CN108524547B - 美洲大蠊提取物在制备激活自然杀伤性t细胞药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，公开了美洲大蠊提取物激活自然杀伤性T细胞的应用。以美洲大蠊为原料，经石油醚、氯仿甲醇溶液浸泡除去杂质之后，将固体分散于水中，用正丁醇萃取，旋干后得到的美洲大蠊提取物。该提取物能够激活NKT细胞，具有治疗癌症、感染和自身免疫性疾病的应用前景。

Description

美洲大蠊提取物在制备激活自然杀伤性T细胞药物中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及美洲大蠊提取物在制备激活自然杀伤性T细胞药物中的应用。
背景技术
自然杀伤性T细胞（NKT细胞）是一种T淋巴细胞，在固有免疫和获得性免疫间发挥着重要的桥梁作用。NKT细胞被激活后迅速释放出大量细胞因子，包括1型辅助性T细胞因子(T helper 1，Th1)和Th2型细胞因子。Th1型细胞因子，如白细胞介素(Interleukin，IL)-2和干扰素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)，促进机体的细胞免疫应答，增强细胞毒作用，进而发挥抗感染抗肿瘤的作用。Th2型细胞因子，如IL-4和IL-10，刺激B细胞增殖分化产生抗体，促进机体的体液免疫应答；诱导树突状细胞的成熟，影响自然杀伤细胞、巨噬细胞、传统T细胞以及B淋巴细胞的功能，进而调节机体的固有免疫和适应性免疫应答。因此靶向激活NKT细胞成为免疫治疗的热点，寻找能被NKT细胞识别的抗原引起了人们极大的兴趣。
美洲大蠊是一种传统的药用昆虫，具有理气散结、补气养阴、解毒生肌等功效，其干燥虫体乙醇提取物康复新液已广泛应用于临床实践。发明人在对美洲大蠊的提取分离过程中，意外地发现美洲大蠊正丁醇提取液对NKT细胞有很好的激活作用。
发明内容
本发明的目的在于提供美洲大蠊提取物在制备激活自然杀伤性T细胞药物中的应用。
本发明的目的是这样实现的：
美洲大蠊提取物在制备激活自然杀伤性T细胞药物中的应用。
美洲大蠊提取物在制备预防/治疗癌症、感染、自身免疫性疾病药物中的应用。
美洲大蠊提取物预防/治疗的癌症包括：肝癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、大肠癌、胃癌、肾癌、鼻咽癌、卵巢癌、前列腺癌、皮肤癌。
美洲大蠊提取物预防/治疗的癌症的感染包括：细菌感染、真菌感染、支原体感染、衣原体感染、病毒感染。
美洲大蠊提取物预防/治疗的癌症的自身免疫性疾病为系统性红斑狼疮、过敏性哮喘、多发性硬化症、变应性鼻炎、移植物抗宿主病、类风湿性关节炎、1型糖尿病、银屑病、韦格纳肉芽肿病、复发性多软骨炎、原发性胆汁性肝硬化。
美洲大蠊提取物通过以下方式得到：
（1）将美洲大蠊磨成粉末，加入美洲大蠊粉末质量体积（g/ml）1~3倍的石油醚，超声15min后浸泡24小时；处理2-3次，过滤后收集沉淀；
（2）称取经石油醚处理过的美洲大蠊粉末，加入质量体积（g/ml）1~3倍的氯仿甲醇溶剂浸泡12小时，过滤，沉淀用氯仿甲醇溶剂洗涤5次，收集沉淀；
（3）沉淀中加入水，超声处理5分钟，加入正丁醇萃取3次，合并正丁醇提取液，减压浓缩蒸去正丁醇后，得到美洲大蠊提取物。
步骤（2）中氯仿甲醇溶剂的体积比为1：1。
一种药物组合物，包含美洲大蠊提取物作为活性成分或者是药用载体。
本发明优点：
本发明提供的美洲大蠊提取物能够有效激活自然杀伤性T细胞。
附图说明
图1为石油醚提取部位刺激NKT细胞小鼠杂交瘤2H4细胞分泌IL-2。
图2为氯甲提取部位刺激NKT细胞小鼠杂交瘤2H4细胞分泌IL-2。
图3为美洲大蠊提取物刺激NKT细胞小鼠杂交瘤2H4细胞分泌IL-2。
具体实施方式
下面对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明所作的任何变换，均属于本发明的保护范围。
美洲大蠊提取物在制备激活自然杀伤性T细胞药物中的应用。
美洲大蠊提取物在制备预防/治疗癌症、感染、自身免疫性疾病药物中的应用。
美洲大蠊提取物预防/治疗的癌症包括：肝癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、大肠癌、胃癌、肾癌、鼻咽癌、卵巢癌、前列腺癌、皮肤癌。
美洲大蠊提取物预防/治疗的癌症的感染包括：细菌感染、真菌感染、支原体感染、衣原体感染、病毒感染。
美洲大蠊提取物预防/治疗的癌症的自身免疫性疾病为系统性红斑狼疮、过敏性哮喘、多发性硬化症、变应性鼻炎、移植物抗宿主病、类风湿性关节炎、1型糖尿病、银屑病、韦格纳肉芽肿病、复发性多软骨炎、原发性胆汁性肝硬化。
美洲大蠊提取物通过以下方式得到：
（1）将美洲大蠊磨成粉末，加入美洲大蠊粉末质量体积（g/ml）1~3倍的石油醚，超声15min后浸泡24小时；处理2-3次，过滤后收集沉淀；
（2）称取经石油醚处理过的美洲大蠊粉末，加入质量体积（g/ml）1~3倍的氯仿甲醇溶剂浸泡12小时，过滤，沉淀用氯仿甲醇溶剂洗涤5次，收集沉淀；
（3）沉淀中加入水，超声处理5分钟，加入正丁醇萃取3次，合并正丁醇提取液，减压浓缩蒸去正丁醇后，得到美洲大蠊提取物。
步骤（2）中氯仿甲醇溶剂的体积比为1：1。
一种药物组合物，包含美洲大蠊提取物作为活性成分或者是药用载体。
实施例1
将干燥美洲大蠊虫体干燥，用粉碎机粉碎后不过筛，装袋备用。
取美洲大蠊粉末500g，置于锥形瓶中，加入石油醚1000ml，超声15min，浸泡24小时。用玻棒搅拌后，超声15分钟，抽滤，收集沉淀。
向沉淀中再次加入石油醚680ml，于室温下浸泡提取24h，抽滤，收集沉淀。
再次向沉淀中加入380ml石油醚，浸泡4天，抽滤收集沉淀。
合并滤液，浓缩后成石油醚提取部位。
沉淀合并，晾干后成经石油醚反复提取处理过的美洲大蠊粉末。
称取经石油醚反复提取处理过的美洲大蠊粉末1g，用氯仿-甲醇（1:1）30ml浸泡12h，然后超声15min，抽滤，沉淀用氯仿-甲醇（1:1）洗涤5次，每次20ml，合并滤液，浓缩后成氯甲提取部位。沉淀抽干后成经氯甲处理过的美洲大蠊粉末。
向氯甲处理过的美洲大蠊粉末中加入100ml水，超声处理5分钟，静置，收集上清液。再加入100ml水，超声处理5分钟，静置，收集上清液。合并上清液，加入正丁醇萃取3次，每次30ml，合并正丁醇提取液，40℃减压浓缩得到美洲大蠊提取物。
实施例2
同实施例1，其中不同的地方是：石油醚用量为500ml，处理3次。
实施例3
同实施例1，其中不同的地方是：石油醚用量为1500ml，处理2次。
实施例4
以实施例1制备得到的美洲大蠊提取物进行试验，具体试验方法和过程如下：
将石油醚提取部位、氯甲提取部位和美洲大蠊提取物溶于DMSO中，配制成100mg/ml的储存溶液备用，实验时用培养基梯度稀释成500μg/ml，100μg/ml，20μg/ml的溶液。
取对数期的A20-CD1d细胞接种于96孔平板上，接种密度为3X104/孔，接种体积为100μl，然后分别加100μl的含药培养基，使化合物终浓度为250μg/ml，50μg/ml，10μg/ml，以含等量DMSO的培养基作为阴性对照，以100ng/ml的α-Galcer作为阳性对照。于37℃培养箱中共孵育24h，然后弃去培养基，加入150μl的2H4细胞，密度为3X104/孔，继续培养24h后收集上清液，用酶联免疫吸附法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）检测IL-2细胞因子的分泌。
实验结果：
图1为石油醚提取部位刺激NKT细胞小鼠杂交瘤2H4细胞分泌IL-2。在高浓度时，石油醚提取部位有激活作用。图2为氯甲提取部位刺激NKT细胞小鼠杂交瘤2H4细胞分泌IL-2。氯甲提取部位的激活作用不明显。图3为美洲大蠊提取物刺激NKT细胞小鼠杂交瘤2H4细胞分泌IL-2。在低浓度时即显示出较强的激活作用，高浓度时可能因为毒性所以反而分泌的IL-2减少。从图中可以看出，本发明提供的美洲大蠊提取物对NKT细胞有激活作用。
实施例5
分别以实施例2、实施例3制备得到的美洲大蠊提取物进行试验，试验方法同试验例1，结果均表明，本发明所述的美洲大蠊提取物对NKT细胞有激活作用。

Claims (3)

1.一种美洲大蠊提取物，其特征在于所述美洲大蠊提取物具有激活自然杀伤性T细胞的作用，美洲大蠊提取物的用量为10μg/mL；所述美洲大蠊提取物的制备方法为：
（1）将干燥美洲大蠊虫体干燥，用粉碎机粉碎后不过筛，装袋备用；取美洲大蠊粉末500g，置于锥形瓶中，加入石油醚1000mL，超声15min，浸泡24小时；用玻棒搅拌后，超声15分钟，抽滤，收集沉淀；向沉淀中再次加入石油醚680mL，于室温下浸泡提取24h，抽滤，收集沉淀；再次向沉淀中加入380mL石油醚，浸泡4天，抽滤收集沉淀；合并滤液，浓缩后成石油醚提取部位；沉淀合并，晾干后成经石油醚反复提取处理过的美洲大蠊粉末；
（2）称取经石油醚反复提取处理过的美洲大蠊粉末1g，用体积比为1:1的氯仿-甲醇30mL浸泡12h，然后超声15min，抽滤，沉淀用体积比为1:1的氯仿-甲醇洗涤5次，每次20mL，合并滤液，浓缩后成氯甲提取部位；沉淀抽干后成经氯甲处理过的美洲大蠊粉末；
（3）向氯甲处理过的美洲大蠊粉末中加入100mL水，超声处理5分钟，静置，收集上清液；再加入100mL水，超声处理5分钟，静置，收集上清液；合并上清液，加入正丁醇萃取3次，每次30mL，合并正丁醇提取液，40℃减压浓缩得到美洲大蠊提取物。
2.一种权利要求1所述美洲大蠊提取物的应用，其特征在于所述美洲大蠊提取物在制备激活自然杀伤性T细胞药物中的应用。
3.一种药物组合物，其特征在于以权利要求1所述美洲大蠊提取物作为活性成分或者是药用载体。
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