CN108504700B - 一种酶法制备酪胺的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酶法制备酪胺的方法,涉及生物酶工程技术领域。步骤如下:1)L‑酪氨酸‑α‑脱羧酶加入到PBS缓冲溶液中破碎后加入到氯化钙水溶液A中,40‑50℃反应,分离得粗酶液;取海藻酸钠和明胶的混合水溶液,加入粗酶液搅拌得混合液;混合液加入氯化钙水溶液B中,搅拌,静置,过滤,加入戊二醛交联剂,浸泡,过滤,洗涤,得固定化L‑酪氨酸‑α‑脱羧酶;2)L‑酪氨酸和水配成底物悬浊液,加入碱液和酸液,控制无机盐质量浓度1‑5%之间,得底物溶液;3)向底物溶液中一次性加入固定化L‑酪氨酸‑α‑脱羧酶,20‑50℃下催化反应,至底物反应完全,得酪胺转化液。本发明酶催化转化率高,无副反应,产品纯度高,生产成本低。
Description
技术领域
本发明涉及生物酶工程和医药技术领域,尤其是一种酶法制备酪胺的方法。
背景技术
酪胺[2-(4-Hydroxyphenyl)ethylamine],又名对羟基苯乙胺,是一种具有升高血压和兴奋子宫的药物,可用于生化试剂、有机合成药物中间体,可用于治疗偏头疼和诊断噬铬细胞瘤的药物,现在主要用于降血脂药物苯扎贝特的中间体。
酪胺是一种可以从麦角碱或腐烂动植物组织中分离出来的一种化合物,目前国内外有报道采用化学合成法以苯乙腈、苯酚、茴香醛等原料为起始反应物进行合成。以上化学合成方法工艺路线较长,反应步骤多,总收率低,能耗较高,反应过程不易控制,对环境污染较大。也有中国专利(公开号CN101955435A)公开的工艺路线是采用化学催化剂,在有机溶剂体系中将底物酪氨酸进行催化转化,催化温度在140-170℃之间,过程需要进行脱水装置进行脱水,过程采用氮气保护,反应结束后还要进行水解反应才能获得酪胺;此路线采用了溶媒体系,反应过程能耗较大,脱水条件苛刻,不利于低碳环保。中国专利(公开号CN105695525A)公开的工艺路线是以L-酪氨酸为底物,以屎肠球菌为催化剂,过程通入氮气和氧气,通过反应24-36h获得酪胺溶液粗品,之后将酪胺溶液粗品加入苯中,低温过滤,所得酪胺再在乙醇中沸腾脱色,过滤后进行结晶得到酪胺,此路线采用生物菌为催化剂,生产周期长,过程使用的苯溶剂毒性较大。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种酶法制备酪胺的方法,该方法酶催化转化率高,无副反应,产品纯度高,生产成本低。
为解决上述技术问题,本发明所采取的技术方案是:一种酶法制备酪胺的方法,包括以下步骤:
1)酶的固定化:将L-酪氨酸-α-脱羧酶加入到PBS缓冲溶液中,配制成酶液,将酶液破碎,得到L-酪氨酸-α-脱羧酶液;然后将L-酪氨酸-α-脱羧酶液加入到氯化钙水溶液A中,在40-50℃反应,反应后分离得到粗酶液;
称取海藻酸钠与明胶,加入水,加热溶解后降温,得到海藻酸钠和明胶的混合水溶液,再加入上述粗酶液并搅拌均匀,得到混合液;将混合液加入氯化钙水溶液B中,搅拌,加毕静置使之硬化,过滤,加入戊二醛交联剂,浸泡,过滤,洗涤,得到固定化L-酪氨酸-α-脱羧酶;
2)配制底物溶液:向反应器中投入L-酪氨酸,加入水配成底物悬浊液,加入碱液和酸液,控制无机盐质量浓度1-5%之间,即得底物溶液;
3)酶催化转化:向底物溶液中一次性加入固定化L-酪氨酸-α-脱羧酶,控制温度20-50℃条件下进行催化反应,至底物反应完全,最终得到酪胺转化液。
优选的,步骤1)中:将L-酪氨酸-α-脱羧酶加入到PBS缓冲溶液中,配制成L-酪氨酸-α-脱羧酶浓度为60-90g/L的酶液,将酶液在0±2℃下超声破碎,超声破碎条件为:20-22KHZ,5-20min,得到L-酪氨酸-α-脱羧酶液。
优选的,步骤1)中:氯化钙水溶液A为质量浓度3.0%的氯化钙水溶液,氯化钙水溶液A所用毫升数为L-酪氨酸-α-脱羧酶所用克数的10-12倍。
优选的,步骤1)中:氯化钙水溶液B为质量浓度3.0%的氯化钙水溶液,氯化钙水溶液B所用体积为混合液体积的2倍。
优选的,步骤1)中:称取海藻酸钠与明胶,加入水,60-70℃加热溶解后,降温,得到海藻酸钠和明胶的混合水溶液;海藻酸钠和明胶的混合水溶液中,海藻酸钠的质量浓度为1.5-2.0%,明胶的质量浓度为1.0-1.5%,海藻酸钠和明胶的混合水溶液体积为粗酶液体积的1.9-2.2倍。
优选的,步骤1)中:粗酶液反应时间为1-3h。
优选的,步骤1)中:戊二醛交联剂的质量浓度为0.1-0.9%。
优选的,步骤2)中:底物溶液中L-酪氨酸底物浓度为15-180g/L。
优选的,步骤2)中:碱液为碳酸氢钠水溶液、氨水、碳酸钠水溶液、氢氧化钠水溶液中的一种;酸液为硫酸、盐酸、硝酸、磷酸中的一种;无机盐为硫酸铵、硫酸钠、氯化铵、氯化钠,硝酸钠、硝酸铵、磷酸钠、磷酸铵中的一种。
优选的,步骤3)酶催化转化中:固定化L-酪氨酸-α-脱羧酶用量是L-酪氨酸质量的3%-30%。
PBS是磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline)。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于:
(1)本发明底物和酶一次性加入,省去了多次补酶及底物的复杂操作过程;
(2)本发明制得的固定化酶粒径大,机械强度高,可重复利用;
(3)本发明制备酪胺,酶催化转化率高,可达98.5%以上,无副反应,提取工艺简单,产品纯度高,生产成本低。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明,但本发明并不局限于此:
实施例1
1)酶的固定化
将2.3g L-酪氨酸-α-脱羧酶加入到33mL PBS缓冲溶液中,配制成66g/L的酶液,将酶液在冰水浴下(0±2℃)超声破碎,超声破碎条件为:22KHZ,15min,得到L-酪氨酸-α-脱羧酶液。然后将L-酪氨酸-α-脱羧酶液加入到25mL的3.0wt%氯化钙水溶液A中,在45℃下搅拌2h后,离心分离得到粗酶液60mL。
称取1.8g海藻酸钠与1.2g明胶,加水定容至120mL,加热至65℃溶解后降温至40℃,加入上述粗酶液并搅拌均匀,得到的混合液置于一滴液漏斗中,边震荡边缓慢滴入350mL 3.0wt%的氯化钙水溶液B中,同时用磁子搅拌,滴加完毕之后静置2h使之成块,过滤,加入5g的戊二醛交联剂(戊二醛交联剂的质量浓度为0.2%),继续浸泡0.5h,过滤,洗涤得到固定化L-酪氨酸-α-脱羧酶。
2)配制底物溶液
向反应器中投入18.5g L-酪氨酸,加入260mL水配成底物悬浊液,缓慢滴加碱液和酸液,控制生成的无机盐质量浓度5%,即得底物溶液。采用的碱液为碳酸钠水溶液,酸液为稀硫酸,无机盐为硫酸钠。
3)酶催化转化
向底物溶液中一次性加入步骤1)所得固定化L-酪氨酸-α-脱羧酶,控制温度20-50℃进行催化反应,高效液相检测至底物反应完全,最终得到酪胺反应液。转化5h,反应总体收率为99.867%(见表1实施例1Shimadzu LCsolution分析报告峰表),收率为95.4%。
表1实施例1 Shimadzu LCsolution分析报告峰表
峰# | 保留时间min | 峰面积mV*min | 峰高mV | 面积% | 高度% |
1 | 5.862 | 2197477 | 245809 | 99.867 | 99.910 |
2 | 7.031 | 1241 | 123 | 0.056 | 0.050 |
3 | 7.587 | 1676 | 98 | 0.076 | 0.040 |
总计 | 2200395 | 246029 | 100.00 | 100.000 |
表1中,保留时间5.862min对应的峰为酪胺。
实施例2
1)酶的固定化
将30g L-酪氨酸-α-脱羧酶加入到310mL PBS缓冲溶液中,配制成90g/L的酶液,将酶液在冰水浴下(0℃)超声破碎,超声破碎条件为:20KHZ,20min,得到L-酪氨酸-α-脱羧酶液。然后将L-酪氨酸-α-脱羧酶液加入到300mL的3.0wt%氯化钙水溶液A中,在50℃下搅拌2h后,离心分离得到粗酶液630mL。
称取24g海藻酸钠与18g明胶,加水定容至1.2L,加热至68℃溶解后降温至40℃,加入上述粗酶液并搅拌均匀,得到的混合液置于一滴液漏斗中,边震荡边缓慢滴入3.6L3.0wt%的氯化钙水溶液B中,同时用机械搅拌,滴加完毕之后静置2h使之成块,过滤,加入11g的戊二醛交联剂(戊二醛交联剂的质量浓度为0.5%),继续浸泡0.5h,过滤,洗涤得到固定化L-酪氨酸-α-脱羧酶。
2)配制底物溶液
向反应器中投入120g L-酪氨酸,加入1L水配成底物悬浊液,缓慢滴加碱液和酸液,控制生成的无机盐质量浓度2%,即得底物溶液。采用的碱液为氨水,酸液为稀盐酸,无机盐为氯化铵。
3)酶催化转化
向底物溶液中一次性加入步骤1)所得固定化L-酪氨酸-α-脱羧酶,控制温度20-50℃进行催化反应,高效液相跟踪至底物反应完全,最终得到酪胺转化液。转化8h,反应总体转化率为99.7%(见表2实施例2Shimadzu LCsolution分析报告峰表),收率为92.8%。
表2实施例2 Shimadzu LCsolution分析报告峰表
峰# | 保留时间min | 峰面积mV*min | 峰高mV | 面积% | 高度% |
1 | 5.951 | 2173853 | 223027 | 99.707 | 99.774 |
2 | 6.728 | 2385 | 177 | 0.109 | 0.079 |
3 | 7.051 | 1875 | 144 | 0.086 | 0.064 |
4 | 7.387 | 1068 | 91 | 0.049 | 0.041 |
5 | 7.555 | 1056 | 93 | 0.048 | 0.042 |
总计 | 2180238 | 223533 | 100.00 | 100.000 |
表1中,保留时间5.951min对应的峰为酪胺。
Claims (8)
1.一种酶法制备酪胺的方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)酶的固定化:将L-酪氨酸-α-脱羧酶加入到PBS缓冲溶液中,配制成酶液,酶液浓度为60-90g/L,酶液在0±2℃下超声破碎,超声破碎条件为:20-22KHZ,15-20min,得到L-酪氨酸-α-脱羧酶液,后将L-酪氨酸-α-脱羧酶液加入到氯化钙水溶液A中,在40-50℃反应,反应后分离得到粗酶液;
称取海藻酸钠与明胶,加入水,加热溶解后降温,得到海藻酸钠和明胶的混合水溶液,再加入上述粗酶液并搅拌均匀,得到混合液;将混合液加入氯化钙水溶液B中,搅拌,加毕静置使之硬化,过滤,加入戊二醛交联剂,浸泡,过滤,洗涤,得到固定化L-酪氨酸-α-脱羧酶;
2)配制底物溶液:向反应器中投入L-酪氨酸,加入水配成底物悬浊液,加入碱液和酸液,控制无机盐质量浓度1-5%之间,即得底物溶液;所述碱液为碳酸氢钠水溶液、氨水、碳酸钠水溶液、氢氧化钠水溶液中的一种;酸液为硫酸、盐酸、硝酸、磷酸中的一种;无机盐为硫酸铵、硫酸钠、氯化铵、氯化钠,硝酸钠、硝酸铵、磷酸钠、磷酸铵中的一种;
3)酶催化转化:向底物溶液中一次性加入固定化L-酪氨酸-α-脱羧酶,控制温度20-50℃条件下进行催化反应,至底物反应完全,最终得到酪胺转化液。
2.根据权利要求1所述的一种酶法制备酪胺的方法,其特征在于:步骤1)中:氯化钙水溶液A为质量浓度3.0%的氯化钙水溶液,氯化钙水溶液A所用毫升数为L-酪氨酸-α-脱羧酶所用克数的10-12倍。
3.根据权利要求1所述的一种酶法制备酪胺的方法,其特征在于:步骤1)中:氯化钙水溶液B为质量浓度3.0%的氯化钙水溶液,氯化钙水溶液B所用体积为混合液体积的2倍。
4.根据权利要求1所述的一种酶法制备酪胺的方法,其特征在于:步骤1)中:称取海藻酸钠与明胶,加入水,60-70℃加热溶解后,降温,得到海藻酸钠和明胶的混合水溶液;海藻酸钠和明胶的混合水溶液中,海藻酸钠的质量浓度为1.5-2.0%,明胶的质量浓度为1.0-1.5%,海藻酸钠和明胶的混合水溶液体积为粗酶液体积的1.9-2.2倍。
5.根据权利要求1所述的一种酶法制备酪胺的方法,其特征在于:步骤1)中:粗酶液反应时间为1-9h。
6.根据权利要求1所述的一种酶法制备酪胺的方法,其特征在于:步骤1)中:戊二醛交联剂的质量浓度为0.1-0.9%。
7.根据权利要求1所述的一种酶法制备酪胺的方法,其特征在于:步骤2)中:底物溶液中L-酪氨酸底物浓度为15-180g/L。
8.根据权利要求1所述的一种酶法制备酪胺的方法,其特征在于:步骤3)酶催化转化中:固定化L-酪氨酸-α-脱羧酶用量是L-酪氨酸质量的3%-30%。
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