CN106606602A - 用于保护肝脏和保护胃黏膜的解酒饮 - Google Patents

用于保护肝脏和保护胃黏膜的解酒饮 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于保护肝脏和保护胃黏膜的解酒饮及其制备方法，包括：将枳梖子、丹参、葛根、党参、陈皮、枸杞子、葛花、山楂、甘草、女贞子按重量配比混合并用八倍量水煎煮两次，合并滤液进行减压浓缩，制成流浸膏。本发明通过建立小鼠急性肝损伤和胃黏膜损伤的模型，检查肝脏和胃黏膜的组织形态，测定血清中ALT、AST、ALB等指标，免疫组化方法检测肝脏MnSOD、BCL‑2、Caspase‑3的表达情况，荧光PCR法检测肝组织Nrf2、SOD的基因表达水平，测定各组小鼠胃黏膜损伤指数、抑制率以及胃黏膜内皮素‑1等含量，综合研究了本发明对小鼠肝脏和胃黏膜的保护作用，实验数据证明本发明能够提高肝脏抗氧化能力，抑制肝细胞凋亡，同时具有保护胃黏膜损伤的作用。

Description

用于保护肝脏和保护胃黏膜的解酒饮
技术领域
本发明涉及中药解酒方剂。更具体地说，本发明涉及用于保护肝脏和保护胃黏膜的解酒饮及其制备方法。
背景技术
随着生活水平的提高、饮食结构改变和酒精消费量的日益增长，酒精性肝病发病率在世界范围内呈现逐年升高的趋势。有资料表明,成年男性每天摄入乙醇的剂量>40g,女性摄入乙醇的剂量>20-30g,就可导致肝脏损伤。进入体内的乙醇,仅有2-10％通过肺脏和肾脏排出,其余大部分在肝脏中分解代谢。乙醇代谢过程中引起机体氧化应激,氧化应激可以损伤线粒体,乙醇也可直接导致内质网应激,进而造成线粒体功能紊乱、脂质蓄积、炎症反应以及细胞凋亡。长期饮酒可造成全身多系统的损伤、尤其对胃肠道,肝脏损伤更为明显,酒精可直接或间接引起慢性胃炎,消化性溃疡和酒精中毒性肝硬化。近年来,成人酒精中毒的发生率也逐年升高，急性酒精中毒可引起多脏器损害，特别是导致急性胃黏膜糜烂出血。
现有的解酒药品多具有醒酒解酒的功效，但只局限于能延缓饮酒者的醉酒时间，缓解醉酒者的头痛、恶心等症状，减短醉酒者的醉睡时间，而缺乏解酒药对于醉酒者肝脏和胃黏膜的保护功效；虽然有公开的具有护肝作用的解酒组合物，但其公开例中缺乏对于解酒药在预防或治疗醉酒造成的肝脏和胃黏膜损伤方面的药理学实验例证。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种用于保护肝脏和保护胃黏膜的解酒饮及其制备方法。
本发明还有一个目的是通过科学的生化对比试验及相关生理指征表征对比，研究所述解酒饮对小鼠急性肝损伤和急性胃黏膜损伤的预防和治疗作用。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种用于保护肝脏和保护胃黏膜的解酒饮，所述解酒饮制备原料组成包括：枳梖子10-20重量份、丹参5-15重量份、葛根10-20重量份、党参10-20重量份、陈皮10-20重量份、枸杞子10-20重量份、葛花10-20重量份、山楂5-15重量份、甘草5-15重量份、女贞子10-20重量份；
所述各原料配比均以含水率不超过7％的干重计算，所述解酒饮的制备方法为：将各原料按重量配比混合均匀装入纱布包中，辐照灭菌，将纱布包浸入相当于药材总重八倍量的清水浸泡0.5-1h，以大火煮沸后改文火煎煮1h，取出药包沥干后再浸入相当于药材总重八倍量的清水中，以大火煮沸后改文火煎煮1h，取出药包沥干，将两次煎煮的药液合并，在80℃的水浴上进行减压浓缩，压力值为-0.08pa，调整浓缩液为含量相当于含生药1g/ml的流浸膏。
优选的是，其中，枳梖子20重量份、丹参10重量份、葛根15重量份、党参10重量份、陈皮10重量份、枸杞子10重量份、葛花10重量份、山楂5重量份、甘草10重量份、女贞子10重量份。
优选的是，其中，所述枳梖子、丹参、葛根、党参、陈皮、山楂、甘草经粗粉机粉碎，粉碎后的粒度为0.27-0.55cm。
优选的是，其中，所述中药原料装入纱布包时，所述中药原料体积占纱布包容积的1/3-1/2。
优选的是，其中，将纱布包抽线封口后，整理纱布包使药材平铺为1-2cm厚，采用紫外线辐照杀菌。
优选的是，其中，每次取出药包时，用少量清水冲洗药包后沥干，冲洗和沥出的药液回收入煎煮药液中，每次冲洗所用水量不超过1/5的干药总重量。
优选的是，其中，所述药液经过减压浓缩后，放入60℃烘箱内烘干24h之后置于容量瓶中用水稀释定容为含量相当于含生药1g/ml的流浸膏。
优选的是，其中，所述解酒饮可以将流浸膏于棕色容器中密封保存，所述解酒饮也可以经过喷雾干燥制成颗粒，以便于包装并方便服用。
优选的是，其中，所述解酒饮用法及用量为：可于饮酒前服用或饮酒后服用，成人每天服用量按体重计为1.25g/Kg，分三次服用。
优选的是，其中，所述解酒饮可以用于制备具有醒酒、解酒、保肝、护胃等功效的药品或食品。
本发明至少包括以下有益效果：所述解酒饮中包含的葛根、枸杞子、葛花、山楂、甘草、女贞子皆具有保护肝脏的功能，可预防或治疗乙醇对肝脏的损害，同时，甘草还具有解毒功能，可加速乙醇代谢而排泄到体外；而丹参具有促进细胞组织的修复与再生，促进肝脏微循环，防止凝血淤血的作用；陈皮、党参有抑制胃肠道痉挛和保护胃黏膜的作用，还可减轻醉酒产生的呕吐；葛根、山楂具有改善微循环，抗氧化作用，这样可以减轻因醉酒产生的头痛；此外枳梖子还有利尿作用，可以加速乙醇从体内排除；因此所述解酒饮具有醒酒、保肝和保护胃黏膜的作用；由于制备方法中采用两次煎煮的工艺，因此能够充分浸出各中药原料中的有效成分；由于采用80℃水浴上进行减压浓缩，因此能够避免药液被高温煎糊，同时加快浓缩速度；由于部分难以浸煮的药材进行了粗粉碎，因此能够加快药物成分的浸出，同时因为粒度控制在0.27-0.55cm，因此减少了药粉过细时候药粉本身对有效成分的吸附；由于中药原料体积占纱布包容积的1/3-1/2，因此能使药材与容积之间有充足的接触空隙，有助于有效成分的浸出；由于整理纱布包使药材平铺为1-2cm厚，采用紫外线辐照杀菌，因此能够彻底杀死药材上的微生物和虫卵等；由于每次取出药包时，用少量清水冲洗药包后沥干，冲洗和沥出的药液回收入煎煮药液中，因此能够尽可能地回收药材本身所吸附的有效成分；由于所述药液经过减压浓缩后，放入60℃烘箱内烘干24h之后置于容量瓶中用水稀释定容为含量相当于含生药1g/ml的流浸膏，因此能够保证流浸膏的浓度复合规定；由于所述解酒饮可以将流浸膏于棕色容器中密封保存，也可以经过喷雾干燥制成颗粒，因此能够保证药效、便于包装或服用；由于所述解酒饮用法及用量为：可于饮酒前服用或饮酒后服用，成人每天服用量按体重计为1.25g/Kg，分三次服用，因此能够持续有效地发挥其醒酒、保肝和保护胃黏膜的作用；由于所述解酒饮可以用于制备具有醒酒、保肝、护胃等功效的药品或食品，因此可以有更广泛地应用空间，以多种形式服务于人类的身体健康。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明对肝组织病理组织学的改变的影响(HE，×100)；
图2为本发明一个实施例中对免疫组化检测肝脏MnSOD的表达情况对比图(×400)；
图3为本发明一个实施例中对免疫组化检测肝脏Bcl-2的表达情况对比图(×400)；
图4为本发明一个实施例中对免疫组化检测肝脏Caspase-3的表达情况对比图(×400)；
图5为本发明一个实施例中荧光定量RT-PCR产物的扩增曲线；
图6为本发明一个实施例中荧光定量RT-PCR产物的溶解曲线；
图7为本发明一个实施例中对小鼠急性胃黏膜损伤的影响(×10)
图8为本发明一个实施例中对小鼠胃黏膜病理组织学的影响(HE，×400)
具体实施方式
下面对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
<实例1>解酒饮的制备
本发明所述用于保护肝脏和保护胃黏膜的解酒饮由以下重量配比的原料组成：枳梖子20重量份、丹参10重量份、葛根15重量份、党参10重量份、陈皮10重量份、枸杞子10重量份、葛花10重量份、山楂5重量份、甘草10重量份、女贞子10重量份；
其中，所述配比均以含水率不超过7％的干重计算；
本发明所述的丹参养心袋泡茶的制备方法，包括以下步骤：
将所述枳梖子、丹参、葛根、党参、陈皮、山楂、甘草经粗粉机粉碎，粉碎后的粒度为0.27-55cm，按相应比例配合枸杞子、葛花混合均匀，将所述中药原料装入纱布包，其体积占纱布包容积的1/3-1/2，将纱布包抽线封口后，整理纱布包使药材平铺为1-2cm厚，采用紫外线辐照杀菌，将所述纱布包浸入相当于药材总重八倍量的清水浸泡0.5-1h，以大火煮沸后改文火煎煮1h，取出药包，并使用不超过1/5的干药总重量的清水对药包进行冲洗并沥干，冲洗和沥出的药液回收入煎煮药液中，将药包再浸入相当于药材总重八倍量的清水中，以大火煮沸后改文火煎煮1h，取出药包使用不超过1/5的干药总重量的清水对药包进行冲洗并沥干，冲洗和沥出的药液回收入煎煮药液中，将两次煎煮的药液合并，在80℃的水浴上进行减压浓缩，压力值为-0.08pa，待药液变粘稠，转移容器放入60℃烘箱内烘干24h之后置于容量瓶中用水稀释定容为含量相当于含生药1g/ml的流浸膏，所得流浸膏置于棕色容器中密封保存，或者可以将流浸膏进行喷雾干燥制成颗粒进行包装。
<实例2>解酒饮对小鼠急性肝损伤的保护作用的实验
1.材料和方法
1.1实验动物
昆明种健康小鼠60只：SPF级，雌雄各半，体质量18～22g，由广西医科大学动物中心提供，实验动物使用许可证：SCXK桂2014-0002，饲养环境温度为(23±2)℃，湿度为40％～60％。
1.2受试药物
本发明方法所制备的解酒饮
联苯双酯滴丸：万邦德制药集团股份有限公司，批号：A02141148，规格:1.5mg/丸。
1.3试剂与仪器
CCl4：成都市新都区木兰镇工业开发区，批号：2014061301；
考马斯亮蓝检测试剂盒：南京建成生物工程研究所，批号：20151008；
SOD试剂盒(WST-1法)：南京建成生物工程研究所产品，批号：20151212；
AST试剂盒：上海执诚生物科技股份有限公司，批号：ZCMARO020；
ALT试剂盒：上海执诚生物科技股份有限公司，批号：ZCSEPN024；
MDA试剂盒：南京建成生物工程研究所产品，批号：20150715；
GSH试剂盒：南京建成生物工程研究所产品，批号：20150707；
白蛋白测定试剂盒：上海执诚生物科技股份有限公司，批号：ZCJUNN016；
总蛋白测定试剂盒：上海执诚生物科技股份有限公司，批号：ZCJULN010；
MnSOD：武汉博士德生物工程有限公司，批号：BA4566；
Caspase-3：美国bioworlde公司，批号：BS1518；
BCL-2：北京中杉金桥生物有限公司，批号：15680208；
总RNA提取试剂盒(RNAisoPlus)，日本TaKaRa公司，批号:D9108A；
反转录试剂盒，日本TaKaRa公司，批号:DRR036A；
荧光定量PCR试剂盒，日本TaKaRa公司，批号:DRR081A；
Nrf2序列特异引物，大连宝生物工程有限公司；
SOD序列特异引物，大连宝生物工程有限公司；
β-actin序列特异引物，大连宝生物工程有限公司；
DEPC水，美国Sigma公司；
电子分析天平，型号：EL204，上海梅特勒一立托仪器公司；
紫外可见分光光度计，型号：UVmini-1240，日本岛津；
日立全自动生化分析仪，型号：7100，日本日立公司；
酶标仪，型号：MULTISKANMK3，Thermo；
Olympus生物显微镜，型号：CX31+DP73，日本奥林巴斯株式会社；
荧光定量PCR仪:美国应用生物系统公司生产,型号：7500；
2方法
2.1药物的制备
高剂量组用药：解酒饮流浸膏1g/ml的浓度；
中剂量组用药：将解酒饮流浸膏用蒸馏水进行2倍稀释成0.5g/ml的浓度；
低剂量组用药：将解酒饮流浸膏用蒸馏水进行4倍稀释成0.25g/ml的浓度；阳性药物的制备：
联苯双酯滴丸40粒(规格1.5mg，共60mg)研磨成粉末，用蒸馏水稀释至10ml，配制成浓度为0.006g/ml药物混悬液，用时新鲜配制，摇匀使用。0.3％CCl4溶液：
用微量移液器量取30μlCCl4分析纯置于10ml容量瓶中，加橄榄油至容量瓶的刻度线，充分混匀，制成0.3％CCl4橄榄油溶液。
2.2动物分组及给药
(1)动物分组
健康的昆明种小鼠，60只，体重18-22g，适应性地喂养一周后，随机分为模型对照组、正常对照组、解酒饮高剂量组、解酒饮中剂量组、解酒饮低剂量组和联苯双酯组，每组10只，雄雌各半。
(2)给药
高剂量组小鼠灌服25g/kg剂量的解酒饮，中剂量组灌服12.5g/kg剂量的解酒饮，低剂量组灌服6.25g/kg剂量的解酒饮，联苯双酯阳性对照组灌服150mg/kg剂量的联苯双酯混悬液，模型和空白对照组灌服同体积蒸馏水。一天一次，连续给药8天。第8天给药后，除空白对照组外，其他各组小鼠均于末次给药后2小时，按5ml/kg的剂量腹腔内注射0.3％CCl4橄榄油溶液，空白对照组等体积腹腔注射橄榄油溶剂。
2.3实验动物处理及标本采集
2.3.1 ALT、AST、ALB、GLB、TP的活性测定
小鼠造模后禁食不禁水，12h后采用摘眼球取血法获得血标本，血液静置2h后置于离心机中，4℃温度下转速为3000r/min离心10分钟，吸取上清液，用日立全自动生化分析仪检测ALT、AST、GLB、TP、ALB活性值，然后计算出白球比(A/G)。
2.3.2肝脏指数的计算
采血后处死小鼠，剖腹取肝组织。用生理盐水漂洗除去积血，擦拭后称重。肝脏指数的计算为：肝脏指数＝[肝脏重量(g)/体重(g)]×100％
2.3.3肝匀浆中MDA、SOD、GSH活性的测定
取肝脏组织，精密称定0.2g肝组织，加入九倍量预冷的0.9％氯化钠溶液中制成10％的肝匀浆液，匀浆液以4000r/min离心10分钟，取上清液。-20℃冷藏备用。按试剂盒说明书方法测定超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)的含量。组织中蛋白含量的测定按照考马斯亮蓝法。
2.3.4病理组织学观察
取小鼠左叶肝组织，立即固定于10％中性缓冲甲醛。70％、80％、90％、100％乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋后切片，常规脱蜡，HE染色，中性树胶封片。在显微镜下观察肝组织的组织病理学变化。
2.3.5免疫组化法测定肝组织MnSOD、BCL-2、Caspase-3蛋白的表达
2.3.5.1免疫组化法测定MnSOD蛋白的表达
每组分别取出10只小鼠肝组织切片，共6组。常规脱蜡至水；3％H2O2室温浸泡10min，PBS洗3次，每次5min；抗原修复：切片浸入0.01M枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)，微波炉加热至沸腾后断电，10min后反复一次，冷却后0.1MPBS洗涤2次，切片上滴加抗原修复液水浴箱37℃5～10min，0.1MPBS洗涤2次；加过氧化氢酶阻断液，室温孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶活性，PBS洗3次，每张片加1滴生物素标记的第二抗体；室温下孵育10min，PBS冲洗3次，每次5min；每张片加链霉菌抗生物素蛋白—过氧化酶，室温下10min，PBS冲洗3次，每次5min；每张片2滴新配制的DAB溶液，显微镜下3～10min钟观察显色情况，自来水冲洗；苏木素复染，自来水冲洗返蓝；脱水，透明中性树酯胶封固；正置显微镜镜下观察结果并拍照。用Image Pro Plus 6.0软件计算每张片的平均光密度值(mean density)，再进行统计学分析。
2.3.5.2免疫组化法测定BCL-2蛋白的表达
每组分别取出10只小鼠肝组织切片，共6组。常规脱蜡至水；3％H2O2孵育10min以消除内源性过氧化氢酶的活性，蒸馏水冲洗，PBS浸洗5min；滴加正常山羊血清封闭液室温孵育15min以消除背景非特异染色；滴加兔抗Bcl-2蛋白多克隆抗体，37℃孵育1h，PBS冲洗3次，每次5min；滴加生物素标记羊抗兔lgG，37℃孵育15min，PBS冲洗3次，每次5min；滴加辣根酶标记链霉卵白素，37℃孵育，15min PBS冲洗3次，每次5min；DAB显色，自来水充分冲洗，苏木素复染，封片。正置显微镜镜下观察结果并拍照。用Image Pro Plus 6.0软件计算每张片的平均光密度值(mean density)，再进行统计学分析。
2.3.5.3免疫组化法测定Caspase-3蛋白的表达
每组分别取出10只小鼠肝组织切片，共6组。常规二甲苯脱蜡，经梯度乙醇水化后灭活内源性酶，高压修复抗原，再经抗原抗体反应后，DAB室温显色，苏木素复染60s，返蓝，干燥，中性树胶封片，正置显微镜镜下观察。用Image Pro Plus 6.0软件计算每张片的平均光密度值(mean density)，再进行统计学分析。
2.3.6荧光定量PCR法检测肝组织中Nrf2,SOD的mRNA表达水平
1.RNA的提取
(1)称取小鼠肝脏0.1g，加iso plus试剂lml匀浆，静置5min，离心取上清，转移至1.5ml无RNAase的EP管中。
(2)每管中加入0.2ml氯仿，上下颠倒混匀，室温静置5min。以12000r/min于4℃离心机中离心1 5min，样品分为三层，下层为浅红色酚-氯仿层，中间层和无色上层水相，RNA即存在于水相中。一般水相占细胞匀浆液体积的60％左右。
(3)小心吸取上层水相约600μl移至另一无RNAase的EP管中，加入等体积的异丙醇，上下轻轻颠倒混匀，沉淀水相中的RNA，室温静置20min，于离心机内12000r/min、4℃离心10min。
(4)弃上清，加入0.1％DEPC水配制的75％乙醇约lml洗涤RNA沉淀，混匀后于离心机内12000r/min、4℃离心10min。重复一次。
(5)小心弃上清，超净台内吹干RNA沉淀，使乙醇完全挥发。加入40μl DEPC水，用移液枪充分吹打使沉淀溶解，待溶解完全后保存于-80℃冰箱备用。取1μl提取的总RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检查。
2.反转录反应
(1)反转录前用Thermo Scientific Nano Drop 2000/2000c微量紫外分光光度计测定总RNA纯度及浓度。
(2)按以下组分在冰上操作配制RT反应液，见表1。
表1 RT反应液的配制
*根据上述测定的RNA浓度，计算500ng的Total RNA的使用量。
(3)反转录反应条件:37℃15分钟(反转录反应)；85℃5秒(反转录酶的失活反应)。
(4)反转录后的cDNA分装后于-80℃冰箱保存或进一步荧光定量PCR反应,cDNA液的加入量不要超过PCR反应体积的1/10(v/v)量。
3.PCR反应
(1)PCR引物序列、稀释及储备液的制备:引物存管离心后,用DEPC处理水稀释成100pmol/μl的储备液,每lOμl分装于PCR管中-80℃保存备用。序列及稀释成储各液时加DEPC水的量，见表2。
表2引物序列及稀释
(2)PCR工作液的配制:取6个EP管,分别标记为Nrf2-F、Nrf2-R、SOD-F、SOD-R、β-actin-F、β-actin-R；每管加入上述储备液10μl，再加入9μlDEPC水后充分混勻,即制成10pmol/μl的工作液。
(3)按以下组分在冰上操作配制PCR反应液，见表3。
表3 PCR反应液的配制
*1通常引物终浓度为0.2μM可以得到较好结果。反应性能较差时,可以在0.1-1.0μM范围内调整引物
浓度。
*2在20μl的反应体系中，DNA模板的添加量通常在100ng以下。因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板添加量。另外，反转录反应的cDNA(RT反应液)作为模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10％。
(4)PCR条件:预变性:95℃30秒1个循环；PCR反应:95℃变性5秒,60℃退火复性34秒,扩增40个循环；最后72℃熔解10分钟。
(5)扩增目的基因时加入β-actin引物作为内参对照。
2.4统计学处理
实验数据均使用SPSS17.0统计软件进行分析，采用均数±标准差 表示。对实验数据的显著性检验采用单因素方差分析方法，先进行方差齐性检验，各组方差齐用LSD进行统计，若方差不齐，用Tamhaneg T2进行统计。P<0.05表示在统计学上有差异性，对P<0.01表示在统计学上有显著性差异。
3.实验结果
3.1解酒饮对CCl4致急性肝损伤小鼠的形态学观察
各组小鼠造模前状态良好，进食及饮水正常，黑褐色颗粒状大便，毛色润泽。造模后，除正常对照组以外，其余各组小鼠均不同程度表现为反应迟缓，少动，聚堆；其中以模型对照组最为明显，大便稀软或不成形，毛发蓬乱，不润泽。解酒饮各剂量组状态较模型对照组好转。解剖后，观察肝脏，正常对照组小鼠肝脏颜色鲜红，质地柔软；模型对照组小鼠肝脏体积增大，呈土黄色，质地变硬，或可见针尖样大小结节；解酒饮各剂量组小鼠肝脏形态介于正常对照组与模型对照组之间，保护效果明显。
3.2解酒饮对CCl4致急性肝损伤小鼠肝脏指数的影响
与正常对照组比较，模型对照组小鼠肝脏指数明显增高(P<0.05)。与模型对照组比较，解酒饮高剂量组可明显降低肝损伤小鼠肝脏指数(P<0.05)。见表4。
表4解酒饮对CCl4致急性肝损伤小鼠肝脏指数的影响(n＝10)
注：与正常对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与CCl4模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01
3.3解酒饮对CCl4致小鼠急性肝损伤生化指标ALT、AST的影响
通过生化仪测出血清数据显示，与正常组相比，模型组小鼠血清中ALT、AST的值升高(P<0.01)；说明该方法造模成功。与模型组对比，联苯双酯组小鼠血清中ALT、AST值下降(P<0.01)，解酒饮各剂量组小鼠血清中ALT值下降(P<0.01或P<0.05)，解酒饮高剂量组AST活性降低(P<0.05)。解酒饮中、低剂量组AST活性降低但无差别。这说明高剂量组解酒饮可能对CCl4所致的小鼠急性肝损伤有较明显的保护作用，结果见表5。
表5解酒饮对CCl4致小鼠急性肝损伤ALT、AST生化指标的影响(n＝10)
注：与正常对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与CCl4模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01
3.4解酒饮对CCl4致小鼠急性肝损伤ALB、GLB、TP生化指标的影响
肝细胞损害可影响TP与ALB合成。ALB减少常伴有GLB增加，ALB含量与有功能的肝细胞数量呈正比，ALB持续下降，提示肝细胞坏死进行性加重，预后不良。ALB与GLB比值(A/G)下降也是反应肝脏受到损伤的指标之一。从表2看，与模型组比较，尽管各组间ALB、GLB、TP、A/G差异无统计学意义的。但用解酒饮和联苯双酯治疗后，小鼠ALB、TP、A/G在数值上是回升的，GLB是下降的，这提示治疗可能有效果的，只是数值差别不是很大。结果见表6。
表6解酒饮对CCl4致小鼠急性肝损伤ALB、GLB、TP指标的影响(n＝10)
注：与正常对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与CCl4模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01
3.5解酒饮对CCl4致急性肝损伤小鼠肝匀浆SOD、MDA、GSH水平的影响
表7的结果表明，模型组肝匀浆MDA水平升高，同时，SOD、GSH的水平降低。给予高剂量解酒饮可以降低肝匀浆MDA水平的升高，低、中剂量组解酒饮对MDA水平无作用。中、高剂量组解酒饮可提高肝匀浆SOD、GSH水平，而低剂量组的解酒饮对SOD、GSH含量无显著影响。
表7解酒饮对CCl4致小鼠急性肝损伤MDA、SOD、GSH指标的影响(n＝10)
注：与正常对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与CCl4模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01
3.6解酒饮对肝组织病理组织学改变的影响
参考图1可知，正常组肝组织结构基本正常,清晰可见,肝细胞呈放射状排列整齐,细胞核圆形,核仁清晰,胞质内儿乎无脂滴。模型组模型组肝小叶中央静脉扩大,肝窦淤血和出血,肝细胞明显肿胀,弥漫性肝细胞脂肪变性。阳性对照组肝小叶的组织结构基本接近正常,肝细胞未见明显肿胀,肝细胞索排列整齐,但仍可见少量充血。低剂量组肝细胞肿胀,大量肝细胞脂肪变性。中剂量组中央静脉周围部分肝细胞脂肪变性,病变范围变小,肿胀程度减轻。高剂量组肝小叶排列较齐,未见明显的窦腔狭窄,偶见散在肝细胞脂肪变性肝组织病理学检查正常组小鼠肝小叶和细胞结构正常。模型组小鼠肝组织有更多的炎症和坏死和炎症细胞浸润，解酒饮治疗后，其症状均减轻。
3.7解酒饮对CCl4致急性肝损伤小鼠肝MnSOD、BCL-2、Caspase-3蛋白表达的影响
参考图2和表4，MnSOD是一种能够对抗氧化损伤的金属酶，它能催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，提高机体抗氧化能力。免疫组化切片染色可以看出，四氯化碳造模导致急性肝损伤的肝脏中MnSOD蛋白表达水平下降。与模型组相比较，解酒饮高剂量组的MnSOD表达升高(P<0.01)。这表明解酒饮可以上调MnSOD表达，提高肝脏抗氧化能力，起保护肝损伤作用。
参考图3和表4，四氯化碳造模能够引起肝细胞的凋亡。在细胞凋亡过程中，bcl-2家族的调控对减少细胞凋亡起着重要的作用。Bcl-2是细胞膜和细胞质受体，细胞核不着色，经免疫组化染色显示阳性细胞呈棕黄色的环形，阳性细胞越多，说明bcl-2蛋白表达越高。从图3和表4可以看出，与模型组相比，解酒饮高剂量组的bcl-2表达升高(P<0.01)。这提示解酒饮可以上调bcl-2蛋白表达的作用，减少细胞的凋亡。
从图4和表8可以看出，模型组肝细胞胞质内caspase-3呈棕黄色弥漫表达比较显著。caspase-3的表达水平在解酒饮各剂量组较模型组降低，其中，高剂量解酒饮caspase-3的表达下降最明显(P<0.01)。这提示高剂量组的解酒饮可以下调caspase-3蛋白表达的作用，减少细胞的凋亡。
表8解酒饮对小鼠肝MnSOD、BCL-2、Caspase-3平均光密度值比较(n＝10)
注：与正常对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与CCl4模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01
3.8荧光定量PCR检测肝组织中Nrf2、SODmRNA表达的变化
3.8.1 RNA纯度分析
280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了总RNA提取液中核酸、背景(溶液浑池度)、盐浓度和蛋白等有机物的值。一般的情况下,当OD260/OD280的值在1.8-2.0时,可认为RNA中蛋白或者其他有机物的污染是可以接受的,当比值<1.8时,说明溶液中蛋白或者其他有机物的污染比较明显。当比值>2.2时,说明RNA已经水解成了单核酸。因此OD260/OD280的比值可以反映所提取RNA的纯度。经微量紫外分光光度计分析,各组小鼠肺脏组织提取的总RNA的OD260/OD280比值的平均值均在1.8-2.2之间,符合实验要求。
3.8.2荧光定量RT-PCR产物的扩增曲线和溶解曲线
参考图5及图6，扩增曲线和溶解曲线可以分别反映扩增的效率及扩增产物的纯度。本实验中的扩增曲线表明扩增效率较高,熔解曲线说明扩增产物纯度较好。
3.8.3肝组织中Nrf2、SODmRNA表达的变化
表9显示,与模型组比较，解酒饮各剂量组和联苯双酯组肝组织屮Nrf2mRNA、SODmRNA表达的差异均无统计学意义。
表9解酒饮对CCl4致小鼠急性肝损伤Nrf2mRNA、SODmRNA表达的变化(n＝10)
注：与正常对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与CCl4模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01
4.讨论
CCl4能造成肝脏损伤。在肝脏中，CCl4经肝脏细胞色素P450激活，生成有毒性的三氯甲基自由基，破坏细胞膜结构，它自身的溶酶作用可造成肝细胞脂质过氧化损伤，诱导肝脏病理变化包括肝肿大和血清学变化，伴随着谷丙转氨酶(AST)，谷草转氨酶(ALT)活性的增加。因此血清AST和ALT活性被认为是肝损伤最敏感的生物学指标而被广泛应用于对肝损伤的判断。本实验选择CCl4复制动物模型。按5mL/kg腹腔注射0.3％CCl4橄榄油溶液12小时后，从生化指标结果分析，高剂量的解酒饮有可能抑制CCl4引发的小鼠ALT、AST活性的提高。从指标MDA、SOD、GSH结果发现，解酒饮高剂量组可以降低肝匀浆中升高的MDA水平和提高肝匀浆SOD和GSH水平，这提示解酒饮对CCl4肝损伤的保护作用与抗脂质过氧化和提高机体的抗氧化酶活性有关。
小鼠肝脏病理组织学检查中，正常组肝脏组织结构正常，肝细胞完整，肝细胞胞浆均匀，核仁清晰。模型组肝脏切片中则发现肝细胞肿大，胞浆疏松，细胞核固缩，脂肪空洞，汇管区炎症细胞浸润等现象。解酒饮各剂量组和阳性对照组较模型组炎症减轻，脂肪空泡减少，其中解酒饮高剂量组除了血管周围少量肝细胞肿胀之外，肝细胞排列较整齐。
MnSOD是一种能够对抗氧化损伤的金属酶，它能催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，提高机体抗氧化能力。本实验研究可以看出急性CCl4导致肝脏中MnSOD蛋白表达水平下降，而在给予解酒饮高剂量的药物后，MnSOD的表达水平上调(P<0.01)。所以解酒饮可能有抗氧化活性，通过抗氧化应激作用，起到较强的清除氧自由基作用，保护和修复肝细胞病理损伤，从而保护肝脏的结构和功能。
CCl4造模能够引起肝细胞的凋亡。细胞凋亡是复杂的分子调控过程，在凋亡信号调控中有3个关键的调控因素：Caspase家族、Bcl-2基因家族和线粒体。Caspase-3是Caspase家族中最重要的成员，它能在各种程序启动的凋亡程序中起最后枢纽的作用，也是凋亡发生的标志酶。Caspase-3表达增加，促进细胞的凋亡。本实验结果发现，模型组小鼠肝细胞胞质内Caspase-3表达强度显著高于正常组，联苯双酯组和解酒饮高剂量组Caspase-3表达降低(P<0.01)，表明解酒饮高剂量组可能通过降低Caspase-3表达，减少肝细胞凋亡。另外，Bcl-2家族相关基因的表达和调控是影响细胞凋亡的关键因素之一，Bcl-2基因是一种重要的凋亡抑制基因。Bcl-2表达增加，抑制细胞的凋亡。在细胞凋亡过程当中，Bcl-2家族蛋白参与线粒体自噬/细胞凋亡互调节及线粒体分裂，发挥抗凋亡作用。本实验免疫组化结果表明，解酒饮各剂量组小鼠肝组织中Bcl-2表达均高于模型组对照组(P<0.01)，Bcl-2主要分布于中央静脉及肝细胞坏死灶周。这提示，高剂量的解酒饮可能通过调节凋亡抑制基因Bcl-2从而起到保护肝脏的作用。
Nrf2是在1994年被发现的一种66000的蛋白质，当时是被作为结合在β-珠蛋白基因启动子NF-E2重复序列的因子，该转录因子是CNC转录因子家族的成员，含有一个基本亮氨酸拉链结构域。Nrf2是调节抗氧化应激反应的重要转录因子，Kelch样ECH相关蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein1,Keap1)是其特异性受体。正常情况下，在胞质内Keap1与Nrf2形成复合物以抑制Nrf2的活性。在氧化应激等情况下，Keap1与Nrf2解离，Nrf2发生核转位进入细胞核，与抗氧化反应元件(antioxidant response elements,ARE)结合，启动ARE调控的第Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶基因表达，增强细胞对氧化应激和亲核化合物的抗性。ARE调控的抗氧化基因有HO-1、SOD、NQO1等，这些酶能够保护机体免受活性氧的侵害。激活Keap1/Nrf2/ARE通路，促进SOD等基因的表达，可以减轻氧化损伤。研究表明，Nrf2具有保护肝脏作用。敲除Nrf2后导致肝内氧化应激水平增高，GSH、解毒酶、CAT、SOD水平降低、炎症因子、脂肪酸代谢相关酶、纤维化相关酶活性显著增高，肝病的发生和进展加速。所以抗氧化治疗可以减轻肝脏炎症和纤维化。实验结果从数值上看，解酒饮各剂量组和联苯双酯组肝组织屮Nrf2mRNA、SODmRNA表达均数比模型组均数高，比正常组均数低。可能因为样本量不够大，各组之间差异均无统计学意义。如果增大样本量，解酒饮有可能通过调节Nrf2/SOD通路发挥抗氧化作用。
从中医学的角度来看,急性肝损伤是归属“胁痛”、“黄疸”、“积聚”等范畴，本病邪侵正虚，脾胃功能受损。病理性质有虚实之分，治疗大法应清热解毒，益气利湿。解酒饮中葛根、枸杞子、葛花、山楂、甘草、女贞子皆具保护急性的肝脏损害的作用。丹参具有促进细胞组织的修复与再生，促进肝脏微循环的作用。女贞子明显改善肝脏损伤，抗肝纤维化，起到养肝功效。同时甘草渣中的黄酮类化合物具有良好的抗氧化活性，能保护正常细胞免受氧化损伤。而陈皮、党参对胃肠痉挛有抑制作用，还有抗胃酸分泌，保护胃粘膜，健脾益胃。葛根具有抗氧化作用，山楂对脑缺血再灌注后细胞凋亡具有明显保护作用，这样可以减轻因醉酒产生的头痛。此外枸杞子具有滋补阴，活血化瘀功效和保肝作用。根据中医理论，解酒饮具有醒脾养肝益胃、解酒毒、祛烦渴、理气止呕和升清阳而止头痛的功效。通过对实验数据的分析表明，解酒饮能降低脂质过氧化程度，提高人体的抗氧化酶活性，发挥对氧自由基的清除作用，保护氧化应激对肝细胞损伤的病理修复，从而保护肝功能。同时，解酒饮在一定程度上干预了肝细胞的凋亡的发生和发展，进而起到保护肝脏的作用。
<实例3>解酒饮对小鼠急性胃黏膜损伤的保护作用实验
1.材料和方法
1.1实验动物
昆明种健康小鼠60只：SPF级，雌雄各半，体质量18～22g，由广西医科大学动物中心提供，实验动物使用许可证：SCXK桂2014-0002，饲养环境温度为(23±2)℃，湿度为40％～60％。
1.2受试药物
本发明方法所制备的解酒饮
硫糖铝咀嚼片：江苏鹏鹞药业有限公司，批号：1501152，规格:0.25g/片。
1.3试剂与仪器
95％乙醇：成都市新都区木兰镇工业开发区，批号：2014041801；
NO一步法试剂盒：南京建成生物工程研究所，批号：20151104；
TNF-α试剂盒：北京诚林生物科技有限公司,批号:20151211；
IL-6试剂盒：北京诚林生物科技有限公司,批号:20151219；
PGE2试剂盒：北京东亚免疫技术研究所,批号:20041106；
ET-1试剂盒：北京东亚免疫技术研究所,批号:15092503；
BCA法蛋白定量测试盒：南京建成生物工程研究所，批号：20151126；
电子分析天平：型号：EL204，上海梅特勒一立托仪器公司；
酶标仪：型号：SpectraMaxPlus384，Bio-Rad公司；
Olympus生物显微镜：型号：CX31+DP73，日本奥林巴斯株式会社；
2方法
2.1药物的制备
高剂量组用药：解酒饮流浸膏1g/ml的浓度；
中剂量组用药：将解酒饮流浸膏用蒸馏水进行2倍稀释成0.5g/ml的浓度；
低剂量组用药：将解酒饮流浸膏用蒸馏水进行4倍稀释成0.25g/ml的浓度；
阳性药物的制备：硫糖铝咀嚼片2粒(规格0.25g，共60mg)研磨成粉末，用蒸馏水稀释至10ml，配制成浓度为0.006g/ml药物混悬液，用时新鲜配制，摇匀使用。
2.2酒精致小鼠急性胃黏膜损伤实验
2.2.1实验动物分组
健康的60只昆明种小鼠，4周龄，体重18～22g，适应性喂养一周后，随机分为模型对照组、空白对照组和解酒饮高、中、低剂量组及硫糖铝治疗组，每组10只,雄雌各半。
2.2.2给药及造模
实验前先禁食24小时，自由饮水。解酒饮组小鼠分别按生药25g/kg、12.5g/kg、6.25g/kg的剂量灌服解酒饮，硫糖铝治疗组小鼠按600mg/kg的剂量灌服硫糖铝咀嚼片制成的混悬液，模型组和空白对照组小鼠灌服同体积蒸馏水，每天一次，连续给药8天。在第7天给药后，禁食24小时。第8天用药2小时后，除空白对照组外，其他各组小鼠均按10ml/kg的剂量灌胃给予95％乙醇造模。
2.3实验动物处理及标本采集
2.3.1小鼠急性胃黏膜损伤指数和抑制率测定
小鼠于造模2h后颈椎脱臼处死，取出胃，沿胃大弯剪开，生理盐水漂洗干净，可见局限于胃黏膜的损伤病灶。置载玻片上，在10倍放大镜下，拍照并用游标卡尺测量病灶长度，按改良Guth标准计算损伤指数和抑制率：其中病灶长度﹤1mm为1分，1mm≤病灶长度﹤2mm为2分，2mm≤病灶长度﹤3mm为3分，3mm≤病灶长度﹤4mm为4分，若病灶长于4mm，则分段计分，病灶宽于2mm时，分数乘以2，最后以全胃病灶分数总和作为该动物胃黏膜损伤指数。损伤抑制率采用模型组平均损伤指数和用药组平均损伤指数之差所得的结果与模型组平均损伤指数的比值。
2.3.2小鼠胃黏膜ET-1、NO的含量测定
剪下损伤严重的胃黏膜0.1g，置于0.9ml的冰生理盐水中，冰浴下进行匀浆，3000r/min离心15min，取上清液体，即为10％的胃组织匀浆液体。根据试剂盒采用酶联免疫吸附法检测ET-1含量，一步法检测NO含量，并用蛋白含量校正。
2.3.3小鼠胃黏膜TNF-α、IL-6、PGE2含量测定
剪下损伤严重的胃黏膜0.1g，置于0.9ml的冰生理盐水中，冰浴下进行匀浆，3000r/min离心15min，取上清液体，即为10％的胃组织匀浆液体。采用酶联免疫吸附法对TNF-α、IL-6、PGE2含量测定，并用蛋白含量校正。
2.3.4小鼠胃黏膜病理组织学观察及评分
将损伤最严重的胃黏膜部位剪下来，立即固定于10％中性缓冲甲醛。70％、80％、90％、100％乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋后切片，常规脱蜡，HE染色，中性树胶封片。显微镜下观察胃黏膜的病理组织学的变化。评分方法：以充血、出血、黏膜细胞变性坏死在切片的整个黏膜上皮层的累及程度分为5级。充血权重为1，出血权重为2，上皮细胞变性坏死权重为3，评分标准及病变总积分公式见表10。
2.4统计学处理
实验数据均使用SPSS17.0统计软件进行分析，采用单因素方差分析方法，先进行方差齐性检验，各组方差齐用LSD进行统计，若方差不齐，用Tamhaneg T2进行统计。P<0.05则在统计学上有差异性，对P<0.01表示在统计学上有显著性差异。
表10小鼠急性胃黏膜损伤病理切片评分标准
3结果
3.1解酒饮对酒精致急性胃黏膜损伤小鼠的形态学观察
各组小鼠造模前状态良好，进食及饮水正常，黑褐色颗粒状大便，毛色润泽。造模后，除正常对照组以外，其余各组小鼠均不同程度表现先出现兴奋状态，在笼内奔跑，打斗，尔后见四肢瘫软、行走不稳、卧倒酣睡等中枢抑制状态，或直接进入中枢抑制状态。其中以模型对照组最为明显，解酒饮各剂量组状态较模型对照组好转。
3.2解酒饮对小鼠急性胃黏膜损伤指数的影响
表11显示，解酒饮中、高剂量组的胃黏膜损伤指数分别为12.00±6.68、6.40±3.438，与模型组33.40±14.32比较，均下降。解酒饮低剂量组损伤指数为16.10±9.55，然而其损伤指数下降不显著(P＞0.05)。解酒饮中、高剂量组损伤指数下降差别有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。这提示解酒饮中、高剂量组可以显著降低胃黏膜的损伤指数来保护胃黏膜。
表11解酒饮对小鼠急性胃黏膜损伤的影响
注：与正常对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与CCl4模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01
3.3解酒饮对小鼠急性胃黏膜损伤胃水肿指数的影响
与正常对照组比较，模型对照组小鼠水肿指数明显增高(P<0.01)。与模型对照组比较，硫糖铝组、解酒饮中高剂量组可明显降低胃黏膜损伤小鼠胃水肿指数(P<0.01)。见表12。
表12解酒饮对小鼠急性胃黏膜损伤胃水肿指数的影响(n＝10)
注：与正常对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与CCl4模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01
3.4解酒饮对小鼠胃黏膜ET-1、NO含量的影响
与正常组比较，模型组小鼠在95％乙醇造模2小时后，胃黏膜ET-1含量升高(P<0.01)。与模型组比较，解酒饮中、高剂量组和硫糖铝治疗组ET-1含量明显降低(P<0.05或P<0.01)，而低剂量组ET-1含量也有所下降，但是差异无统计学意义。这表明中、高剂量组解酒饮通过降低ET-1含量来保护胃黏膜作用。
模型组小鼠胃黏膜与正常组相比，NO含量降低(P＜0.01)。解酒饮高剂量组、硫糖铝治疗组的NO含量比模型组升高(P<0.05)。解酒饮低、中剂量组NO含量较模型组升高，但差异无统计学意义。这表明高剂量组解酒饮通过升高NO含量来保护胃黏膜作用。见表13。
表13解酒饮对小鼠胃黏膜ET-1、NO含量的影响(n＝10)
注：与正常对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与CCl4模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01
3.5解酒饮对小鼠胃黏膜TNF-α、IL-6、PGE2含量的影响
与正常组比较，模型组小鼠胃黏膜TNF-α含量升高(P<0.01)。与正常组比较，模型组胃黏膜组织中的TNF-α含量升高(P＜0.01)。与模型组比较，硫糖铝治疗组和解酒饮中、高剂量组TNF-α含量明显降低(P<0.05)。这表明中、高剂量组解酒饮通过降低TNF-α含量来保护胃黏膜。
模型组与正常组相比，小鼠胃黏膜IL-6含量升高(P＜0.01)。解酒饮中、高剂量组和硫糖铝治疗组的IL-6含量比模型组的降低(P<0.05)。这提示中、高剂量组解酒饮通过降低IL-6含量来保护胃黏膜。与正常组比较，模型组小鼠胃黏膜PGE2的值下降(P<0.05)。与模型组相比，PGE2的含量在解酒饮各剂量组均增加，但差异无统计学意义。见表14。
表14解酒饮对小鼠胃黏膜TNF-α、IL-6、PGE2含量的影响(n＝10)
注：与正常对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与CCl4模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01
3.6肉眼观察小鼠急性胃黏膜损伤的情况
参考图7，在10倍的放大倍率下，与正常组对比，模型组小鼠胃黏膜表面可见明显的出血、糜烂、点状溃疡。与模型组对比，解酒饮高、中、低剂量组和硫糖铝治疗组出血、糜烂、溃疡较少，解酒饮高剂量组对胃黏膜保护最好。
3.7解酒饮对胃黏膜病理组织学改变的影响
参考图8，在光镜下观察病理组织切片，模型组胃黏膜充血肿胀并脱落，损伤严重，可见大量炎细胞浸润，血管扩大，通透性增加。硫糖铝治疗组和解酒饮各剂量组胃黏膜损伤脱落减轻，炎细胞浸润较少，血管通透性改变较少。
4讨论
高浓度的乙醇是诱发急性胃黏膜损伤的常见物质。95％乙醇入胃后可以直接损伤细胞，破坏胃黏膜-碳酸氢盐屏障，出现胃黏膜上皮细胞肿胀，氧自由基生成增加，并可致胃酸增多，胃蛋白酶增加等，在胃中，攻击因子增强，使胃黏膜防御功能降低了，由一定浓度酒精引发的胃黏膜组织损害，与氧自由基和胃血流量的降低有关。NO作为一种内源性血管扩张剂，对血管舒缩功能和血液的流动性有着重要调节作用,可以有效地增加胃血管的血流，以保持黏膜的完整性和黏膜的防御功能。NO可以对ET-1的产物和效应产生影响，反过来，ET-1又可以对NO的产物和效应产生影响。这表明NO浓度的增高对ET-1起负反馈作用。其机制可能与NO促进eGMP生成而抑制ET-1生成有关,NO也可拮抗ET-1的血管反应。在血管反应中,ET-1可增加内皮细胞NO的生成,这次促进的反应可以作为负反馈机制调节ET-1诱导的血管收缩反应，抑制ET-1的生产。因此ET-1、NO是作为急性胃黏膜损伤的重要观察指标。本实验结果显示，解酒饮各剂量组损伤抑制率分别为模型对照组的51.8％、64.1％、80.8％，提示解酒饮可以明显减轻95％乙醇所致的小鼠胃黏膜损伤指数。解酒饮中、高剂量组可以降低小鼠急性酒精性胃黏膜损伤过程中胃组织ET-1含量的异常增高，并可以使胃黏膜降低的NO水平回升。通过增加胃黏膜NO含量、降低ET-1含量，增加胃黏膜血管的血流量,改善胃黏膜血液循环障碍,增强胃黏膜防御能力和屏障功能。
乙醇致胃黏膜损伤后，可导致中性粒细胞活化，激活中性粒细胞可产生大量自由基，对胃黏膜有损伤作用。TNF-α主要由活化的单核-巨噬细胞产生，它能促进白细胞尤其是中性粒细胞活化，诱导中性粒细胞黏附,释放氧自由基与过氧化物酶,导致胃血流减少，胃血供的影响进而加重了黏膜的损伤，甚至形成溃疡。IL-6主要由T、B细胞和单核巨噬细胞分泌的细胞因子，在炎症和免疫调节过程中发挥着重要的作用。体内的IL-6水平升高可导致胃粘膜组织的炎症。IL-6因子可通过诱导磷脂酶-2基因的表达刺激TNF-α因子的产生，在炎症的发生发展中，TNF-α、IL-6在胃黏膜损伤以及炎症的发生共同起协同作用。本实验结果显示,模型组小鼠胃黏膜组织TNF-α、IL-6含量显著高于正常组,说明TNF-α、IL-6的升高与胃黏膜损害有关。解酒饮中、高剂量组和硫糖铝治疗组与模型组相比,TNF-α、IL-6含量则明显下降,显示解酒饮中、高剂量组可通过有效降低TNF-α、IL-6含量,减轻胃黏膜的炎性损伤。
PGE2对胃黏膜起着重要的作用，它保护胃黏膜的机制主要通过抑制胃酸分泌和胃泌素的分泌，另一方面可以它还可以促进黏液和碳酸氢盐分泌。PGE2在胃黏膜保护机制中发挥重要作用,PGE2一方面通过抑制胃酸及胃泌素的分泌保护胃黏膜，另一方面可以促进碳酸氢钠和黏液的分泌，前列腺素受体可以供及胃丰富的营养物质，加强胃的防御能力。但实验结果显示，解酒饮对小鼠急性酒精性胃黏膜损伤过程中胃黏膜PGE2水平的降低无明显上升作用，提示解酒饮保护胃黏膜作用可能不是通过直接上调PGE2含量来发挥作用。
综上所述，按生药12.5g/kg、25g/kg给予解酒饮，可对小鼠急性酒精性胃黏膜损伤模型，能降低胃黏膜血管的通透性，通过局部血液供应促进抗酒精损伤，提高抗氧化能力和清除氧自由基，减轻酒精对血管内皮细胞结构的破坏作用。
实例2-3的研究数据表明，本发明对肝脏和胃黏膜具有良好的保护作用。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (10)

1.一种用于保护肝脏和保护胃黏膜的解酒饮，其特征在于，所述解酒饮制备原料组成包括：枳梖子10-20重量份、丹参5-15重量份、葛根10-20重量份、党参10-20重量份、陈皮10-20重量份、枸杞子10-20重量份、葛花10-20重量份、山楂5-15重量份、甘草5-15重量份、女贞子10-20重量份；
所述各原料配比均以含水率不超过7％的干重计算，所述解酒饮的制备方法为：将各原料按重量配比混合均匀装入纱布包中，辐照灭菌，将纱布包浸入相当于药材总重八倍量的清水浸泡0.5-1h，以大火煮沸后改文火煎煮1h，取出药包沥干后再浸入相当于药材总重八倍量的清水中，以大火煮沸后改文火煎煮1h，取出药包沥干，将两次煎煮的药液合并，在80℃的水浴上进行减压浓缩，压力值为-0.08pa，调整浓缩液为含量相当于含生药1g/ml的流浸膏。
2.如权利要求1所述的用于保护肝脏和保护胃黏膜的解酒饮，其特征在于，枳梖子20重量份、丹参10重量份、葛根15重量份、党参10重量份、陈皮10重量份、枸杞子10重量份、葛花10重量份、山楂5重量份、甘草10重量份、女贞子10重量份。
3.如权利要求1所述的用于保护肝脏和保护胃黏膜的解酒饮，其特征在于，所述枳梖子、丹参、葛根、党参、陈皮、山楂、甘草经粗粉机粉碎，粉碎后的粒度为0.27-0.55cm。
4.如权利要求1所述的用于保护肝脏和保护胃黏膜的解酒饮，其特征在于，所述中药原料装入纱布包时，所述中药原料体积占纱布包容积的1/3-1/2。
5.如权利要求1所述的用于保护肝脏和保护胃黏膜的解酒饮，其特征在于，将纱布包抽线封口后，整理纱布包使药材平铺为1-2cm厚，采用紫外线辐照杀菌。
6.如权利要求1所述的用于保护肝脏和保护胃黏膜的解酒饮，其特征在于，每次取出药包时，用少量清水冲洗药包后沥干，冲洗和沥出的药液回收入煎煮药液中，每次冲洗所用水量不超过1/5的干药总重量。
7.如权利要求1所述的用于保护肝脏和保护胃黏膜的解酒饮，其特征在于，所述药液经过减压浓缩后，放入60℃烘箱内烘干24h之后置于容量瓶中用水稀释定容为含量相当于含生药1g/ml的流浸膏。
8.如权利要求1所述的用于保护肝脏和保护胃黏膜的解酒饮，其特征在于，所述解酒饮可以将流浸膏于棕色容器中密封保存，所述解酒饮也可以经过喷雾干燥制成颗粒，以便于包装并方便服用。
9.如权利要求1所述的用于保护肝脏和保护胃黏膜的解酒饮，其特征在于，所述流浸膏用法及用量为：可于饮酒餐前服用或饮酒餐后服用，成人每天服用量按体重计为1.25g/Kg，分三次服用。
10.如权利要求1所述的用于保护肝脏和保护胃黏膜的解酒饮，其特征在于，所述解酒饮可以用于制备具有醒酒、解酒、保肝、护胃等功效的药品或食品。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108392528A (zh) * 2018-05-02 2018-08-14 暨南大学 具有醒酒和护肝肾作用的中药雾化剂及其制备方法与应用
CN113533706A (zh) * 2021-08-12 2021-10-22 大理大学 紫地榆总鞣质对鼠急性胃溃疡保护作用的实验方法及应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102727661A (zh) * 2012-07-18 2012-10-17 张立峰 一种解酒保肝护肝胶囊及其制备方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102727661A (zh) * 2012-07-18 2012-10-17 张立峰 一种解酒保肝护肝胶囊及其制备方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108392528A (zh) * 2018-05-02 2018-08-14 暨南大学 具有醒酒和护肝肾作用的中药雾化剂及其制备方法与应用
CN108392528B (zh) * 2018-05-02 2020-06-16 暨南大学 具有醒酒和护肝肾作用的中药雾化剂及其制备方法与应用
CN113533706A (zh) * 2021-08-12 2021-10-22 大理大学 紫地榆总鞣质对鼠急性胃溃疡保护作用的实验方法及应用

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