CN104195128A - 海藻酸钠二氧化硅杂化凝胶固定化糖化酶的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于固定化酶的技术领域，尤其涉及用海藻酸钠二氧化硅杂化凝胶固定化糖化酶的方法及用所得到的固定化糖化酶进行糖化生产葡萄糖的方法。采用海藻酸钠二氧化硅杂化凝胶包埋糖化酶进行酶的固定化，通过二氧化硅与海藻酸钠最适配比克服了以往包埋法中底物与酶不易接触或酶分子容易脱落等缺点，降低了糖化酶的固定化成本，提高了包埋法固定化糖化酶的稳定性，减少了生产污染。同时进行了固定化糖化酶水解淀粉反应设备的设计，实现了反应液的搅动和固定化酶与反应液分离的功能，使固定化糖化酶可以重复使用。

Description

海藻酸钠二氧化硅杂化凝胶固定化糖化酶的方法及应用

技术领域

本发明属于固定化酶的技术领域，尤其涉及用海藻酸钠二氧化硅杂化凝胶固定化糖化酶的方法及用所得到的固定化糖化酶进行糖化生产葡萄糖的方法和固定化酶反应器的计。

背景技术

酶作为专一高效的生物催化剂具有非常广泛和良好的应用前景，由于酶的价格昂贵游离酶难以回收利用，将酶进行有效的固定化一直是酶工程领域的研究热点。 

在玉米淀粉水解生产葡萄糖的过程中，糖化工序要使用大量的糖化酶，游离态糖化酶在一次使用后无法有效回收，不但造成了很大的浪费，还增加了后处理工序的难度和环境污染。

目前固定化糖化酶的现状：固定化糖化酶多采用共价法和交联法。共价法和交联法虽然能实现酶与载体连接牢固，不易脱落，有良好的稳定性及重复使用性，是目前研究最为活跃的酶固定化方法。但该法的最大缺陷是常引起酶蛋白高级结构变化，破坏酶的活性中心，从而使酶的固定化率大大降低；而且交联法还要用到价格昂贵的交联试剂进一步增加了固定化成本。也有用吸附法进行糖化酶的固定化的，吸附法有许多不足，如酶量的选择全凭经验，酶和载体之间结合力不强易导致催化活力的丧失和玷污反应产物等。因此，其应用受到限制。

发明内容

本发明的目的在于，通过正交实验找到了海藻酸钠与二氧化硅的最佳配比，既能使液化后的淀粉分子自由进出固定化微球又能有效的固定化糖化酶，采用海藻酸钠和二氧化硅杂化凝胶固定化糖化酶，在现有生产设备的基础上对糖化生产工艺做改进设计，使大量的糖化酶得以回收利用，对现行糖化工艺的改进有重要的指导性。

本发明的目的有两个，一个为提供一种用海藻酸钠二氧化硅杂化凝胶固定化糖化酶的方法，另一个为提供一种用上述得到的固定化糖化酶进行糖化生产葡萄糖的方法和反应器的设计。

本发明的技术方案为：

海藻酸钠二氧化硅杂化凝胶固定化糖化酶的方法，包括以下步骤：

制备质量浓度2%（w/w）的海藻酸钠溶液作为A液消毒后备用，用无菌水制备质量浓度1.7% (w/w)的硅酸钠溶液用酸调至pH5.6-7.0作为B液备用；

使A液B液等体积混合均匀为C液，取理论酶活1.5倍糖化酶加入C溶液称中搅拌10-30分钟，混匀后为D液，然后滴入质量浓度3%-6%的氯化钙溶液中形成糖化酶固定化微球颗粒，在氯化钙溶液中浸泡2-4小时；然后用蒸馏水洗净微球颗粒，得到固定化糖化酶。

将上述得到的固定化糖化酶放于4℃冰箱中储存，以备用。

所述的酸为选自浓度大于30%的醋酸或盐酸。 

所述的混匀后为D液，为用蠕动泵通过10ml注射器针头滴入质量浓度3%-6%的氯化钙溶液中形成糖化酶固定化微球颗粒，其优点在于使酶固定于微球颗粒中，使酶能够回收利用，提高酶的稳定性。

上述所述的理论酶活的1.5倍是指，若某一工艺需要采用游离态酶用0.4‰时，则在本发明中需要加入的糖化酶的量为0.6‰用来制成固定化酶。

本发明的另一目的技术方案为：

一种用上述得到的固定化糖化酶进行糖化生产葡萄糖的方法，步骤如下：

（1）取固定化糖化酶与淀粉液化液按质量比1：15-18的比例在恒温水浴槽中混合，待温度稳定在62-69℃时泵入糖化罐，其中所述的淀粉液化液中的干基质量含量为30%-35%；

（2）在温度为65℃-68℃ ,pH值为4.0-4.5，搅拌速度为每分钟50-60转条件下，糖化53-65小时；

（3）检测糖化液的纯度，当dx值大于98%时停止反应；

（4）反应结束后糖化液从出料口泵入产物收集罐，固定化酶留在糖化罐中重复使用；

（5）取与步骤（1）中相同质量和浓度的淀粉液化液于恒温水浴中升温到65℃，泵入糖化罐重复（2）、（3）、（4）步骤；

（6）重复使用固定化糖化酶直到单批次糖化反应时间超过75小时后取出固定化酶。

dx值是葡萄糖的百分含量。

所述的步骤（1）中，固定化糖化酶与淀粉液化液质量比为1：15。

所述的步骤（2）的优选条件为，在温度为65℃ ,pH值为4.0，搅拌速度为每分钟60转条件下，糖化53-65小时。

所述的步骤（3）中采用高效液相色谱检测糖化液的纯度。

上述所述的糖化罐，为依据固定化糖化酶水解淀粉液化液原料和固定化糖化酶的性质及工艺要求和操作条件 ,在原有糖化罐的基础上,设计出更适宜于该固定化酶的反应器，本发明所述的糖化罐具体的结构为：一种糖化罐，包括罐体，在罐体的上端设有进料口和排气口，其特征在于，在罐体内设置有搅拌器，在罐体内底部还设有倾斜设置的丝网隔板将罐体分为两个空间，在空间较大的罐体内用于放置固定化糖化酶，并在该空间的对应位置设有固定化糖化酶出口，在另一空间的相对应位置设有出料口。

 本发明的有益效果为：本发明采用海藻酸钠二氧化硅杂化凝胶包埋法进行糖化酶的固定化，通过二氧化硅与海藻酸钠最适配比克服了以往包埋法中底物与酶不易接触或酶分子容易脱落等缺点，降低了糖化酶的固定化成本，提高了糖化酶的稳定性（固定化糖化酶在60℃有底物存在下半衰期为64天，所述糖化酶为购自诺维信公司的糖化酶），使大规模工业化成为可能。

采用本发明的固定化糖化酶，以及提供了一种新型的糖化罐，能搅动，易于固定化载体与糖化液分离，实现了反应液的搅动和固定化酶与反应液分离的功能，使固定化糖化酶可以重复使用，整个工艺降低了糖化工段的生产成本，每批固定化酶使用13次计算，平均每吨葡萄糖的糖化成本可降低约230元；同时结晶后的葡萄糖母液中蛋白含量显著减少，结晶率提高。

附图说明

图1：固定化糖化酶水解淀粉糖化罐的结构示意图。

图2：实施例1中第一次固定化糖化酶糖化产物检测液相色谱图。

图3：实施例1中第二次固定化糖化酶糖化产物检测液相色谱图。

图4：实施例1中第十三次固定化糖化酶糖化产物检测液相色谱图。

图5：实施例2中第一次固定化糖化酶糖化产物检测液相色谱图。

图6：实施例2中第二次固定化糖化酶糖化产物检测液相色谱图。

图7：实施例2中第十二次固定化糖化酶糖化产物检测液相色谱图。

其中，1-固定化糖化酶出口，2-出料口，3-丝网隔板，4-罐体，5-固定化糖化酶微球，6-搅拌器，7-排气口，8-进料口。

具体实施方式

    下面通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细的说明，但并不理解为对本技术方案的限定。

实施例1：

1.海藻酸钠二氧化硅杂化凝胶固定化糖化酶的制取：

（1）制取质量浓度2.0%（w/w）的海藻酸钠溶液25ml作为A液消毒后备用，用无菌水制备1.5%浓度(w/w)的硅酸钠溶液25ml用浓度30%以上的醋酸调至pH5.6-7.0作为B液备用；

(2)使A液B液混合均匀为C液，取0.12g糖化酶加入C溶液称中搅拌10-30分钟，得到D液；

(3)混匀后的D液用蠕动泵通过10ml注射器针头滴入质量浓度3%的氯化钙溶液中形成糖化酶固定化微球颗粒，在氯化钙溶液中浸泡3小时；然后用蒸馏水洗净微球颗粒放于4℃冰箱中备用。

2.淀粉液化液在固定化糖化酶催化下水解

（1）取30%质量浓度经高温淀粉液化酶液化后的淀粉液化液500ml,加入1000ml的三角瓶中；加入30g固定化糖化酶置于恒温水浴摇床中反应；

（2）在温度为65℃ ,pH值为4.0，摇床转速为每分钟50转条件下，糖化约53-65小时。

（3）用高效液相色谱检测糖化液的纯度当，dx值大于98%时停止反应（色谱图见附图2-4）。

（4）反应结束后，用纱布盖住三角瓶口，把糖化液从瓶口倒出，固定化酶留在三角瓶中重复使用。

（5）取与（1）中相同质量和浓度的淀粉液化液于三角中重复（2）、（3）、（4）步骤。

(6)固定化糖化酶重复使用了13次，平均糖化时间为68小时，糖化液dx值均大于98%。

对于附图2-4的处理通道说明如下：

图2见表1。

表1

 图3见表2。

表2

      图4见表3。

表3

 实施例2：

1.海藻酸钠二氧化硅杂化凝胶固定化糖化酶的制取

（1）制取质量浓度1.8%（w/w）的海藻酸钠溶液4升作为A液消毒后备用，用无菌水制备质量浓度1.6%浓度(w/w)的硅酸钠溶液3.9升用盐酸调至pH5.6-7.0作为B液备用；

(2)使A液B液混合均匀为C液，取15.3g糖化酶加入C溶液称中搅拌10-30分钟，得到D液。

(3)混匀后的D液用蠕动泵通过装有多个注射器针头的圆盘滴入质量浓度4%的氯化钙溶液中形成糖化酶固定化微球颗粒，在氯化钙溶液中浸泡3小时；然后用蒸留水洗净微球颗粒放于4℃冰箱中备用。

2.淀粉液化液化在固定化酶催化下水解

（1）取淀粉液化液80升固定化酶5000g在恒温水浴槽中混合，待温度稳定在68℃左右时泵入糖化罐；所述的淀粉液化液中的干基质量含量为33%。

（2）在温度为68℃ ,pH值为4.0，搅拌速度为每分钟60转条件下，糖化约53-65小时。

（3）用高效液相色谱检测糖化液的纯度，当dx值大于98%时停止反应（色谱图见附图5-7）。

（4）反应结束后糖化液从出料口泵入产物收集罐，固定化酶留在糖化罐中重复使用。

（5）取与（1）中相同质量和浓度的淀粉液化液于恒温水浴槽中升温到65℃，泵入糖化罐重复（2）、（3）、（4）步骤。

(6)固定化糖化酶重复使用了12次，平均糖化时间为65小时，糖化液dx值均大于98%。

对于附图5-7的处理通道说明如下：

图5见表4。

表4

      图6见表5。

表5

 图7见表6。

表6

     所述的糖化罐的结构为： 

一种糖化罐，包括罐体4，在罐体的上端设有进料口8和排气口7，在罐体4内设置有搅拌器6，在罐体4内底部还设有倾斜设置的丝网隔板3将罐体分为两个空间，在空间较大的罐体内用于放置固定化糖化酶5，并在该空间的对应位置设有固定化糖化酶出口1，在另一空间的相对应位置设有出料口2。

总之，糖化罐在原有糖化罐中加了一块丝网作为隔板,这样可使固定化酶与反应产物有效分离，而且便于固定化酶的加入与排出，同时在糖化罐中加了搅拌，使固定化酶与底物充分接触。

Claims (8)

1.海藻酸钠二氧化硅杂化凝胶固定化糖化酶的方法，包括以下步骤：

制备质量浓度2%的海藻酸钠溶液作为A液消毒后备用，用无菌水制备质量浓度1.7%的硅酸钠溶液用酸调至pH5.6-7.0作为B液备用；

使A液B液等体积混合均匀为C液，取理论酶活1.5倍糖化酶加入C溶液称中搅拌10-30分钟，混匀后为D液，然后滴入质量浓度3%-6%的氯化钙溶液中形成糖化酶固定化微球颗粒，在氯化钙溶液中浸泡2-4小时；然后用蒸馏水洗净微球颗粒，得到固定化糖化酶。

2.根据权利要求1所述的海藻酸钠二氧化硅杂化凝胶固定化糖化酶的方法，其特征在于，所述的酸为选自浓度大于30%的醋酸或盐酸。 

3.根据权利要求1所述的海藻酸钠二氧化硅杂化凝胶固定化糖化酶的方法，其特征在于，所述的混匀后为D液，为用蠕动泵通过10ml注射器针头滴入质量浓度3%-6%的氯化钙溶液中形成糖化酶固定化微球颗粒。

4.一种用上述得到的固定化糖化酶进行糖化生产葡萄糖的方法，步骤如下：

（1）取固定化糖化酶与淀粉液化液按质量比1：15-18的比例在恒温水浴槽中混合，待温度稳定在62-69℃时泵入糖化罐，其中所述的淀粉液化液中的干基质量含量为30%-35%；

（2）在温度为65℃-68℃ ,pH值为4.0-4.5，搅拌速度为每分钟50-60转条件下，糖化53-65小时；

（3）检测糖化液的纯度，当dx值大于98%时停止反应；

（4）反应结束后糖化液从出料口泵入产物收集罐，固定化酶留在糖化罐中重复使用；

（5）取与步骤（1）中相同质量和浓度的淀粉液化液于恒温水浴中升温到65℃，泵入糖化罐重复（2）、（3）、（4）步骤；

（6）重复使用固定化糖化酶直到单批次糖化反应时间超过75小时后取出固定化酶。

5.根据权利要求4所述的生产葡萄糖的方法，其特征在于，所述的步骤（1）中，固定化糖化酶与淀粉液化液质量比为1：15。

6.根据权利要求4所述的生产葡萄糖的方法，其特征在于，所述的步骤（2）的优选条件为，在温度为65℃ ,pH值为4.0，搅拌速度为每分钟60转条件下，糖化53-65小时。

7.根据权利要求4所述的生产葡萄糖的方法，其特征在于，所述的步骤（3）中采用高效液相色谱检测糖化液的纯度。

8.一种糖化罐，包括罐体，在罐体的上端设有进料口和排气口，其特征在于，在罐体内设置有搅拌器，在罐体内底部还设有倾斜设置的丝网隔板将罐体分为两个空间，在空间较大的罐体内用于放置固定化糖化酶，并在该空间的对应位置设有固定化糖化酶出口，在另一空间的相对应位置设有出料口。