CN101361457B - 一种膏桐离体叶片植株再生的方法 - Google Patents

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本发明属于植物组织培养中的一项苗木生产应用技术，具体来说是通过组织培养中不定芽的直接诱导来进行大规模生产膏桐组培苗的方法，包括无菌苗的获得，不定芽诱导，不定芽增殖，不定芽的生根培养，生根苗的炼苗与移栽，通过调整激素浓度和配比，使得膏桐离体叶片不经过愈伤组织便可直接产生不定芽，大大地提高了其遗传性状的稳定性；此外，缩短了不定芽产生的时间，而且出芽率高，达到了90％以上，对膏桐今后的大面积扩繁具有重要的利用价值。

Description

一种膏桐离体叶片植株再生的方法
技术领域
本发明属于植物组织培养中的一项苗木生产应用技术，具体来说是通过组织培养中不定芽的直接诱导来进行大规模生产膏桐组培苗的方法。
背景技术
膏桐(Jatropha curcas L.)又名小桐子、麻疯树、黑皂树、木花生、油芦子、老胖果等，属大戟科(Eu-phobiaceae)麻疯树属(Jatropha)落叶灌木或小乔木，高2～5m；根系十分发达，老干灰褐色，小枝灰绿至嫩绿色；单叶互生，卵圆形，长宽近相等，3～5裂或不分裂，叶柄长达15cm；花单性，雌雄同株，排列成腋生或顶生的聚伞花序；种子椭圆形，长18～20mm，直径11mm。在气温较高的地区一般年开花结实2次，环境好的地方可常年开花。
膏桐喜光、喜暖热气候；具有很强的抗旱、耐贫瘠的特性，能在石砾质土、粗质土、石灰岩裸露地生长。处于野生状况的膏桐，生长迅速，生命力强，广泛分布于热带和亚热带地区。膏桐作为一种我国南方山区民间应用的木本油料树种，也是化工、轻工的原料植物，在工业、农业、环保及生态建设上都有应用。目前膏桐作为生物能源树种正在大力开发，2006年6月云南省林业厅组织编制了《云南省林木生物质能源——生物柴油原料林发展规划》，规划期为10年(2006——2015年)，总体目标：培育以膏桐为主的1000万亩原料林基地。因此采用传统的播种和扦插育苗很难在短时间内满足膏桐大面积推广种植的需要，而采用组织培养的方式可以有效地满足其需求。目前关于膏桐组织培养技术的报道是通过茎段或顶芽等离体器官诱导愈伤组织后再诱导出不定芽，但通过离体器官诱导出愈伤组织后再进行不定芽的诱导，脱分化所需的时间较长，而且纯愈伤诱导出来的不定芽遗传性状容易产生变异。
发明内容
本发明的目的在于提供一种脱分化所需时间短，得到的芽苗数量多，且诱导出来的不定芽遗传性状相对纯愈伤出芽方式较为稳定的膏桐植株再生的方法。
本发明方法主要包括无菌苗的获得，不定芽诱导，不定芽增殖，不定芽的生根培养，生根苗的炼苗与移栽，其特征在于各步骤具体如下：
(1)选种，催芽，消毒后取种胚接种于MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.05mg/L培养基上，光强为1000-3000Lux，光照时间12小时每天，温度在25-28℃间，7天后便可得到生长健壮的无菌苗；
(2)取无菌苗的叶片，接种在MS+6-BA1.0mg/L+KT1.0mg/L+NAA0.03mg/L的培养基上，光强为1000-3000Lux，光照时间12小时每天，温度在25-28℃间，25天后便可在叶片上直接产生大量的不定芽；
(3)将获得的嫩芽转接到增殖培养基MS+6-BA0.5mg/L+KT0.5mg/L+NAA0.05mg/L上，20天后便又可生成更多的不定芽，光照时间12小时每天，光强为1000-3000Lux，温度在25-28℃间；
(4)将经过反复转接后的不定芽切下，转至生根培养基MS+NAA0.1-0.3mg/L上，15天后便开始生根。光强为3000-5000Lux，光照时间12小时每天，温度在25-28℃间；
(5)将生根苗在自然光照条件下，过渡一星期，取出生根苗，洗净沾附在小苗根部的培养基，用0.02mg/LNAA的溶液浸泡1分钟，便可移栽到经过灭菌的基质当中。
本发明通过调整激素浓度和配比，使得膏桐离体叶片不经过愈伤组织便可直接产生不定芽，大大地提高了其遗传性状的稳定性；此外，缩短了不定芽产生的时间，而且出芽率高，达到了90％以上，对膏桐今后的大面积扩繁具有重要的利用价值。
具体实施方式
实施例：
所选用的膏桐种子，为云南省大理州宾川县一株性状较为优良的单株上采得，炼苗于2007年5月份在西南林学院的温室大棚内进行，步骤如下：
(1)先用洗衣粉将种子清洗干净，在流水下冲洗20分钟，之后用40度始温的无菌水催芽1小时。去种壳，用75％的酒精消毒30秒，无菌水漂洗一次，再用2％的次氯酸钠消毒11分钟，用无菌水冲洗4-5次，无菌滤纸吸干，再将种子在酒精灯火焰上烧3-5秒，之后取种胚接种于MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.05mg/L培养基上，光强为1000-3000Lux，每天光照12小时，温度26℃间，接种后第三天，胚便开始萌动，7天后长成健状的小苗，且无菌率达100％。
(2)将无菌苗的叶片切成不规则的形状，接种于MS+6-BA1.0mg/L+KT1.0mg/L+NAA0.03mg/L的培养基上，叶的背面与培养基相接触，其培养条件与上同。接种10天后，叶片开始卷曲，切口边缘有少量的愈伤组织形成，20天后可见少量的绿色芽点，其叶片的不定芽诱导率达90％以上，再经过5-10天的培养，芽点逐渐形成小芽丛。
(3)将芽丛切割，转接到增殖培养基MS+6-BA0.5mg/L+KT0.5mg/L+NAA0.05mg/L上，20天后又可在芽丛的周围形成大量的芽点，如此反复，待芽增殖到一定数量后，便可将一部分高度大于1cm以上的芽接种到生根培培养基上。
此外，可以将分化得到的无菌苗，取叶片，重复步骤(2)后，同样也可以诱导出大量的不定芽，从而避免后期再用种子消毒来得到无菌苗。
(4)生根培养基为MS+NAA0.1—0.3mg/L上，光强3000-5000Lux。15天后可见白色的根系长出，数量2-5条不等。当根长至2cm时，移到自然光下炼苗，炼苗期间将瓶口透气膜松动以利于透气。
(5)炼苗1星期后，取出洗净附在小苗根部的培养基，用0.02mg/LNAA的溶液浸泡1分钟，之后移栽到消毒过的河沙基质中，覆盖塑料膜保湿。此期间每天透气1-3次，每隔1星期喷洒低浓度的多菌灵溶液和MS溶液一次，到第5天后逐渐揭去透气膜。随着时间的延长，到第10天开始延长其透气时间，15天后揭去塑料膜，20天后转入正常管理，30天后的苗木保存活率达90％以上。

Claims (1)

1.一种膏桐离体叶片植株再生的方法，包括无菌苗的获得，不定芽诱导，不定芽增殖，不定芽的生根培养，生根苗的炼苗与移栽，其特征在于各步骤具体如下：
(1)选种，催芽，消毒后取种胚接种于MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.05mg/L培养基上，光强为1000-3000Lux，光照时间12小时每天，温度在25-28℃间，7天后便可得到生长健壮的无菌苗；
(2)取无菌苗的叶片，接种在MS+6-BA1.0mg/L+KT1.0mg/L+NAA0.03mg/L的培养基上，光强为1000-3000Lux，光照时间12小时每天，温度在25-28℃间，25天后便可在叶片上直接产生大量的不定芽；
(3)将获得的嫩芽转接到增殖培养基MS+6-BA0.5mg/L+KT0.5mg/L+NAA0.05mg/L上，20天后便又可生成更多的不定芽，光照时间12小时每天，光强为1000-3000Lux，温度在25-28℃间；
(4)将经过反复转接后的不定芽切下，转至生根培养基MS+NAA0.1-0.3mg/L上，15天后便开始生根，光强为3000-5000Lux，光照时间12小时每天，温度在25-28℃间；
(5)将生根苗在自然光照条件下，过渡一星期，取出生根苗，洗净沾附在小苗根部的培养基，用0.02mg/LNAA的溶液浸泡1分钟，便可移栽到经过灭菌的基质当中。
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