CN108474027A - 侧流印迹试验 - Google Patents
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Abstract
提供了一种侧流设备。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年12月30日提交的美国临时专利申请号62/273,055的优先权,该申请通过引用纳入本文用于所有目的。
背景技术
生物科学中经常使用检测固定的分析物的方法。例如,常规印迹(例如,Southern、Northern、Western、Far Western、Eastern、真空、Middle Eastern、Eastern-Western和Far-Eastern印迹等)可用于检测固定在基材或膜上或基质中的分析物(例如,在琼脂糖或丙烯酰胺中)。一般而言,这类印迹技术涉及固定待检测的分析物和使分析物接触结合试剂(例如,抗体)。印迹也通常在固定和最终检测之间包括多个洗涤步骤和/或封闭步骤。这类洗涤和封闭步骤消耗了实施者有限的时间和/或试剂,并且可以是误差和不可再现性的常见来源。
发明内容
本文提供了一种侧流设备。在一些实施方式中,该设备是单次使用的一次性设备。在一些实施方式中,该设备包括包含多孔基材的芯吸垫(wicking pad),该芯吸垫具有:
(i)用于应用包括固定的分析物(例如,蛋白质)的膜的区域;和
(ii)用于应用一抗的区域;并且
其中,该芯吸垫具有:
第一边缘和第二边缘和两个侧边缘,
第一储库,其包括与芯吸垫第一侧邻近的第一吸收垫;和
第二储库,其包括与芯吸垫第二侧邻近的第二吸收垫。
在一些实施方式中,该芯吸垫还包括:(iii)用于应用二抗或其它第二检测试剂的区域。
在一些实施方式中,该设备被密封在塑料外壳中。在一些实施方式中,塑料外壳包括模塑的顶部部分以及密封于顶部部分的平底板。在一些实施方式中,模塑的顶部包括被第一存储库和/或第二存储库上可移除的层所覆盖的端口,以允许液体通过端口施加到第一储库并允许空气通过来释放第二存储库中的压力(第二储库外壳可以另外任选地包括孔,以允许没有被覆盖的空气流动)。在一些所述方法中,可移除覆盖物包含金属或塑料薄膜。在一些实施方式中,模塑的顶部部分包括区域(i)、(ii)和(iii)上的盖子,以允许进入这些区域并且后续闭合该盖子。在一些实施方式中,该盖子包括一个或多个端口,以允许在该盖子闭合时通过该端口将试剂递送至芯吸垫。
在一些实施方式中,用于应用一抗的区域位于第一储库和用于应用包括蛋白质的膜的区域之间,并且其中塑料外壳模塑的顶部部分具有允许递送液体至第一储库的用户可及端口,并且缺少通向第二储库的用户可及端口。在一些实施方式中,用于应用一抗的区域位于第一储库和用于应用包括蛋白质的膜的区域之间,并且其中塑料外壳模塑的顶部部分具有允许递送液体至第一储库的用户可及端口,以及允许空气流入第二储库的用户可及端口。
在一些实施方式中,至少一个储库与芯吸垫通过可移除的非吸收性条状物分离。
在一些实施方式中,芯吸垫和储库是干燥的。
在一些实施方式中,至少一个芯吸垫以及第一储库是湿润的。
在一些实施方式中,芯吸垫上用于应用二抗的区域包括包埋于芯吸垫内的干燥二抗。在一些实施方式中,芯吸垫包括狭槽,其被配置成接受包括二抗的吸收条状物。
在一些实施方式中,芯吸垫上用于应用一抗的区域包括包埋于芯吸垫内的干燥一抗。在一些实施方式中,芯吸垫包括狭槽,其被配置成接受包括一抗的吸收条状物。
还提供了用于进行侧流的试剂盒。在一些实施方式中,该试剂盒包含上述或本文其它地方所述的侧流设备。在一些实施方式中,该试剂盒包括二抗或第二检测试剂。在一些实施方式中,二抗或检测试剂是液体形式。在一些实施方式中,二抗或检测试剂包埋于条状物内。在一些实施方式中,条状物是干燥的。在一些实施方式中,条状物是湿润的。
在一些实施方式中,试剂盒还包括一抗。在一些实施方式中,一抗是液体形式。在一些实施方式中,一抗包埋于条状物内。在一些实施方式中,条状物是干燥的。在一些实施方式中,条状物是湿润的。在一些实施方式中,用报告物分子预标记一抗和/或二抗。在其它实施方式中,用与报告物分子相互作用或作用的分子(例如,生物素或链霉亲和素)标记一抗和/或二抗。
在一些实施方式中,试剂盒还包括没有抗体的条状物,其适合用户施用抗体或检测试剂。在一些实施方式中,该试剂盒包括用于进行侧流的试剂或溶液(运行缓冲液),并且任选地可以包含封闭剂,表面活性剂,预防蛋白质聚集的介质,促进试剂完全均匀流动和/或促进膜上分子反应并使膜上背景最小化的介质。还提供了进行侧流western印迹试验的方法。在一些实施方式中,该方法包括如上或本文其它地方所述的侧流设备;向第一储库和芯吸垫应用运行缓冲液;向用于应用包括蛋白质的膜的区域(i)应用包括分析物或蛋白质的膜(例如,western印迹);向用于应用一抗的区域(ii)应用一抗;并且允许来自第一储库的运行缓冲液侧流至第二储库,从而使得一抗在芯吸垫中运输并且与膜中的蛋白质接触,其中,一抗与膜中如果存在的其靶蛋白接合。
在一些实施方式中,设备密封在塑料外壳中,其中该塑料外壳包括模塑的顶部部分以及与顶部部分密封的平底板,并且该模塑的顶部包括第一储库上可移除的层,以允许施加液体,以及区域(i)和(ii)上的盖子,以允许通向这些区域并且后续闭合该盖子;并且该方法还包括:
去除第一储库上的层,并且向第一储库应用运行缓冲液;并且
打开盖子,并且向芯吸垫应用运行缓冲液和膜,并且后续闭合该盖子以允许由第一储库至第二储库的侧流。
在一些实施方式中,所述向用于应用一抗的区域(ii)应用一抗包括使包括干燥包埋的一抗的多孔条状物与芯吸垫接触,从而一抗从多孔条状物被洗脱至芯吸垫。
在一些实施方式中,该方法还包括向芯吸垫应用二抗或第二检测试剂,从而使得该二抗或第二检测试剂通过侧流流过该芯吸垫并且在一抗接触膜后进入膜中。在一些实施方式中,所述向芯吸垫应用二抗或第二检测试剂包括使包括干燥包埋的二抗的多孔条状物与芯吸垫接触,因此二抗或第二检测试剂从多孔条状物被洗脱至芯吸垫。
在一些实施方式中,该方法还包括在一抗与如果存在的靶蛋白接合后(以及任选地,二抗或第二检测试剂与一抗接触后),去除膜并且检测一抗与如果存在的靶蛋白的接合。在一些实施方式中,一抗通过盖子的一个或多个端口应用于芯吸垫。
附图简要说明
图1描述了本文所述侧流装置的外壳。图的顶部显示了外壳的顶。图的底部显示了外壳的顶(左下)和平底(右下)。
图2描述了外壳以及内部侧流设备的实施方式。此处所示的实施方式是允许递送液体至第一储库的端口。芯吸垫上外壳顶部的盖子允许通向芯吸垫。该盖子可以开启和闭合。
图3描述了外壳以及内部侧流设备的实施方式。该实施方式与图2所示实施方式相似,但是在盖子中包括端口,其在盖子闭合时允许向芯吸垫递送试剂。尽管只描述了一个端口,但是盖子可以具有两个或多个端口。
图4描述了外壳以及内部侧流设备的实施方式。该实施方式与图3所示实施方式相似。在图4的顶部,通过盖子的端口应用包括抗体的条状物,从而将一抗转移至(例如,预湿润的)芯吸垫。图4的底部显示去除包括一抗的条状物,并用包括二抗的条状物替换,所述二抗被转移至芯吸垫。或者,盖子可以具有两个端口,一抗可以应用于一个端口,二抗可以应用于第二个端口。
I.定义
术语“分析物”是指生物分子,例如,蛋白质、核酸、多糖、脂质、抗原、生长因子、半抗原等或其部分。可在表面(如膜)上不可逆地固定分析物并检测,如本文所述。
本文所用的术语“固定”是指可逆或不可逆地固定的分子(例如,结合试剂或分析物)。可逆固定的分子以允许分子或其部分(例如,这些分子的至少25%、50%、60%、75%、80%或更多)从其固定的位置上移去而没有明显变性或聚集。例如,分子可通过将含该分子的溶液与多孔基材接触可逆地固定在多孔基材中或之上,从而吸掉溶液并可逆地固定分子。然后可通过从多孔基材中芯吸溶液,或将溶液从多孔基材的一个区芯吸到另一个区来移去可逆固定的分子。在一些情况中,分子可通过将含该分子的溶液与多孔基材接触可逆地固定在多孔基材上,从而吸掉溶液,然后干燥含溶液的多孔基材。然后可通过将多孔基材接触相同或不同组成的另一种溶液来移去可逆固定的分子,从而溶解可逆固定的分子,然后从多孔基材中芯吸溶液或将溶液从多孔基材的一个区芯吸到另一个区。
固定可逆固定的分子(例如,结合试剂或分析物)使得在温和条件(例如,约4-9的pH,约4-65℃的温度)下它们不被或基本不被从它们的位置上移去。示例性的可逆固定的分子包括通过标准印迹技术(例如,电印迹)与硝酸纤维素或聚偏二氟乙烯膜结合的蛋白质分析物。
术语“结合试剂”是指特异性结合分子(如分析物)的试剂。尽管抗体在本文的许多内容中描述,应当理解的是,如用户所优选,可以使用其它的接合介质而不是抗体。本领域已知多种结合试剂,包括抗体、适体、粘合素(affimer)、脂质运载蛋白(如抗运载蛋白)、硫氧还蛋白A、胆汁三烯结合蛋白或含有锚蛋白重复、葡萄球菌蛋白A的Z结构域或纤连蛋白III型结构域的蛋白。
术语“特异性结合”是指分子(例如,结合试剂如抗体或抗体片段)与靶标结合的亲和性比非靶标化合物高至少2倍,例如至少4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、25倍、50倍、100倍或1000倍或更高。
术语“抗体”是指包含来自免疫球蛋白基因的构架区的多肽或其片段,其特异性结合并识别抗原,例如,特定分析物。通常,“可变区”包含有抗体的抗原结合区(或其功能性等价物)并且对于结合的特异性和亲和性是至关重要的。参见Paul,Fundamental Immunology(《基础免疫学》)(2003)。抗体包括例如嵌合的、人的、人源化的抗体,或单链抗体。
示范性免疫球蛋白(抗体)的结构单元包含四聚体。各四聚体包含相同的两对多肽链,每对包含一条“轻”链(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。每条链的N末端确定约100至110个或更多个氨基酸构成的可变区,所述可变区主要负责抗原识别。术语轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)分别指这些轻链和重链。
“同种型”是由重链恒定区确定的一类抗体。免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因。轻链被归类为κ或λ。重链被归类为γ、μ、α、δ或ε,这进而确定了同种型类别,分别为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
抗体可以完整的免疫球蛋白形式或任何包含特异性抗原结合活性的多种已充分表征片段的形式存在。这样的片段可以通过用多种肽酶消化来产生。胃蛋白酶在铰链区中的二硫键以下消化抗体,产生Fab的二聚体F(ab)'2,Fab本身是由二硫键连接到VH-CH1的轻链。可在温和条件下还原F(ab')2以打断铰链区中的二硫键,从而将F(ab')2二聚体转化为Fab'单体。Fab'单体本质上Fab附带有部分绞链区(参见《基础免疫学》(FundamentalImmunology),Paul编,第3版,1993年)。虽然根据对完整抗体的消化定义了多种抗体片段,但是本领域技术人员会理解,这类片段也可用化学方法或重组DNA方法从头合成。因此,本文中所用术语抗体,也包括通过修饰整个抗体而生成的抗体片段,或用重组DNA方法从头合成所产生(例如,单链Fv),或使用噬菌体展示文库鉴定的那些抗体片段(参见如McCafferty等,Nature 348:552-554(1990))。
发明详述
本发明人发现了有用的侧流设备构造,用于允许使用特异性接合试剂(例如,抗体)有效地侧流检测膜上的蛋白质(例如,western印迹)。在一些实施方式中,本文所述设备可以装配在单次使用外壳中,从而允许经济实惠且简单的试验模式。
本文所述侧流设备构造包括供给液体(缓冲液)的第一储库,可以放置试剂以及包括蛋白质或其它待检测的分析物的一个或多个膜的芯吸垫,以及第二储库,其通过将液体芯吸至干燥第二储库来作为泵。
第一储库可以包括包封在防水覆盖物中的一个或多个吸收垫。该储库与芯吸垫液体连通(即,当液体存在于第一储库时,其可以由第一储库流向芯吸垫)。防水覆盖物可以包括一个或多个端口,任选地用可移除的覆盖物层覆盖,因此当该设备投入使用时,该端口可以被用于递送流体(例如,封闭缓冲液、运行缓冲液)至储库。示例性的封闭缓冲液可以包括,例如,酪蛋白,脱脂奶,合成的阻断剂,明胶,牛血清蛋白(BSA),去污剂和/或表面活性剂,缓冲液和盐,包括但不限于,Tris-缓冲盐水,0.1%吐温20(TBST)或用吐温20或曲通X-100缓冲的磷酸盐盐水(PBST),例如,如通常与western印迹所用。缓冲液中的盐浓度和阻断剂可以用来控制背景,从而在侧流试验中优化信噪比。
芯吸垫是平面吸收材料,其上可以放置检测试剂(例如,抗体)以及包括固定的分析物或蛋白质的膜(例如,western印迹)。芯吸垫可以包括图示/标志或其它针对用户应当在何处放置检测试剂或膜的指示。或者,图示/标志可以在盖子或外壳上。
芯吸垫材料通常将会是吸水材料,并且可由例如天然、合成、玻璃纤维或其混纺制成。非限制性的示例包括棉/纤维素、玻璃、聚丙烯酸酯、人造丝、聚丙烯及其组合。诸如阿尔斯通公司(Ahlstrom)、沃特曼公司(Whatman)(GE)、PALL公司、密理博公司(Millipore)、萨托瑞斯公司(Sartorius)、S&S公司等供应商有许多用于诊断用途的市售材料。在一些实施方式中,可以背衬(back)芯吸垫,以防止在底面流动。这可以例如使用与芯吸垫粘附的粘合剂背衬来实现。粘合剂的性质可能影响试验性能(即,流动特性,试剂稳定性等),所以这可以针对所需试验或应用优化。在一些实施方式中,粘合剂可以是设备平面密封侧的部分。
尽管包括待检测的分析物的膜通常将由用户提供,但是在一些实施方式中,芯吸垫将会具有包埋的检测试剂。例如,在一些实施方式中,一抗或二抗或两者可以被包埋于芯吸垫中的特定位置,从而使得用户将不在需要提供该试剂。作为一个示例,在一些实施方式中,用户将提供膜和一抗,而芯吸垫将具有包埋的二抗或第二试剂,其将特异性地接合待使用的一抗。例如,二抗可以是与可检测标记物连接的山羊抗-兔抗体,用于当一抗是兔抗体时使用。应当理解,可以使用来自不同物种的其它抗体组合。包埋的试剂通常被包埋在芯吸垫中并在其中干燥,因此其是固定的,直到其在侧流下接触水性流体前缘并在用户定义的事件中释放。抗体可以在这样的溶液中沉积,所述溶液在试验期间促进其长期稳定性、降低/消除的聚集和/或均一的释放。
芯吸垫将具有不同的区域。例如,相较于下述其它区域,相对靠近第二储库的一个区域将会被用于放置包括固定的蛋白质的膜。在一些实施方式中,芯吸垫或盖子将具有指示用户何处放置膜的字迹或图示。在一些实施方式中,芯吸垫或外壳可以具有用于推荐试剂等放置位置的字迹或图示或颜色或其它指示物。芯吸垫还将具有用于应用一抗(或其它第一检测试剂)的区域。用于应用第一抗体的区域将会比用于放置膜的区域更靠近第一储库。在一些实施方式中,芯吸垫或盖子将具有指示用户何处放置一抗的字迹或图示。任选地,如上所述,芯吸垫可以具有用于应用用于检测一抗的二抗或其它第二检测试剂的区域。用于应用二抗或其它第二检测试剂的区域(如果存在)将位于用于应用一抗的区域和第一储库之间。在一些实施方式中,芯吸垫或盖子将具有指示用户何处放置二抗或第二检测试剂的字迹或图示。
第二储库作为针对侧流系统的芯吸“泵”,其将包括包封在防水覆盖物(即,外壳)中的一个或多个吸收垫。在一些实施方式中,第二储库可以是垫。该储存库与芯吸垫液体连通(即,当液体存在于芯吸垫时,其可以由芯吸垫流向第二储库)。针对第二储库的防水覆盖物通常不具有对于用户可及的开口,但是在一些实施方式中,可能具有一个或多个孔以允许气体流动。
上述组件可以包含于并且密封在防水外壳中。在一些实施方式中,外壳将会是塑料或其它便宜的防水材料。在一些实施方式中,外壳包括模塑的顶部部分以及密封于顶部部分的平底板。外壳可以例如是真空模塑的或以其它方式构建的。图1示出了这种外壳的一个示例。第一和第二储库可以被模塑的部分101和103所覆盖。较为平坦的芯吸垫被如图1中102所示的外壳的部分所覆盖。在一些实施方式中,外壳不与芯吸垫接触。在一些实施方式中,模塑的顶部部分包括可移除的层,其位于第一储库上,而非第二储库,以允许施加液体。例如,图2描述了第一储库中允许递送流体至第一储库的端口201。使用前,端口201将会被可移除的金属或塑料薄膜或可以容易地被用户去除的其它层所覆盖。例如,薄膜可以通过粘合剂连接。
芯吸垫上顶部外壳部分可以包括盖子或可以被开启和闭合的其它覆盖以提供用户至芯吸垫通道。该用户可以因此向芯吸垫应用流体来湿润芯吸垫,并且还可以应用包括分析物的膜,并且任选地还可以应用检测试剂,诸如一抗和/或二抗。
图2描述了可以被用于提供至芯吸垫通道的盖子202。图2还显示了使用该设备的方法的实施方式。在该方面,芯吸垫与包括分析物的膜(例如,western印迹)接触并且其包括一抗和二抗。该芯吸垫被用户预湿润,并且向第一储库施加运行缓冲液。运行缓冲液通过芯吸从干燥的第二储库抽取,载着一抗然后二抗与膜接触。一般而言,一旦施加了试剂,盖子就将会闭合,以使蒸发最小化。在一些实施方式中,芯吸垫上的盖子包括一个或多个端口,用于在该盖子闭合时将试剂递送至芯吸垫。图3以端口301显示这个方面。图3显示了在设置阶段中的耗材。在一些实施方式中,用户将会打开外壳的中心部分,用运行缓冲液以及任选的封闭缓冲液湿润芯吸垫,并且填充运行缓冲液以及任选的封闭缓冲液储库垫。将膜面朝下置于芯吸垫上。
在图4所述的实施方式中,布置后,用户将闭合盖子,然后通过盖子上的开放端口,首先将放置一抗储库条状物,并且允许该体积被抽取至侧流试验足够长的时间以允许抗体转移至该芯吸垫(例如,1或多个小时)。该用户可以手动去除该条状物,然后放置二抗储库条状物,允许该体积被抽取至侧流试验足够时间以实现将抗体转移至该芯吸垫(例如,1或多个小时)。然后可以将该条状物去除,并且用最终轮缓冲液条状物替换或留白。该过程需要用户与耗材最小限度的相互作用,但是可能会获得更敏感的结果,因为两种抗体在侧流试验过程中有时间与膜相互作用而混合机会较少。
在一些方面,可以干燥和/或包埋于芯吸垫中的方式提供一些或所有检测试剂。例如,在一些实施方式中,一抗和二抗或第二检测试剂被干燥地包埋于芯吸垫。在这样的方面,用户仅仅提供包括固定的分析物的膜,然后向第一储库以及任选的芯吸膜添加运行缓冲液,并且然后允许运行缓冲液将抗体和试剂移动至膜。
在一些方面,用户将提供一些或所有检测试剂。例如,在一些实施方式中,芯吸垫将包括包埋的二抗或第二检测试剂,并且该用户将提供一抗。在这样的方面,用户将向芯吸垫应用包括固定的分析物的膜以及一抗。一抗可以液体形式提供,或者,在多孔基材条状物上干燥。示例性的多孔基材述于例如WO2015/131142中。可以将在多孔基材条状物上干燥的抗体或其它试剂应用于芯吸垫上的适当位置。一旦芯吸垫被润湿,抗体将从多孔基材流至芯吸垫。
在一些实施方式中,多孔材料是玻璃纤维。在一些实施方式中,多孔基材可包括但不限于含聚合物的基材。聚合物可以是聚合物珠、聚合物膜或聚合物整料的形式。一些情况中,聚合物是纤维素。含纤维素的基质包括纸、布、织造或非织造纤维素基质。布料基质包括含有天然纤维素纤维如棉或羊毛的那些。纸基质包括含有天然纤维素纤维(例如,纤维素或再生纤维素)的那些以及含有纤维素纤维衍生物的那些,所述衍生物包括但不限于:纤维素酯(例如,硝酸纤维素,乙酸纤维素、三乙酸纤维素、丙酸纤维素、乙酸-丙酸纤维素、乙酸-丁酸纤维素和硫酸纤维素),和纤维素醚(例如,甲基纤维素、乙基纤维素、乙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟乙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基羟乙基纤维素和羧甲基纤维素)。一些情况中,纤维素基质含有人造丝。一些情况中,基质是纸,例如各种纸。
多孔基材也可包括,但不限于含有烧结材料的基材。例如,基材可含有烧结玻璃、烧结聚合物或烧结金属,或其组合。在一些情况中,通过烧结一种或多种粉状玻璃、粉状聚合物或粉状金属来形成烧结材料。其它情况中,通过烧结一种或多种玻璃、金属或聚合物纤维来形成烧结材料。其它情况中,由烧结一种或多种玻璃、聚合物或金属珠来形成烧结材料。
多孔基材还可含有但不限于一种或多种非纤维素聚合物,例如合成聚合物、天然聚合物或半合成聚合物。例如,基材可含有聚酯,例如聚乙交酯、聚乳酸、聚己内酯、聚己二酸乙二醇酯、聚羟基烷酸酯、聚羟基丁酸酯、3-羟基丁酸-共聚-3-羟基戊酸、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚对苯二甲酸丁二醇酯、聚对苯二甲酸1,3-丙二酯、萘二甲酸乙二醇酯、一些情况中,基材是纺粘的,例如纺粘聚酯。
其它合成聚合物包括但不限于:尼龙、聚丙烯、聚乙烯(polyethylene)、聚苯乙烯、二乙烯基苯、聚乙烯(polyvinyl)、聚二氟乙烯、高密度聚二氟乙烯、(C2-C6)单烯烃聚合物、乙烯基芳族聚合物、乙烯基氨基芳族聚合物、卤乙烯聚合物、(C1-C6)烷基(甲基)丙烯酸酯聚合物、(甲基)丙烯酰胺聚合物、乙烯基吡咯烷酮聚合物、乙烯基吡啶聚合物、(C1-C6)羟烷基(甲基)丙烯酸酯聚合物、(甲基)丙烯酸聚合物、丙烯酰胺基甲基丙磺酸聚合物、含N-羟基的(C1-C6)烷基(甲基)丙烯酰胺聚合物、丙烯腈或前述任意物质的混合物。
在一些实施方式中,用户将提供一抗和二抗或检测试剂(如果需要)。它们可以液体形式或以多孔条状物中的干燥形式提供。
侧流设备可以各种形式提供给用户。在一些实施方式中,三个组件(两个吸收垫(储库)和芯吸垫)将干燥运输。在其他实施方式中,吸收垫中的一个以及芯吸垫以预湿的形式提供;将会存在连接其它吸收垫并且启动侧流泵的可移除的层/屏障。
将抗体或试剂导入芯吸垫的其它方式可以包括被包埋于盖子中的储库,以及与标准侧流设备相似并且对本领域技术人员熟悉的芯吸垫接触的储库。
本领域已知许多吸收吸水垫材料、芯吸垫材料和抗体施用材料,可以从其中进行选择,以控制体积,以控制系统的流速,以保证均匀的流动,并且以包括由条状物完整地递送抗体/试剂。条状物的位置、宽度和间隔可以针对所需特定印迹试验进行优化。影响试剂/抗体递送时间的其它方法,诸如在芯吸垫中使用曲折的路径或控制抗体条状物的接触范围,从而控制抗体去除的速率是可能的。同样,控制侧流过程的其它实施方式可以经工程改造成塑料外壳,其中表面可以包含倾斜区域以使用重力延缓或加速液体的流动。
除了针对一抗和任选的二抗或第二检测试剂的区,还有可能通过应用用运行或其它洗涤溶液湿润的条状物进一步在抗体之间引入洗涤区,以便于进一步去除背景信号并导致该过程中的灵敏度提高。
图中示出的是可消耗设备,其容纳一个小型凝胶尺寸的膜。通常用户使用被称为中等尺寸印迹的膜进行western印迹,所述印迹通常是2x宽的微型膜。在其它western印迹应用中,用户可以将小型和/或中型膜切成更小的部分,其对应于用于电泳和转移蛋白质的原始凝胶的几条泳道。因此,在一些实施方式中,可消耗侧流设备可以是适应小型或中型膜的尺寸。在其它实施方式中,可将单独的脊模塑于或以其它方式存在于可以放置膜部分的耗材的基部。在这后续设置中,载有不同抗体的较小条状物可以被置于各部分的头部,以促进在相同装置中以不同抗体对膜的各部分进行western印迹探测。
在该western印迹侧流设备的其它实施方式中,可以将抗体混合并且加入条状物以促进在单一样品中靶标的多重检测。
在其他实施方式中,取决于用户在侧流western处理完成后所需的检测形式,可以用针对化学发光检测的HRP、荧光或比色标签或其他酶/标签标记不同的二抗。
示例性的检测试剂
本文描述结合试剂用于检测分析物。在一些情况中,结合试剂是抗体(例如,一抗或二抗)。一抗可用于结合分析物。在一些情况中,一抗经标记使得能够检测一抗并因此检测分析物。在一些情况中,通过结合至标记的二级结合试剂,如标记的二抗来检测一抗。在一些情况中,使用三级结合试剂来检测含有分析物和一级结合试剂以及二级结合试剂的复合物。
ii.标记物
可通过检测与结合试剂连接的标记物来检测分析物。该标记物可直接连接至结合试剂(例如,通过与一抗的共价键或其它键)或可以间接连接(例如使用螯合剂或接头分子)。术语“标记物”和“可检测标记物”在本文中同义使用。在一些实施方式中,各标记物(如连接至第一结合试剂的第一标记物、连接至第二结合试剂的第二标记物等)生成可检测信号且这些信号(例如第一标记生成的第一信号、第二标记生成的第二信号等)是可区分的。在一些实施方式中,两种或更多种结合试剂标记物包含相同类型的试剂(例如作为第一标记物的第一荧光剂和作为第二标记物的第二荧光剂)。在一些实施方式中,两种或更多种结合试剂标记物(如第一标记物、第二标记物等)联合生成可检测信号,该可检测信号是在一种或多种标记物不存在时无法生成的。
可检测标记的示例包括但不限于:生物素/链霉亲和素标记、核酸(例如寡核苷酸)标记、化学反应性标记、荧光标记、酶标记、放射性标记、量子点、聚合物点、质量标记、胶体金及其组合。在一些实施方式中,标记可包括光学试剂,如生色团、荧光剂、磷光剂、化学发光剂等。多种试剂(如染料、探针或指示剂)是本领域已知的并可用于本发明。(参见例如英杰公司(Invitrogen),The Handbook—A Guide to Fluorescent Probes and LabelingTechnologies(《手册——荧光探针和标记技术指导》),第10版(2005))。生色团包括具有可测吸光的辅酶和辅因子。一些情况中,可通过检测肽键在例如220或280nm处的固有吸光来检测结合试剂。
荧光剂可包括多种有机和/或无机小分子或多种荧光蛋白及其衍生物。例如,荧光剂可包括但不限于:花青、酞菁、卟啉、吲哚菁、若丹明、吩噁嗪、苯基呫吨、吩噻嗪、吩硒嗪、荧光素(例如FITC、5-羧基荧光素和6-羧基荧光素)、苯并卟啉、方酸菁、二吡咯并嘧啶酮、并四苯、喹啉、吡嗪、咕啉、克酮酸、吖啶酮、菲啶、若丹明(例如TAMRA、TMR和若丹明红)、吖啶、蒽醌、硫族吡喃鎓(chalcogenopyrylium)类似物、氯、萘菁、次甲基染料、方菁染料、偶氮化合物、甘菊蓝、氮杂甘菊蓝、三苯基甲烷型染料、吲哚、苯并吲哚、吲哚羰花青、苯并吲哚羰花青、BODIPYTM和BODIPYTM衍生物,及其类似物。在一些实施方式中,荧光剂是Alexa Fluor染料。在一些实施方式中,荧光剂是聚合物点或量子点。荧光染料和荧光标记物试剂包括可购自英杰/分子探针公司(Invitrogen/Molecular Probes)(俄勒冈州尤金市)和皮尔斯生物技术公司(Pierce Biotechnology,Inc.)(伊利诺斯州洛克福德)的那些。在一些实施方式中,该光学试剂是插入染料。在一些实施方式中,2、3、4、5或更多种结合试剂各自标记有光学试剂如荧光剂(例如第一结合试剂标记有第一荧光标记物,第二结合试剂标记有第二荧光标记物等),且通过检测该光学试剂生成的信号(例如荧光标记物生成的荧光信号)来检测标记有光学试剂的各结合试剂。在一些实施方式中,所有结合试剂都标记有光学试剂,且带有光学试剂标记的各结合试剂都通过检测该光学试剂生成的信号来测得。
在一些实施方式中,该标记物是放射性同位素。放射性同位素包括放射性核素,其发射γ射线、正电子、β和α粒子和X射线。合适的放射性核素包括但不限于:225Ac、72As、211At、11B、128Ba、212Bi、75Br、77Br、14C、109Cd、62Cu、64Cu、67Cu、18F、67Ga、68Ga、3H、166Ho、123I、124I、125I、130I、131I、111In、177Lu、13N、15O、32P、33P、212Pb、103Pd、186Re、188Re、47Sc、153Sm、89Sr、99mTc、88Y和90Y。在一些实施方式中,2、3、4、5或更多种结合试剂各自标记有放射性同位素(例如第一结合试剂标记有第一放射性同位素标记,第二结合试剂标记有第二放射性同位素标记等),且标记有放射性同位素的各结合试剂通过检测该放射性同位素生成的放射性来测得。例如,一种结合试剂可标记有γ发射子,而一种结合试剂可标记有β发射子。或者,这些结合试剂可标记有以可辨识性不同能级发射同一粒子(例如,α、β或γ)的放射性核素。在一些实施方式中,所有结合试剂都标记有放射性同位素,且各带标记结合试剂可通过检测该放射性同位素生成的放射性来测得。
在一些实施方式中,标记物是酶,并通过检测该酶生成的产物来检测结合试剂。合适的酶的示例包括但不限于:脲酶、碱性磷酸酶、(辣根)过氧化氢酶(HRP)、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶和水解二乙酸荧光素的酯酶。例如,辣根过氧化物酶检测系统可与生色底物四甲基联苯胺(TMB)联用,其在过氧化氢存在下产生在450nm处可检测的可溶产物。碱性磷酸酶检测系统可与生色底物对硝基苯基磷酸盐联用,其产生405nm处易测的可溶性产物。β-半乳糖苷酶检测系统可与生色底物邻硝基苯-β-D-半乳糖苷(ONPG)联用,产生在410nm可测的可溶性产物。脲酶检测系统可与底物如脲溴甲酚紫(西格玛免疫化学品公司(Sigma Immunochemicals),密苏里州圣路易斯)联用。在一些实施方式中,2、3、4、5或更多种结合试剂各自标记有酶(例如第一结合试剂标记有第一酶,第二结合试剂标记有第二酶等),且标记有酶的各结合试剂通过检测该酶生成的产物来测得。在一些实施方式中,所有结合试剂都标记有酶,且带有酶标记的各结合试剂都通过检测该酶生成的产物来测得。
在一些实施方式中,该标记物是亲和标签。合适的亲和标签的示例包括但不限于:生物素、肽标签(如FLAG标签、HA标签、His标签、Myc标签、S标签、SBP标签、Strep标签、eXact标签)和蛋白质标签(如GST标签、MBP标签、GFP标签)。
在一些实施方式中,该标记物是核酸标记物。合适的核酸标记物的示例包括但不限于:寡核苷酸序列、单链DNA、双链DNA、RNA(如mRNA或miRNA)或DNA-RNA杂交体。在一些实施方式中,该核酸标记物的长度是约10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1000个核苷酸。
在一些实施方式中,该标记是核酸条码。如本文所用条码摂是专一限定带标记分子的或带标记结合试剂上结合的第二分子的短核苷酸序列(例如,长至少约4、6、8、10或12个核苷酸)。条码序列的长度决定了可以区分多少独特的样品。例如,4个核苷酸的条码能区分不多于44即256个样品;6个核苷酸的条码能区分不多于4096个不同样品;而8个核苷酸的条码能标引不多于65,536个不同样品。本领域熟知条码技术的应用,参见例如KatsuyukiShiroguchi等Digital RNA sequencing minimizes sequence-dependent bias andamplification noise with optimized single-molecule barcodes(数字式RNA测序用优化的单分子条码降低序列依赖性偏置和扩增噪音),PNAS(2012)和Smith,AM等NucleicAcids Research Can 11,(2010)。
在一些实施方式中,该标记物是“点击”化学部分。点击化学使用简单稳健的反应(如铜催化的炔和叠氮化物的环加成)来建立分子间连接。对于点击化学的综述,参见Kolb等,Agnew Chem 40:2004-2021(2001)。在一些实施方式中,点击化学部分(如叠氮化物或炔部分)可使用另一种可检测标记(例如带荧光标记、生物素化或放射性标记的炔或叠氮化物部分)来检测。
接合可检测标记物与结合试剂如蛋白质(例如,抗体)的技术是熟知的。例如,常见蛋白标记技术的综述可参见Biochemical Techniques:Theory and Practice(《生物化学技术:理论和实践》),John F.Robyt和Bernard J.White,维弗兰德出版公司(WavelandPress,Inc.)(1987)。其他标记技术综述于,例如,R.Haugland,Excited States ofBiopolymers(《生物聚合物的兴奋状态》),Steiner编,普莱南出版社(Plenum Press)(1983);Fluorogenic Probe Design and Synthesis:A Technical Guide(《荧光探针设计与合成:技术指南》),PE应用生物系统公司(PE Applied Biosystems)(1996);以及G.T.Herman,Bioconjugate Techniques(《生物偶联技术》),学术出版社(Academic Press)(1996)。
在一些实施方式中,两种或更多标记(如第一标记物、第二标记物等)联合生成可检测信号,该可检测信号在所述多种标记物缺失其一或其中多个时不会生成。例如,在一些实施方式中,各标记物是酶,且这些酶的活性联合生成可检测信号来指示标记物(并因此指示各带标记的蛋白质)的存在。联合生成可检测信号的酶的示例包括成对的试验,例如使用己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的成对试验;以及针对与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、β-D-半乳糖苷酶或碱性磷酸酶试验偶联的NAD(P)H的化学发光试验。参见例如,Maeda等,JBiolumin Chemilumin 1989,4:140-148。
本说明书中引用的所有专利、专利申请和其它公开的参考材料都通过引用全文结合入本文中。在本说明书和权利要求书中所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括多个指示物,除非上下文中有明显的表示。
Claims (34)
1.一种侧流设备,其包括:
包含多孔基材的芯吸垫,所述芯吸垫具有:
(i)用于应用包括固定的分析物的膜的区域;和
(ii)用于应用一抗的区域;并且
其中,所述芯吸垫具有第一边缘和第二边缘和两个侧边缘,
第一储库,其包括与所述芯吸垫第一侧邻近的第一吸收垫;和
第二储库,其包括与所述芯吸垫第二侧邻近的第二吸收垫。
2.如权利要求1所述的设备,其中,所述分析物是蛋白质。
3.如权利要求1所述的设备,其中,所述芯吸垫还包括:
(iii)用于应用二抗或其它第二检测试剂的区域。
4.如权利要求1所述的设备,其中,所述设备密封在塑料外壳中。
5.如权利要求4所述的设备,其中,所述塑料外壳包括模塑的顶部部分以及密封于所述顶部部分的平底板。
6.如权利要求4或5所示的设备,其中,所述模塑的顶部部分包括被所述第一储库上的可移除的层所覆盖的端口以允许施加液体,并且任选地,所述模塑的顶部部分包括被所述第二储库上的可移除的层所覆盖的端口以允许空气流动。
7.如权利要求6所述的设备,其中,所述可移除的层包含金属或塑料薄膜。
8.如权利要求4-7中任一项所述的设备,其中,所述模塑的顶部部分包括所述区域(i)、(ii)和(iii)上的盖子,以允许通向所述区域并且后续闭合所述盖子。
9.如权利要求8所述的设备,其中,所述盖子包括端口以允许在所述盖子闭合时通过所述端口将试剂递送至所述芯吸垫。
10.如权利要求4-9中任一项所述的设备,其中,所述用于应用一抗的区域位于所述第一储存库和所述用于应用包括蛋白质的膜的区域之间,并且其中,所述塑料外壳的所述模塑的顶部部分:
具有用户可及的端口以允许将液体递送至所述第一储库,并且
(i)缺少通向所述第二储库的用户可及的端口,并且任选地,在围绕所述第二储库的外壳中具有孔,以允许空气流动,或者(ii)在所述第二储库周围具有用户可及的端口以允许空气流动。
11.如权利要求4所述的设备,其中,至少一个所述储库与所述芯吸垫通过可移除的非吸收性条状物分离。
12.如权利要求1所述的设备,其中,所述芯吸垫和储库是干燥的。
13.如权利要求1所述的设备,其中,至少一个所述芯吸垫、所述第一储库以及所述第二储库是湿润的。
14.如权利要求3所述的装置,其中,所述芯吸垫上用于应用二抗的区域包括包埋于所述芯吸垫中的干燥二抗。
15.如权利要求1所述的装置,其中,所述芯吸垫上用于应用一抗的区域包括包埋于所述芯吸垫中的干燥一抗。
16.一种用于侧流的试剂盒,所述试剂盒包括权利要求1-15中任一项所述的设备。
17.如权利要求16所述的试剂盒,其还包括二抗。
18.如权利要求17所述的试剂盒,其中,所述二抗是液体形式。
19.如权利要求17所述的试剂盒,其中,所述二抗被包埋于条状物上。
20.如权利要求19所述的试剂盒,其中,所述条状物是干燥的。
21.如权利要求19所述的试剂盒,其中,所述条状物是湿润的。
22.如权利要求16-21中任一项所述的试剂盒,其还包括一抗。
23.如权利要求22所述的试剂盒,其中,所述一抗是液体形式。
24.如权利要求22所述的试剂盒,其中,所述一抗被包埋于条状物上。
25.如权利要求24所述的试剂盒,其中,所述条状物是干燥的。
26.如权利要求24所述的试剂盒,其中,所述条状物是湿润的。
27.如权利要求16-21中任一项所述的试剂盒,其还包括缺少抗体的条状物,其适合抗体的用户使用。
28.一种进行侧流western印迹试验的方法,所述方法包括:
提供权利要求1-15中任一项所述的设备;
向所述第一储库和所述芯吸垫应用运行缓冲液;
向所述用于应用包括蛋白质的膜的区域(i)应用包括蛋白质的膜(例如,western印迹);
向所述用于应用一抗的区域(i)应用一抗;
允许所述运行缓冲液从所述第一储库侧流至所述第二储库,从而所述一抗被运输到所述芯吸垫中并且与所述膜中的蛋白质接触,其中,所述一抗与所述膜中如果存在的其靶蛋白结合。
29.如权利要求28所述的方法,其中,所述设备密封在塑料外壳中,其中,所述塑料外壳包括模塑的顶部部分以及密封于所述顶部部分的平底板,并且所述模塑的顶部包括所述第一储库上可移除的层以允许施加液体,以及区域(i)和(ii)上的盖子,以允许通向所述区域并且后续闭合所述盖子;并且
所述方法还包括:
去除所述第一储库上的层,并且向所述第一储库应用运行缓冲液;
打开所述盖子,并且向所述芯吸垫应用运行缓冲液和所述膜,并且后续闭合所述盖子以允许从所述第一储库至所述第二储库的侧流。
30.如权利要求28-29中任一项所述的方法,其中,所述向用于应用一抗的区域(ii)应用一抗包括使包括干燥包埋的一抗的多孔条状物与芯吸垫接触,从而所述一抗从所述多孔条状物被洗脱至所述芯吸垫。
31.如权利要求28-30中任一项所述的方法,其还包括向所述芯吸垫应用二抗或第二检测试剂,从而所述二抗或第二检测试剂通过侧流流过所述芯吸垫并且在所述一抗接触所述膜后进入所述膜中。
32.如权利要求31所述的方法,其中,所述向芯吸垫应用二抗或第二检测试剂包括使包括干燥包埋的二抗的多孔条状物与所述芯吸垫接触,从而所述二抗或第二检测试剂从所述多孔条状物被洗脱至所述芯吸垫。
33.如权利要求28-31中任一项所述的方法,其还包括在所述一抗与如果存在的所述靶蛋白接合后(以及任选地,所述二抗或第二检测试剂与所述一抗接触),去除所述膜并且检测所述一抗与如果存在的所述靶蛋白的接合。
34.如权利要求29所述的方法,其中,所述一抗通过所述盖子中的端口应用于所述芯吸垫。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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