抽滤去除上清液中的细胞。本发明实施例LB-EPS提取采用的水浴加热条件和离心条件最有利于将第一污泥沉降物中LB-EPS提取出来，提取效率高。本发明实施例采用高速离心(13000×g、15min、4℃)、不同功率短时超声(分别以功率为0.8W/mL、2.4W/mL、3.5W/mL超声处理2min)和水浴加热(分别在60℃、80℃水浴5min)方法，对提取LB-EPS的效果进行了对比实验研究。如附图2所示，研究结果可见，三种提取方式中，LB-EPS提取量总体比较：水浴加热＞超声处理＞高速离心。其中以80℃水浴加热5min提取的LB-EPS提取量最高，高速离心提取的LB-EPS最少。以eDNA/EPS来衡量细胞的破损程度，各种提取方法中，超声对细胞的破损程度最高，水浴加热法对细胞的破损程度最低。超声法中，随着超声功率的提高，更多的LB-EPS被释放出来，但超声也更加直接地作用于细胞壁上，eDNA/EPS也随之增加。水浴法中，随着水浴加热温度的升高，LB-EPS提取量出现显著上升。80℃水浴加热5min的提取方式虽然获得的eDNA/EPS较高，但仍在正常的比例范围内(2％～15％)。若水浴温度高于80℃则会影响细胞和酶的活性。
作为更优选实施例，将所述第一污泥沉降物的重悬液采用80℃水浴加热5min，然后在离心力为13000×g、温度为4℃的条件下，离心15min，分离得到所述LB-EPS上清液和所述第二污泥沉降物。此时，第一污泥沉降物中LB-EPS有更高的提取效率。
具体地，上述步骤S40中，获取Na2S·9H2O和NH4F，将所述Na2S·9H2O添加到所述第二污泥沉降物中混合处理后，添加所述NH4F进行处理，分离得到离子型TB-EPS上清液和第三污泥沉降物。本发明实施例采用Na2S·9H2O和NH4F依次对第二污泥沉降物进行处理，分离得到离子型TB-EPS上清液和第三污泥沉降物，提取效率高，对细胞破损小。本发明实施例对提取离子型TB-EPS提取剂的选择进行了实验研究。首先，如附图3所示，在转速为600rpm、温度为4℃的搅拌条件下分别以空白(不添加提取剂)、CER、NH4F作为提取剂处理1h；并在转速为400rpm、温度为4℃、充满氮气且避光的密闭振荡条件下分别以空白(不添加提取剂)和Na2S·9H2O作为提取剂处理1h，研究了提取剂对离子型TB-EPS的提取效果。从附图可知，搅拌条件下，NH4F、CER与搅拌空白相比，NH4F具有更好的提取效果，其对蛋白质、多糖的提取产量均显著高于搅拌空白和CER。NH4F对离子型TB-EPS较高的提取产量及较低的细胞破损表明NH4F是一种有效的离子型TB-EPS提取剂。振荡条件下，Na2S·9H2O与对应的振荡空白相比，其EPS提取量相对较高，其对蛋白质、多糖的提取产量均显著高于振荡空白，同时eDNA含量处于较为合理的范围内。因此，本发明实施例依次用Na2S·9H2O与NH4F对第二污泥沉降物进行提取，离子型TB-EPS提取率高、细胞破损小、纯度高。
作为优选实施例，将所述Na2S·9H2O添加到所述第二污泥沉降物中混合处理的步骤包括：按所述Na2S·9H2O与所述第二污泥沉降物的质量比为1：(3.3～5)，将所述Na2S·9H2O添加到所述第二污泥沉降物的重悬液中，在转速为300rpm～500rpm、温度为4℃、充满氮气且避光的密闭条件下，处理0.8h～1.2h，得到第一混合物。本发明实施例在转速为300rpm～500rpm、温度为4℃、充满氮气且避光的密闭条件下，添加Na2S·9H2O到所述第二污泥沉降物处理0.8h～1.2h，提取效率高，细胞破损小。若低于该处理条件，则提取不充分，提取效果不佳；若高于该提取条件，则增加了对细胞的破损程度，细胞内物质污染提取物，影响提取的离子型TB-EPS的纯度。氮气氛围，有效避免了Na2S·9H2O与氧气反应。
作为优选实施例，添加所述NH4F进行提取处理的步骤包括：按所述NH4F的质量与所述第二污泥沉降物中有机物干重的比例为1：(5.3～6.2)，将所述NH4F添加到所述第一混合物中，在转速为500rpm～800rpm、温度为4℃的条件下，处理0.8h～1.2h，分离得到所述离子型TB-EPS上清液和所述第三污泥沉降物。本发明实施例对Na2S·9H2O处理后的第一混合物，进一步添加NH4F，在转速为500rpm～800rpm、温度为4℃的条件下，处理0.8h～1.2h，进一步确保对离子型TB-EPS的提取效率。若低于该处理条件，则提取不充分，提取效果不佳；若高于该提取条件，则增加了对细胞的破损程度，细胞内物质污染提取物，影响提取的离子型TB-EPS的纯度。
在一些实施例中，按所述Na2S·9H2O与所述第二污泥沉降物的质量比为1：(3.3～5)，将所述Na2S·9H2O添加到所述第二污泥沉降物的重悬液中，在转速为300rpm～500rpm、温度为4℃、充满氮气且避光的密闭条件下，处理0.8h～1.2h后，按所述NH4F与所述第二污泥沉降物的质量比为1：(5.3～6.2)，添加所述NH4F，在转速为500rpm～800rpm、温度为4℃的条件下，处理0.8h～1.2h，分离得到离子型TB-EPS上清液和第三污泥沉降物。
本发明实施例Na2S·9H2O和NH4F对第二污泥沉降物中离子型TB-EPS的提取顺序和提取时间最有利于离子型TB-EPS的提取。对此，本发明实施例对Na2S·9H2O和NH4F提取顺序对提取效果的影响进行了实验验证。以①Na2S·9H2O(在转速为400rpm、温度为4℃、充满氮气且避光的密闭条件下，处理1h)→NH4F(在转速为600rpm、温度为4℃的条件下，处理1h)，②NH4F(在转速为600rpm、温度为4℃的条件下，处理1h)→Na2S·9H2O(在转速为400rpm、温度为4℃、充满氮气且避光的密闭条件下，处理1h)，③将Na2S·9H2O和NH4F两者混合后在转速为400rpm、温度为4℃、充满氮气且避光的密闭条件下，处理1h，④将Na2S·9H2O和NH4F两者混合后在转速为400rpm、温度为4℃、充满氮气且避光的密闭条件下，处理2h，进行了四组对比实验。结果如附图4所示，第①种提取方式比其他三种提取方式更高效，在保证细胞完整度的情况下可提取较多的EPS，变换提取顺序或混合提取均会降低EPS的提取量，这是由于改变提取顺序或混合提取后引起提取体系中pH改变所致。金属离子型TB-EPS主要为Ca2+、Mg2+、Fe3+、Al3+这四种离子结合型TB-EPS。金属离子与TB-EPS的酸性基团或位点结合构成离子桥连作用，共同维持聚集体的稳定。碱性环境是离子TB-EPS提取的有利条件，先投加Na2S·9H2O创造碱性环境，可以促进与酸性基团相结合的金属离子的电离释放及后续硫离子、氟离子与金属离子结合生成沉淀，从而破坏TB-EPS中原有的离子桥连作用，使得污泥细胞更容易在外力作用下释放TB-EPS到水溶液中。而混合提取会削弱此种碱性环境。先NH4F后Na2S·9H2O的提取顺序，会使得提取体系先呈现弱酸性，不利于金属离子的充分电离释放，影响提取效果。
进一步地，本发明实施例为验证经Na2S·9H2O和NH4F提取后的EPS是金属离子型TB-EPS，对提取前后污泥中金属离子(Ca2+、Mg2+、Fe3+、Al3+)的含量进行测定。如附图5所示，①NH4F(在转速为600rpm、温度为4℃的条件下，处理1h)；②Na2S·9H2O(在转速为400rpm、温度为4℃、充满氮气且避光的密闭条件下，处理1h)；③Na2S·9H2O(在转速为400rpm、温度为4℃、充满氮气且避光的密闭条件下，处理1h)→NH4F(在转速为600rpm、温度为4℃的条件下，处理1h)；④CER(在转速为600rpm、温度为4℃的条件下，处理1h)，使用这四种提取方案分别对第二污泥沉降物中的离子型TB-EPS进行提取，与方案④相比，方案①的实验结果表明：NH4F对钙镁铝离子均具有一定的减量作用，尤其是铝离子。单独使用NH4F对污泥进行提取，污泥中铝离子的含量下降43％，这可能是由于NH4F水溶液呈弱酸性，尽管pH为弱酸性时铝离子的释放量较碱性环境少，但该环境下，氟离子、铝离子和OH-容易发生共沉淀作用以形成沉淀物，因而对铝离子具有一定的减量作用。方案②的结果表明：Na2S·9H2O提取离子型TB-EPS后，污泥中铁离子含量下降明显，但对于钙镁铝离子去除效果一般。这主要是由于硫离子可结合铁离子形成稳定的沉淀物，但硫离子本身与钙镁铝离子不能结合(Al2S3、CaS及MgS不能在水溶液中形成)。方案③中先Na2S·9H2O再NH4F的联合提取，使得污泥中的四种金属离子含量均显著下降，铝离子的含量下降61％，铁离子的含量下降47％，镁离子的含量下降41％，钙离子的含量下降36％。这主要是由于Na2S·9H2O与NH4F的协同作用。硫化钠创造的碱性环境，有利于TB-EPS中与酸性基团相结合的金属离子的电离释放。然后，硫离子与氟离子主要通过沉淀结合的方式将释放出的铁钙镁铝四种金属离子去除。由于金属离子被去除，离子桥连作用被破坏，与这四种离子桥连的EPS通过强烈振荡或搅拌等外力作用随之被提取。因此，实验结果表明这种提取方法及顺序最有利于离子型TB-EPS的提取。
在一些优选实施例中，离子型TB-EPS的提取步骤为：获取250mgNa2S·9H2O/g VSS(污泥干重中的有机物重量)，添加到第二污泥沉降物的重悬液中，在4℃、400rpm、充满氮气且避光的密闭条件下，处理1h，而后投加170mgNH4F/g VSS，在4℃、600rpm的条件下，处理1h，而后经13000×g、4℃离心15min，分离得到所述离子型TB-EPS上清液和所述第三污泥沉降物，所述离子型TB-EPS上清液再经0.22μm滤膜抽滤去除细胞。
具体地，上述步骤S50中，获取十二烷基硫酸钠，将所述十二烷基硫酸钠添加到所述第三污泥沉降物混合处理，分离得到疏水型TB-EPS上清液。本发明实施例采用十二烷基硫酸钠对第三污泥沉降物进行混合处理，提取其中的疏水型TB-EPS，在保证细胞完整的条件下，获得最大化的疏水型TB-EPS提取量。
本发明实施例对不同类型的表面活性剂：非离子表面活性剂-吐温、两性表面活性剂-甜菜碱、阴离子表面活性剂-SDS(十二烷基硫酸钠)、阳离子表面活性剂-CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，对第三污泥沉降物中疏水型TB-EPS的提取效果进行了对比实验研究。结果如附图6所示，四种表面活性剂对疏水型TB-EPS的提取效果，其中，空白为在不加任何表面活性剂的情况下进行搅拌处理(在转速为600rpm、温度为4℃的条件下，处理1h)，四种表面活性剂对疏水型TB-EPS的提取量显著高于搅拌空白，SDS的提取量最高，尤其对蛋白质的提取较为显著(由于在提取时采用的SDS浓度较高(质量体积比0.2％)，导致eDNA/EPS超出15％这一合理范围上限，可能引发细胞破损)。CTAB提取量也相对较高，但破损程度也较高，且CTAB常用于DNA的分离提取，低离子强度下能沉淀DNA。因此，低离子强度下采用CTAB提取得到的EPS样品不能反映其细胞破损的真实程度。吐温与甜菜碱两者对蛋白质和多糖的提取量较低，且从其eDNA在EPS中占比较高来看，也存在细胞破损的可能。因此，采用SDS对第三污泥沉降物中疏水型TB-EPS进行提取有较高的提取效率，且对细胞的破损最小。
进一步地，为了验证SDS对疏水型TB-EPS的提取纯度，本发明实施例对不同表面活性剂提取疏水型TB-EPS后活性污泥表面疏水性的影响进行了进一步的实验研究。如附图7所示，空白提取前为S-EPS和LB-EPS去除后的细胞，细胞疏水性达到54.0％，细胞表面相对疏水。空白提取后为空白提取前的细胞在不加任何表面活性剂的情况下提取疏水型TB-EPS后的细胞，细胞疏水性稍降为50.1％。SDS处理后的污泥细胞表面呈亲水态，而添加其他几种表面活性剂的污泥细胞表面疏水程度均有不同程度的降低。可知，用低浓度的SDS进行疏水型EPS的提取可以保证疏水型TB-EPS的高提取量及纯度。
作为优选实施例，将所述十二烷基硫酸钠和所述第三污泥沉降物混合提取处理的步骤包括：S51.所述十二烷基硫酸钠的质量和所述第三污泥沉降物中有机物干重的比例为1：(4.7～9.5)，将所述十二烷基硫酸钠添加到所述第三污泥沉降物的重悬液中，在转速为500rpm～700rpm、温度为4℃的条件下，处理0.5h～1h，分离得到所述疏水型TB-EPS上清液。本发明实施例所述十二烷基硫酸钠的质量和所述第三污泥沉降物中有机物干重的比例为1：(4.7～9.5)，在转速为500rpm～700rpm、温度为4℃、处理时间为0.5h～1h的条件下，对疏水型TB-EPS有最佳的提取效率，且此时对细胞的破损最小。
本发明实施例对SDS浓度对疏水型TB-EPS提取效率的影响进行了实验研究，以SDS在第三污泥沉降物的重悬液中的质量体积比(w/v)为0.012％、0.024％、0.040％、0.080％、0.160％及0.200％，分别在相同条件下提取疏水型TB-EPS，其中，SDS在第三污泥沉降物的重悬液中的质量体积比为0.04％时，所述十二烷基硫酸钠的质量和所述第三污泥沉降物中有机物干重的比例为1：7.1。提取结果如附图8所示，随着质量体积比从0.012％增加到0.04％，EPS提取量大幅提升，且0.04％的质量体积比提取出的疏水型TB-EPS其eDNA/EPS为10.7％，保持在合理的范围内。而浓度继续提升至0.20％时，蛋白质提取量基本不变，多糖略有提升，同时eDNA/EPS不断上升超出正常范围，细胞破损程度加剧，有胞内物质污染EPS的可能。因此，SDS质量体积比为0.04％左右时(即所述十二烷基硫酸钠的质量和所述第三污泥沉降物中有机物干重的比例为1：7.1)，不但有最佳的提取效率，而且对细胞的破损作用最小。更优选的，以质量体积比为0.04％的SDS提取疏水型TB-EPS。另外，本发明在转速为500rpm～700rpm、温度为4℃、处理时间为0.5h～1h的条件下，对疏水型TB-EPS的提取效果较佳。若处理时间太短，则提取不充分；若处理时间过长，长时间与氧的接触可能会引起EPS的氧化降解。在一些实施例中，处理时间为35min、40min、45min、50min或55min。
在一些实施例中，所述十二烷基硫酸钠和所述第三污泥沉降物混合处理的步骤包括：投加SDS 140mg/g VSS，在600rpm、4℃下搅拌45min，而后经13000×g、4℃离心15min，分离得到所述疏水型TB-EPS上清液，然后再经0.22μm滤膜抽滤去除细胞。
在一些实施例中，活性污泥胞外聚合物的提取方法，包括以下步骤：
S12.获取活性污泥；
S22.在离心力为5000×g、温度为4℃的条件下，对所述活性污泥进离心10min，分离得到S-EPS上清液和第一污泥沉降物；
S32.将所述第一污泥沉降物，在温度为80℃的水浴中加热处理5min，然后在离心力为13000×g、温度为4℃的条件下，离心15min，分离得到LB-EPS上清液和第二污泥沉降物；
S42.按所述Na2S·9H2O的质量与所述第二污泥沉降物中有机物干重的比例为1：4，将所述Na2S·9H2O添加到所述第二污泥沉降物的重悬液中，在转速为400rpm、温度为4℃、充满氮气且避光的密闭条件下，处理1h；然后按所述NH4F的质量与所述第二污泥沉降物中有机物干重的比例为1：5.9，添加所述NH4F，在转速为600rpm、温度为4℃的条件下，处理1h，分离得到所述离子型TB-EPS上清液和所述第三污泥沉降物；
S52.按所述十二烷基硫酸钠的质量和所述第三污泥沉降物中有机物干重的质量比例为1：7.1，将所述十二烷基硫酸钠添加到所述第三污泥沉降物的重悬液，在转速为600rpm、温度为4℃的条件下，处理45min，分离得到所述疏水型TB-EPS上清液。
为使本发明上述实施细节和操作能清楚地被本领域技术人员理解，以及本发明实施例活性污泥胞外聚合物的提取方法的进步性能显著的体现，以下通过多个实施例来举例说明上述技术方案。
实施例1
一种活性污泥胞外聚合物的LB-EPS的提取方法，将所述第一污泥沉降物的重悬液采用60℃或80℃，水浴加热5min，然后在离心力为13000×g、温度为4℃的条件下，离心15min，分离得到LB-EPS上清液和第二污泥沉降物。
对比例1
在与实施例1相同的条件下，分别采用高速离心(13000×g、15min、4℃)、不同功率短时超声(分别以功率为0.8W/mL、2.4W/mL、3.5W/mL超声处理2min)方法提取LB-EPS，进行对比分析。
结果如附图2所示，LB-EPS提取量总体比较：水浴加热＞超声处理＞高速离心。其中，本发明实施例1以80℃水浴加热5min提取分离的LB-EPS提取量最高，对细胞的破损小，综合提取效率最佳。
实施例2
一种对第二污泥沉降物中离子型TB-EPS的提取方法，包括：按所述Na2S·9H2O与所述第二污泥沉降物的质量比为1：4，将所述Na2S·9H2O添加到所述第二污泥沉降物的重悬液中，在转速为400rpm、温度为4℃、充满氮气且避光的密闭条件下，处理1h后，按所述NH4F与所述第二污泥沉降物的质量比为1：5.9，添加所述NH4F，在转速为600rpm、温度为4℃的条件下，处理1h，分离得到离子型TB-EPS上清液和第三污泥沉降物。
对比例2
在与实施例2相同的条件下，分别以②NH4F(在转速为600rpm、温度为4℃的条件下，处理1h)→Na2S·9H2O(在转速为400rpm、温度为4℃、充满氮气且避光的密闭条件下，处理1h)，③将Na2S·9H2O和NH4F两者混合后在转速为400rpm、温度为4℃、充满氮气且避光的密闭条件下，处理1h，④将Na2S·9H2O和NH4F两者混合后在转速为400rpm、温度为4℃、充满氮气且避光的密闭条件下，处理2h，与实施例2①Na2S·9H2O(在转速为400rpm、温度为4℃、充满氮气且避光的密闭条件下，处理1h)→NH4F(在转速为600rpm、温度为4℃的条件下，处理1h)处理方法进行对比分析，研究Na2S·9H2O和NH4F提取顺序对提取效果的影响。
结果如附图4所示，第①种提取方式比其他三种提取方式更高效，在保证细胞完整度的情况下提取较多的EPS，变换提取顺序或混合提取均会降低EPS的提取量，这是由于改变提取顺序或混合提取后引起提取体系中pH改变所致。
实施例3
一种对第三污泥沉降物中疏水型TB-EPS的提取方法，包括：在第三污泥沉降物中投加SDS 140mg/g VSS，在600rpm、4℃下搅拌45min，而后经13000×g、4℃离心15min，然后再经0.22μm滤膜抽滤所得的上清液即为疏水型TB-EPS。
对比例3
在与实施例3的相同条件下，分别以非离子表面活性剂-吐温、两性表面活性剂-甜菜碱和阳离子表面活性剂-CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)代替SDS提取剂，提取疏水型TB-EPS。
本发明实施例3对分别以SDS、吐温、甜菜碱和CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)为提取剂的提取效率进行了对比分析。结果如附图6所示，四种表面活性剂对疏水型TB-EPS的提取量显著高于搅拌空白，SDS的提取量最高，尤其对蛋白质的提取较为显著，且对细胞的破损最小。
实施例4
本发明实施例为验证经Na2S·9H2O和NH4F提取后的EPS是金属离子型TB-EPS，对提取前后污泥中金属离子(Ca2+、Mg2+、Fe3+、Al3+)的含量进行测定。以①NH4F(在转速为600rpm、温度为4℃的条件下，处理1h)；②Na2S·9H2O(在转速为400rpm、温度为4℃、充满氮气且避光的密闭条件下，处理1h)；③Na2S·9H2O(在转速为400rpm、温度为4℃、充满氮气且避光的密闭条件下，处理1h)→NH4F(在转速为600rpm、温度为4℃的条件下，处理1h)；④CER(在转速为600rpm、温度为4℃的条件下，处理1h)这四种提取方案分别对离子型TB-EPS进行提取。
实验结果如附图5所示，Na2S·9H2O与NH4F联合提取，使污泥中的四种金属离子含量均显著下降，表明这种提取方法及顺序最有利于离子型TB-EPS的提取。
实施例5
本发明实施例为验证疏水型TB-EPS与离子型TB-EPS的提取顺序对TB-EPS的提取量和细胞完整度的影响。①先提取疏水型TB-EPS后提取离子型TB-EPS：SDS→Na2S·9H2O→NH4F；②先提取离子型TB-EPS后提取疏水型TB-EPS：Na2S·9H2O→NH4F→SDS，进行对比分析实验。对不同类型TB-EPS提取顺序对TB-EPS组分含量的影响结果如附图9所示，先离子后疏水的提取获得的TB-EPS提取量更高，能提取更多的TB-EPS成分，且eDNA占比相对较低。活性污泥絮状物中离子型TB-EPS可能分布在外层，疏水型TB-EPS主要集中在内层。这种结构分布必然导致SDS→Na2S·9H2O→NH4F中的提取剂不能充分与目标EPS接触反应，影响EPS的提取量。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种活性污泥胞外聚合物的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
获取活性污泥；
采用离心法对所述活性污泥进行提取，分离得到S-EPS上清液和第一污泥沉降物；
对所述第一污泥沉降物依次进行水浴加热处理和高速离心处理，分离得到LB-EPS上清液和第二污泥沉降物；
获取Na2S·9H2O和NH4F，将所述Na2S·9H2O添加到所述第二污泥沉降物中混合处理后，添加所述NH4F进行处理，分离得到离子型TB-EPS上清液和第三污泥沉降物；
获取十二烷基硫酸钠，将所述十二烷基硫酸钠添加到所述第三污泥沉降物中并进行混合处理，分离得到疏水型TB-EPS上清液。
2.如权利要求1所述的活性污泥胞外聚合物的提取方法，其特征在于，将所述Na2S·9H2O添加到所述第二污泥沉降物中混合处理的步骤包括：
按所述Na2S·9H2O的质量与所述第二污泥沉降物中有机物干重的比例为1：(3.3～5)，将所述Na2S·9H2O添加到所述第二污泥沉降物的重悬液中，在转速为300rpm～500rpm、温度为4℃、充满氮气且避光的密闭条件下，处理0.8h～1.2h，得到第一混合物。
3.如权利要求2所述的活性污泥胞外聚合物的提取方法，其特征在于，添加所述NH4F进行处理的步骤包括：
按所述NH4F的质量与所述第二污泥沉降物中有机物干重的比例为1：(5.3～6.2)，将所述NH4F添加到所述第一混合物中，在转速为500rpm～800rpm、温度为4℃的条件下，处理0.8h～1.2h，分离得到所述离子型TB-EPS上清液和所述第三污泥沉降物。
4.如权利要求1～3任意一项所述的活性污泥胞外聚合物的提取方法，其特征在于，将所述十二烷基硫酸钠添加到所述第三污泥沉降物中并进行混合处理的步骤包括：
按所述十二烷基硫酸钠的质量和所述第三污泥沉降物中有机物干重的比例为1：(4.7～9.5)，将所述十二烷基硫酸钠添加到所述第三污泥沉降物的重悬液中，在转速为500rpm～700rpm、温度为4℃的条件下，处理0.5h～1h，分离得到所述疏水型TB-EPS上清液。
5.如权利要求4所述的活性污泥胞外聚合物的提取方法，其特征在于，对所述第一污泥沉降物依次进行水浴加热处理和高速离心处理的步骤包括：
将所述第一污泥沉降物的重悬液在温度为70℃～80℃的水浴中加热处理3min～8min，然后在离心力为10000×g～15000×g、温度为4℃的条件下，离心10min～20min，分离得到所述LB-EPS上清液和所述第二污泥沉降物。
6.如权利要求1或2或3或5所述的活性污泥胞外聚合物的提取方法，其特征在于，所述采用离心法对所述活性污泥进行提取的步骤包括：
将所述活性污泥的重悬液在离心力为4000×g～8000×g、温度为4℃的条件下，离心8min～15min，分离得到所述S-EPS上清液和所述第一污泥沉降物。
7.如权利要求6所述的活性污泥胞外聚合物的提取方法，其特征在于，所述活性污泥的重悬液、所述第一污泥沉降物的重悬液、所述第二污泥沉降物的重悬液和所述第三污泥沉降物的重悬液中采用的重悬液为浓度为0.1mol/L，pH为7.0，NaCl浓度为0.3mol/L～2mol/L的PBS缓冲液。
8.如权利要求7所述的活性污泥胞外聚合物的提取方法，其特征在于，所述PBS缓冲液的制备步骤包括：在39mL的0.1mol/L NaH2PO4·2H2O溶液中加入1.75g～11.69g的NaCl，待NaCl溶解后，与61mL的0.1mol/L Na2HPO4·12H2O混合均匀后定容至100mL，即获得浓度为0.1mol/L，pH为7.0的PBS缓冲液。
9.如权利要求8所述的活性污泥胞外聚合物的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
获取活性污泥；
在离心力为5000×g、温度为4℃的条件下，对所述活性污泥离心10min，分离得到所述S-EPS上清液和所述第一污泥沉降物；
将所述第一污泥沉降物，在温度为80℃的水浴中加热处理5min，然后在离心力为13000×g、温度为4℃的条件下，离心15min，分离得到所述LB-EPS上清液和所述第二污泥沉降物；
按所述Na2S·9H2O的质量与所述第二污泥沉降物中有机物干重的比例为1：4，将所述Na2S·9H2O添加到所述第二污泥沉降物的重悬液中，在转速为400rpm、温度为4℃、充满氮气且避光的密闭条件下，处理1h；然后按所述NH4F的质量与所述第二污泥沉降物中有机物干重的比例为1：5.9，添加所述NH4F，在转速为600rpm、温度为4℃的条件下，处理1h，分离得到所述离子型TB-EPS上清液和所述第三污泥沉降物；
按所述十二烷基硫酸钠的质量和所述第三污泥沉降物中有机物干重的质量比例为1：7.1，将所述十二烷基硫酸钠添加到所述第三污泥沉降物的重悬液中，在转速为600rpm、温度为4℃的条件下，处理45min，分离得到所述疏水型TB-EPS上清液。
10.如权利要求9所述的活性污泥胞外聚合物的提取方法，其特征在于，所述活性污泥胞外聚合物的提取方法还包括步骤：对所述S-EPS上清液、所述LB-EPS上清液、所述离子型TB-EPS上清液和所述疏水型TB-EPS上清液进行抽滤处理，去除上清液中的细胞。
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