CN108541591A - 一种莲藕脱毒组织培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种莲藕脱毒组织培养方法，包括如下步骤：（1）选材：选取无腐无病害、健壮莲藕块茎；（2）催芽：将选取好的莲藕块茎进行催芽；（3）表面处理；（4）切割；（5）初代培养；（6）增殖继代；（7）生根；（8）驯化炼苗：将根系发达的莲藕无菌小苗采用半干半湿苔藓包住根部，放于苗钵中，转移至小温棚中进行驯化。本发明的有益效果是：本发明对影响莲藕组培苗快繁的培养基、培养温度和光照时间及炼苗方法等开展了研究，成功地解决了脱毒、种性退化和提高繁殖系数的问题，提高了产品产量和品质，实现莲藕出口创汇和农民的增收。

Description

一种莲藕脱毒组织培养方法

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体的说涉及一种莲藕脱毒组织培养方法。

背景技术

莲藕是睡莲科多年生水生草本植物，是中国广泛栽培的特色水生蔬菜和重要的出口创汇蔬菜之一。

近年来，我国莲藕的种植面积不断扩大，产品日益畅销于国外市场，但由于莲藕长期以来一直通过根茎进行无性繁殖，其繁殖系数较低，需种量多，成本高，且容易发生种性退化现象，病虫害的发生也有日益严重的趋势，严重影响了产品产量和品质，也限制了生产的进一步扩大，影响了我国的出口创汇和农民的增收。

因此,克服种性退化、改善莲藕品质、提高莲藕的繁殖系数,已成为当前莲藕生产上迫切需要解决的问题。许多无性繁殖的植物已经通过组织培养的方法成功地解决了脱毒、种性退化和提高繁殖系数的问题。对莲藕的组织脱毒技术己有成功的研究报道,但对莲藕组培苗的简易高效快繁技术尚少见报道。目前鲜见莲藕组织培养方法的专利报道，扬州大学谢科硕士毕业论文《莲藕组培苗高效扩繁技术的研究》中初步探讨了莲藕的组织培养方法，但多数研究仅在实验室阶段，不能解决实际生产过程中的问题，具有一定的局限性。

发明内容

本发明的目的是为克服上述莲藕组织培养的缺陷，对莲藕的脱毒组织培养方法进行系统的研究，经过大量实验，得到一种操作简便、提高莲藕产量与品质的培养方法。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种莲藕脱毒组织培养方法，包括：

（1）选材：春季或秋季选取无腐无病害、健壮莲藕块茎；

（2）催芽：将选取好的莲藕块茎放置于20~28℃环境中直至得到有苞叶和芽体的莲藕块，春季选取的莲藕块茎如果已经有苞叶和芽体则不需要进行此步骤；

（3）表面处理：对莲藕进行修剪，去掉大的苞叶和杆茎，修剪成一芽一杆的外植体，用自来水对其进行冲洗，滴入洗洁精冲洗15~20min，流水冲洗，直至将洗洁精冲洗干净；将莲藕外植体浸入75%酒精中处理1~5min，随后采用次氯酸钠溶液消毒15~20min，用无菌水冲洗干净；

（4）切割：去掉外侧苞叶，去掉杆茎，保留0.5~1cm外植体；

（5）初代培养：将步骤（4）得到的外植体接种到培养基Ⅰ上，放置于温度25~28℃、每天光照12~20h、光照强度为2500~3500Lux、培养40~60d；

（6） 增殖继代：选取步骤（5）中得到的无菌苗将其接种到培养基Ⅱ上进行增殖培养，培养条件为：温度25~28℃、每天光照10~16h、光照强度为6000~9000Lux、培养25~35d；重复上述增殖过程；

（7）生根：选取长势健壮的莲藕无菌苗，将其接种至培养基Ⅲ中，放置于温度25~28℃、每天光照12~20h、光照强度为7000~9000Lux的环境中，培养20~30d；

（8）驯化炼苗：将步骤（7）得到的根系发达的莲藕无菌苗根部清洗干净，采用半干半湿苔藓包住根部，放置于苗钵中，转移到小温棚中进行驯化，遮荫，保持小温棚中温度为25~28℃，湿度维持在85%以上，此后湿度逐渐减低，直至新叶长出后移植到淤泥中；；

其中：培养基Ⅰ为WPM培养基中添加1.0~3.0mg/LTDZ、0.5~2.0mg/LNAA、0.5~2g/L活性炭、0.5~3g/L蛋白胨、25~35g/L蔗糖和3~4g/L琼脂；

培养基Ⅱ为WPM培养基中添加0.1~2.0mg/LTDZ、0.1~1.0mg/LNAA、25~35g/L蔗糖、3~4g/L琼脂、0.5~2g/L活性炭和1~5g/L蛋白胨；

培养基Ⅲ为WPM培养基中添加0.1~1.0mg/LNAA、0.1~0.6mg/LIBA、25~35g/L蔗糖和3~4g/L琼脂；

作为优化的，所述一种莲藕脱毒组织培养方法，包括：

（1）选材：春季或秋季选取无腐无病害、健壮莲藕块茎；

（2）催芽：将选取好的莲藕块茎放置于20~28℃环境中直至得到有苞叶和芽体的莲藕块，春季选取的莲藕块茎如果已经有苞叶和芽体则不需要进行此步骤；

（3）表面处理：对莲藕进行修剪，去掉大的苞叶和杆茎，修剪成一芽一杆的外植体，用自来水对其进行冲洗，滴入洗洁精冲洗15~20min，流水冲洗，直至将洗洁精冲洗干净；将莲藕外植体浸入75%酒精中处理1~5min，随后采用5%次氯酸钠溶液消毒15~20min，用无菌水冲洗干净；

（4）切割：去掉外侧苞叶，去掉杆茎，保留0.5~1cm外植体；

（5）初代培养：将步骤（4）得到的外植体接种到培养基Ⅰ上，放置于温度25~26℃、每天光照16h、光照强度为3000Lux、培养50d；

（6） 增殖继代：选取步骤（5）中得到的无菌苗将其接种到培养基Ⅱ上进行增殖培养，培养条件为：温度25~26℃、每天光照14h、光照强度为7000~9000Lux、培养30d；重复上述增殖过程；

（7）生根：选取长势健壮的莲藕无菌苗，将其接种至培养基Ⅲ中，放置于温度25~26℃、每天光照16h、光照强度为7000~8000Lux的环境中，培养25d；

（8）驯化炼苗：将步骤（7）得到的根系发达的莲藕无菌苗根部清洗干净，采用半干半湿苔藓包住根部，放置于苗钵中，转移到小温棚中进行驯化，遮荫，保持小温棚中温度为25~28℃，湿度维持在85%以上，此后湿度逐渐减低，直至新叶长出后移植到淤泥中；

作为优化的，所述培养基Ⅰ为WPM培养基中添加2.0mg/LTDZ、1.0mg/LNAA、1g/L活性炭、2g/L蛋白胨、30g/L蔗糖和3.5g/L琼脂；

作为优化的，所述培养基Ⅱ为WPM培养基中添加1.0mg/LTDZ、0.5mg/LNAA、30g/L蔗糖、3.5g/L琼脂、1g/L活性炭和3g/L蛋白胨；

作为优化的，所述培养基Ⅲ为WPM培养基中添加0.5mg/LNAA、0.2mg/LIBA、30g/L蔗糖和3.5g/L琼脂；

作为优化的，所述培养基Ⅰ、培养基Ⅱ和培养基Ⅱ的pH均被调节至5.8。

作为优化的，所述步骤（3）次氯酸钠溶液浓度为3~7%。

作为优化的，所述步骤（7）中莲藕根为6~10条，长度10~20cm。

作为优化的，所述步骤（8）中，组织培养苗从培养瓶中取出后，前期维持小温棚内湿度为90%以上，此后逐渐递减，7d后渐渐递减至80%，依次降低，培养1~2月后，新叶长出移植到淤泥中。

WPM培养基是1981年由Lloyd和McCown为山月桂茎尖培养专业设计，根据MS培养基改良而来，相对MS培养基而言，使用了硫酸钾替换了硝酸钾，硝酸铵的含量也降低到了MS培养基的1/4，氮盐也主要以硝酸钙的形式供应。

苯基脲衍生物(TDZ)：已被广泛用于植物组织培养形态发生的高效生物调节剂，它能诱导外植体从愈伤组织形成到体细胞胚胎发生的一系列不同反应，具有生长素和细胞分裂素双重作用的特殊功能。许多研究报告指出TDZ通过调节内源植物生长激素起作用，或者是诱导逆境产生起间接作用，它还能调节细胞膜结构、能量水平、营养吸收和同化作用。

活性炭：可以降低组织培养物的有害代谢浓度，对细胞生长有利。活性炭为木炭粉碎经加工形成的粉末结构，它结构疏松，孔隙大，吸水能力强，有很强的吸附作用，它的颗粒大小决定着吸附能力，粒度越小其吸附能力越大。它可以吸附非极性物质和色素等大分子物质，包括琼脂中所含的杂质，培养物分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5-羟甲基糖醛及激素等。

蛋白胨是将肉、酪素或明胶用酸或蛋白酶水解后干燥而成的外观呈淡黄色的粉剂，具有肉香的特殊气息。蛋白胨作为培养基的一种原料提供氮源和维生素。

吲哚丁酸（IBA）： 植物生长调节剂，用于细胞分裂和细胞增生，促进草本和木本植物的根的分生。

萘乙酸(NAA)：是促进植物根系生长的植物生长调节剂，也是萘乙酰胺的中间体。萘乙酸用作植物生长调节剂，具有促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根，增加坐果，防止落果等，可随营养流输导到作用部位。

琼脂：琼脂的最有用特性是它的凝点和熔点之间的温度相差很大。它在水中需加热至95℃时才开始熔化，熔化后的溶液温度需降到40℃时才开始凝固，所以它是配制固体培养基的最好凝固剂。用琼脂配制的固体培养基，可用以进行高温培养而不熔化，在凝固之前接种时，也不致将培养物烫死。因此，琼脂是制备各种生物培养基中应用最广泛的一种凝固剂。

蔗糖：蔗糖除供能之外，还能诱导愈伤组织组织的再分化； 培养基高温灭菌时，蔗糖更稳定且不容易碳化；植物细胞中含有蔗糖转化酶，蔗糖能更好地维持培养基内的低渗环境，蔗糖形成的渗透压可较长时间地保持相对稳定，可在一定程度上减少微生物的污染。

本发明的有益效果是：

1.莲藕通过组织培养，可以起到脱毒、快繁、种质资源保存、品质改良的作用，大幅度提高了莲藕质量和品质，扩大了莲藕的种植规模。

2．确定了组织培养中控制分化、继代生长、生根等的培养基成分，研究确定了生长调节物质的种类、浓度以及培养条件的最佳优化选择，攻克了莲藕组织培养过程中的技术壁垒，达到很好的培养效果。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件，除非特别说明，比例和百分比基于重量。

本发明实施例所用原料均为市售，各实施例所述培养基Ⅰ、培养基Ⅱ和培养基Ⅱ的pH均被调节至5.8。

实施例1，一种莲藕脱毒组织培养方法，包括：

（1）选材：春季或秋季选取无腐无病害、健壮莲藕块茎；

（2）催芽：将选取好的莲藕块茎放置于20~28℃环境中直至得到有苞叶和芽体的莲藕块，春季选取的莲藕块茎如果已经有苞叶和芽体则不需要进行此步骤；

（3）表面处理：对莲藕进行修剪，去掉大的苞叶和杆茎，修剪成一芽一杆的外植体，用自来水对其进行冲洗，滴入洗洁精冲洗20min，流水冲洗，直至将洗洁精冲洗干净；将莲藕外植体浸入75%酒精中处理1min，随后采用3%次氯酸钠溶液消毒18min，用无菌水冲洗干净；

（4）切割：去掉外侧苞叶，去掉杆茎，保留0.5~1cm外植体；

（5）初代培养：将步骤（4）得到的外植体接种到培养基Ⅰ上，放置于温度25~28℃、每天光照20h、光照强度为2500Lux、培养50d；培养基Ⅰ为WPM培养基中添加2.0mg/LTDZ、2.0mg/LNAA、0.5g/L活性炭、2g/L蛋白胨、35g/L蔗糖和3g/L琼脂；

（6） 增殖继代：选取步骤（5）中得到的无菌苗将其接种到培养基Ⅱ上进行增殖培养，培养条件为：温度25~28℃、每天光照16h、光照强度为6000Lux、培养30d；重复上述增殖过程；培养基Ⅱ为WPM培养基中添加1.0mg/LTDZ、1.0mg/LNAA、25g/L蔗糖、3.5g/L琼脂、2g/L活性炭和1g/L蛋白胨；

（7）生根：选取长势健壮的莲藕无菌苗，将其接种至培养基Ⅲ中，放置于温度25~28℃、每天光照20h、光照强度为7000Lux的环境中，培养25d；培养基Ⅲ为WPM培养基中添加0.5mg/LNAA、0.6mg/LIBA、25g/L蔗糖和3.5g/L琼脂，得到根系发达的莲藕无菌小苗；

（8）驯化炼苗：将步骤（7）得到的根系发达的莲藕无菌苗根部清洗干净，采用半干半湿苔藓包住根部，放置于苗钵中，转移到小温棚中进行驯化，遮荫，保持小温棚中温度为25~28℃，湿度维持在90%，此后湿度逐渐减低，7d后湿度降低至80%，直至新叶长出后移植到淤泥中。

实施例2 一种莲藕脱毒组织培养方法，包括：

（1）选材：春季或秋季选取无腐无病害、健壮莲藕块茎；

（2）催芽：将选取好的莲藕块茎放置于20~28℃环境中直至得到有苞叶和芽体的莲藕块，春季选取的莲藕块茎如果已经有苞叶和芽体则不需要进行此步骤；

（3）表面处理：对莲藕进行修剪，去掉大的苞叶和杆茎，修剪成一芽一杆的外植体，用自来水对其进行冲洗，滴入洗洁精冲洗18min，流水冲洗，直至将洗洁精冲洗干净；将莲藕外植体浸入75%酒精中处理5min，随后采用5%次氯酸钠溶液消毒15min，用无菌水冲洗干净；

（4）切割：去掉外侧苞叶，去掉杆茎，保留0.5~1cm外植体；

（5）初代培养：将步骤（4）得到的外植体接种到培养基Ⅰ上，放置于温度25~28℃、每天光照16h、光照强度为3500Lux、培养40d；培养基Ⅰ为WPM培养基中添加1.0mg/LTDZ、1.0mg/LNAA、2g/L活性炭、0.5g/L蛋白胨、30g/L蔗糖和4g/L琼脂；

（6） 增殖继代：选取步骤（5）中得到的无菌苗将其接种到培养基Ⅱ上进行增殖培养，培养条件为：温度25~28℃、每天光照14h、光照强度为9000Lux、培养25d；重复上述增殖过程；培养基Ⅱ为WPM培养基中添加0.1mg/LTDZ、0.5mg/LNAA、35g/L蔗糖、3g/L琼脂、1g/L活性炭和5g/L蛋白胨；

（7）生根：选取长势健壮的莲藕无菌苗，将其接种至培养基Ⅲ中，放置于温度25~28℃、每天光照16h、光照强度为9000Lux的环境中，培养20d；培养基Ⅲ为WPM培养基中添加0.1mg/LNAA、0.3mg/LIBA、35g/L蔗糖和3g/L琼脂，得到根系发达的莲藕无菌小苗；

（8）驯化炼苗：将步骤（7）得到的根系发达的莲藕无菌苗根部清洗干净，采用半干半湿苔藓包住根部，放置于苗钵中，转移到小温棚中进行驯化，遮荫，保持小温棚中温度为25~28℃，湿度维持在85%，此后湿度逐渐减低，7d后湿度降低至80%，直至新叶长出后移植到淤泥中。

实施例3 一种莲藕脱毒组织培养方法，包括：

（1）选材：春季或秋季选取无腐无病害、健壮莲藕块茎；

（2）催芽：将选取好的莲藕块茎放置于20~28℃环境中直至得到有苞叶和芽体的莲藕块，春季选取的莲藕块茎如果已经有苞叶和芽体则不需要进行此步骤；

（3）表面处理：对莲藕进行修剪，去掉大的苞叶和杆茎，修剪成一芽一杆的外植体，用自来水对其进行冲洗，滴入洗洁精冲洗15min，流水冲洗，直至将洗洁精冲洗干净；将莲藕外植体浸入75%酒精中处理3min，随后采用7%次氯酸钠溶液消毒20min，用无菌水冲洗干净；

（4）切割：去掉外侧苞叶，去掉杆茎，保留0.5~1cm外植体；

（5）初代培养：将步骤（4）得到的外植体接种到培养基Ⅰ上，放置于温度25~28℃、每天光照12h、光照强度为3000Lux、培养60d；培养基Ⅰ为WPM培养基中添加3.0mg/LTDZ、0.5mg/LNAA、1g/L活性炭、3g/L蛋白胨、25g/L蔗糖和3.5g/L琼脂；

（6） 增殖继代：选取步骤（5）中得到的无菌苗将其接种到培养基Ⅱ上进行增殖培养，培养条件为：温度25~28℃、每天光照10h、光照强度为7500Lux、培养35d；重复上述增殖过程；培养基Ⅱ为WPM培养基中添加2.0mg/LTDZ、0.1mg/LNAA、30g/L蔗糖、4g/L琼脂、0.5g/L活性炭和3g/L蛋白胨；

（7）生根：选取长势健壮的莲藕无菌苗，将其接种至培养基Ⅲ中，放置于温度25~28℃、每天光照12h、光照强度为8000Lux的环境中，培养30d；培养基Ⅲ为WPM培养基中添加1.0mg/LNAA、0.1mg/LIBA、30g/L蔗糖和4g/L琼脂，得到根系发达的莲藕无菌小苗；

（8）驯化炼苗：将步骤（7）得到的根系发达的莲藕无菌苗根部清洗干净，采用半干半湿苔藓包住根部，放置于苗钵中，转移到小温棚中进行驯化，遮荫，保持小温棚中温度为25~28℃，湿度维持在90%，此后湿度逐渐减低，7d后湿度降低至80%，直至新叶长出后移植到淤泥中。

实施例4

一种莲藕脱毒组织培养方法，包括：

（1）选材：春季或秋季选取无腐无病害、健壮莲藕块茎；

（2）催芽：将选取好的莲藕块茎放置于20~28℃环境中直至得到有苞叶和芽体的莲藕块，春季选取的莲藕块茎如果已经有苞叶和芽体则不需要进行此步骤；

（3）表面处理：对莲藕进行修剪，去掉大的苞叶和杆茎，修剪成一芽一杆的外植体，用自来水对其进行冲洗，滴入洗洁精冲洗18min，流水冲洗，直至将洗洁精冲洗干净；将莲藕外植体浸入75%酒精中处理2min，随后采用5%次氯酸钠溶液消毒16min，用无菌水冲洗干净；

（4）切割：去掉外侧苞叶，去掉杆茎，保留0.5~1cm外植体；

（5）初代培养：将步骤（4）得到的外植体接种到培养基Ⅰ上，放置于温度25~28℃、每天光照16h、光照强度为3000Lux、培养50d；培养基Ⅰ为WPM培养基中添加2.0mg/LTDZ、1.0mg/LNAA、1g/L活性炭、2g/L蛋白胨、30g/L蔗糖和3.5g/L琼脂；

（6） 增殖继代：选取步骤（5）中得到的无菌苗将其接种到培养基Ⅱ上进行增殖培养，培养条件为：温度25~28℃、每天光照14h、光照强度为8000Lux、培养30d；重复上述增殖过程；培养基Ⅱ为WPM培养基中添加1.0mg/LTDZ、0.5mg/LNAA、30g/L蔗糖、3.5g/L琼脂、1g/L活性炭和3g/L蛋白胨；

（7）生根：选取长势健壮的莲藕无菌苗，将其接种至培养基Ⅲ中，放置于温度25~28℃、每天光照16h、光照强度为7500Lux的环境中，培养25d；培养基Ⅲ为WPM培养基中添加0.5mg/LNAA、0.2mg/LIBA、30g/L蔗糖和3.5g/L琼脂，得到根系发达的莲藕无菌小苗；

（8）驯化炼苗：将步骤（7）得到的根系发达的莲藕无菌苗根部清洗干净，采用半干半湿苔藓包住根部，放置于苗钵中，转移到小温棚中进行驯化，遮荫，保持小温棚中温度为25~28℃，湿度维持在95%，此后湿度逐渐减低，7d后湿度降低至80%，直至新叶长出后移植到淤泥中。

实施例1~4中初代培养得到的莲藕无菌苗为4~7cm；增殖继代过程中莲藕无菌苗为增殖过程，莲藕无菌苗增多，高度为6~12cm；生根步骤莲藕无菌苗长成根系发达的无菌小苗，根的条数为6~10条，长度为10~20cm，能够确保炼苗环节根部附着力好，且能避免移植时根部受到损伤。经过此莲藕脱毒组织培养方法得到的莲藕苗成活率在99%以上，莲藕产量和品质都有大幅度的提高。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种莲藕脱毒组织培养方法，其特征在于：包括：

（1）选材：春季或秋季选取无腐无病害、健壮莲藕块茎；

（2）催芽：将选取好的莲藕块茎放置于20~28℃环境中直至得到有苞叶和芽体的莲藕块，春季选取的莲藕块茎如果已经有苞叶和芽体则不需要进行此步骤；

（3）表面处理：对莲藕进行修剪，去掉大的苞叶和杆茎，修剪成一芽一杆的外植体，用自来水对其进行冲洗，滴入洗洁精冲洗15~20min，流水冲洗，直至将洗洁精冲洗干净；将莲藕外植体浸入75%酒精中处理1~5min，随后采用次氯酸钠溶液消毒15~20min，用无菌水冲洗干净；

（4）切割：去掉外侧苞叶，去掉杆茎，保留0.5~1cm外植体；

（5）初代培养：将步骤（4）得到的外植体接种到培养基Ⅰ上，放置于温度25~28℃、每天光照12~20h、光照强度为2500~3500Lux、培养40~60d；

（6） 增殖继代：选取步骤（5）中得到的无菌苗将其接种到培养基Ⅱ上进行增殖培养，培养条件为：温度25~28℃、每天光照10~16h、光照强度为6000~9000Lux、培养25~35d；重复上述增殖过程；

（7）生根：选取长势健壮的莲藕无菌苗，将其接种至培养基Ⅲ中，放置于温度25~28℃、每天光照12~20h、光照强度为7000~9000Lux的环境中，培养20~30d；

（8）驯化炼苗：将步骤（7）得到的根系发达的莲藕无菌苗根部清洗干净，采用半干半湿苔藓包住根部，放置于苗钵中，转移到小温棚中进行驯化，遮荫，保持小温棚中温度为25~28℃，湿度维持在85%以上，此后湿度逐渐减低，直至新叶长出后移植到淤泥中；；

其中：培养基Ⅰ为WPM培养基中添加1.0~3.0mg/LTDZ、0.5~2.0mg/LNAA、0.5~2g/L活性炭、0.5~3g/L蛋白胨、25~35g/L蔗糖和3~4g/L琼脂；

培养基Ⅱ为WPM培养基中添加0.1~2.0mg/LTDZ、0.1~1.0mg/LNAA、25~35g/L蔗糖、3~4g/L琼脂、0.5~2g/L活性炭和1~5g/L蛋白胨；

培养基Ⅲ为WPM培养基中添加0.1~1.0mg/LNAA、0.1~0.6mg/LIBA、25~35g/L蔗糖和3~4g/L琼脂。

2.根据权利要求1所述一种莲藕脱毒组织培养方法，其特征在于：包括：

（1）选材：春季或秋季选取无腐无病害、健壮莲藕块茎；

（2）催芽：将选取好的莲藕块茎放置于20~28℃环境中直至得到有苞叶和芽体的莲藕块，春季选取的莲藕块茎如果已经有苞叶和芽体则不需要进行此步骤；

（3）表面处理：对莲藕进行修剪，去掉大的苞叶和杆茎，修剪成一芽一杆的外植体，用自来水对其进行冲洗，滴入洗洁精冲洗15~20min，流水冲洗，直至将洗洁精冲洗干净；将莲藕外植体浸入75%酒精中处理1~5min，随后采用次氯酸钠溶液消毒15~20min，用无菌水冲洗干净；

（4）切割：去掉外侧苞叶，去掉杆茎，保留0.5~1cm外植体；

（5）初代培养：将步骤（4）得到的外植体接种到培养基Ⅰ上，放置于温度25~26℃、每天光照16h、光照强度为3000Lux、培养50d；

（6） 增殖继代：选取步骤（5）中得到的无菌苗将其接种到培养基Ⅱ上进行增殖培养，培养条件为：温度25~26℃、每天光照14h、光照强度为7000~9000Lux、培养30d；重复上述增殖过程；

（7）生根：选取长势健壮的莲藕无菌苗，将其接种至培养基Ⅲ中，放置于温度25~26℃、每天光照16h、光照强度为7000~8000Lux的环境中，培养25d；

（8）驯化炼苗：将步骤（7）得到的根系发达的莲藕无菌苗根部清洗干净，采用半干半湿苔藓包住根部，放置于苗钵中，转移到小温棚中进行驯化，遮荫，保持小温棚中温度为25~28℃，湿度维持在85%以上，此后湿度逐渐减低，直至新叶长出后移植到淤泥中。

3.根据权利要求1所述一种莲藕脱毒组织培养方法，其特征在于：所述培养基Ⅰ为WPM培养基中添加2.0mg/LTDZ、1.0mg/LNAA、1g/L活性炭、2g/L蛋白胨、30g/L蔗糖和3.5g/L琼脂。

4.根据权利要求1所述一种莲藕脱毒组织培养方法，其特征在于：所述培养基Ⅱ为WPM培养基中添加1.0mg/LTDZ、0.5mg/LNAA、30g/L蔗糖、3.5g/L琼脂、1g/L活性炭和3g/L蛋白胨。

5.根据权利要求1所述一种莲藕脱毒组织培养方法，其特征在于：所述培养基Ⅲ为WPM培养基中添加0.5mg/LNAA、0.2mg/LIBA、30g/L蔗糖和3.5g/L琼脂。

6.根据权利要求1所述一种莲藕脱毒组织培养方法，其特征在于：所述培养基Ⅰ、培养基Ⅱ和培养基Ⅱ的pH均被调节至5.8。

7.根据权利要求1所述一种莲藕脱毒组织培养方法，其特征在于：所述步骤（3）次氯酸钠溶液浓度为3~7%。

8.根据权利要求1所述一种莲藕脱毒组织培养方法，其特征在于：所述步骤（7）中莲藕根为6~10条，长度10~20cm。

9.根据权利要求1所述一种莲藕脱毒组织培养方法，其特征在于：所述步骤（8）中，莲藕苗采用半干半湿苔藓包住根部，放置于苗钵中，转移到小温棚中，前期维持小温棚内湿度为90%以上，此后逐渐递减，7d后渐渐递减至80%，依次降低，培养1~2月后，新叶长出移植到淤泥中。