CN108535388A

CN108535388A - 一种血清中孕二醇-3-葡糖醛酸含量的液相色谱串联质谱测定方法

Info

Publication number: CN108535388A
Application number: CN201810768440.XA
Authority: CN
Inventors: 胡清源; 陈建; 侯宏卫; 陈欢; 罗彦波; 何昀潞
Original assignee: National Tobacco Quality Supervision and Inspection Center
Current assignee: National Tobacco Quality Supervision and Inspection Center
Priority date: 2018-07-13
Filing date: 2018-07-13
Publication date: 2018-09-14

Abstract

一种血清中孕二醇‑3‑葡糖醛酸含量的液相色谱串联质谱测定方法，其特征在于：是将血清样品经除蛋白后引入液相色谱‑电喷雾电离‑串联质谱仪进行测定，采用外标法定量分析物，可快速、准确检测出血清中孕二醇‑3‑葡糖醛酸的含量水平。本发明为全新的血清中孕二醇‑3‑葡糖醛酸含量的测定方法，串联质谱法更好的提高了方法的选择性与准确性，孕二醇‑3‑葡糖醛酸的定量限为0.05 ng/mL，方法的回收率范围是95.5‑99.4.0%，RSD＜2.1%。通过色谱柱以及洗脱条件的选择与优化，较好的提高了色谱分离过程，缩短了色谱分析的时间，仅为15 min。本发明的优点在于：测定结果准确、灵敏度高、测定干扰少。

Description

一种血清中孕二醇-3-葡糖醛酸含量的液相色谱串联质谱测定方法

技术领域：

本发明属于血液的理化检验技术领域，具体说是一种采用液相色谱-电喷雾电离-串联质谱仪测定血清中孕二醇-3-葡糖醛酸含量的方法。

背景技术：

孕酮主要由黄体和胎盘分泌，是主要天然存在的人类孕激素。其水平异常会对生殖、神经发育和免疫系统造成影响。孕酮通过孕激素受体作用，它属于核激素受体超家族，并在甲状腺癌和乳腺癌中表达异常。以往的研究表明，孕激素受体很少在甲状腺髓样癌中表达，而孕激素受体表达的免疫组化评估有助于预测甲状腺乳头状癌患者的预后。甲状腺癌（Thyroid carcinoma， TCC）是世界范围内常见的内分泌恶性肿瘤，与过去几十年的死亡率下降相比，其发病率稳步上升。因此，血清孕酮检测方法的建立可能对甲状腺癌的预后有一定的指导作用。而孕酮被认为在不同的女性体内的代谢/排泄方式并不相同，因此有必要开发一种用于评估孕酮生成的方法。其中孕二醇-3-葡糖醛酸（pregnanediol-3-glucuronide，PDG，结构如下）是孕酮的主要代谢物，有研究表明其可以作为排卵的生物标志物。

以前的测定PDG的方法通常是酶免疫测定法（EIA），通过与辣根过氧化物酶进行非特异性结合并检测。EIA被广泛应用于各种行业的药品诊断和质量控制措施，但也存在一些缺陷，主要为抗体或抗原的非特异性结合易引起假阳性结果。因此，PDG的测定需要高度灵敏、特异的方法。LC-MS/MS以其优异的灵敏度和特异性被广泛用于公共卫生领域的激素定量研究，可将目标分析物与大量的内源性基质成分通过色谱柱进行有效分离。综合考虑这些原因，LC-MS/MS或可成为PDG分析的替代方法。样品直接除蛋白通过LC-MS/MS来测定血清中PDG含量的方法还未见报道。

发明内容：

本发明的目的旨在克服现有技术缺陷，建立一种简单、快速、特异性好、灵敏度高的测定血清中孕二醇-3-葡糖醛酸（PDG）含量的LC-MS/MS方法，该方法能快速、准确检测血清中PDG的含量，测定结果准确、测定干扰少。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种血清中PDG含量的液相色谱串联质谱测定方法，具体包括以下步骤：

a、血清在4˚C下解冻，离心以后，然后移取100 µL血清于1.5 mL的离心管中；

b、加入300 µL甲醇，涡旋30 s，4˚C离心15 min（15000×g），吸取200 µL上清于含内插管的色谱瓶中，待液相色谱串联质谱进行分析；

c、标准工作液配制：用浓度50%的甲醇水溶液配制不同浓度的PDG标准工作溶液，浓度分别为0.5、1、2、8、40和100 ng/mL。

d、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定，吸取上述配制好的不同浓度的标准工作溶液，注入LC-MS/MS系统，PDG的线性方程为y=10500x+143000，其中Y代表分析物的峰面积，X表示样品中目标分析物的浓度，相关系数r大于0.9990，对样品待测液进行测定，测得分析物的峰面积，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量。

液相色谱条件为：采用XSelect^TM HSS T3 column色谱柱，规格150 mm × 2. 1mm，2.5 μm，流动相：溶剂A：0.1%甲酸水溶液，溶剂B：乙腈∶水∶甲酸=95∶5∶0.1，流动相流速为300 μL/min，梯度洗脱，分析时间为15 min，进样量为5 μL。梯度洗脱条件：0-2 min，10%B-10%B；2-6min，10%B-90%B；6-11min，90%B-90%B；11-13min，90%B-10%B，13-15min，10%B-10%B。

串联质谱检测器的条件：电喷雾离子源，多反应监测正离子扫描方式；电喷雾电压：-4500V, 雾化气：-70 psi, 气帘气：-20 psi, 辅助加热气：-70 psi，射入电压：10 V，离子源温度：400˚C，驻留时间：200 ms；PDG所选择的定量离子对、定性离子对分别为495.3→112.9和495.3→377.3。

本发明方法的线性范围和检出限：

用50%甲醇水溶液配制系列标准曲线，PDG标准工作溶液浓度分别为0.5、1、2、8、40和100 ng/mL。化合物的线性良好，相关系数均大于0.9990。利用信噪比的方法计算定量限和检出限，目标峰10倍信噪比对应的浓度为定量限，3倍信噪比对应的浓度为检出限。PDG的定量限分别为0.05 ng/mL，检测限为0.01 ng/mL。

本发明方法加标回收率和重复性：

采用基质加标准品的方法测定方法的回收率。选取六个血清样本，混合均匀后测定其含量为19.6 ng/mL，选取低、中和高三个添加水平加入标准品，每个浓度平行做3个重复，得到方法的回收率和精密度（以相对标准偏差（RSD）计）,见表1，方法的回收率范围是95.5-99.4%，RSD＜6.8%。

。

本发明的方法克服了现有技术灵敏度低的不足，针对血清样本对LC-MS/MS的相关检测条件进行了优化，主要优化了离子源条件，色谱柱以及流动相体系。与现有技术相比具有如下优势：

① 本方法前处理简便，不需要经过复杂的抗体孵育过程，大大缩短了样品处理时间，具有快速、准确、灵敏度高及重复性好的优点。

② 与EIA相比，该方法特异性好，灵敏度高，能够将PDG从分子量相同且结构相似的复杂基质中有效分离，且分析时间短，仅为15 min，缩短了分析时间。

综上，本发明为全新的血清中PDG含量的测定方法，串联质谱法更好的提高了方法的特异性与灵敏度，PDG的定量限分别为0.05 ng/mL，方法的回收率范围是95.5-99.4%，RSD＜6.8%。通过色谱柱以及洗脱条件的选择与优化，较好的提高了色谱分离过程，缩短了色谱分析的时间，为15 min。

附图说明

图1. PDG的标准品色谱图，

图2.实际血清样本色谱图。

具体实施方式

本发明以下结合实例做进一步描述，但并不是限制本发明。

实例1：

1．仪器与试剂：安捷伦1200 液相色谱（美国安捷伦公司），配有G1329A 自动进样器，G1311A 四元混合泵和G1316A，柱温箱；API 4000三重四级杆串联质谱仪（美国应用生物系统公司），配有电喷雾离子源（ESI）和analyst 1.5软件数据处理系统。

PDG标准品以购自Sigma-Aldrich公司，纯度大于96%；甲酸和乙腈均为色谱纯，实验中所用水为去离子水。

2．样品处理：血清在4˚C下解冻，离心以后，然后移取100 µL血清于1.5 mL的离心管中，加入300 µL甲醇，涡旋30 s，4˚C离心15 min（15000×g），吸取200 µL上清于含内插管的色谱瓶中，待LC-MS/MS进行分析。

3．测定方法：吸取标准溶液（标准工作溶液浓度分别为0.5、1、2、8、40和100 ng/mL和稀释过滤后的样品各5 µL，注入LC-MS/MS系统进行分离分析，测得样本中PDG的含量。

实例2：按实施例1所述的测定方法，选取8个血清样本，测得其PDG的含量如表2所示。

表2 样品中PDG的含量水平（ng/mL）

序号	PDG	序号	PDG
				1	159.2	5	8.52
2	149.6	6	9.44
				3	63.6	7	8.72
4	31.72	8	4.72

其中1-4号样本为健康女性志愿者的血清样本，5-8号为甲状腺癌患者血清样本。甲状腺癌患者血清中的PDG水平较健康志愿者低。PDG可能作为甲状腺癌的一个潜在的生物标志物。下一步将扩大样本量，并通过该方法进行检测，分别制定在健康人群和甲状腺癌患者人群血清中PDG的水平区间。

Claims

1.一种血清中孕二醇-3-葡糖醛酸含量的液相色谱串联质谱测定方法，其特征在于：包括以下步骤：

b、加入300 µL甲醇，涡旋30 s，4˚C离心，吸取200 µL上清于色谱瓶中，待液相色谱串联质谱进行分析；

c、标准工作溶液配制：用50%甲醇水溶液配制不同浓度的孕二醇-3-葡糖醛酸标准工作溶液；

d、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定，吸取上述配制好的不同浓度的标准工作溶液，注入LC-MS/MS系统，孕二醇-3-葡糖醛酸的线性方程为y=10500x+143000，其中Y代表分析物的峰面积，X表示样品中目标分析物的浓度，相关系数r大于0.9990，对样品待测液进行测定，测得分析物的峰面积，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量；

液相色谱条件：采用XSelect^TM HSS T3 column色谱柱，规格150 mm × 2. 1 mm，2.5 μm，流动相：溶剂A：0.1%甲酸水溶液，溶剂B：乙腈∶水∶甲酸=95∶5∶0.1，流动相流速为300 μL/min，梯度洗脱，分析时间为15 min，进样量为5 μL；

串联质谱检测器条件：电喷雾离子源，多反应监测正离子扫描方式；电喷雾电压：-4500V, 雾化气：-70 psi, 气帘气：-20 psi, 辅助加热气：-70 psi，射入电压：10 V，离子源温度：400˚C，驻留时间：200 ms；孕二醇-3-葡糖醛酸所选择的定量离子对、定性离子对分别为495.3→112.9和495.3→377.3。

2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤b中的离心条件如下：在15000×g，15 min。

3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤c中，孕二醇-3-葡糖醛酸标准工作溶液浓度分别为0.5、1、2、8、40和100 ng/mL。

4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：在d步骤中，梯度洗脱条件：0-2 min，10%B-10%B；2-6min，10%B-90%B；6-11min，90%B-90%B；11-13min，90%B-10%B，13-15min，10%B-10%B。