CN108531476B - 一种通过冷冻干燥浓缩质粒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种通过冷冻干燥浓缩质粒的方法，包括以下步骤：按照小提质粒试剂盒要求提取质粒，最终用100μLddH2O洗脱到1.5mL EP管中；使用超微量分光光度计NANO DROP测量质粒浓度；将测量好的质粒打开盖子封上一层封口膜，放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥；同一种质粒用定量的ddH2O重溶，保证双蒸水充分接触到干燥后质粒液体形成的薄膜，且完全将该薄膜溶解；用超微量分光光度计NANO DROP测量质粒浓度；对比冷冻干燥前后质粒体，浓度和质量的变化，整理数据，统计前后质粒浓度体积变化的规律。本发明的方法稳定性强，该方法也同样适用于其他浓度较低的核酸产物的浓缩。

Description

一种通过冷冻干燥浓缩质粒的方法
技术领域
本发明属于生物业技术领域，涉及一种通过冷冻干燥浓缩质粒的方法。
背景技术
分子生物学技术中一些环节，如：双酶切、核酸回收、连接等对目的质粒浓度要求较高，但是用柱式质粒DNA小量抽提试剂盒中提取质粒的过程中，常常由于质粒自身的低拷贝数、洗脱液用量不易掌控(洗脱液用量过大会导致浓度较小；洗脱液用量过小致使洗脱效率降低)等因素，所得质粒浓度和量常常达不到理想标准，故需要对其进行浓缩。现有技术中，质粒浓缩过程中，成本高，易受污染，方法稳定性较差。
现实应用中，急需一种稳定性强，成本低，易操作且得率高的浓缩质粒的方法。
发明内容
本发明的目的在于，提出了一种通过冷冻干燥浓缩质粒的方法，该方法具有稳定性强，成本低，易操作且得率高的优点，适合推广应用。
其技术方案如下：
一种通过冷冻干燥浓缩质粒的方法，包括以下步骤：
步骤1.按照小提质粒试剂盒要求提取质粒，菌液收集量3-5mL，最终用100μLddH2O洗脱到经过121℃，30min高压蒸汽灭菌处理的1.5mL EP管中；
步骤2.使用超微量分光光度计NANO DROP测量质粒浓度，记录单位为ng/μL；测量过后盖好盖子放置-20℃冰箱冷冻处理1-2h；提前打开真空冷冻干燥机，使冷阱温度下降至-55℃：
步骤3.将冷冻处理好的质粒移至超净工作台，打开盖子封上一层封口膜，并将其余部分包裹好，用牙签在封口膜上戳开3-4个小洞，防止质粒液体溅出，同时可以平衡管内外压强，处理好质粒，此时冷阱温度下降至-55℃，立即放入冷冻干燥机中，密封好干燥箱，关闭通气阀门，打开真空泵，使干燥箱中压强达到15Pa左右，冷冻干燥6h；
步骤4.6h之后取出，掀掉封口膜，盖上盖子，拿到超净工作台中，用定量的ddH2O重溶同一种质粒，保证双蒸水充分接触到干燥后质粒液体形成的一层薄膜，且完全将该薄膜溶解；溶解后标记号，用超微量分光光度计NANO DROP测量质粒浓度，记录单位为ng/μL；并记录参数OD260/OD280；
步骤5.对比冷冻干燥前后质粒体积、浓度和质量的变化，整理数据，统计前后质粒浓度体积变化的规律。
进一步，步骤2中，如果洗脱液大于100μL，冻干时低压沸腾过程会溅出封口膜，需分装，使最终每个1.5mLEP管中溶液体积≤100μL。
进一步，步骤4中，参数OD260/OD280＝1.8。
本发明的有益效果为：
本发明通过冷冻干燥浓缩质粒的方法浓缩之后质粒序列未发生改变且没有受到污染，说明该方法稳定性强，该方法也同样适用于其他浓度较低的核酸产物的浓缩，本发明具有稳定性强，成本低，易操作且得率高的优点，适合推广应用。
附图说明
图1是本发明实施例的流程示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
材料与仪器：含有目的质粒的菌液，质粒小提试剂盒，封口膜，牙签，1.5mLEP管，记号笔，双蒸水，超微量分光光度计NANODROP，冷冻干燥机，超净工作台，-20℃冰箱，高压灭菌锅，电子分析天平，移液枪。
方法与步骤：
1.按照小提质粒试剂盒要求提取质粒，菌液收集量3-5mL，最终用100μLddH2O洗脱到经过121℃，30min高压蒸汽灭菌处理的1.5mL EP管中。
2.使用超微量分光光度计NANO DROP测量质粒浓度，记录单位为ng/μL。测量过后盖好盖子放置-20℃冰箱冷冻处理1-2h。(注意：若洗脱液大于100μL，冻干时低压沸腾过程会溅出封口膜，故需分装，使最终每个1.5mLEP管中溶液体积不得超过100μL)。提前打开真空冷冻干燥机，使冷阱温度下降至-55℃。
3.将冷冻处理好的质粒移至超净工作台，打开盖子封上一层封口膜，并将其余部分包裹好，用牙签在封口膜上戳开3-4个小洞，防止质粒液体溅出，同时可以平衡管内外压强，处理好质粒，此时冷阱温度下降至-55℃，立即放入冷冻干燥机中，密封好干燥箱，关闭通气阀门，打开真空泵，使干燥箱中压强达到15Pa左右，冷冻干燥6h。
4. 6h之后取出，掀掉封口膜，盖上盖子，拿到超净工作台中，用定量的ddH2O重溶同一种质粒，保证双蒸水充分接触到干燥后质粒液体形成的一层薄膜，且完全将该薄膜溶解。溶解后标记号，用超微量分光光度计NANO DROP测量质粒浓度，记录单位为ng/μL。并记录参数OD260/OD280(≈1.8)。
5.对比冷冻干燥前后质粒体积、浓度和质量的变化，整理数据，统计前后质粒浓度体积变化的规律。如表1所示。
表1
Figure BSA0000162196200000041
Figure BSA0000162196200000051
如图1所示的具体操作流程示意图(以pET-28a-205为例)：
实验数据显示，浓缩后质粒浓度均有提高，且浓缩前后关系如下：
Figure BSA0000162196200000052
Cn：浓缩后质粒浓度(ng/μL)；C：未浓缩质粒浓度(ng/μL)；a：浓缩倍数
以pET-28a-205为例：
干燥前质粒浓度c1＝39.79ng/μL；c2＝34.79ng/μL
干燥前体积为：200μL；干燥后体积为100μL；a＝200/100＝2
Cn＝[(c1+c2)·100]/100＝[(39.79ng/μL+34.79ng/μL)·100]/100＝74.58ng/μL(理论浓度)≈71.53ng/μL(实际浓度)
(操作过程中对核酸的轻微损耗和少量丢失会影响到浓缩后质粒的真正浓度)
故，通过以上实验数据表明，该方法真实可行，简单方便，是实验室快速浓缩低浓度质粒的可行性较高的方法。
经过后期试验结果表明，通过这种方法浓缩之后质粒序列未发生改变且没有受到污染，说明该方法稳定性强，该方法也同样适用于其他浓度较低的核酸产物的浓缩。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (1)

1.一种通过冷冻干燥浓缩质粒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1.按照小提质粒试剂盒要求提取质粒，菌液收集量3-5mL，最终用100μLddH2O洗脱到经过121℃，30min高压蒸汽灭菌处理的1.5mL EP管中；如果洗脱液大于100μL，冻干时低压沸腾过程会溅出封口膜，需分装，使最终每个1.5mLEP管中溶液体积≤100μL；
步骤2.使用超微量分光光度计NANO DROP测量质粒浓度，记录单位为ng/μL；测量过后盖好盖子放置-20℃冰箱冷冻处理1-2h；提前打开真空冷冻干燥机，使冷阱温度下降至-55℃；
步骤3.将冷冻处理好的质粒移至超净工作台，打开盖子封上一层封口膜，并将其余部分包裹好，用牙签在封口膜上戳开3-4个小洞，冷阱温度下降至-55℃，立即放入冷冻干燥机中，密封好干燥箱，关闭通气阀门，打开真空泵，使干燥箱中压强达到15Pa，冷冻干燥6h；
步骤4.6h之后取出，掀掉封口膜，盖上盖子，拿到超净工作台中，用定量的ddH2O重溶同一种质粒，保证双蒸水充分接触到干燥后质粒液体形成的一层薄膜，且完全将该薄膜溶解；溶解后标记号，用超微量分光光度计NANO DROP测量质粒浓度，记录单位为ng/μL；并记录参数OD260/OD280；参数OD260/OD280＝1.8；
步骤5.对比冷冻干燥前后质粒体积、浓度和质量的变化，整理数据，统计前后质粒浓度体积变化的规律。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN2352909Y (zh) * 1998-08-28 1999-12-08 张祯儒 一种冷冻干燥机

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真空冷冻干燥技术在生物制药方面的应用;董充慧 等;《沈阳药科大学学报》;20090731;第26卷;第76-78页 *

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