CN106665353A - 一种巨紫荆组培苗的继代培养方法 - Google Patents

一种巨紫荆组培苗的继代培养方法 Download PDF

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Abstract

一种巨紫荆组培苗继代培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：1、无菌外植体的获取；2、巨紫荆继代增殖步骤；3、巨紫荆生根培养步骤；4、巨紫荆继代培养及生根培养条件；和5、巨紫荆组培苗的炼苗与移栽。发明的巨紫荆组培苗的繁殖具有如下优点：(1)增殖系数高，平均增殖系数达到5以上；(2)生根率高，最高可达98％；(3)炼苗成活率高，平均为90％以上。

Description

一种巨紫荆组培苗的继代培养方法
技术领域
本发明涉及一种组培苗的培养方法，具体涉及一种巨紫荆组培苗的继代培养方法。
背景技术
巨紫荆(Cercis giganter Lines)为豆科/苏木科紫荆属落叶乔木，自然生长的大树胸径达60cm、高达15m以上，因树形巨大，又与常见的灌木状紫荆相象而得名“巨紫荆”。巨紫荆为我国特有的乡土树种，集中分布在亚热带地区。南到贵州的遵义，北到河南洛宁；东到浙江的临安,西到湖北的神农架地区。巨紫荆幼叶紫红色，花假蝶形，淡紫红色，3～4月叶前开花，花色艳丽，“像法桐一样高大，像樱花一样灿烂”，具有较高的观赏价值，是优良的行道树、庭荫树及绿化点缀树种。
巨紫荆属豆科紫荆属树种，有关巨紫荆的研究及应用尚处于起始阶段，因此巨紫荆组织培养的研究报道较少，仅河南四季春园林艺术工程有限公司张林等进行了巨紫荆组织培养的研究，并且发现MS+ZT 2.0mg/L的增殖效果最好，增殖倍数为3.56倍(巨紫荆优良新品系组织培养快速繁殖技术)。该配方是以MS为基本培养基，增值系数为3.56，本实验中所用玉米素(ZT)成本高，不适用于组培苗的工厂化生产。本发明对MS培养基进行改良，使平均增殖系数达到5以上，生根率达到98％，大棚炼苗成活率为90％以上，降低了生产成本，在规模化生产中带来了更高的经济效益。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种巨紫荆组培苗的继代培养方法，以克服现有技术所存在的上述缺点和不足。
本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现：
一种巨紫荆组培苗继代培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、无菌外植体的获取；
(2)、巨紫荆继代增殖步骤：
(2.1)试验材料；
(2.2)巨紫荆继代培养的实验方案设计；
(3)、巨紫荆生根培养步骤；
(3.1)选取继代培养的巨紫荆组培苗，选取标准为高度1.8～3.5cm、健壮、叶片舒展的单株组培苗；
(3.2)将选取的继代培养的巨紫荆组培苗接种至1/2MS生根培养基上；
(3.3)进行生根培养激素筛选，接种30天后统计生根率，生根率＝生根株数/接种株数×100％；
(4)、巨紫荆继代培养及生根培养条件；
(5)、巨紫荆组培苗的炼苗与移栽。
(5.1)巨紫荆大棚炼苗种苗要求；
(5.2)巨紫荆大棚炼苗条件；
(5.3)巨紫荆大棚炼苗基质特点。
其中，步骤1中，选取1～2年生带芽包的健壮枝条于室内进行水培，待新芽萌发后切割成1～2cm长的顶芽或带腋芽的茎段，剪去叶片留3～5mm叶柄，用75％酒精擦拭外植体表面，用洗衣粉水浸泡2min，再置于流水下冲洗0.5～1h；在超净工作台上，用0.05～0.1％的升汞处理5～15min，用无菌水冲洗5～6次，接种至诱导培养基中，按照MS+0.1～1mg/L6-BA+30g/L糖+5～7g/L琼脂，每瓶接种一株，获得的无菌外植体的成功率为85％。
其中，步骤(2.1)中，(2.1)试验材料，选取步骤1中诱导出来的芽直接进行增殖培养，所选材料生长健壮、叶片舒展，利用顶芽及茎段进行繁殖，其中顶芽高0.5～1cm左右、茎段高0.5～1cm左右含至少一个腋芽。
其中，步骤(2.2)中，改良MS培养基包括KNO3 2000～2100mg/L、NH4NO3 1645～1600mg/L、MgSO4·7H2O 555～740mg/L与KH2PO4 255～340mg/L，细胞分裂素的最佳浓度为0.3～1.0mg/L，生长素为IBA，浓度范围为0.03～0.1mg/L。因此，巨紫荆继代培养最佳增殖培养基配方为：改良MS+0.3～1.0mg/L 6-BA+0.03～0.1mg/L IBA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂。
其中，步骤(3.2)中，1/2MS生根培养基中包括：NH4NO3 825mg/L、KNO3 950mg/L、KH2PO4 85mg/L、MgSO4·7H2O 185mg/L、CaCl2·2H2O 220mg/L、FeSO4·7H2O 13.9mg/L、Na2·EDTA·2H2O 18.65mg/L、KI 0.42mg/L、H3BO3 3.1mg/L、MnSO4·H2O 8.45mg/L、ZnSO4·7H2O4.25mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.05mg/L、CoCl2·6H2O 0.0125mg/L、CuSO4·5H2O 0.0125mg/L、肌醇50mg/L、烟酸0.25mg/L、盐酸吡哆醇0.25mg/L、盐酸硫胺素0.05mg/L、甘氨酸1.0mg/L、吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)、20g/L蔗糖、7g/L琼脂。
其中，步骤(3.3)中，IBA与NAA配合使用时巨紫荆生根率明显提高。其中筛选出的最适生根配方为：1/2MS+0.5～1.0mg/L NAA+0.5～1.0mg/L IBA+20g/L蔗糖+7g/L琼脂。
其中，步骤4中，巨紫荆组培苗继代及生根培养的条件为：光培养与暗培养交替进行，光培养条件为连续进行12h光照，光照强度为3000lx，培养温度为26℃；暗培养条件为连续进行12h，温度为20℃。
其中，步骤5中，还包括：
(5.1)生根培养35～45天的生根苗可进温室炼苗移栽，选取叶色正常、无枯叶黄叶的健壮植株进行移栽。
(5.2)将巨紫荆生根苗根系上的培养基洗净，种植在含蛭石、珍珠岩、草炭等基质的营养杯或穴盘中，湿度控制在80～90％，待新根与新叶发出后逐渐降低湿度，培养45～60天，即可得巨紫荆容器苗，巨紫荆生根苗大棚炼苗成活率为90％以上。
(5.3)上述所说基质配方包括上下两层，其中上层1/3容量体积为蛭石：珍珠岩＝2:1；下层2/3容量体积为草炭：蛭石：珍珠岩＝3:1:1，该基质配方的特点是上层基质疏松透气、保水保湿，利于炼苗前期新根及新叶的发出；下层基质营养丰富，利于后期组培苗营养生长，且根系与基质易于成团、便于容器苗运输。
本发明的有益效果：
《巨紫荆优良新品系组织培养快速繁殖技术》所采用的方法，平均增殖系数为3.56，且使用的激素ZT成本是6-BA与IBA的几百倍。
采用该方法的巨紫荆组培苗的繁殖具有如下优点：
(1)增殖系数高，平均增殖系数达到5以上；
(2)生根率高，最高可达98％；
(3)炼苗成活率高，平均为90％以上。
该方法增殖系数明显高于《巨紫荆优良新品系组织培养快速繁殖技术》，且所用药品成本更低，生根率及炼苗成活率也高于前者，因此适合用于巨紫荆组培苗的工厂化生产及推广。
附图说明
图1为巨紫荆扩繁培养。
图2为巨紫荆生根培养的侧视图。
图3为巨紫荆生根培养的主视图。
图4为巨紫荆生根培养的仰视图。
图5为巨紫荆大棚炼苗营养杯苗。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
实施例1
(一)实验材料
母本材料：从生长健壮、无病虫害的4年生大树上剪取1～2年生带饱满芽体的健康枝条于室内水培，待新芽萌发后作为外植体启动培养的来源；
继代及生根培养材料：继代周期为25～30天，生长健壮、叶片舒展，株高为3～5cm的巨紫荆组培苗作为继代培养及生根培养的实验材料；
(二)具体实验步骤
一种巨紫荆组培苗继代培养的方法，步骤如下：
1、无菌外植体的获取
选取1～2年生带芽包的健壮枝条于室内进行水培，待新芽萌发后切割成1～2cm长的顶芽或带腋芽的茎段，剪去叶片留3～5mm叶柄，用75％酒精擦拭外植体表面，用洗衣粉水浸泡2min，再置于流水下冲洗0.5～1h；在超净工作台上，用0.05～0.1％的升汞处理5～15min，用无菌水冲洗5～6次，接种至诱导培养基中(MS+0.1～1mg/L 6-BA+30g/L糖+7g/L琼脂)，每瓶接种一株，获得的无菌外植体的成功率为85％。
2、巨紫荆继代增殖步骤：
(1)试验材料
选取步骤1中诱导出来的芽直接进行增殖培养，所选材料生长健壮、叶片舒展，利用顶芽及茎段进行繁殖，其中顶芽高0.5～1cm左右、茎段高0.5～1cm左右含至少一个腋芽。
(2)巨紫荆继代培养的实验方案设计
巨紫荆继代培养的基本培养基为改良MS培养基，其中添加蔗糖30g/L，琼脂5～7g/L，pH为5.8～6.0。选用6-BA(6-苄基腺嘌呤)、IBA(吲哚丁酸)、NAA(萘乙酸)等植物生长调节剂。每个处理接种20瓶，每瓶接种15株，实验重复三次，培养28天统计增殖比例及生长情况，从而比较不同培养基对不定芽增殖的影响，进一步筛选出最佳继代增殖培养基。
改良MS培养基包括KNO3 2000～2100mg/L、NH4NO3 1645～1600mg/L、MgSO4·7H2O555～740mg/L与KH2PO4 255～340mg/L，改良MS配方主要针对培养基的大量元素进行改良，其它MS添加物保持不变，改良如表1：
表1改良MS培养基配方
大量元素 MS培养基中用量(mg/L) 改良MS培养基中用量(mg/L)
KNO3 1900 1995～2090
NH4NO3 1650 1568～1485
MgSO4·7H2O 370 555～740
KH2PO4 170 255～340
巨紫荆继代培养细胞分裂素6-BA的筛选如表2：
表2巨紫荆继代培养细胞分裂素6-BA的筛选
由上述结果显示，如图1所示，巨紫荆继代培养所用细胞分裂素的最佳浓度为0.3～1.0mg/L。在此基础上进行巨紫荆生长素种类的筛选，各处理结果如表3：
表3巨紫荆生长素种类的筛选
处理 6-BA IBA NAA 处理结果
1 0.3 0.03 0 植株健壮，平均株高为2.5，增殖比例为3
2 0.3 0 0.03 基部愈伤组织大，植株不长高，基本无增殖
由上述结果可知，NAA不适合用作巨紫荆的继代培养，6-BA与IBA的组合利于巨紫荆的增殖扩繁。在此实验基础上，对巨紫荆继代培养的激素水平进行调整，实施结果如表4：
表4巨紫荆继代培养的激素水平进行调整
由上述结果可知，适合巨紫荆继代培养的生长素为IBA,浓度范围为0.03～0.1mg/L。因此，巨紫荆继代培养最佳增殖培养基配方为：改良MS+0.3～1.0mg/L 6-BA+0.03～0.1mg/L IBA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂。
3、巨紫荆生根培养步骤
(1)选取继代培养的巨紫荆组培苗，选取标准为高度1.8～3.5cm、健壮、叶片舒展的单株组培苗；
(2)将选取的继代培养的巨紫荆组培苗接种至1/2MS生根培养基上。
1/2MS生根培养基中包括：NH4NO3 825mg/L、KNO3 950mg/L、KH2PO4 85mg/L、MgSO4·7H2O 185mg/L、CaCl2·2H2O 220mg/L、FeSO4·7H2O 13.9mg/L、Na2·EDTA·2H2O 18.65mg/L、KI 0.42mg/L、H3BO3 3.1mg/L、MnSO4·H2O 8.45mg/L、ZnSO4·7H2O 4.25mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.05mg/L、CoCl2·6H2O 0.0125mg/L、CuSO4·5H2O 0.0125mg/L、肌醇50mg/L、烟酸0.25mg/L、盐酸吡哆醇0.25mg/L、盐酸硫胺素0.05mg/L、甘氨酸1.0mg/L、吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)、20g/L蔗糖、7g/L琼脂。
(3)接种30天后统计生根率，生根率＝生根株数/接种株数×100％。
生根培养基激素筛选如表5，如图2-4所示：
表5生根培养基激素筛选
由上述结果可知，IBA与NAA单独使用时不利于巨紫荆组培苗的生根培养，而IBA与NAA配合使用时巨紫荆生根率明显提高。其中筛选出的最适生根配方为：1/2MS+0.5～1.0mg/L NAA+0.5～1.0mg/L IBA+20g/L蔗糖+7g/L琼脂。该配方培养的巨紫荆组培苗生根率最高可达98％,且根系数量多、根系粗壮，在炼苗移栽过程中提高了巨紫荆组培苗的成活率，本发明不仅解决了巨紫荆组培苗生根率低的问题，而且大大降低了生产成本，加快了巨紫荆的工厂化生产及推广。
4、巨紫荆继代培养及生根培养条件
巨紫荆组培苗继代及生根培养的条件为：光培养与暗培养交替进行，光培养条件为连续进行12h光照，光照强度为3000lx，培养温度为26℃；暗培养条件为连续进行12h，温度为20℃。
5、巨紫荆组培苗的炼苗与移栽
(1)如图5所示，生根培养35～45天的生根苗可进温室炼苗移栽，选取叶色正常、无枯叶黄叶的健壮植株进行移栽；
(2)将巨紫荆生根苗根系上的培养基洗净，种植在含蛭石、珍珠岩、草炭等基质的营养杯或穴盘中，湿度控制在80～90％，待新根与新叶发出后逐渐降低湿度，培养45～60天，即可得巨紫荆容器苗。巨紫荆生根苗大棚炼苗成活率为90％以上。
(3)上述所说基质配方包括上下两层，其中上层1/3容量体积为蛭石：珍珠岩＝2:1；下层2/3容量体积为草炭：蛭石：珍珠岩＝3:1:1。该基质配方的特点是上层基质疏松透气、保水保湿，利于炼苗前期新根及新叶的发出；下层基质营养丰富，利于后期组培苗营养生长，且根系与基质易于成团、便于容器苗运输。
对比分析
《巨紫荆优良新品系组织培养快速繁殖技术》所采用的方法，平均增殖系数为3.56，且使用的激素ZT成本是6-BA与IBA的几百倍。
采用该方法的巨紫荆组培苗的繁殖具有如下优点：
(1)增殖系数高，平均增殖系数达到5以上；
(2)生根率高，最高可达98％；
(3)炼苗成活率高，平均为90％以上。
该方法增殖系数明显高于《巨紫荆优良新品系组织培养快速繁殖技术》，且所用药品成本更低，生根率及炼苗成活率也高于前者，因此适合用于巨紫荆组培苗的工厂化生产及推广。
以上对本发明的具体实施方式进行了说明，但本发明并不以此为限，只要不脱离本发明的宗旨，本发明还可以有各种变化。

Claims (10)

1.一种巨紫荆组培苗继代培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、无菌外植体的获取；
(2)、巨紫荆继代增殖步骤：
(2.1)试验材料；
(2.2)巨紫荆继代培养的实验方案设计；
(3)、巨紫荆生根培养步骤；
(3.1)选取继代培养的巨紫荆组培苗，选取标准为高度1.8～3.5cm、健壮、叶片舒展的单株组培苗；
(3.2)将选取的继代培养的巨紫荆组培苗接种至1/2MS生根培养基上；
(3.3)生根培养基激素筛选，接种30天后统计生根率，生根率＝生根株数/接种株数×100％；
(4)、巨紫荆继代培养及生根培养条件；
(5)、巨紫荆组培苗的炼苗与移栽；
(5.1)巨紫荆大棚炼苗种苗要求；
(5.2)巨紫荆大棚炼苗条件；
(5.3)巨紫荆大棚炼苗基质特点。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，选取1～2年生带芽包的健壮枝条于室内进行水培，待新芽萌发后切割成1～2cm长的顶芽或带腋芽的茎段，剪去叶片留3～5mm叶柄，用75％酒精擦拭外植体表面，用洗衣粉水浸泡2min，再置于流水下冲洗0.5～1h；在超净工作台上，用0.05～0.1％的升汞处理5～15min，用无菌水冲洗5～6次，接种至诱导培养基中，按照MS+0.1～1mg/L 6-BA+30g/L糖+7g/L琼脂，每瓶接种一株，获得的无菌外植体的成功率为85％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2.1)中，(2.1)试验材料，选取步骤1中诱导出来的芽直接进行增殖培养，所选材料生长健壮、叶片舒展，利用顶芽及茎段进行繁殖，其中顶芽高0.5～1cm左右、茎段高0.5～1cm左右含至少一个腋芽。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2.2)中，改良MS培养基包括KNO3 2000～2100mg/L、NH4NO3 1645～1600mg/L、MgSO4·7H2O 555～740mg/L与KH2PO4 255～340mg/L，细胞分裂素的最佳浓度为0.3～1.0mg/L，生长素为IBA，浓度范围为0.03～0.1mg/L，因此，巨紫荆继代培养最佳增殖培养基配方为：改良MS+0.3～1.0mg/L6-BA+0.03～0.1mg/L IBA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3.2)中，1/2MS生根培养基中包括：NH4NO3 825mg/L、KNO3 950mg/L、KH2PO4 85mg/L、MgSO4·7H2O 185mg/L、CaCl2·2H2O 220mg/L、FeSO4·7H2O 13.9mg/L、Na2·EDTA·2H2O 18.65mg/L、KI 0.42mg/L、H3BO3 3.1mg/L、MnSO4·H2O 8.45mg/L、ZnSO4·7H2O 4.25mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.05mg/L、CoCl2·6H2O0.0125mg/L、CuSO4·5H2O 0.0125mg/L、肌醇50mg/L、烟酸0.25mg/L、盐酸吡哆醇0.25mg/L、盐酸硫胺素0.05mg/L、甘氨酸1.0mg/L、吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)、20g/L蔗糖、7g/L琼脂。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3.3)中，IBA与NAA配合使用时巨紫荆生根率明显提高，其中筛选出的最适生根配方为：1/2MS+0.5～1.0mg/L NAA+0.5～1.0mg/LIBA+20g/L蔗糖+7g/L琼脂。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：其中，步骤(4)中，巨紫荆组培苗继代及生根培养的条件为：光培养与暗培养交替进行，光培养条件为连续进行12h光照，光照强度为3000lx，培养温度为26℃；暗培养条件为连续进行12h，温度为20℃。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5.1)中，生根培养35～45天的生根苗可进温室炼苗移栽，选取叶色正常、无枯叶黄叶的健壮植株进行移栽。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5.2)中，将巨紫荆生根苗根系上的培养基洗净，种植在含蛭石、珍珠岩、草炭等基质的营养杯或穴盘中，湿度控制在80～90％，待新根与新叶发出后逐渐降低湿度，培养45～60天，即可得巨紫荆容器苗，巨紫荆生根苗大棚炼苗成活率为90％以上。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(5.3)中，上述所说基质配方包括上下两层，其中上层1/3容量体积为蛭石：珍珠岩＝2:1；下层2/3容量体积为草炭：蛭石：珍珠岩＝3:1:1，该基质配方的特点是上层基质疏松透气、保水保湿，利于炼苗前期新根及新叶的发出；下层基质营养丰富，利于后期组培苗营养生长，且根系与基质易于成团、便于容器苗运输。
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