CN108553619A - 一种中药组合物、其活性成分、中药制剂及制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明一种中药组合物、其活性成分、中药制剂及制备方法和应用，属于中医药技术领域。所述中药组合物由下述重量份的原料组成：鳖甲110～130份、赤芍80～90份、当归40～60份、三七40～60份、党参80～90份、黄芪80～90份、羊胎盘20～180份、冬虫夏草20～30份、板蓝根130～150份、连翘130～150份和莪术20～30份。本发明具有以下优点：本发明的中药组合物、活性成分和中药片剂对急性肝损伤和肝纤维化有良好的治愈效果；本发明解决了当前紫河车的资源短缺、价格昂贵等问题，提供了一种新的具有良好治愈效果的中药组合物和片剂。

Description

一种中药组合物、其活性成分、中药制剂及制备方法和应用
技术领域
本发明属于中医药技术领域，具体涉及一种中药组合物、其活性成分、中药制剂及制备方法和应用。
背景技术
肝纤维化(hepatic fibrosis)是多种慢性肝脏疾病发展至肝硬化的必经阶段，由各种致病因子(如慢性肝炎病毒感染、血吸虫感染、慢性酒精中毒、代谢性疾病、持续胆汁淤积等)引起的肝脏损伤后组织代偿修复反应。我国是病毒性肝炎高发区，仅乙型肝炎病毒携带者就达1.3亿，其中约有3000万以上的慢性肝炎患者。慢性肝炎若不能得到有效治疗，就有可能转化为肝纤维化，进而肝硬化，更严重者则直接形成肝癌。由“肝炎”→“肝纤维化”→“肝硬化”→“肝癌”的过程是各种慢性肝病导致严重后果的共同途径。病毒性肝炎的治疗，目前虽有少数药物具一定疗效，但治愈率不理想，且费用昂贵；肝硬化是肝脏实质性病变，治疗上除对症外，缺乏其他有效措施，普遍认为较难逆转。因此，医学工作者均聚焦于肝纤维化这一中心环节，并发现肝纤维化的干预能有效逆转肝硬化的进展。逆转肝纤维化临床尚无理想药物。肝纤维化的发生由多因素复杂的网络构成，单一环节的干预很难取得理想的疗效。中药复方以其多成分、多环节、多层次、分阶段、多靶点的药理学特点对肝纤维化的发生与发展显示了独有的优越性，具有广阔的应用前景。复方鳖甲软肝片(Fufang BiejiaRuangan Tables)主要由鳖甲(制)、莪术、赤芍、紫河车等11味药材组成，具有软坚散结、化瘀解毒、益气养血之功，用于治疗瘀血阻络、气血亏虚、热毒未尽之证。其作为纯中药复方制剂，攻补兼施、标本兼顾，清热除邪，消散肝络瘀血，恢复肝脾肾三功，从而达到扶正消癥的效果。复方鳖甲软肝片为我国临床预防、治疗慢性乙型肝炎肝纤维化以及早期肝硬化的首选中成药，目前收载于2017版国家基本医疗药品目录中。
紫河车(Human Placenta，HP)是我国传统的名贵中药材，亦为复方鳖甲软肝片处方中重要佐药，据《本草纲目》记载：“紫河车即人类胎盘，味甘、成、性温”，具有“安神养血、补气、益精、解毒、补血”之功效。然而，近年来受价格昂贵、原料时有短缺等限制，紫河车的应用存在采购困难、制约产业化生产等诸多问题，可能对紫河车及其相关中成药的临床应用与长远发展存在潜在的影响。
发明内容
本发明的目的在于公开了一种中药组合物。
本发明第二个目的在于公开了上述中药组合物的活性成分的制备方法。
本发明第三个目的在于公开了上述中药组合物的活性成分。
本发明第四个目的在于公开了一种中药制剂。
本发明第五个目的在于公开了一种中药制剂的制备方法。
本发明第六个目的在于公开了上述制备方法制备得到的片剂。
本发明第七个目的在于公开了上述中药组合物、上述活性成分或上述片剂的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种中药组合物，其中，所述中药组合物由下述重量份的原料组成：
鳖甲110～130份、赤芍80～90份、当归40～60份、三七40～60份、党参80～90份、黄芪80～90份、羊胎盘20～180份、冬虫夏草20～30份、板蓝根130～150份、连翘130～150份和莪术20～30份。
上述技术方案所述的一种中药组合物，其中，所述中药组合物由下述重量份的原料组成：
鳖甲110～130份、赤芍80～90份、当归40～60份、三七40～60份、党参80～90份、黄芪80～90份、羊胎盘20～25份、冬虫夏草20～30份、板蓝根130～150份、连翘130～150份和莪术20～30份。
上述技术方案所述的一种中药组合物，其中，所述中药组合物由下述重量份的原料组成：
鳖甲120份、赤芍85份、当归50份、三七50份、党参85份、黄芪85份、羊胎盘22.5份、冬虫夏草25份、板蓝根140份、连翘140份和莪术25份。
一种中药组合物的活性成分的制备方法，其特征在于：所述活性成分包括挥发油和细粉混合物；所述制备方法包括下述步骤：
(1)、称取上述技术方案所述重量份的原料药；
(2)、将鳖甲、三七、赤芍、冬虫夏草和羊胎盘粉碎成细粉；
(3)、取当归、莪术和连翘混合，加7～9倍量的水蒸馏1～5小时，提取挥发油；蒸馏后的水溶液待用，将药渣加水煎煮1～2小时，滤过，滤液与蒸馏后的水溶液合并；
(4)、将党参、黄芪和板蓝根三味加水煎煮三次，每次1～2小时，合并三次煎液，过滤得滤液；
(5)、将步骤(3)中滤液与蒸馏后的水溶液合并产物与步骤(4)所得滤液合并，在60℃-85℃下减压浓缩至相对密度为1.25～1.30(60℃)的稠膏；
(6)、将步骤(5)所得稠膏与步骤(2)所得鳖甲、三七、赤芍、冬虫夏草和羊胎盘的细粉混匀，真空干燥，得干膏。
上述技术方案所述制备方法制备所得的一种中药组合物的活性成分。
一种中药制剂，其中，所述中药制剂由上述技术方案所述的活性成分和药学上可接受的载体组成。
一种中药制剂的制备方法，其中：所述中药制剂为片剂；所述制备方法包括下述步骤：
(1)、称取上述技术方案所述重量份的原料药；
(2)、将鳖甲、三七、赤芍、冬虫夏草和羊胎盘粉碎成细粉；
(3)、取当归、莪术和连翘混合，加7～9倍量的水蒸馏1～5小时，提取挥发油；蒸馏后的水溶液待用，将药渣加水煎煮1～2小时，滤过，滤液与蒸馏后的水溶液合并；
(4)、将党参、黄芪和板蓝根三味加水煎煮三次，每次1～2小时，合并三次煎液，过滤得滤液；
(5)、将步骤(3)中滤液与蒸馏后的水溶液合并产物与步骤(4)所得滤液合并，在60℃-85℃下减压浓缩至相对密度为1.25～1.30(60℃)的稠膏；
(6)、将步骤(5)所得稠膏与步骤(2)所得鳖甲、三七、赤芍、冬虫夏草和羊胎盘的细粉混匀，真空干燥，得干膏；
(7)、将步骤(6)所得干膏，粉碎成细粉，与药学上可接受的载体混匀，用乙醇作为湿润剂制成软材，制粒，干燥得干燥颗粒；
(8)、将步骤(3)得到的挥发油，用95％乙醇溶解，摇匀后喷洒到干燥颗粒上，加硬脂酸镁，总混均匀后密闭35～45分钟，压制成片即可。
上述技术方案所述的中药制剂的制备方法，其中：步骤(7)中药学上可接受的载体为蔗糖粉，蔗糖粉的加入量为步骤(1)原料药总重量的1.5％-5.5％；步骤(7)中所述乙醇的浓度为72％～78％；所述制粒整粒为16目。
上述技术方案所述中药制剂的制备方法制备得到的片剂。
上述技术方案所述中药组合物或上述技术方案所述活性成分或上述技术方案所述片剂在制备治疗肝纤维化药物和制备治疗急性肝损伤药物中的应用。
本发明中使用羊胎盘，羊胎盘的营养组成与人类胎盘基本一致，营养结构最接近人胎盘，其合理的自然结构及特别丰富的营养成分含量成为动物胎盘的首选种类，且羊胎盘不会感染肝炎等病毒，不会与人类产生交叉感染，相对要安全得多。大量报道显示，羊胎盘同样具有传递体液免疫和细胞免疫等作用，在抗氧化，抗衰老，抗疲劳，耐缺氧，增强机体抵抗力，免疫调节与生物活性方面与紫河车有相似性。经系统的国内外文献检索，羊胎盘替代紫河车的成药性系统评价至今尚无研究报道。采用羊胎盘代替紫河车既符合国家鼓励制药企业对此类中药材进行替代使用的发展思路，也有利于解决紫河车对中药大品种发展的制约问题，此举在国内属首创性工作。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明的中药组合物、活性成分和中药片剂对急性肝损伤和肝纤维化有良好的治愈效果。
2、本发明解决了当前紫河车的资源短缺、价格昂贵等问题，提供了一种新的具有良好治愈效果的中药组合物和片剂。
附图说明：
1、图1为中药片剂对急性肝损伤小鼠肝组织HE染色的影响(200×)。
2、图2为第6周造模结束大鼠肝脾组织大体观察和肝组织HE染色病理图。
3、图3为实验结束后肝纤维化大鼠肝组织大体观察图片。
4、图4为中药片剂对肝纤维化大鼠肝组织HE染色的影响(200×)。
5、图5为中药片剂对肝纤维化大鼠肝组织Masson染色的影响(200×)。
6、图6为各组别Masson染色肝纤维化面积图例。
7、图7为中药片剂对肝纤维化大鼠肝组织免疫组化染色的影响(200×)。
8、图8为各组别α-SMA免疫组化表达面积图例。
具体实施方式：
为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对本发明一种中药组合物、其活性成分、中药片剂的制备作进一步的说明。
实施例1：一种中药组合物：
鳖甲120g、赤芍85g、当归50g、三七50g、党参85g、黄芪85g、羊胎盘22.5g、冬虫夏草25g、板蓝根140g、连翘140g和莪术25g。
实施例2：中药组合物的活性成分：
(1)、称取鳖甲120g、赤芍85g、当归50g、三七50g、党参85g、黄芪85g、羊胎盘22.5g、冬虫夏草25g、板蓝根140g、连翘140g和莪术25g；
(2)、将鳖甲、三七、赤芍、冬虫夏草和羊胎盘粉碎成细粉；
(3)、取当归、莪术和连翘混合，加8倍量的水蒸馏3小时，提取挥发油；蒸馏后的水溶液待用，将药渣加水煎煮1小时，滤过，滤液与蒸馏后的水溶液合并；
(4)、将党参、黄芪和板蓝根三味加水煎煮三次，每次1.5小时，合并三次煎液，过滤得滤液；
(5)、将步骤(3)中滤液与蒸馏后的水溶液合并产物与步骤(4)所得滤液合并，在60℃-85℃下减压浓缩至相对密度为1.30(60℃)的稠膏；
(6)、将步骤(5)所得稠膏与步骤(2)所得鳖甲、三七、赤芍、冬虫夏草和羊胎盘的细粉混匀，真空干燥，得干膏；
中药组合物的活性成分包括步骤(3)中得到的挥发油和步骤(6)中得到的干膏。
实施例3：中药片剂：
(1)、称取鳖甲120g、赤芍85g、当归50g、三七50g、党参85g、黄芪85g、羊胎盘22.5g、冬虫夏草25g、板蓝根140g、连翘140g和莪术25g；
(2)、将鳖甲、三七、赤芍、冬虫夏草和羊胎盘粉碎成细粉；
(3)、取当归、莪术和连翘混合，加8倍量的水蒸馏3小时，提取挥发油；蒸馏后的水溶液待用，将药渣加水煎煮1小时，滤过，滤液与蒸馏后的水溶液合并；
(4)、将党参、黄芪和板蓝根三味加水煎煮三次，每次1.5小时，合并三次煎液，过滤得滤液；
(5)、将步骤(3)中滤液与蒸馏后的水溶液合并产物与步骤(4)所得滤液合并，在80℃下减压浓缩至相对密度为1.27(60℃)的稠膏；
(6)、将步骤(5)所得稠膏与步骤(2)所得鳖甲、三七、赤芍、冬虫夏草和羊胎盘的细粉混匀，真空干燥，得干膏；
(7)、将步骤(6)所得干膏，粉碎成细粉，与蔗糖粉混匀，用浓度为75％乙醇作为湿润剂制成软材，制粒整粒为16目，干燥得干燥颗粒；其中蔗糖粉的加入量为步骤(1)原料药总重量的3.5％；
(8)、用用95％乙醇溶解步骤(3)得到的挥发油，摇匀后喷洒到干燥颗粒上，加硬脂酸镁，总混均匀后密闭40分钟，压制成片即可。
以下通过具体实验例来说明本发明中药片剂的有益效果作进一步的说明。
实验例1：中药片剂抗小鼠急性肝损伤的实验研究
一、材料：
1、供试品：供试药为中药片剂(羊胎盘22.5g)原料药粉，每克药粉相当于生药1.8389克，批号X20161201；中药片剂(羊胎盘45g)原料药粉，每克药粉相当于生药1.8214克，批号X20161202；中药片剂(羊胎盘90g)原料药粉，每克药粉相当于生药1.7607克，批号X20161203；中药片剂(羊胎盘180g)原料药粉，每克药粉相当于生药1.6417克，批号X20161204；上述片剂通过实施例3的方法制备，原料和步骤均相同，区别在于羊胎盘的加入量。
复方鳖甲软肝片原料药，每克药粉相当于生药1.8545克，批号X20161205；复方鳖甲软肝片不加紫河车原料药粉，每克药粉相当于生药1.9714克，批号X20161206；均由内蒙古福瑞医疗科技股份有限公司提供；
联苯双酯(阳性对照药)，批号16100103，由北京协和药厂提供。
试验时上述药物均用0.5％CMC-Na配制成所需浓度的混悬液。
2、主要试剂：
四氯化碳(批号20160108，天津永大化学试剂有限公司)；CMC-Na(批号151204，安徽山河药用辅料股份有限公司)；ALT试剂盒(批号140116024)、AST试剂盒(批号140216018)、ALP试剂盒(批号140316014)、ALB试剂盒(批号140916014)、TP试剂盒(批号140816013)及T-Bil试剂盒(批号140616017)均购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；SOD测定试剂盒(批号：20160315)、GSH-PX测定试剂盒(批号20160327)及MDA测定试剂盒(批号20160318)均购于上海酶联生物科技有限公司。
3、主要仪器
YP 2002型体重秤(上海越平科学仪器有限公司)；BSA124S电子天平(赛多利科学仪器(北京)有限公司)；酶标仪(伯腾BioTek公司)；离心机(KUBOTA CORPORAT ION，日本久宝田公司)；B120型全自动生化分析仪(深圳市迈瑞生物医疗电子股份有限公司)；
4、实验动物：
KM小鼠108只，SPF级别，雌雄各半，体重(20±2)g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，动物生产许可证号SCXK(军)2012-0004；动物质量合格证号No：0041197；解放军第302医院动物中心实验动物使用许可证号SYXK(军)2012-0010。
5、动物饲养条件：
小鼠用全价颗粒饲料(经Co60照射灭菌)，由北京科奥协力饲料有限公司提供。使用对小鼠正常的生理活动没有任何影响，并且舒适、没有油脂、没有异味、没有粉尘、吸湿和保湿性能好的玉米芯垫料。经高压灭菌器120℃，灭菌30min，由中国人民解放军第302医院动物中心提供。采用SDLA-T-0051型无菌饮水器提供水。试验前先喂养3d为适应期。适应期：第1d检疫、称重、尾标，黑色、红色无刺激性的记号笔标尾标，每笼6只，雌雄分开。每天观察记录动物的外观状态并记录体质量。
6、给药剂量设计：
(1)供试物剂量设计
(a)在中药片剂(羊胎盘22.5g)原料药粉：人剂量0.1705/1.8389＝0.0927g/kg(药粉量)；小鼠的剂量为0.0927×9.1＝0.8436g/kg(临床等效量)。
(b)在中药片剂(羊胎盘45g)原料药粉：人剂量为0.175/1.8214＝0.0961g/kg(药粉量)；小鼠的剂量为0.0961×9.1＝0.8745g/kg(临床等效量)。
(c)在中药片剂(羊胎盘90g)原料药粉：人剂量为0.184/1.7607＝0.1045g/kg(药粉量)；小鼠的剂量为0.1045×9.1＝0.9510g/kg(临床等效量)。
(d)在中药片剂(羊胎盘180g)原料药粉：人剂量为0.202/1.6417＝0.1230g/kg(药粉量)；小鼠的剂量为0.1230×9.1＝1.1193g/kg(临床等效量)。
(e)复方鳖甲软肝片原料药粉：人剂量为0.175/1.8545＝0.0944g/kg(药粉量)；小鼠的剂量为0.0944×9.1＝0.8590g/kg(临床等效量)。
(f)复方鳖甲软肝片不加紫河车原料药粉：人剂量为0.166/1.9714＝0.0842g/kg(药粉量)；小鼠的剂量为0.0842×9.1＝0.7662g/kg(临床等效量)。
(2)联苯双酯(阳性对照药)剂量设计：成人1天服用联苯双酯的剂量为0.375mg·kg-1，由文献可知联苯双酯对小鼠给药剂量0.2g·kg-1，约相当于成人剂量的53.3倍。
二、方法：
1、动物分组：
取经检疫合格的KM小鼠108只，准确称取体重，用分组软件将其随机分为9组，每组12只，雌雄各半。分别为阴性对照组(等容量0.5％CMC-Na混悬液)、模型对照组(等容量0.5％CMC-Na混悬液)、中药片剂(羊胎盘22.5g)剂量组(0.8436g·kg-1，简称“A组”)、中药片剂(羊胎盘45g)剂量组(0.8745g·kg-1，简称“B组”)、中药片剂(羊胎盘90g)剂量组(0.9510g·kg-1，简称“C组”)、中药片剂(羊胎盘180g)剂量组(1.1193g·kg-1，简称“D组”)、复方鳖甲软肝片中不加紫河车剂量组(0.7662g·kg-1，简称“N组”)、复方鳖甲软肝片剂量组(0.8590g·kg-1，简称“复方组”)及联苯双酯组(阳性对照，0.2g·kg-1)。
2、造模及给药：
禁食不禁水12h后，除阴性对照组和模型对照组小鼠给予等体积的CMC-Na混悬液外，各给药组按设定剂量每天灌胃1d，给药容积均为20ml·kg-1，连续14d。各试验组于末次给药2h后，除阴性对照组小鼠腹腔注射(ip)等容量大豆油外，其余各组小鼠ip0.1％CCl4的大豆油溶液10ml·kg-1，制备小鼠急性肝损伤模型。
3、小鼠一般状态观察：
观察小鼠在检疫期及给药期间的进食及饮水、大便、活动、皮毛等状态变化。
4、小鼠肝脏及脾脏指数变化：
小鼠每隔两天称一次体重，小鼠取血后颈椎脱臼处死，剖腹，迅速取出肝脏、脾脏，称重、拍照，计算肝脏指数、脾脏指数(肝脏指数(％)＝肝重(g)/体重(g)×100；脾脏指数(％)＝脾重(g)/体重(g)×100)。
5、血液生化检测：
小鼠摘取眼球取血分离血清，测各项血液生化指标及脂质过氧化指标，以方差分析进行统计学处理。摘取眼球取血，置于加有抗凝剂的EP管中，3000r/min离心15min，取上清，-20℃冰箱中保存，用全自动血液生化仪检测血清中ALT、AST、TP、ALB、T-Bil、ALP水平。
6、脂质过氧化指标的测定：
根据试剂盒说明，利用双抗夹心法检测超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的含量。
6.1、测定SOD方法：
(1).标准品的稀释。把原倍标准品的浓度梯度稀释成5个浓度。
(2).加样。把酶标包被板分别设空白孔(不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上准确加入50μl标准品，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，后再加待测样品10μl，使其最终稀释成5倍。
(3).温育。用封板膜封板后放置在37℃中温育30min。
(4).洗涤。揭掉封板膜，弃去液体甩干，每孔加满稀释后的洗涤液，静置30s后弃去，重复5次，拍干。
(5).加酶及温育。除空白孔外，每孔均加入酶标试剂50μl。温育30min后，同样洗涤5次，拍干。
(6).显色及终止。每孔先加入50μl显色剂A，后加入50μl显色剂B，震荡混匀，37℃避光显色15min。最后每孔加50μl终止液，终止反应
(7).检测。把空白孔调零后，450nm波长下在酶标仪中测量各孔的吸光度(OD值)，并通过标准曲线计算样品中小鼠超氧化物歧化酶(SOD)浓度。
6.2、MDA及GSH-PX的测定方法同上。
7、小鼠肝组织病理学变化：
取小鼠肝大叶相同部位的肝组织固定于10％中性福尔马林溶液中，做病理切片检查。HE染色观察肝组织病理形态学的改变。
8、统计学处理：
用SPSS19.0软件对试验定量数据进行处理，组与组之间比较用One way ANOVA进行分析，统计结果用均数±标准差(±s)表示，P＜0.05为组别之间具有显著差异，P＜0.01表明组别之间具有极显著差异。
三、结果：
1、小鼠一般状况观察：
各组小鼠造模前状态良好，进食饮水正常，毛发润泽，大便呈黑褐色颗粒状。造模后，除阴性对照组外，剩余各组小鼠均不同程度的反应迟缓，活动减少，其中以模型组最为显著，毛发蓬乱不润泽，大便稀软不成形呈黄绿色。
2、对急性肝损伤小鼠肝脏及脾脏指数的影响：
结果如表3所示，与阴性对照组比较，模型对照组小鼠的肝脏指数、脾脏指数显著增高(P<0.01)；与模型对照组相比，A组、B组与C组均能显著降低肝损伤小鼠的肝脏及脾脏指数升高(P<0.01或0.05)，D组及N组的小鼠脾脏指数显著降低(P＜0.01)；与复方组比较，各供试品组小鼠肝脾肿胀下降程度均无明显变化(P＞0.05)。结果提示，中药片剂可能对小鼠肝脏及脾脏轻度肿胀有一定的缓解作用。
表1对CCl4致小鼠急性肝损伤肝脏及脾脏指数的影响(n＝12)
组别 剂量(g·kg-1) 体重(g) 肝重(g) 脾重(g) 肝脏指数(％) 脾脏指数(％)
阴性对照 - 30.69±4.41 1.34±0.20 0.12±0.03 4.38±0.12 0.38±0.04
模型对照 - 28.98±5.40 1.59±0.34 0.23±0.11** 5.45±0.23** 0.78±0.27**
A 0.8436 29.96±7.63 1.34±0.40 0.13±0.052## 4.42±0.33## 0.42±0.08##
B 0.8745 29.54±4.92 1.42±0.33 0.13±0.045## 4.80±0.61# 0.46±0.13##
C 0.9510 27.77±4.91 1.23±0.25# 0.13±0.037## 4.43±0.43## 0.47±0.12##
D 1.1193 28.37±4.65 1.51±0.45 0.12±0.031## 5.31±1.42 0.43±0.08##
N 0.7662 26.26±5.11 1.42±0.43 0.13±0.026## 5.37±1.01 0.49±0.05##
复方 0.8590 28.02±4.23 1.40±0.33 0.13±0.037## 4.97±0.57 0.49±0.13##
联苯双酯 0.2 28.78±6.36 1.29±0.31# 0.12±0.03## 4.49±0.35## 0.42±0.09##
注：与阴性对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。
3、对急性肝损伤小鼠血清中ALT及AST的影响：
结果如表2所示，与阴性对照组相比，模型对照组小鼠血液中AST及ALT含量显著增高(P<0.01)；与模型对照组比较，各给药组小鼠血清中AST及ALT含量均显著降低(P＜0.01或0.05)；与复方组比较，各供试品组对小鼠血清中AST及ALT的改变无明显变化(P＞0.05)。结果提示，中药片剂可以降低肝损伤小鼠血清中ALT及AST水平，其中以A组及B组降低效果最为显著。
表2对CCl4致小鼠急性肝损伤血液中AST、ALT的影响(x±s,n＝12)
组别 剂量(g·kg-1) AST(U/L) ALT(U/L)
阴性对照 - 102.50±24.54 35.95±12.75
模型对照 - 886.67±177.42** 706.76±175.81**
A 0.8436 205.83±78.09## 263.33±357.04##
B 0.8745 335.00±81.48## 390.67±164.99#
C 0.9510 637.50±107.98# 407.33±134.56#
D 1.1193 553.33±132.20## 465.83±160.22#
N 0.7662 651.67±153.88# 511.67±198.09#
复方 0.8590 391.67±102.5## 312.50±104.15##
联苯双酯 0.2 387.42±154.23## 300.00±74.19##
注：与阴性对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。
4、对急性肝损伤小鼠血清ALB、GLO的影响：
结果如表3所示，与阴性对照组相比，模型对照组小鼠血清中ALB、A/G明显降低(P<0.05)，血清中GLO含量则显著性升高(P<0.01)；与模型对照组相比，各给药组小鼠血清中ALB及A/G水平均显著升高(P<0.01或0.05)，而血清中GLO含量仅有降低趋势；与复方组比较，各供试品组对小鼠血清中ALB及GLO的均无显著变化(P＞0.05)。结果提示，中药片剂可明显升高急性损伤所致ALB的骤降，改善小鼠急性肝细胞损伤。
表3对CCl4致急性肝损伤小鼠血液中ALB、GLO的影响(n＝12)
组别 剂量(g·kg-1) ALB(g/L) GLO(g/L) A/G
阴性对照 - 13.19±1.91 54.67±4.16 0.24±0.03
模型对照 - 10.64±2.19* 61.51±6.34** 0.17±0.04*
A 0.8436 15.48±2.21## 57.30±4.28 0.27±0.05##
B 0.8745 14.92±3.26## 56.37±6.68 0.27±0.05##
C 0.9510 12.82±1.96# 54.07±6.35 0.24±0.04##
D 1.1193 12.94±1.93# 56.28±1.66 0.23±0.04#
N 0.7662 14.55±1.47## 63.13±3.75 0.23±0.03#
复方 0.8590 13.63±1.92# 55.00±6.74 0.25±0.05##
联苯双酯 0.2 14.27±2.15## 56.96±4.52 0.25±0.03##
注：与阴性对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。
5、对急性肝损伤小鼠血清中TP、T-Bil及ALP的影响：
结果如表4所示，与阴性对照组相比，模型对照组小鼠血清中T-Bil及ALP含量均显著性升高(P<0.01)，而血清中TP水平则明显降低(P<0.05)；与模型对照组比较，A组、B组及N组小鼠血清中TP含量均有不同程度升高(P＜0.01)，同时A组、B组及C组血清中T-Bil含量明显降低(P＜0.01或0.05)，各给药组血清中ALP含量均显著降低(P＜0.01或0.05)；与复方组比较，各供试品组对小鼠血清中TP、T-Bil及ALP的改变均无明显变化(P＞0.05)。由试验结果可知，中药片剂能提高TP，降低T-Bil及ALP水平，其中以A组及B组最为明显，稍优于复方鳖甲软肝片。
表4对CCl4致急性肝损伤小鼠血液中TP、T-Bil及ALP的影响(n＝12)
组别 剂量(g·kg-1) TP(g/L) T-Bil(g/dL) ALP(U/L)
阴性对照 - 65.64±6.20 0.15±0.05 96.28±21.39
模型对照 - 59.12±6.44* 0.30±0.12** 181.70±43.57**
A 0.8436 75.15±5.61## 0.15±0.07## 119.06±28.94##
B 0.8745 70.43±8.36## 0.18±0.06# 136.81±43.51##
C 0.9510 66.22±5.93 0.20±0.12# 124.52±42.85##
D 1.1193 62.17±3.78 0.23±0.11 120.83±27.42##
N 0.7662 73.23±5.52## 0.23±0.14 146.06±56.94#
复方 0.8590 68.17±6.13# 0.21±0.13# 125.68±37.94##
联苯双酯 0.2 71.62±6.78## 0.18±0.07# 119.96±42.43##
注：与阴性对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。
6、对急性肝损伤小鼠脂质过氧化指标的影响：
结果如表5所示，与阴性对照组相比，模型对照组血清中SOD及GSH-PX水平显著降低(P<0.05或0.01)，而血清中MDA含量则显著升高(P<0.01)；与模型对照组相比，各给药组小鼠血清中SOD含量均显著升高(P＜0.01)，同时A组、B组及C组血清中GSH-PX含量也明显升高(P＜0.05或0.01)，而A组、B组血清中MDA含量则显著降低(P＜0.05)；与复方组比较，各供试品组小鼠血清中抗过氧化能力均无显著变化(P＞0.05)。结果提示，中药片剂能抑制急性肝损伤造成的氧化胁迫，表现出明显的肝损伤保护作用，其中以A组及B组效果与复方鳖甲软肝片一致。
表5对CCl4致小鼠急性肝损伤脂质过氧化指标的影响(n＝12)
组别 剂量(g·kg-1) SOD(pg/mL) MDA(nmol/L) GSH-Px(ng/L)
阴性对照 - 20.04±1.75 1.17±0.286 41.12±4.09
模型对照 - 14.66±3.43* 3.10±1.275** 22.68±2.07**
A 0.8436 26.96±1.66## 1.54±0.225# 32.31±2.75#
B 0.8745 29.13±2.79## 1.37±0.43# 40.35±1.09##
C 0.9510 25.76±1.99## 2.99±0.529 29.23±3.77#
D 1.1193 26.51±3.52## 2.91±0.325 26.21±2.38
N 0.7662 25.13±1.88## 2.16±0.573 25.16±6.87
复方组 0.8590 26.77±1.65## 1.48±0.255# 35.74±6.04#
联苯双酯 0.2 23.30±1.80## 1.27±0.220## 31.49±1.75#
注：与阴性对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。
7、肝组织病理学观察：
病理学结果如图1所示，图1为中药片剂对急性肝损伤小鼠肝组织HE染色的影响(200×)；其中a：阴性对照组；b：模型对照组；c：A组；d：B组；e：C组；f:D组；g:N组；h:复方组；i:联苯双酯组。
图1中阴性对照组小鼠肝小叶排列整齐、结构清晰，肝细胞形态及结果正常；模型对照组小鼠肝组织存在广泛的气球样变，胞浆透明化，中央静脉周围(肝小叶中心)有大量灶性坏死，并伴有炎性细胞及单核细胞浸润，表明采用CCl4致小鼠急性肝损伤造模成功。与模型对照组比较，A组小鼠肝细胞水肿、气球样变均有不同程度减轻，肝小叶无变形、坏死；B组小鼠肝索间隙增大，肝窦扩张，肝细胞核固缩、深染，有少量肝细胞水样变性；C组小鼠肝小叶中心细胞明显坏死，肝细胞核固缩、深染，有少量淋巴细胞浸润及肝细胞坏死；D组小鼠肝小叶细胞中度气球样变性，肝细胞核固缩、深染，可见大量肝细胞坏死；N组小鼠存在广泛的肝细胞气球样变，胞浆透明化，肝小叶内皮坏死，大量肝细胞坏死及淋巴细胞浸润；复方组小鼠肝小叶结构清晰，仅有极少量肝细胞水样变性及坏死；联苯双酯组小鼠肝小叶结构清晰，有轻度水样变性，有少量肝细胞坏死。与复方组比较，A组、B组及C组小鼠肝组织病理学改变不大，D组及N组小鼠的肝组织病理学改善程度明显降低。结果提示，中药片剂对急性肝损伤小鼠仍有一定的肝保护作用，其中以A组及B组保护效果较好，明显优于复方鳖甲软肝片。
CCl4为肝毒性物质，在肝细胞膜上达到损伤肝细胞的目的。主要是通过以下两种途径：①肝微粒酶系代谢产生的脂质过氧化及活性自由基氯烷化损伤肝细胞膜，破坏膜结构和脂质代谢；②肝细胞膜的直接溶解。本试验采用CCl4诱导小鼠急性肝损伤模型，初步考察中药片剂对小鼠体内肝组织保护作用的变化。
急性肝损伤产生过量自由基引发肝细胞膜脂质过氧化，代谢产物与细胞内物质共价结合，扰乱细胞内钙代谢，破坏细胞膜的完整性。随后又释放炎性细胞因子诱发肝组织酶代谢异常，使肝细胞内转氨酶ALT和AST释放入血、蛋白质合成代谢功能降低，胆道梗阻抑制酶排泄。具体表现为小鼠血清中ALT、AST、T-Bil和ALP含量大量升高，ALB和TP也随着肝脏代谢功能降低而减少。由试验结果可知，中药片剂能显著降低急性肝损伤小鼠血清中AST、ALT、T-Bil及ALP含量，升高TP及ALB水平，明显改善小鼠急性肝细胞损伤，恢复肝功能，其中以0.5:1及1:1剂量组改善效果最为明显。结果提示，本发明的中药片剂表现出明显的抗急性肝损伤效果。
过量自由基使肝微粒体诱发脂质过氧化反应，导致机体重要的抗氧化及自由基清除剂SOD、GSH-Px大量减少，MDA含量大量增加。在本试验中，中药片剂各羊胎盘含量组均明显升高SOD水平，其中以0.5:1及1:1剂量组降低血清中MDA、升高GSH-PX水平效果最为显著。表明本发明中药片剂可降低急性肝损伤造成的脂质过氧化反应，改善肝细胞由病理学结果分析可知本发明中药片剂对急性肝损伤小鼠具有保护作用，减轻肝细胞水肿、气球样变及炎性细胞浸润，表现出明显的抗损伤效果。即以中药片剂(羊胎盘22.5g)组小鼠改善效果最为显著。
综上所述，通过CCl4致小鼠急性肝损伤实验，可初步得知本发明中药片剂(羊胎盘22.5g)和中药片剂(羊胎盘45g)对急性肝损伤小鼠均表现出明显的保肝降酶效果，其中以中药片剂(羊胎盘22.5g)效果最为显著。
实验例2：对CCl4诱导大鼠肝纤维化的保护作用
一、材料：
1、供试品：供试药为中药片剂(羊胎盘22.5g)原料药粉，每克药粉相当于生药1.8389克，批号X20161201；中药片剂(羊胎盘45g)原料药粉，每克药粉相当于生药1.8214克，批号X20161202；中药片剂(羊胎盘90g)原料药粉，每克药粉相当于生药1.7607克，批号X20161203；中药片剂(羊胎盘180g)原料药粉，每克药粉相当于生药1.6417克，批号X20161204；上述片剂通过实施例3的方法制备，原料和步骤均相同，区别在于羊胎盘的加入量。
复方鳖甲软肝片原料药，每克药粉相当于生药1.8545克，批号X20161205；复方鳖甲软肝片不加紫河车原料药粉，每克药粉相当于生药1.9714克，批号X20161206；均由内蒙古福瑞医疗科技股份有限公司提供；
秋水仙碱(阳性对照药)，批号160604，由西双版纳版纳药业有限责任公司；
试验时上述药物均用0.5％CMC-Na配制成所需浓度的混悬液。
2、主要试剂：
丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)、总蛋白(TP)、总红素(T-Bil)、碱性磷酸酶(ALP)测定试剂盒均购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；羟脯胺酸(Hyp)、透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)、III型前胶原(PC-III)、IV型胶原(IV-C)试剂盒，购自华美生物工程有限公司；超氧化物岐化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒，均由南京建成生物工程研究所提供；α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)小鼠单克隆抗体(1:500)，Abcam提供。
3、实验动物：
取经检疫合格的SPF级SD大鼠150只，体重(200±20)g，雌雄各半，动物质量合格证号NO：0041081，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，生产许可证号SCXK(军)2012-0004。于中国人民解放军第三〇二医院实验动物房中适应性饲养3天，观察无异常后开始试验，实验动物使用许可证号SYXK(军)2012-0010。
4、主要仪器：
YP2002型电子天平，上海越平科学仪器有限公司；BSA124S电子天平，赛多利科学仪器(北京)有限公司；全自动生化分析仪，深圳雷杜生命科技有限公司；标准试剂型纯水仪，青岛富勒姆科技有限公司；台式高速冷冻离心机，Heal Force公司；紫外可见分光光度计，上海现科仪器有限公司；酶标检测仪，伯腾BioTek公司；脱水机、包埋机和冻台，武汉俊杰电子有限公司；病理切片机，上海徕卡仪器有限公司；组织摊片机，浙江省金华市科迪仪器设备有限公司；DHG-9140A型烤箱，上海慧泰仪器制造有限公司；载玻片及盖玻片，江苏世泰实验器材有限公司；3D HISTECH Pannoramic MIDI扫描仪，购自匈牙利。
5、给药剂量设计：
(1)在中药片剂(羊胎盘22.5g)原料药粉：人剂量为0.1705/1.8389＝0.0927g/kg(药粉量)；换算成大鼠的等效剂量为0.0927×6.3＝0.5840g/kg(临床等效量)。
(2)在中药片剂(羊胎盘45g)原料药粉：人剂量为0.175/1.8214＝0.0961g/kg(药粉量)，换算成大鼠的剂量为0.0961×6.3＝0.6054g/kg(临床等效量)。
(3)在中药片剂(羊胎盘90g)原料药粉：人剂量为0.184/1.7607＝0.1045g/kg(药粉量)，换算成大鼠的剂量为0.1045×6.3＝0.6584g/kg(临床等效量)。
(4)在中药片剂(羊胎盘180g)原料药粉：人剂量为0.202/1.6417＝0.1230g/kg(药粉量)，换算成大鼠的剂量为0.1230×6.3＝0.7749g/kg(临床等效量)。
(5)复方鳖甲软肝片原料药粉：人剂量为0.175/1.8545＝0.0944g/kg(药粉量)，换算成大鼠的剂量为0.0944×6.3＝0.5947g/kg(临床等效量)。
(6)复方鳖甲软肝片不加紫河车原料药粉：人剂量为0.166/1.9714＝0.0842g/kg(药粉量)，换算成大鼠的剂量为0.0842×6.3＝0.5305g/kg(临床等效量)。
(7)秋水仙碱片：规格：0.5mg，口服，一次1mg，一日3次。能减轻CCl4引起的大鼠慢性肝损伤并改善其肝功能。剂量设计依据：成人(60kg)1d服用秋水仙碱片的剂量为0.05mg·kg-1，大鼠ig秋水仙碱片剂量为0.1mg·kg-1，为人用剂量2倍。
二、方法：
1、模型建立及给药：
取SPF级SD大鼠150只，雌雄各半。用随机法把大鼠分为2组，即阴性组20只，模型组130只，均雌雄各半。模型组首次皮下注射(sc)5mL/kg 40％CCl4大豆油溶液，3d后sc 3mL/kg 40％CCl4大豆油溶液，每周2次(周三、周五)，同时对照组sc同等剂量的大豆油溶液，连续6周。最后一次造模结束后，分别随机抽取阴性组及模型组大鼠各2只，验证造模是否成功。第6周结束后，阴性组及模型组大鼠进行分组。随机分为9组，每组8只，雌雄各半，分别为阴性对照组、模型对照组、中药片剂(羊胎盘22.5g)剂量组(0.5840g/kg，简称“A组”)、中药片剂(羊胎盘45g)剂量组(0.6054g/kg，简称“B组”)、中药片剂(羊胎盘90g)剂量组(0.6584g/kg，简称“C组”)、中药片剂(羊胎盘180g)剂量组(0.7749g/kg，简称“D组”)、复方鳖甲软肝片中不加紫河车剂量组(0.5305g/kg，简称“N组”)、复方鳖甲软肝片剂量组(0.5947g/kg，简称“复方组”)和秋水仙碱组(阳性对照，0.1mg/kg)。从第7周开始，除阴性对照组及模型对照组每天ig等容量0.5％CMC-Na溶液外，其余各给药组每天均ig对应剂量供试品溶液，共给药6周，造模加给药总计12周。
2、体质量及一般状态观察：
每周称取大鼠体质量，雌雄分开统计，每日观察记录大鼠在实验期间的进食、活动及皮毛光泽度等一般状况。
3、肝脏、脾脏称重及肝组织样本采集：
于实验第12周当晚大鼠禁食不禁水12h，次日上午对大鼠称重，并根据体质量注射10％水合氯醛3.5ml/kg进行麻醉。以“T”型在大鼠腹部正中剪开腹腔暴露脏器，提取肝脏及脾脏组织。用生理盐水冲洗后，用滤纸去除多余水分，记录肝脏及脾脏外观变化情况，测湿重，计算肝脏指数及脾脏指数(肝脏指数＝肝脏湿重/体质量×100％；脾脏指数＝脾脏湿重/体质量×100％)。每组大鼠均取肝大叶部位转至中性福尔马林固定，用于病理学检查。剩余肝脏则分装于冻存管中放入液氮中急速冷冻，之后再转移到-80℃冰箱内保存，以备其他检测。
4、血清生化检查：
末次给药后，禁食不禁水12h，腹主动脉采血，3000r/min离心15min，分取血清存放于－80℃低温冰箱保存，用全自动生化分析仪检测ALT、AST、ALB、TP、T-Bil及ALP水平。
5、大鼠羟脯胺酸(Hyp)含量测定：
肝组织胶原蛋白中特有的氨基酸为Hyp，其水平高低可反映肝脏胶原蛋白合成的量。因此，测定肝组织Hyp含量可定量反映肝组织纤维化的程度。取100mg大鼠肝组织，放入含有液氮的研钵中迅速研磨，转移至加了1ml水解液的EP管后混匀。于沸水浴中水解20min后，按照试剂盒说明书检测肝脏Hyp含量，并由Hyp含量计算出肝组织胶原变化。
肝组织胶原含量＝肝组织羟脯氨酸含量/0.13
6、大鼠血清中脂质过氧化指标含量的测定：
取上述分离血清，按照试剂盒说明，用分光光度法检测血清中SOD、MDA及GSH含量。
7、检测大鼠肝组织中HA、LN、PC-III、IV-C水平：
取上述新鲜肝脏制备肝脏组织匀浆，将肝脏组织匀浆稀释成不同比例的待测样品用于Elisa法检测肝脏组织中匀浆中HA、LN、PC-III及IV-C水平，采用酶标仪450nm处测定吸光度(A)值。
8、肝组织病理学观察：
8.1 HE染色及Masson染色
各组大鼠肝组织经取材、脱水、透明及包埋后制成蜡块，切片后进行染色。HE染色用以观察肝组织病理变化(细胞核呈蓝色，细胞质及其它部位呈粉红色)；Masson染色观察胶原纤维增生情况(胶原纤维呈蓝色，细胞核呈蓝黑色，胞浆呈紫红色)。显微镜下每张玻片随机选择5个视野(200×)，用Image J图像分析软件对图像进行灰度变换，定量分析肝纤维化面积百分比(胶原纤维面积百分比＝胶原纤维区域面积/整个视野面积×100％)，取平均值进行评估。
8.2免疫组化染色
石蜡切片脱蜡至水后，用EDTA进行抗原修复，3％双氧水溶液阻断内源性过氧化物酶，接着用5％胎牛血清室温封闭后，在切片上加稀释后的α牛血清室抗体(1:500)4:5孵育过夜，加与一抗对应的二抗后用DAB显色。α色。α，阳性反应后为棕黄色，自来水冲洗终止显色后，用苏木素复染细胞核。α性反应后免疫组化染色阳性表达后胞浆或胞核内出现棕黄色颗粒，细胞核呈蓝色。应用Image J图像分析程序，使阳α像分析程性表达着色区域与背景分开，定量分析α表达着色阳性表达染色面积百分比(α性表达染阳性表达染色面积百分比＝性表达染色阳性表达染色面积/整个视野面积×性表达染)。通过比较各组肝组织的α。通过比阳性表达程度评价肝纤维化大鼠肝星状细胞活化的程度，取平均值进行评估。
9病理组织评分
显微镜下观察各组大鼠肝组织病理学变化，并通过HE及Masson染色结果对肝组织炎症活动度及肝纤维化程度进行分析。据文献报道，肝内结缔组织增多统称为肝纤维化，属于慢性肝炎的常见现象。参照中华医学会肝病学会及传染病学会1995年修订的病理组织学诊断标准(简称“95草案”)，对镜下肝纤维化程度进行分级、分期，标准见表6。
表6慢性肝病分级、分期标准
注：PN：碎屑性坏死；BN：桥连性坏死。
10、数据统计方法：
用SPSS19.0软件对试验定量数据进行处理，组与组之间比较用One way ANOVA进行分析，统计结果用均数±标准差(±s)表示，P＜0.05为组别之间具有显著差异，P＜0.01表明组别之间具有极显著差异。
三、结果：
1、验证造模是否成功：
第6周造模结束，分别随机抽取阴性组及模型组大鼠各2只，雌雄各半。用10％水合氯醛麻醉后，腹主动脉取血检测血液生化指标的变化，取各组肝大叶固定于中性福尔马林中，脱水、包埋、切片后进行HE染色，观察并比较肝组织的病理学变化，验证造模是否成功。通过对大鼠血液生化指标的检测可得，与阴性组比较，模型组大鼠血清中TP及ALB水平显著性降低(P<0.01)，且血清中T-Bil、ALT、AST及ALP水平均显著性升高(P<0.01)，表明由CCl4诱导肝细胞受损、转氨酶升高，肝脏已成纤维化趋势。见表7。
第6周造模结束大鼠肝脾组织大体观察和肝组织HE染色病理图如图2所示，其中A.阴性对照组肝，B.阴性对照组脾脏，C.阴性对照肝组织HE染色图片(×200)，D.模型对照组肝脏，E.模型对照组脾脏，F.模型对照肝组织HE染色图片(×200)。由图2中HE染色结果可见，阴性组大鼠肝小叶结构完整，轮廓清晰，肝细胞分界清晰，排列整齐，未见明显变性、坏死，汇管区结构清晰，未见小胆管及纤维组织增生；模型组大鼠肝小叶结构破坏严重，肝索排列紊乱，可见典型的肝纤维化病理特征，偶见假小叶及结节形成，肝细胞气球样变性，炎性细胞浸润汇管区胶原纤维大量增生的，呈条索状，形成纤维间隔，将肝小叶分成大小不同的肝细胞团，形成假小叶。由此可得，表明CCl4肝损伤模型的诱导成功。
表7第6周造模结束大鼠血液生化指标的变化(n＝4)
注：与阴性对照组比较：**P＜0.01。
2、肝纤维化大鼠的一般状况及肝脏大体观察：
各组小鼠造模前状态良好，进食及饮水正常，黑褐色颗粒状大便，被毛润泽。造模后，除阴性对照组以外，其余各组小鼠均不同程度表现为反应迟缓，少动，聚堆；其中以模型对照组最为显著，大便稀软或不成形，黄绿色，被毛失润泽。各给药组状态较模型组好转，以秋水仙碱片对照组、A组及B组小鼠效果显著。由图3(实验结束后肝纤维化大鼠肝组织大体观察图片，A.阴性对照组，B.模型对照组，C.阳性对照组，D.A组，E.B组，F.C组，G.D组，H.复方组，I.N组))可以看出，阴性对照组小鼠肝脏呈深红色，表面平滑，有光泽，边缘锐禾质地较软；模型对照组小鼠肝脏明显增大，呈暗褐色，表面有粗颗粒状，边缘钝化，质地较硬。阳性对照组小鼠肝脏颜色略浅，边缘较钝，表面略有黄色小斑块突起。A组及B组小鼠肝脏颜色较红，体枳略增大，表曲欠光滑，细颗粒状表现较模型组减轻。总之，从肝脏的形态上来讲，阳性对照组和各剂量组均对肝损伤有一定的保护作用，其中以A组及B组效果最为显著。
3、肝纤维化大鼠的体质量变化：
大鼠体质量统计采用雌雄分开法。造模期间(第1周至第6周)模型组大鼠有死亡现象(现统计为造模成功后存活大鼠)。与阴性对照组比较，模型对照组大鼠第5周及第6周大鼠体质量降低程度最为显著(P＜0.01)；与模型对照组比较，其余各给药组大鼠体质量均呈缓慢增长趋势。直至造模结束开始给药(第7周)，与阴性对照组比较，模型对照组大鼠体质量增加缓慢；与模型对照组比较，各给药组雄性大鼠体质量无明显增长趋势(P＞0.05)，但A、B、C组雌性大鼠的体质量均有不同程度增加(P＜0.01或0.05)。从第8周至给药结束，各给药组大鼠体质量均呈持续增长趋势。表明肝纤维化大鼠用药物干预后，可改善大鼠肝组织状态，阻断肝纤维化进程。结果见表8及表9。
表8对CCl4致肝纤维化雄鼠体质量的影响(n＝8)
注：与对照组比较：*P＜0.05**P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05##P＜0.01。
表9对CCl4致肝纤维化雌鼠体质量的影响(n＝8)
注：与对照组比较：*P＜0.05**P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05##P＜0.01。
4、中药片剂对肝纤维化大鼠肝脏及脾脏指数的影响
与阴性对照组比较，模型对照组的肝重、脾重、肝脏指数和脾脏指数均显著性增加(P<0.01)；与模型对照组比较，各供试品组的肝重、脾重、肝脏指数和脾脏指数均显著性降低(P<0.01或0.05)；与复方组比较，各供试品组降低肝脾湿重及肝脾指数无明显差异(P＞0.05)，且均与复方组变化保持一致。结果提示，中药片剂能显著性减轻肝纤维化引起的肝脾肿胀，降低肝脏及脾脏指数。结果见表10。
表10对CCl4致肝纤维化大鼠肝脏及脾脏指数的影响(n＝8)
组别 剂量(g/kg) 肝重(g) 脾重(g) 肝脏指数(％) 脾脏指数(％)
阴性对照 - 9.06±2.38 0.64±0.11 2.47±0.20 0.18±0.03
模型对照 - 15.09±3.57** 0.83±0.18** 3.82±0.47** 0.23±0.03**
A 0.5840 10.39±1.50## 0.61±0.07## 2.66±0.32## 0.16±0.03##
B 0.6054 10.49±2.10## 0.69±0.14## 2.55±0.30## 0.17±0.04##
C 0.6584 9.29±1.77## 0.64±0.19## 2.39±0.18## 0.17±0.04##
D 0.7749 9.89±1.81## 0.64±0.06## 2.45±0.12## 0.16±0.03##
N 0.5305 9.52±1.73## 0.60±0.14## 2.53±0.36## 0.16±0.06##
复方 0.5947 9.71±1.88## 0.71±0.14# 2.50±0.25## 0.19±0.05#
秋水仙碱 0.1mg/kg 10.11±1.94## 0.70±0.18## 2.48±0.29## 0.17±0.03##
注：与阴性对照组比较：**P<0.01；与模型对照组比较#P<0.05，##P<0.01。
5、中药片剂对肝纤维化大鼠血清生化的影响：
与阴性对照组比较，模型对照组大鼠血清中ALT和AST含量均显著性增加(P<0.01)，同时模型对照组中S/L比值则发生逆转(P<0.05)；与模型对照组比较，各供试品组大鼠血清中ALT和AST含量显著性降低(P<0.01)，同时S/L比值均显著性增加(P<0.01或0.05)；与复方组比较，C组中S/L的比值有显著增加(P<0.05)。试验结果表明，中药片剂能降低肝纤维化大鼠血清中ALT和AST含量，矫正S/L比值，表现出明显的保肝。结果见表11。
表11对CCl4致肝纤维化大鼠血清ALT及AST含量的影响(n＝8)
注：与阴性对照组比较：*P<0.05，**P<0.01；与模型对照组比较：#P<0.05，##P<0.01；与复方组比较：&P<0.05。
对CCl4致肝纤维化大鼠血清ALB及GLO含量的影响结果如表12所示，与阴性对照组比较，模型对照组大鼠血清中ALB含量及A/G比值显著性降低(P<0.05)；与模型对照组比较，各供试品组大鼠血清中ALB含量和A/G比值均显著性增加(P<0.01或0.05)，其中A组大鼠血清中GLO含量明显降低(P<0.05)。结果提示，A组具有升高ALB、降低GLO、升高A/G比值的效果，抗肝纤维化效果显著。
表12对CCl4致肝纤维化大鼠血清ALB及GLO含量的影响(n＝8)
组别 剂量(g/kg) ALB(g/L) GLO(g/L) A/G
阴性对照 - 27.16±2.42 29.60±2.70 0.92±0.10
模型对照 - 24.36±1.37* 30.83±2.56 0.82±0.07*
A 0.5840 27.46±2.35# 27.80±2.30# 0.97±0.05##
B 0.6054 27.72±2.46# 29.80±1.87 0.93±0.05##
C 0.6584 28.47±2.88## 31.40±2.84 0.91±0.05#
D 0.7749 28.01±1.74## 30.20±2.66 0.93±0.07##
N 0.5305 27.62±2.09# 30.80±1.48 0.90±0.05#
复方组 0.5947 27.49±1.68# 30.20±3.26 0.92±0.10##
秋水仙碱 0.1mg/kg 26.84±2.14 29.40±1.35 0.92±0.07##
注：与阴性对照组比较：*P<0.05；与模型对照组比较：#P<0.05，##P<0.01。
对CCl4致肝纤维化大鼠血清TP、T-Bil及ALP含量的影响如表13所示，与阴性对照组比较，模型对照组大鼠血清中T-Bil及ALP含量均显著增高(P<0.01或0.05)，TP含量仅有降低趋势；与模型对照组比较，A组、B组及D组大鼠血清中TP含量明显增高(P<0.01或0.05)，A组、B组、C组及N组大鼠血清中T-Bil含量明显降低(P<0.01或0.05)，各组大鼠血清中ALP含量均显著性降低(P<0.01或0.05)；与复方组比较，B组及N组大鼠血清中T-Bil含量降低明显(P<0.01或0.05)。结果提示，中药片剂升高TP、降低T-Bil及ALP水平，其中A组和B组效果最为明显。
表13对CCl4致肝纤维化大鼠血清TP、T-Bil及ALP含量的影响(n＝8)
组别 剂量(g/kg) TP(g/L) T-Bil(μmol/L) ALP(U/L)
阴性对照 - 57.14±3.59 0.74±0.24 133.40±48.04
模型对照 - 54.18±3.85 1.85±0.78** 211.67±115.44*
A 0.5840 58.32±3.26# 1.05±0.52## 106.40±37.41##
B 0.6054 59.73±5.50## 0.72±0.39##&& 130.80±69.12#
C 0.6584 57.39±4.03 1.30±0.60# 111.30±42.25##
D 0.7749 58.30±3.72# 1.31±0.34 123.30±74.50##
N 0.5305 55.66±4.27 0.75±0.36##& 102.90±35.75##
复方 0.5947 57.60±4.63 1.34±0.83 105.70±26.06##
秋水仙碱 0.1mg/kg 56.18±2.70 0.82±0.31## 114.60±43.77##
注：与阴性对照组比较：*P<0.05，**P<0.01；与模型对照组比较：#P<0.05，##P<0.01；与复方组比较：&P<0.05，&&P<0.01。
6、中药片剂对肝纤维化大鼠血清Hyp及胶原含量的影响：
与阴性对照组比较，模型对照组大鼠血清中Hyp及胶原含量均显著性增加(P<0.01)；与模型对照组比较，A组、B组和C组大鼠血清中Hyp及胶原含量均显著性降低(P<0.01)；与复方组比较，各供试品组大鼠肝组织中Hyp及胶原含量变化均无显著差异，但D组及N组降低肝组织中Hyp及胶原含量效果弱于原复方组。结果提示，中药片剂可抑制CCl4诱导大鼠肝纤维化血清中Hyp含量的增加，使肝纤维化大鼠肝脏中胶原纤维增生和沉积减少。结果见表14。
表14对CCl4致肝纤维化大鼠血清Hyp含量的影响(n＝8)
组别 剂量(g/kg) Hyp(ng/ml) 胶原含量(ng/ml)
阴性对照 - 36.06±6.36 277.39±48.94
模型对照 - 132.54±11.47** 1019.54±88.24**
A 0.5840 39.40±12.07## 303.07±92.85##
B 0.6054 66.84±26.04## 514.17±200.33##
C 0.6584 70.94±15.60## 591.82±120.04##
D 0.7749 97.30±39.80 748.49±306.16
N 0.5305 94.32±14.78 725.32±113.70
复方 0.5947 66.87±14.21## 514.35±109.30##
秋水仙碱 0.1mg/kg 47.93±23.71## 368.67±182.40##
注：与阴性对照组比较：**P<0.01；与模型对照组比较：##P<0.01。
7、中药片剂对肝纤维化大鼠血清脂质过氧化指标的影响：
对CCl4致肝纤维化大鼠脂质过氧化指标的影响结果如表15所示，与阴性对照组比较，模型对照组大鼠血清中SOD和GSH含量均显著性降低(P<0.01)，而血清中MDA含量则显著性升高(P<0.01)。与模型对照组比较，A组和B组大鼠血清中SOD和GSH含量显著性升高(P<0.01或0.05)，同时血清中MDA含量则显著降低(P<0.01)；C组与模型组比较，血清中MDA含量明显降低、GSH含量升高(P<0.01或0.05)；D组相较于模型组血清中MDA含量明显降低(P<0.01)；N组血清中SOD含量升高、MDA含量明显降低(P<0.01或0.05)；与复方组比较，A组大鼠血清中SOD含量明显升高(P<0.05)。本试验结果提示，中药片剂抑制肝纤维化大鼠脂质过氧化反应，其中以A组降低过氧化水平最为显著。
表15对CCl4致肝纤维化大鼠脂质过氧化指标的影响(n＝8)
组别 剂量(g/kg) SOD(U/ml) MDA(nmol/ml) GSH(mg/L)
阴性对照 - 169.27±23.11 3.22±0.68 15.10±3.33
模型对照 - 130.43±4.57** 5.97±0.61** 6.35±1.08**
A 0.5840 164.13±21.23##& 3.57±0.79## 11.87±3.09##
B 0.6054 157.32±5.66# 4.10±0.85## 9.72±2.04#
C 0.6584 143.00±4.81 3.77±0.21## 10.13±1.58#
D 0.7749 136.27±2.26 3.62±0.45## 9.21±1.72
N 0.5305 153.31±8.27# 4.01±0.96## 7.23±1.03
复方 0.5947 160.50±4.75## 3.47±0.33## 10.03±2.42#
秋水仙碱 0.1mg/kg 156.00±13.12## 4.00±0.53## 9.74±1.37#
注：与阴性对照组比较：**P<0.01；与模型对照组比较：#P<0.05，##P<0.01；与复方组比较：&P<0.05。
8、中药片剂对肝纤维化大鼠肝纤维化指标的影响：
对CCl4致肝纤维化大鼠纤维化指标的影响如表16所示，与阴性对照组比较，模型对照组大鼠血清中HA，LN，PC-III和C-IV含量均显著性增高(P<0.01)；与模型对照组比较，A组及B组降低大鼠血清中HA含量效果显著(P＜0.01或0.05)，A、B、C及N组大鼠血清中LN含量显著降低(P＜0.01或0.05)，仅A组大鼠血清中PC-III含量明显降低(P＜0.01)，各供试品组均降低大鼠血清中C-IV显著含量(P＜0.01)；与复方组比较，各供试品组大鼠血清中HA、LN、PC-III和C-IV含量变化均无显著意义。结果提示，中药片剂对CCl4致肝纤维化大鼠具有明显的治疗效果，可显著性改善大鼠肝纤维程度，其中A组大鼠肝纤维化指标改善效果最为显著。
表16对CCl4致肝纤维化大鼠纤维化指标的影响(n＝8)
组别 剂量(g/kg) HA(ng/ml) LN(ng/ml) PC-III(ng/ml) C-IV(ng/ml)
阴性对照 - 78.35±14.93 45.31±2.98 23.00±4.66 94.07±12.23
模型对照 - 183.00±29.05** 75.67±8.28** 51.00±9.14** 256.16±26.90**
A 0.5840 108.75±17.02## 52.04±4.07## 31.25±6.29## 123.95±21.84##
B 0.6054 123.00±27.08# 45.95±2.95## 38.00±13.88 132.84±22.71##
C 0.6584 137.50±28.79 55.56±6.10# 40.85±7.56 144.50±10.69##
D 0.7749 147.00±17.39 61.59±5.91 43.00±8.6 143.92±19.77##
N 0.5305 142.00±28.57 46.29±5.00## 39.01±5.94 134.64±11.15##
原复方 0.5947 113.35±22.35## 47.60±4.54## 34.85±4.91# 122.87±22.21##
秋水仙碱 0.1mg/kg 107.50±18.44## 44.59±7.37## 32.15±5.15## 115.37±27.57##
注：与阴性对照组比较：**P<0.01；与模型对照组比较：#P<0.05，##P<0.01。
9、中药片剂对肝纤维化大鼠肝组织病理学变化的影响：
(1)、HE染色结果：HE染色用以观察肝组织病理改变。图4为中药片剂对肝纤维化大鼠肝组织HE染色的影响(200×)，其中A.阴性对照组；B.模型对照组；C.A组；D.B组；E.C组；F.D组；G.N组；H.复方；I.阳性对照组。结果显示，阴性对照组大鼠肝细胞圆润、饱满，肝索排列规则、整齐，肝窦无明显扩张或挤压，未见明显炎症细胞浸润。模型对照组大鼠中央静脉周围肝细胞肿胀坏死，偶有桥连，胞核固缩深染，胞质内可见大量大小不一的圆形空泡，静脉周围可见炎症细胞灶性浸润。A组大鼠肝细胞变形明显改善，肝索排列规则、整齐，肝窦无明显扩张或挤压，未见明显炎症细胞浸润，仅部分组织可见汇管区有颗粒状的肥大细胞增生，静脉周围有棕黄色色素沉积。B组大鼠静脉周围胶原纤维增生并伴有棕黄色色素沉积，成纤维细胞增生，胶原纤维增生，纤维化，并伴有炎症细胞浸润，偶见肝细胞脂肪变性，汇管区胆管增生。C组大鼠静脉周围胶原纤维增生并伴有大量棕黄色色素沉积，汇管区胆管明显增生、肥大细胞增多并有局灶性坏死。D组大鼠静脉周围有明显棕黄色色素沉积，汇管区胆管、肥大细胞、成纤维细胞及胶原纤维均有大量增生并引发纤维化。N组大鼠肝细胞变形轻微改善，炎性细胞浸润减少，静脉周围胶原纤维增生并伴有大量棕黄色色素沉积，汇管区胆管增生，局部汇管区可见大量肥大细胞增生。复方组大鼠肝细胞变性明显改善，炎性细胞浸润大量减少，静脉周围胶原纤维增生并伴有少量棕黄色色素沉积，汇管区胆管及肥大细胞增生减轻。秋水仙碱组大鼠肝细胞圆润、饱满，肝索排列规则、整齐，肝窦无明显扩张或挤压，未见明显炎症细胞浸润。
对肝纤维化大鼠肝组织的病理学评分由表17所示，由病理学评分表可知，与阴性对照组比较，模型对照组大鼠肝细胞变性、炎症活动度显著性增加(P<0.01)；与模型对照组比较，A组、B组及D组大鼠肝细胞炎症活动度显著性减轻(P<0.01或0.05)；与复方比较，各供试品组肝细胞炎症活动度变化无显著性差异。结果提示，中药片剂抑制大鼠肝纤维化损伤，其中A组大鼠改善炎症活动度效果最为显著。
表17对肝纤维化大鼠肝组织的病理学评分(n＝8)
注：与阴性对照组比较：**P＜0.01；与模型对照组比较：##P＜0.01；与复方组比较：&P＜0.05，&&P＜0.01。
(2)、Masson染色结果：
Masson染色用于观察胶原纤维增生情况。图5为中药片剂对肝纤维化大鼠肝组织Masson染色的影响(200×)，其中A.阴性对照组；B.模型对照组；C.A组；D.B组；E.C组；F.D组；G.N组；H.复方；I.阳性对照组；图6为各组别Masson染色肝纤维化面积图例。
结果显示，阴性对照组大鼠肝细胞圆润、饱满，肝索排列整齐，中央静脉及汇管区血管壁附着微量蓝色，胶原纤维无明显增生。与阴性对照组比较，模型对照组大鼠肝组织汇管区有大量蓝色附着，纤维间隔增多增宽构成桥连，纤维间隔把肝小叶分成大小不同的肝细胞团后形成假小叶，胶原纤维有明显增生(P<0.01)。与模型对照组比较，A组大鼠中央静脉及汇管区周围结缔组织增生明显减少，胶原纤维增生也显著性减少(P<0.01)；B组大鼠中央静脉及汇管区周围桥连减少，静脉周围可见少量胶原纤维增生(P<0.01)；C组大鼠汇管区及静脉周围有大量蓝色附着，汇管区及静脉周围可见大量胶原纤维增生；D组大鼠汇管区结缔组织增生减少，纤维束向周围延伸，仅小部分形成假小叶，胶原纤维增生显著性抑制(P<0.01)；N组大鼠中央静脉及汇管区周围结缔组织增生减少，胶原纤维桥连减轻，胶原纤维增生改善(P<0.01)。复方组大鼠中央静脉及汇管区周围蓝色附着大量减少，胶原纤维增生明显抑制。秋水仙碱组大鼠仅静脉周围有极少量胶原纤维增生，其他无胶原纤维明显增生。与复方组比较，A组大鼠肝纤维化程度明显改善(P<0.05)。
对肝纤维化大鼠肝组织的病理学评分由表19所示，由病理学评分表知，与阴性对照组比较，模型对照组及N组大鼠汇管区周围明显纤维化，纤维隔形成假小叶，纤维化程度明显(P<0.01)；与模型对照组比较，A组、B组及D组改善大鼠肝纤维化程度最为明显(P<0.01或0.05)；与复方组比较，各供试品组肝组织肝纤维化程度变化无显著差异。结果提示，中药片剂表现出明显的抗肝纤维化效果，其中A组改善肝纤维化程度最为显著。
(3)、免疫组化染色结果：
中药片剂对肝纤维化大鼠肝组织免疫组化染色的影响(200×)见图7，其中A.阴性对照组；B.模型对照组；C.A组；D.B组；E.C组；F.D组；G.N组；H.复方；I.阳性对照组；图8为各组别α-SMA免疫组化表达面积图例。
结果显示，阴性对照组大鼠中α-SMA阳性表达极少，仅在血管平滑肌细胞内有极少量表达。与阴性对照组比较，模型对照组大鼠伴随肝组织纤维化程度的加深，棕黄色区域颜色加深，α-SMA阳性表达面积大量增加(P<0.01)，主要分布在汇管区及纤维间隔。与模型对照组比较，A组大鼠肝组织棕黄色区域面积大量减少，颜色减轻，主要分布在汇管区及仅存的纤维间隔中，α-SMA阳性表达面积明显减少(P<0.01)；B组及C组大鼠棕黄色区域面积减少，主要分布在汇管区，α-SMA阳性表达减轻(P<0.01)；D组及N组大鼠棕黄色染色区域面积轻微减少，颜色略减轻，大量聚集在汇管区，α-SMA阳性表达较模型对照组有明显改善(P<0.01)。原复方组及秋水仙碱组大鼠汇管区棕黄色区域面积明显减少，α-SMA阳性表达面积相比于模型对照组明显减少(P<0.01)。与复方组比较，A组大鼠抑制α-SMA阳性表达效果最明显(P<0.01)；B、C、D及N组大鼠肝组织中α-SMA阳性表达减少程度明显弱于原有复方(P＜0.01)。结果提示，中药片剂能明显降低肝组织中α-SMA阳性表达，表现出明显的抑制肝星状细胞活化效果，其中以A组抑制效果较佳，优于原复方鳖甲软肝片。见图7和图8。
四、讨论：
CCl4在体内代谢产生大量自由基(CCl3·及Cl·)共价结合肝细胞内大分子，攻击膜脂质、破坏脂质代谢，引发生成活性氧自由基和脂质过氧化，从而损伤肝细胞。CCl4诱导肝纤维化模型在形态学及病理生理学方面与人慢性肝病较为相似，是诱导实验肝纤维化和肝硬化最广泛使用的手段之一。本研究采用皮下注射CCl4诱发肝损伤，每周2次，形成“损害→修复→损害”的阶段性过程，诱导肝纤维化的发生。具有造模简便、耗时短、低廉、病变稳定可靠的特点。本试验选用CCl4皮下注射致肝纤维化模型对中药片剂药效进行评价。
1、对肝纤维化大鼠的肝保护作用：
体内大量自由基诱发肝损伤，致使大鼠体重减轻、摄食量减少，同时由于ECM沉积和门静脉高压导致肝脏肿大，从而造成肝脏及脾脏指数升高。自由基同时诱导肝细胞膜发生脂质过氧化，改变膜通透性，使机体内血清转氨酶大量释放入血、蛋白质合成代谢功能降低，胆道梗阻抑制酶排泄。表现为纤维化大鼠血清中ALT、AST、T-Bil和ALP含量大量升高，ALB和TP也随着肝脏代谢功能降低而减少。由本实验结果可知，与阴性对照组相比，模型对照组显著增加了肝脏及脾脏指数，血清酶活性也显著上升，表明造模成功。而各中药片剂组显著降低CCl4诱导肝纤维化大鼠的肝脏及脾脏指数，改善CCl4造成的大鼠生存质量下降的状况，显著降低血清ALT、AST、GLO、T-Bil及ALP，显著升高TP、ALB及A/G比值。其中以中药片剂(羊胎盘22.5g)剂量组和中药片剂(羊胎盘45g)剂量组效果最为明显，说明中药片剂在一定程度上缓解了CC14诱导的大鼠肝脏毒性，保护肝细胞及其膜系统的稳定性，维护肝细胞的正常结构，防止细胞内物质释放，促进肝细胞功能恢复，对纤维化大鼠表现出一定的保肝降酶作用。
病理学观察发现，各中药片剂组均不同程度减轻CC14所致肝细胞损伤，改善肝细胞水肿、变性等肝组织结构破坏程度，减少炎性细胞浸润，抑制胶原纤维增生及沉积，促进胶原降解，减少肝纤维化发生的始动因素，保护肝细胞免于进一步受损及纤维化的发展，从而缓解CC14诱导的肝纤维化程度。其中以中药片剂(羊胎盘22.5g)剂量组和中药片剂(羊胎盘45g)剂量组肝保护作用最为显著。提示中药片剂(羊胎盘22.5g)剂量组和中药片剂(羊胎盘45g)剂量组能显著改善大鼠纤维化程度，恢复肝脏基本功能，对肝脏起到有效的保护作用。
2、抑制肝纤维化大鼠ECM累积：
肝纤维化发生伴随胶原纤维蛋白合成、分泌能力亢进，ECM大量生成并沉积于肝脏，影响肝脏的结构和功能。血清胶原成分的检测对肝纤维化具有重要的诊断价值，Hyp是构成胶原蛋白纤维的特有成分，其在肝脏中的含量可衡量胶原降解的情况，是判断机体肝纤维化程度的重要指标。肝纤维化导致肝内胶原纤维组织增多、Hyp含量升高，因此检测肝组织中Hyp含量可反映肝纤维化的程度。本研究中，与模型对照组相比，中药片剂(羊胎盘22.5g)剂量组和中药片剂(羊胎盘45g)剂量组显著抑制CC14诱导纤维化大鼠的肝组织Hyp含量的增加，使肝纤维化大鼠肝脏中胶原纤维增生和沉积减少。
HA是存在于ECM中的一种高分子多糖，由间质细胞合成，肝内皮细胞摄取和降解。肝脏发生病理损伤时，HA合成增加、降解减少，导致血清中HA含量明显增高。LN是存在于基底膜透明层中的一种大分子非胶原糖蛋白，由肝内皮细胞及HSCs合成。大量研究证实，LN随着肝纤维化的发生而合成增加，可作为早期诊断肝纤维化的非损伤性指标之一。PC-III为III型胶原前体，由活化的HSCs合成和释放，形成于肝纤维化早期。C-IV是由HSCs产生的基底膜主要成份，主要分布在血管及胆管底膜中。C-IV为肝纤维化发生最早期增生纤维，转换率快导致大量沉积，被认为是反映基底膜胶原更新、胶原蛋白的生成而非降解的可靠指标。肝组织中HA、LN、PC-III和IV-C均为肝纤维化标志物，与肝纤维化程度呈正相关，是反映肝脏增生的指标，对肝纤维化的产生、发展、评价具有重要临床意义和价值。本实验结果发现，中药片剂各组均不同程度降低HA,LN,PC-III和C-IV水平，其中以中药片剂(羊胎盘22.5g)剂量组改善肝纤维化效果最为显著。提示中药片剂对肝纤维化时肝脏胶原的合成有一定的抑制作用，可以有效的减少ECM沉积，保护肝细胞，显著改善大鼠肝纤维化程度。
3、减轻肝纤维化大鼠的氧化胁迫：
自由基损伤是诱导肝纤维化产生的重要原因之一。过量自由基使肝微粒体诱发脂质过氧化反应，导致机体重要的抗氧化及自由基清除剂发生变化。SOD可抑制自由基启动的脂质过氧化；MDA为脂质过氧化的最终产物，可严重破坏细胞膜的结构，导致细胞肿胀、坏死，其含量反映了组织过氧化的损伤程度。谷耽甘肽(GSH)是由肝脏合成的一种小分子肽，为机体生化防御体系的重要组成部分，直接参与清除自由基并维持细胞氧化还原状态，同时GSH的抗氧化作用可抵抗由氧化胁迫导致的肝损伤，起到保护细胞膜结构与功能的完整作用。当肝脏发生病变时，GSH水平下降，从而加重肝细胞的变性和坏死。本研究中，中药片剂显著降低CCl4诱导肝纤维化大鼠肝组织内膜脂过氧化物MDA含量，同时显著提高SOD和GSH含量，提示中药片剂抑制肝纤维化大鼠脂质过氧化反应，其中以中药片剂(羊胎盘22.5g)剂量组降低过氧化效果最为显著。
5、抑制HSCs活化及增殖：
HSCs的激活伴随着α-SMA大量表达，α-SMA被认为是HSCs活化的标志。随着肝纤维化的严重程度，α-SMA的表达逐渐增加。本实验对α-SMA蛋白表达研究发现，阴性对照组α-SMA蛋白表达较少，造模6周后，模型对照组α-SMA在汇管区和纤维间隔中染色明显加深。应用中药片剂后α-SMA的表达明显降低，肝纤维化程度亦随之减轻，其机制可能与中药片剂减少α-SMA表达、抑制HSCs活化有关，进一步使促肝纤维化释放因子减少，ECM合成下降，减轻肝纤维化的程度。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种中药组合物，其特征在于，所述中药组合物由下述重量份的原料组成：
鳖甲110～130份、赤芍80～90份、当归40～60份、三七40～60份、党参80～90份、黄芪80～90份、羊胎盘20～180份、冬虫夏草20～30份、板蓝根130～150份、连翘130～150份和莪术20～30份。
2.根据权利要求1所述的一种中药组合物，其特征在于，所述中药组合物由下述重量份的原料组成：
鳖甲110～130份、赤芍80～90份、当归40～60份、三七40～60份、党参80～90份、黄芪80～90份、羊胎盘20～25份、冬虫夏草20～30份、板蓝根130～150份、连翘130～150份和莪术20～30份。
3.根据权利要求1所述的一种中药组合物，其特征在于，所述中药组合物由下述重量份的原料组成：
鳖甲120份、赤芍85份、当归50份、三七50份、党参85份、黄芪85份、羊胎盘22.5份、冬虫夏草25份、板蓝根140份、连翘140份和莪术25份。
4.一种中药组合物的活性成分的制备方法，其特征在于：所述活性成分包括挥发油和细粉混合物；所述制备方法包括下述步骤：
(1)、称取权利要求1～3中任一权利要求所述重量份的原料药；
(2)、将鳖甲、三七、赤芍、冬虫夏草和羊胎盘粉碎成细粉；
(3)、取当归、莪术和连翘混合，加7～9倍量的水蒸馏1～5小时，提取挥发油；蒸馏后的水溶液待用，将药渣加水煎煮1～2小时，滤过，滤液与蒸馏后的水溶液合并；
(4)、将党参、黄芪和板蓝根三味加水煎煮三次，每次1～2小时，合并三次煎液，过滤得滤液；
(5)、将步骤(3)中滤液与蒸馏后的水溶液合并产物与步骤(4)所得滤液合并，在60℃-85℃下减压浓缩至60℃相对密度为1.25～1.30的稠膏；
(6)、将步骤(5)所得稠膏与步骤(2)所得鳖甲、三七、赤芍、冬虫夏草和羊胎盘的细粉混匀，真空干燥，得干膏。
5.权利要求4所述制备方法制备所得的一种中药组合物的活性成分。
6.一种中药制剂，其特征在于：所述中药制剂由权利要求5所述的活性成分和药学上可接受的载体组成。
7.一种中药制剂的制备方法，其特征在于：所述中药制剂为片剂；所述制备方法包括下述步骤：
(1)、称取权利要求1～3中任一权利要求所述重量份的原料药；
(2)、将鳖甲、三七、赤芍、冬虫夏草和羊胎盘粉碎成细粉；
(3)、取当归、莪术和连翘混合，加7～9倍量的水蒸馏1～5小时，提取挥发油；蒸馏后的水溶液待用，将药渣加水煎煮1～2小时，滤过，滤液与蒸馏后的水溶液合并；
(4)、将党参、黄芪和板蓝根三味加水煎煮三次，每次1～2小时，合并三次煎液，过滤得滤液；
(5)、将步骤(3)中滤液与蒸馏后的水溶液合并产物与步骤(4)所得滤液合并，在60℃-85℃下减压浓缩至60℃相对密度为1.25～1.30的稠膏；
(6)、将步骤(5)所得稠膏与步骤(2)所得鳖甲、三七、赤芍、冬虫夏草和羊胎盘的细粉混匀，真空干燥，得干膏；
(7)、将步骤(6)所得干膏，粉碎成细粉，与药学上可接受的载体混匀，用乙醇作为湿润剂制成软材，制粒，干燥得干燥颗粒；
(8)、将步骤(3)得到的挥发油，用95％乙醇溶解，摇匀后喷洒到干燥颗粒上，加硬脂酸镁，总混均匀后密闭35～45分钟，压制成片即可。
8.根据权利要求7所述的中药制剂的制备方法，其特征在于：步骤(7)中药学上可接受的载体为蔗糖粉，蔗糖粉的加入量为步骤(1)原料药总重量的1.5％-5.5％；步骤(7)中所述乙醇的浓度为72％～78％；所述制粒整粒为16目。
9.权利要求7或8所述中药制剂的制备方法制备得到的片剂。
10.权利要求1～3中任一权利要求所述中药组合物或权利要求5所述活性成分或权利要求9所述片剂在制备治疗肝纤维化药物和制备治疗急性肝损伤药物中的应用。
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