CN108496799A - 一种紫荆组织培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种紫荆组织培养方法，该一种紫荆组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤：i、前处理：9～10月收集成熟荚果，取种子，清洗、灭菌，无水乙醇浸泡，晾干；ii、初始培养：将种子接种于特制A培养基中培养；向A培养基中加入特制B液，再培养，得到幼苗；iii、增殖培养：将幼苗剪下，转接到特制C培养基中培养；向C培养基中加入特制D液，再培养；iv、进一步培养：将增殖培养后的幼苗剪下，转接到特制E培养基中培养；过程中严格控温、控光照、控时间和物料添加量，具有提高抗寒性的优点。

Description

一种紫荆组织培养方法
技术领域
本发明涉及一种紫荆组织培养方法。
背景技术
紫荆(学名CercischinensisBunge)为豆科紫荆属植物，别名为满条红、紫株、箩筐树等，原产于中国，在湖北西部、辽宁南部、河北、陕西、河南、甘肃、广东、云南、四川等省都有分布。紫荆花朵漂亮，花量大，花色鲜艳，时春季重要的观赏灌木。适合绿地孤植、丛植，或与其他树木混植，也可作庭院树或行道树与常绿树配合种植。
紫荆的繁育常用播种、分株、压条、嫁接的方法。授权公告号为CN106165648B、授权公告日为2018年1月9日的中国专利公开了一种紫荆组培培养基及培养方法，其以健壮的紫荆无菌组培苗为母本，取其带芽茎段，采用紫荆组培培养基进行增殖生根培养。
现有技术的不足之处在于，得到的紫荆幼苗抗寒性差。
发明内容
本发明的目的是提供一种紫荆组织培养方法，具有提高抗寒性的优点。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
一种紫荆组织培养方法，包括以下步骤：
i、前处理：9～10月收集成熟荚果，取出种子，清洗、灭菌，用4～6℃无水乙醇浸泡种子5.5～6.0hr，于25～28℃下晾干；
ii、初始培养：将前处理后的种子接种于A培养基中，放至18～20℃和1500～16001x下培养3.5～4.0天；向A培养基中加入B液，放入22～24℃和2000～21001x下培养6.5～7.0天，得到幼苗；
A培养基为MS+蔗糖25～27g/l+琼脂6.8～7.0g/l+氯化钠56～60mg/l+羧甲基纤维素钠4.5～4.8mg/l+羟甲基纤维素钠2.5～2.7mg/l，pH为5.5～6.0；
B液包括氯化钠2.5～2.8wt％、羟甲基纤维素钠0.12～0.15wt％、碳酸氢钠4.0～4.2wt％和水22.5～23.2wt％，B液的基础溶剂为丙酮；
按质量计，A培养基和B混合液的用量比为1∶0.08～0.10；
iii、增殖培养：将幼苗剪下，转接到C培养基中，放至22～24℃和2400～2500lx下培养15.0～15.5天；向C培养基中加入D液，放入15～16℃和2400～25001x下培养3.5～4.0天；
C培养基为MS+6-苄氨基腺嘌呤3.0～3.2mg/l+吲哚丁酸1.2～1.4mg/l+萘乙酸0.2～0.3mg/l+氯化钠80～85mg/l+羟丙基甲基纤维素2.1～2.2mg/l+聚丙烯酰胺1.4～1.5mg/l；
D液包括氯化钠5.1～5.4wt％、羟丙基甲基纤维素0.25～0.28wt％、碳酸氢钠3.1～3.2wt％和水34.2～34.5wt％，D液的基础溶剂为乙酸乙酯；
按质量计，C培养基和D混合液的用量比为1∶0.11～0.12；
iv、进一步培养：将增殖培养后的幼苗剪下，转接到E培养基中，放至8～10℃和1500～16001x下培养20.5～21.5天；
E培养基为1/2MS+吲哚丁酸0.6～0.8mg/l+萘乙酸0.4～0.5mg/l+氯化钠125～130mg/l+聚丙烯酰胺1.9～2.0mg/l+火山灰144～150mg/l+羟丙基变性淀粉44～48mg/l。
进一步优选为：A培养基还包括PEO-PPO-PEO三嵌段共聚物6.5～6.8mg/l和PEO-PPO二嵌段共聚物3.3～3.5mg/l；B液还包括乳糖0.5～0.6wt％。
进一步优选为：C培养基还包括二酚基丙烷型环氧树脂0.5～0.6mg/l和乙二醇1.1～1.2mg/l；D液还包括乙二醇1.9～2.0wt％和丙三醇1.5～1.6wt％。
进一步优选为：E培养基还包括乙二醇4.5～4.7mg/l和柠檬酸1.2～1.3mg/l。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
培育得到的幼苗生长情况更佳，具有优良的抗寒性和良好的耐酸性。
具体实施方式
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的保护范围内都受到专利法的保护。
实施例1a：一种紫荆组织培养方法，包括以下步骤：
i、前处理：9～10月收集成熟荚果，取出种子，清洗、灭菌，用4℃无水乙醇浸泡种子6.0hr，于25℃下晾干；
ii、初始培养：将前处理后的种子接种于A培养基中，放至18℃和16001x下培养4.0天；向A培养基中加入B液，放入22℃和21001x下培养7.0天，得到幼苗；
A培养基为MS+蔗糖27g/l+琼脂7.0g/l+氯化钠60mg/l+羧甲基纤维素钠4.8mg/l+羟甲基纤维素钠2.7mg/1，pH为6.0；
B液包括氯化钠2.8wt％、羟甲基纤维素钠0.15wt％、碳酸氢钠4.2wt％和水23.2wt％，B液的基础溶剂为丙酮；
按质量计，A培养基和B混合液的用量比为1∶0.10；
iii、增殖培养：将幼苗剪下，转接到C培养基中，放至22℃和25001x下培养15.5天；向C培养基中加入D液，放入15℃和25001x下培养4.0天；
C培养基为MS+6-苄氨基腺嘌呤3.2mg/l+吲哚丁酸1.4mg/l+萘乙酸0.3mg/l+氯化钠85mg/l+羟丙基甲基纤维素2.2mg/l+聚丙烯酰胺1.5mg/l；
D液包括氯化钠5.4wt％、羟丙基甲基纤维素0.28wt％、碳酸氢钠3.2wt％和水34.5wt％，D液的基础溶剂为乙酸乙酯；
按质量计，C培养基和D混合液的用量比为1∶0.12；
iv、进一步培养：将增殖培养后的幼苗剪下，转接到E培养基中，放至8℃和16001x下培养21.5天；
E培养基为1/2MS+吲哚丁酸0.8mg/l+萘乙酸0.5mg/l+氯化钠130mg/l+聚丙烯酰胺2.0mg/l+火山灰150mg/l+羟丙基变性淀粉48mg/l。
实施例1b：一种紫荆组织培养方法，与实施例1a的不同之处在于，A培养基还包括PEO-PPO-PEO三嵌段共聚物6.8mg/l和PEO-PPO二嵌段共聚物3.5mg/l；B液还包括乳糖0.6wt％。
实施例1c：一种紫荆组织培养方法，与实施例1b的不同之处在于，C培养基还包括二酚基丙烷型环氧树脂0.6mg/l和乙二醇1.2mg/l；D液还包括乙二醇2.0wt％和丙三醇1.6wt％。
实施例1d：一种紫荆组织培养方法，与实施例1c的不同之处在于，E培养基还包括乙二醇4.7mg/l和柠檬酸1.3mg/l。
实施例2a：一种紫荆组织培养方法，包括以下步骤：
i、前处理：9～10月收集成熟荚果，取出种子，清洗、灭菌，用6℃无水乙醇浸泡种子5.5hr，于28℃下晾干；
ii、初始培养：将前处理后的种子接种于A培养基中，放至20℃和16001x下培养3.5天；向A培养基中加入B液，放入24℃和20001x下培养6.5天，得到幼苗；
A培养基为MS+蔗糖25g/l+琼脂6.8g/l+氯化钠56mg/l+羧甲基纤维素钠4.5mg/l+羟甲基纤维素钠2.5mg/l，pH为5.5；
B液包括氯化钠2.5wt％、羟甲基纤维素钠0.12wt％、碳酸氢钠4.0wt％和水22.5wt％，B液的基础溶剂为丙酮；
按质量计，A培养基和B混合液的用量比为1∶0.08；
iii、增殖培养：将幼苗剪下，转接到C培养基中，放至24℃和24001x下培养15.0天；向C培养基中加入D液，放入16℃和24001x下培养3.5天；
C培养基为MS+6-苄氨基腺嘌呤3.0mg/l+吲哚丁酸1.2mg/l+萘乙酸0.2mg/l+氯化钠80mg/l+羟丙基甲基纤维素2.1mg/l+聚丙烯酰胺1.4mg/l；
D液包括氯化钠5.1wt％、羟丙基甲基纤维素0.25wt％、碳酸氢钠3.1wt％和水34.2wt％，D液的基础溶剂为乙酸乙酯；
按质量计，C培养基和D混合液的用量比为1∶0.11；
iv、进一步培养：将增殖培养后的幼苗剪下，转接到E培养基中，放至10℃和16001x下培养20.5天；
E培养基为1/2MS+吲哚丁酸0.6mg/l+萘乙酸0.4mg/l+氯化钠125mg/l+聚丙烯酰胺1.9mg/l+火山灰144mg/l+羟丙基变性淀粉44mg/l。
实施例2b：一种紫荆组织培养方法，与实施例2a的不同之处在于，A培养基还包括PEO-PPO-PEO三嵌段共聚物6.5mg/l和PEO-PPO二嵌段共聚物3.3mg/l；B液还包括乳糖0.5wt％。
实施例2c：一种紫荆组织培养方法，与实施例2b的不同之处在于，C培养基还包括二酚基丙烷型环氧树脂0.5mg/l和乙二醇1.1mg/l；D液还包括乙二醇1.9wt％和丙三醇1.5wt％。
实施例2d：一种紫荆组织培养方法，与实施例2c的不同之处在于，E培养基还包括乙二醇4.5mg/l和柠檬酸1.2mg/l。
性能测试
(1)对照组
对照组1：一种紫荆组织培养方法，参照CN106165648B的实施例1。
对照组2：一种紫荆组织培养方法，与实施例1a的不同之处在于，A培养基为MS，C培养基为MS，E培养基为1/2MS。
对照组3：一种紫荆组织培养方法，与实施例1a的不同之处在于，A培养基为MS+蔗糖27g/l+琼脂7.0g/l，
C培养基为MS+6-苄氨基腺嘌呤3.2mg/l+吲哚丁酸1.4mg/l+萘乙酸0.3mg/l，
E培养基为1/2MS+吲哚丁酸0.8mg/l+萘乙酸0.5mg/l。
对照组4：一种紫荆组织培养方法，与实施例1a的不同之处在于，步骤ii中未添加B液，步骤iii中未添加D液。
对照组5：一种紫荆组织培养方法，与实施例1a的不同之处在于，B液为丙酮，D液为乙酸乙酯。
对照组6：一种紫荆组织培养方法，与实施例1a的不同之处在于，B液和D液的基础溶剂均用水替代。
(2)抗寒性测试
取每个测试组培育结束(包括步骤ii至iv，实施例1a-1d和对照组2-6均培育53天，实施例2a-2d均培育48天；对照组1培育55天)的300株植株，随机平均分成3份，分别种植在控温4℃、15℃和25℃的试验田内，试验田的光照、营养成分、湿度控制一致。观察栽培第90天和360天的存活率。观察结果如表1所示。
表1显示，与对照组相比，实施例1a-2d的存活率更高，特别是在4℃和15℃下具有较为明显的优势。
表1抗寒性测试
(3)组织培养测试
取每个测试组培育结束(包括步骤ii至iv，实施例1a-1d和对照组2-3均培育53天，实施例2a-2d均培育48天；对照组1培育55天)的300株植株，量其长度，取其平均值。测试结果如表2所示。
表2显示，和对照组相比，实施例1a-2d的平均长度更长。
表2组织培养测试
(4)耐酸性测试
取每个测试组培育结束(包括步骤ii至iv，实施例1a-1d和对照组2-3均培育53天，实施例2a-2d均培育48天；对照组1培育55天)的300株植株，随机平均分成3份，分别种植在pH控制在6.3、5.6、4.7的试验田内，试验田的温度、光照、营养成分、湿度控制一致。观察栽培第90天和360天的存活率。观察结果如表3所示。
表3显示，与对照组相比，实施例1a-2d在酸性试验田中的存活率更高。
表3耐酸性测试

Claims (4)

1.一种紫荆组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
i、前处理：9～10月收集成熟荚果，取出种子，清洗、灭菌，用4～6℃无水乙醇浸泡种子5.5～6.0hr，于25～28℃下晾干；
ii、初始培养：将前处理后的种子接种于A培养基中，放至18～20℃和1500～1600lx下培养3.5～4.0天；向A培养基中加入B液，放入22～24℃和2000～2100lx下培养6.5～7.0天，得到幼苗；
A培养基为MS+蔗糖25～27g/l+琼脂6.8～7.0g/l+氯化钠56～60mg/l+羧甲基纤维素钠4.5～4.8mg/l+羟甲基纤维素钠2.5～2.7mg/l，pH为5.5～6.0；
B液包括氯化钠2.5～2.8wt％、羟甲基纤维素钠0.12～0.15wt％、碳酸氢钠4.0～4.2wt％和水22.5～23.2wt％，B液的基础溶剂为丙酮；
按质量计，A培养基和B混合液的用量比为1∶0.08～0.10；
iii、增殖培养：将幼苗剪下，转接到C培养基中，放至22～24℃和2400～2500lx下培养15.0～15.5天；向C培养基中加入D液，放入15～16℃和2400～2500lx下培养3.5～4.0天；
C培养基为MS+6-苄氨基腺嘌呤3.0～3.2mg/l+吲哚丁酸1.2～1.4mg/l+萘乙酸0.2～0.3mg/l+氯化钠80～85mg/l+羟丙基甲基纤维素2.1～2.2mg/l+聚丙烯酰胺1.4～1.5mg/l；
D液包括氯化钠5.1～5.4wt％、羟丙基甲基纤维素0.25～0.28wt％、碳酸氢钠3.1～3.2wt％和水34.2～34.5wt％，D液的基础溶剂为乙酸乙酯；
按质量计，C培养基和D混合液的用量比为1∶0.11～0.12；
iv、进一步培养：将增殖培养后的幼苗剪下，转接到E培养基中，放至8～10℃和1500～1600lx下培养20.5～21.5天；
E培养基为1/2MS+吲哚丁酸0.6～0.8mg/l+萘乙酸0.4～0.5mg/l+氯化钠125～130mg/l+聚丙烯酰胺1.9～2.0mg/l+火山灰144～150mg/l+羟丙基变性淀粉44～48mg/l。
2.根据权利要求1所述的一种紫荆组织培养方法，其特征在于，A培养基还包括PEO-PPO-PEO三嵌段共聚物6.5～6.8mg/l和PEO-PPO二嵌段共聚物3.3～3.5mg/l；B液还包括乳糖0.5～0.6wt％。
3.根据权利要求2所述的一种紫荆组织培养方法，其特征在于，C培养基还包括二酚基丙烷型环氧树脂0.5～0.6mg/l和乙二醇1.1～1.2mg/l；D液还包括乙二醇1.9～2.0wt％和丙三醇1.5～1.6wt％。
4.根据权利要求3所述的一种紫荆组织培养方法，其特征在于，E培养基还包括乙二醇4.5～4.7mg/l和柠檬酸1.2～1.3mg/l。
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