CN108472335A - 包含人乳肽的婴儿配方产品 - Google Patents
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Abstract
包含一种或多种人β‑酪啡肽或其前体蛋白质的婴儿配方组合物。
Description
技术领域
本发明涉及接近模拟人母乳组成的婴儿配方组合物。特别地，本发明涉及含有衍生自β-酪蛋白的人β-酪啡肽的婴儿配方组合物。
发明背景
婴儿母乳喂养至少在出生后的前六个月并且优选另外6至12个月的益处已经确立。众所周知，人母乳保护婴儿免受感染，并且降低健康问题包括糖尿病、肥胖和哮喘的发生率。人们普遍可接受的是，母乳喂养婴儿的整个肠内微生物区系提供了抗感染特性，并且是免疫系统的出生后发育的重要刺激因素。母乳被普遍认为是新生儿的最佳营养来源。然而，还众所周知，许多母亲不能母乳喂养她们的婴儿，因此使用婴儿配方产品(也称为乳配方产品)喂养婴儿是优选的，或者在某些情况下是唯一的选择。
成熟人乳含有3-5％脂肪，0.8-0.9％蛋白质，6.9-7.2％碳水化合物(以乳糖计算)和0.2％矿物质成分。主要人乳蛋白质是乳清和酪蛋白。这些蛋白质的平衡使得消化快速并且容易。乳清蛋白质浓度从泌乳早期开始下降，并且继续下降。这些变化导致泌乳早期乳清/酪蛋白比例为约90:10，成熟乳中为60:40，并且泌乳后期为50:50。人乳的主要蛋白质与牛科动物β-酪蛋白同源的酪蛋白、α-乳清蛋白、乳铁蛋白、免疫球蛋白IgA、溶菌酶和血清白蛋白。人乳的基本氨基酸模式非常类似于对人类婴儿发现最佳的模式。
婴儿配方产品的组成基于大约在产后1-3个月的人母乳设计。最常用的婴儿配方产品含有来自牛科动物乳的纯化的乳清和酪蛋白作为蛋白质来源，植物油混合物作为脂肪来源，乳糖作为碳水化合物来源，维生素-矿物质混合物，以及取决于制造商的其它成分。此外，一些婴儿配方产品使用大豆作为蛋白质来源代替牛科动物乳，并且一些婴儿配方产品使用水解成其组分氨基酸的蛋白质，用于对其它蛋白质过敏的婴儿。除了人母乳之外，婴儿配方产品也是医学界认为一岁以下婴儿营养上可接受的仅有的其它乳制品(与母牛乳、山羊乳或多种组分的后续配方产品相对)。
牛科动物乳典型地包含约30克/升蛋白质。酪蛋白构成该蛋白质的最大组分(80％)，而β-酪蛋白占酪蛋白的约37％。在过去的二十年中，在许多健康障碍中涉及酪蛋白，特别是β-酪蛋白的大量证据已经逐步出现。
β-酪蛋白家族包含许多变体，其通常称为A1、A2、A3、B、C、D、E、F、G、H等。A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白是大多数人群中消耗的乳中主要的β-酪蛋白。申请人等在先已经确定了乳和乳制品中A1β-酪蛋白的消耗与某些健康病症的发生率之间的联系，包括I型糖尿病(WO1996/014577)、冠心病(WO 1996/036239)和神经障碍(WO 2002/019832)。此外，申请人已经显示A1β-酪蛋白与肠炎症(WO 2014/193248)、乳糖不耐受(WO 2015/005804)和高血糖水平(WO 2015/026245)之间的联系。
A1β-酪蛋白与A2β-酪蛋白的不同之处仅在于单一氨基酸。组氨酸位于A1β-酪蛋白的209个氨基酸序列的第67位，而脯氨酸位于A2β-酪蛋白的相同位置。然而，这种单一氨基酸差异对于肠中β-酪蛋白的酶消化至关重要。第67位的组氨酸的存在使得在酶消化时产生包含7个氨基酸的蛋白质片段，称为β-酪啡肽-7(BCM-7)。因此，BCM-7是A1β-酪蛋白的消化产物。在A2β-酪蛋白的情况中，第67位被脯氨酸占据，这阻碍了该位置氨基酸键的裂解。BCM-7不是A2β-酪蛋白的消化产物。
基于β-酪蛋白在第67位具有脯氨酸还是组氨酸，所有β-酪蛋白可以分为A1型或A2型。因此，β-酪蛋白的A1型包括A1、B、C、G和Hβ-酪蛋白，而β-酪蛋白的A2型包括A2、A3、D、E和Fβ-酪蛋白。因此，A1型β-酪蛋白能够在消化时产生BCM-7。A2型β-酪蛋白不能产生BCM-7。
β-酪啡肽(BCM)是衍生自β-酪蛋白的具有生物活性的阿片样肽。已知乳中存在的蛋白酶在摄入之前和消化过程中从β-酪蛋白中释放出BCM。BCM在肽链长度方面不同，例如，BCM-4包含4个氨基酸，而BCM-7包含7个氨基酸。所有BCM显然都具有阿片样物质活性，但是具有不同的亲和力。通常，BCM越短，则对阿片样受体的亲和力越强。牛科动物BCM与人BCM在结构上相似，但不完全相同。例如，牛科动物和人BCM-7的差别在于在肽的第4和5位处的2个氨基酸。这些结构差异影响BCM-7的阿片样物质活性。牛科动物BCM已显示出比人BCM有效至少10倍(即对μ-阿片样受体具有更大的结合亲和力)。
申请人目前已发现人BCM-7(hBCM-7)与牛BCM-7(bBCM-7)相比表现出优先的神经原性效应，因此相对于bBCM-7对脑生长和发育具有积极作用。因此，预计含有人BCM和/或人BCM的肽前体的婴儿配方产品将有益于婴儿的健康和发育。
因此，本发明基于将人母乳中发现的肽掺入婴儿配方组合物中。这些肽优选但不限于hBCM-5、hBCM-7和作为hBCM-5和hBCM-7的前体的肽。相关的益处包括脑生长和发育以及改善的免疫系统发育。
因此，本发明的一个目的在于提供含有一种或多种人β-酪啡肽或其生物学前体的婴儿配方组合物，或至少提供现有组合物的有用替代物。
发明概述
本发明的第一个方面提供了婴儿配方组合物，其包含一种或多种人β-酪啡肽或其前体肽。一种或多种人β-酪啡肽可以是任何的BCM-4至BCM-24，但优选BCM-5和/或BCM 7。
在第二个方面，提供了用于制备婴儿配方组合物的方法，包括向成分混合物中添加一种或多种人β-酪啡肽的步骤。
在另一个方面，提供了本发明的婴儿配方组合物作为婴儿食品的用途。
在另一个方面，提供了一种或多种人β-酪啡肽或其前体肽在制备婴儿配方组合物中的用途。
附图简述
图1显示牛科动物A1β-酪蛋白、牛科动物A2β-酪蛋白和人β-酪蛋白的部分氨基酸序列。
图2显示描绘人BCM-7(hBCM-7)和牛科动物BCM-7(bBCM-7)之间基因表达(DET)和基因启动子甲基化水平(DMT)的对比模式的Venn图A和B。
图3A是用显示广泛神经元分化的盐水对照处理的放大的胎儿干细胞的图像。
图3B是用显示广泛神经元分化的1μM吗啡处理的放大的胎儿干细胞的图像。
图3C是用显示与bBCM-7相比更高神经元分化的1μM hBCM-7处理的放大的胎儿干细胞的图像。
图3D是用显示与hBCM-7相比更低神经元分化的1μM bBCM-7处理的放大的胎儿干细胞的图像。
图4显示hBCM-7、bCM-7和bBCM-9的GSH:GSSG之比。
图5显示hBCM-7、bCM-7和bBCM-9的SAM/SAH之比。
图6显示hBCM-7、bCM-7和bBCM-9的CpG甲基化水平。
详细描述
本发明涉及婴儿配方组合物，其包含人β-酪啡肽(BCM)，特别是BCM-5、BCM-7和/或前体肽。
术语“β-酪啡肽”是指衍生自乳蛋白质β-酪蛋白的消化的任何肽。
术语“婴儿配方产品”是指为12个月龄以下的婴儿喂养而设计的加工食品，通常制备用于用粉末(与水混合)或液体(有或没有额外的水)进行瓶喂养或杯喂养。美国联邦食品、药品和化妆品法案(U.S.Federal Food,Drug,and Cosmetic Act)(FFDCA)将婴儿配方产品定义为“一种食品，其目的在于或代表了由于其模拟人乳或其适合作为人乳的完全或部分替代物而仅作为婴儿食品的特别膳食用途”。婴儿配方产品的设计大致基于产后约一至三个月的人母乳。最常用的婴儿配方产品含有纯化的母牛乳乳清和酪蛋白作为蛋白质来源，植物油混合物作为脂肪来源，乳糖作为碳水化合物来源，维生素-矿物质混合物和取决于制造商的其它成分。
术语“前体肽”是指可以被消化或以其它方式转化或分解成另外的肽或者是另外的肽的结构类似物的任何肽。典型地，前体肽的氨基酸链在一个或多个位置被裂解以产生具有更少氨基酸残基的肽。例如，BCM-9和BCM-11是BCM-5的前体肽。特别的肽的“结构类似物”包括具有与特别的肽相同生物学功能的任何肽或肽模拟物，尽管其与特别的肽具有不同的结构。
术语“乳粉”，也称作“粉末乳”或“干燥乳”，是指已经蒸发至干燥并且已经形成粉末或加工以形成粉末的乳。
如上所述，牛科动物β-酪蛋白可以分类为A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白。这两种蛋白质是大多数人群中消耗的乳中主要的β-酪蛋白。A1β-酪蛋白与A2β-酪蛋白的不同之处在于单一氨基酸。组氨酸位于A1β-酪蛋白的209个氨基酸序列的第67位，而脯氨酸位于A2β-酪蛋白的相同位置。然而，这种单一的氨基酸差异对于肠中β-酪蛋白的酶消化至关重要。第67位的组氨酸的存在使得在酶消化时产生包含7个氨基酸的蛋白质片段，称为β-酪啡肽-7(BCM-7)。因此，BCM-7是A1β-酪蛋白的消化产物。在A2β-酪蛋白的情况中，第67位被脯氨酸占据，其阻碍了该位置处的氨基酸键的裂解。因此，BCM-7不是A2β-酪蛋白的消化产物。
其它β-酪蛋白变体例如Bβ-酪蛋白和Cβ-酪蛋白在第67位也具有组氨酸，而其它变体例如A3、D和E在第67位具有脯氨酸。但是，这些变体在来自欧洲来源的母牛的乳中仅以极低的水平被发现，或者完全没有被发现。因此，在本发明的上下文中，术语“A1β-酪蛋白”是指在第67位具有组氨酸的任何β-酪蛋白，并且术语“A2β-酪蛋白”是指在第67位具有脯氨酸的任何β-酪蛋白。
BCM-5和BCM-7被认为是BCM中更重要的。它们对阿片样受体具有最高的亲和力，因此是BCM肽中研究最多的。已经研究了人母乳中BCM-5和BCM-7的存在(Jarmolowska等人,Peptides,2007,28,1982-1986)。发现在初乳中BCM-5(高5倍)和BCM-7(高8倍)的浓度均显著高于成熟乳。发现存在于人母乳中的BCM-5的量范围为约5μg/L(初乳)至约0.5μg/L(四个月)，并且对于BCM-7，从约3μg/L(初乳)至约0.3μg/L(四个月)。在初乳中，发现BCM-5和BCM-7的存在比例为约1.6:1，在分娩后一个月采集的乳为约2.5:1，并且在分娩后4个月采集的乳为约1.7:1。由于BCM富含脯氨酸，所以它们对大多数蛋白酶的攻击具有高度抵抗力。这意味着BCM可以以不变的形式到达肠并且影响肠粘膜。在出生后的前12天肠粘膜和免疫系统的不成熟意味着在此期间生物分子的肠渗透性很高。初乳中高水平的BCM-5和BCM-7表明，它们不仅可以影响胃肠道，还可以在通过肠屏障并且进入体循环后影响整个生物体。
从图1可以看出，人β-酪蛋白与牛科动物A1β-酪蛋白或A2β-酪蛋白不同。更特别地，编码BCM-7的序列在物种间是不同的。因此，这些肽具有不同的作用。
申请人已经研究了牛科动物BCM和人BCM之间的功能差异，并且发现某些人BCM相对于其牛科动物对应物具有潜在重要的有益特征。研究结果对婴儿配方产品的生产具有重要意义，特别是在婴儿配方产品中使用人BCM用于婴儿肠发育、脑生长和发育以及免疫系统发育。
因此，本发明提供了包含一种或多种人β-酪啡肽或其前体肽的婴儿配方组合物。一种或多种人β-酪啡肽可以是任何的BCM-4至BCM-24(即BCM-4、BCM-5、BCM-6、BCM-7、BCM-8、BCM-9、BCM-10、BCM-11、BCM-12、BCM-13、BCM-14、BCM-15、BCM-16、BCM-17、BCM-18、BCM-19、BCM-20、BCM-21、BCM-22、BCM-23和BCM-24的任一种)，但是优选BCM-5和/或BCM 7。前体肽可以选自BCM-4、BCM-5、BCM-6、BCM-7、BCM-8、BCM-9、BCM-10、BCM-11、BCM-12、BCM-13、BCM-14、BCM-15、BCM-16、BCM17、BCM-18、BCM-19、BCM-20、BCM-21、BCM-22、BCM-23和BCM-24的任一种的结构类似物。
在本发明的一些实施方案中，组合物还包含衍生自牛科动物乳的β-酪蛋白，其中乳的总β-酪蛋白含量包含至少50％w/w A2β-酪蛋白，优选至少90％w/w A2β-酪蛋白，例如至少91％、至少95％、至少98％、至少99％或者甚至100％w/w A2β-酪蛋白。
虽然优选β-酪蛋白变体是A2β-酪蛋白，但是应当理解A2β-酪蛋白可以是任何A2型β-酪蛋白变体，即任何的A2、A3、D、E和Fβ-酪蛋白，它们在β-酪蛋白氨基酸序列的第67位具有脯氨酸。在本发明的一些实施方案中，牛科动物乳得自已知具有β-酪蛋白A2A2基因型的牛科动物母牛。
通过下列步骤可以获得包含β-酪蛋白的乳，所述的β-酪蛋白主要或完全是A2β-酪蛋白(即，几乎不含或不含A1β-酪蛋白)：首先在β-酪蛋白基因方面对母牛进行基因分型；鉴定出具有在其乳中产生A2β-酪蛋白并且不产生其它β-酪蛋白能力的那些母牛(即具有A2A2等位基因的母牛)；并且对那些母牛挤奶。该方法通常在WO 1996/036239中描述，并且将被动物基因分型、畜群形成和牛科动物乳的生产和供应领域的技术人员预期和理解。
掺入本发明的婴儿配方产品中的人BCM可以通过任何已知的标准技术制备。这些技术包括化学合成、重组DNA技术以及从人母乳中分离肽。
如实施例1中所示，尽管两者都被概括为外啡肽，但是bBCM-7和hBCM-7对短期和长期基因表达的模式具有相反效果。
申请人研究了在hBCM-7和bBCM-7的影响下基因组范围的表观遗传改变。为了研究由这两种肽和吗啡诱导的功能途径和基因网络变化，采集DNA甲基化MBD-seq和DNA微阵列数据。研究对照SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞和用1μM hBCM-7、bBCM-7或吗啡处理4小时的细胞。吗啡用作阳性阿片样物质作用对照。
全基因组DNA MBD-seq揭示出差异甲基化启动子转录物(DMT)，如由FDR<0.1定义的。微阵列数据揭示出差异表达的转录物(DET)，其由倍数变化≥1.5和原始p值≤0.05定义，其包括来自基因和非编码区的不同甲基化的/转录的基因。
图2中的Venn图显示用1μM吗啡、bBCM-7或hBCM-7处理4小时(n＝5)的SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞中DET和DMT的模式重叠和对比。通过基因组范围的微阵列分析基因表达以产生DET列表(图A)。DNA甲基化通过MBD-seq分析以产生DMT列表(图B)。将DMT和DET绘图以示例与未处理的对照相比，处理组的一个或多个引起的重叠转录物变化。对于DET，N＝3；倍数变化≥1.5；原始p≤0.05。对于DMT，N＝5，FDR<0.1。
实施例2显示hBCM-7和bBCM-7对神经元干细胞(NSC)生长和分化的对比影响，其中bBCM-7与吗啡对照和hBCM-7相比相差无几，表明更高水平的细胞分化。与施用包括bBCM-7的试验的其它阿片样物质肽相比，施用hBCM-7更大程度地促进了NSC神经发生。当hBCM-7在3dpp(铺板后天数)开始施用1天时，这种效果最明显。
实施例3显示阿片样肽(吗啡、bBCM-7、hBCM-7和bBCM-9)对3dpp时分化的NSC的胞内硫醇水平(GSG:GSSH比例)的作用。发现施用bBCM-7或吗啡显著增加了GSH/GSSG比例(图4)并且显著降低SAM/SAH比例(图5)。相反，这些比例都不受hBCM-7或bBCM-9的影响。与对照细胞中的水平相比，所有4种肽倾向于降低CpG甲基化，其中hBCM-7与bBCM-9相差无几并且显著不同于对照和bBCM-7二者(图6)。氧化还原状态以及胞内抗氧化剂例如GSH水平和供体SAM水平形式的甲基化能力是NSC分化过程的重要贡献者。
hBCM-7与bBCM-9(衍生自A2β-酪蛋白)之间的功能相似性是一个强有力的指标，即人BCM不仅作为婴儿配方组合物中的成分有益，而且组合物的乳粉基料应当优选衍生自具有A2β-酪蛋白(或任何A2型β-酪蛋白)作为其主要或唯一的β-酪蛋白组分的乳。应避免衍生自含有大量A1β-酪蛋白(或任何A1型β-酪蛋白)的乳的乳粉。
尽管hBCM-7和bBCM-7的不同作用的机制尚不清楚，但bBCM-7对NSC上表达的μ阿片样受体具有更强的激动活性，导致氧化还原和甲基化状态发生更大的变化是可能的。这些差异作用也可能有助于母乳喂养相对于婴儿早期配方产品喂养的健康益处。
本发明的婴儿配方组合物可以使用任何已知的制备方法制备。可以将一种或多种人BCM肽或其前体肽在该方法中的任何适合的阶段加入。
粉末婴儿配方产品可以通过任何标准方法制备，典型地使用干燥混合方法或湿混合/喷雾干燥方法。在干燥混合方法中，成分为脱水粉末形式并且混合在一起，以实现完整婴儿配方产品所需的大量和微量营养物的均匀混合。然后将混合的产品通过筛子以除去过大的颗粒和外来物质。然后将筛分的产品转移到袋、手提袋或带衬里的纤维板桶中以便储存。在某些情况下，将粉末直接转移到粉末包装线上。在包装线上，粉末被转移到加料斗中，其将粉末送入罐装线。将填充的罐用惰性气体吹扫、密封、贴标签、编码并且装入纸箱中。
在湿混合/喷雾干燥过程中，将成分混合在一起，均化，巴氏杀菌并且喷雾干燥以制备粉末产品。将成分大批量与水混合，然后泵入热交换器进行巴氏杀菌。通常将液体匀化，并且加入任何热敏性微量营养物(例如维生素、氨基酸和脂肪酸)。液体可以通过将其通过蒸发器而浓缩，或者可以将其直接泵入喷雾干燥器。在喷雾干燥之后，产物可以聚集以增加粒度和改善其溶解度。在可选择的方法中，可以将乳通过转鼓式干燥进行干燥，其中可以将乳以薄膜的形式应用于加热转鼓的表面上。然后可以将乳固体刮掉。也可以使用冷冻干燥。加工时乳的干燥方法和热处理改变了乳粉的性质，例如其在冷水中的溶解性，其风味和其堆密度。成品粉末通过筛子然后转移到袋、手提袋或筒储存，或直接转移到粉末包装线。
在本说明书中对现有技术文献的任何提及都不被认为是承认这种现有技术是广泛已知的或者形成本领域中的公知常识的一部分。
如在本说明书中所使用的词语“包括”、“包含”以及类似词语不应被解释为排他性或穷举性含义。换句话说，它们旨在表示“包括但不限于”。
参考以下实施例进一步描述本发明。应当理解，要求保护的本发明不以任何方式受这些实施例的限制。
实施例
实施例1：hBCM-7与bBCM-7对短期和长期基因表达的对比作用
材料
吗啡得自Sigma Chemicals(Catalog#M8777,St.Louis,MO)。BCM-7的人和牛科动物形式委托Neopeptide(Cambridge,MA)合成。SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞购自(Manassas,VA)。
使细胞在37℃和5％CO2下在10cm标准组织培养皿中作为增殖单层生长，所述培养皿含有10mL来自Mediatech(Manassas，VA)的α-改进的最低基础培养基(α-MEM)(其中补充有也来自Mediatech的1％青霉素-链霉素-两性霉素B)，来自HyClone(Logan，UT)的10％胎牛血清(FBS)。在RNA或DNA提取之前，将细胞(传代#4)用1μM hBCM-7、bBCM-7、吗啡处理4小时或作为对照未处理。根据在先的剂量响应研究选择该浓度，表明1μM产生对EAAT3介导的半胱氨酸摄取的最大抑制。
使用来自Epigentek(Farmingdale，NY)的FitAmpTM Blood&Cultured Cell DNAExtraction Kit分离来自细胞培养物DNA用于DNA甲基化的分析。使用ND-1000NanoDrop(Wilmington，DE)分光光度计定量分离的DNA。使用来自Ambion(Austin，TX)的-4PCR试剂盒从细胞培养物中分离RNA用于RNA转录的分析。用DNase处理分离的RNA，然后使用ND-1000NanoDrop分光光度计进行RNA定量。使用适合于细胞系的方案，用Easy DNA试剂盒(Invitrogen K1800-01；Grand Island，NY)从样品中提取基因组DNA。
使用MethylCap-Seq方案(De Meyer等人，PLoS ONE.2013；8,e59068)进行DNA甲基化测定。EdgeR(Robinson等人，Bioinforma Oxf.Engl.2010；26:139-40)用于检测条件之间具有差别MBD覆盖度的区域的检测。
对于微阵列杂交，使用低RNA Input Linear Amplification Labeling试剂盒(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)，按照制造商的方案，用荧光染料(Cy3；AmershamBiosciences Corp，Piscataway，NJ)标记来自每个样品的500ng总RNA。使用NanoDrop ND-1000分光光度计和Agilent Bioanalyzer评估荧光标记的cRNA的量和质量。根据制造商的说明书，在洗涤和扫描之前，将1.6mg Cy3-标记的cRNA与Agilent Human Whole GenomeOligo Microarray(Agilent Technologies，Inc.，Palo Alto，CA)杂交17小时。使用Feature Extraction Software(Agilent Technologies，Inc.，Palo Alto，CA)从扫描图像中提取数据。
使用Student’s t-检验(在倍数变化≥1.5，原始p≤0.05)进行配对比较(例如hBCM-7[4h]与bBCM-7[4h])以产生差异表达基因列表。
使用Graph Pad 版本5.01进行统计学分析。使用独立平均值的Student’s t-检验来测试未处理的对照组和试验组之间的显著性差异。将数据表示为平均值±平均值的标准误差(SEM)。多组数据之间的比较使用单向方差分析法(ANOVA)进行，然后进行Tukey事后检验以确定各组之间的差异。
方法
用1μM hBCM-7和bBCM-7处理SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞。在4小时后分离RNA和DNA，经处理或者不进行处理。利用微阵列方法评估反映基因表达短期变化的转录变化(DET)，并且在450,000个CpG位点处分析对通过CpG甲基化(DMT)状态获得的基因表达的长期作用。通过Ingenuity Pathway Analysis 4.0评估来自两个终点的功能影响，并且进行KEGG途径分析以鉴定在DNA甲基化或转录水平上显著改变的转录物之间的生物学相互作用(p<0.05，FDR<0.1)。结果如图2所示。
实施例2：hBCM-7和bBCM-7对胎儿干细胞神经发生的对比作用
神经元干细胞培养
将在先分离和冷冻的神经元干细胞培养物适当解冻，维持和培养。使细胞悬浮液在由DMEM/F12(1:1)、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、抗生素/抗真菌剂(Invitrogen,GrandIsland,NY)、0.6％葡萄糖、25μg/mL胰岛素、20nM孕酮、60μM腐胺、30nM亚硒酸钠(均来自Sigma,St.Louis,MO)、100μg/mL人转铁蛋白(Roche,Indianapolis,IN)、20ng/mL人重组内皮生长因子(EGF；Roche or Invitrogen,Chicago,IL)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF；Upstate Biotechnology,Lake Placid,NY)组成的确定成分培养基(DF12)中生长。使细胞以自由漂浮的聚集体(神经球)的形式生长，并且每隔3-4天通过机械解离传代。经过至少4次传代后，将细胞以18,000个细胞/cm2的密度在包被有15μg/mL聚-L-赖氨酸(Sigma)的八孔载玻片载室(Nalge Nunc International，Naperville，IL)上铺板。将培养物维持在DF12和EGF或EGF+bFGF中3天，然后转换成无生长因子的DF12，培养时间更长。免疫细胞化学研究在3和10dpp之间的不同时间点进行。为了分析阿片样肽的作用，用10μM浓度的吗啡、人hBCM-7、牛科动物bBCM-7和bBCM-9(American Peptide，Sunnyvale，CA)处理细胞。将肽在无菌水中重构，并且在37℃温育1天或3天。在没有试验肽(未处理组)的DF12中维持平行的孔。免疫细胞化学分析在处理后1、3或10天进行。
间接免疫细胞化学
将细胞用4％多聚甲醛固定20分钟，用乙醇-乙酸溶液(19:1)在20℃透化20分钟，用10％胎牛血清封闭，并且在4℃与初级抗体一起温育过夜。姐妹培养物用作阴性对照并且进行类似处理，除了在每种情况下不与初级抗体一起温育。免疫荧光用于检测所有抗原。单克隆抗巢蛋白(克隆大鼠401；1:200)从Developmental Studies Hybridoma Bank(University of Iowa,Iowa City,IA)获得。多克隆抗胶质细胞原纤维酸性蛋白(1:500)购自Dakopatts(Glostrup，Denmark)。单克隆抗-β微管蛋白同种型III(1:2000)和多克隆抗-β微管蛋白同种型III(1:2000)购自Covance(Richmond，CA)。多克隆抗-O1(1:5)从购自American Type Culture Collection(Manassas，VA)的杂交瘤获得。单克隆抗-溴脱氧尿苷(BrdU；1:50)从Dako(High Wycombe，UK)获得，并且单克隆抗-神经元细胞核(NeuN)从Chemicon(Temecula，CA)获得。对于神经抗原的单一标记，标记有AlexaFluor 568或AlexaFluor 488的山羊抗-小鼠IgG(H+L)或山羊抗-家兔IgG(H+L)购自Molecular Probes(Eugene，OR)。
细胞增殖和细胞凋亡的评价
为了鉴定增殖细胞，在细胞固定前24小时加入100μM BrdU(胸腺嘧啶的类似物)。用乙醇乙酸溶液(19:1)透化后，将细胞用2N HCl在4℃处理30分钟以使DNA变性。在室温加入对抗BrdU的初级单克隆抗体(1:20；Dakopatts)1小时，并且使用AlexaFluor 488-标记的山羊抗-小鼠IgG(H+L)检测。该方法允许鉴定在过去24小时内复制其DNA的细胞。使用Hoechst 33342(LifeTechnologies，MD)将凋亡细胞显示为碎片化浓缩的蓝色染色核，并且在荧光显微镜下计数(López-Toledano M.A.和Shelanski M.L.,2004Neurogenic effectof beta-amyloid peptide in the development of neural stem cells.J Neurosci.24(23):5439-44)。结果显示在图3A至3D中。
实施例3：如根据细胞GSH:GSSH比例和酶活性和甲基化中反映出的DNA甲基化活性证实的对hBCM-7和A2β酪蛋白衍生的bBCM-9之间显示的细胞应答的对比作用
胞内硫醇代谢物的分离
如实施例2中所述，使神经元干细胞培养物在干细胞特异性生长培养基中生长至汇合，然后将其与所示药物一起温育特定时间。抽吸培养基，并且将细胞用1mL冰冷的HBSS洗涤2次。然后抽吸出HBSS并且向细胞中加入0.6mL冰冷的dH2O，并且从烧瓶/培养皿中刮取细胞。将细胞悬液在冰上超声处理15秒，并且使用100μL的超声处理物测定蛋白质含量。将剩余的裂解物与等体积的0.4N高氯酸一起加入到微量离心管中，并且在冰上温育5分钟。将样品以10,000g离心，并且将上清液转移到新的微量离心管中。然后，将100μL样品加入到锥形微量自动取样器小瓶中，并且在自动取样器冷却盘中保持在4℃。最后，将10μL该样品注射到高效液相色谱(HPLC)系统中。
胞内硫醇的HPLC测定
测量以下代谢物的浓度：半胱氨酸(CYS)、胱氨酸(CYS2)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽二硫化物(GSSG)、高半胱氨酸(HCY)、高胱氨酸(HCY2)、甲硫氨酸(MET)、S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)和S-腺苷甲硫氨酸(SAM)。使用Agilent Eclipse XDB-C8分析柱(3×150mm；3.5μm)和Agilent Eclipse XDB-C8(4.6×12.5mm；5μm)保护柱分离氧化还原和甲基化途径代谢物。使用两种流动相。流动相A包含0％乙腈、25mM磷酸钠、1.4mM 1-辛烷磺酸，用磷酸调节至pH 2.65。流动相B是50％乙腈。将流速初始设定为0.6mL/分钟，并且使用如下的阶梯梯度：0-9分钟0％B，9-19分钟50％B，19-30分钟50％B。然后用5％B使柱平衡12分钟，然后进行下次运行。将柱温维持在27℃。电化学检测器是具有BDD Analytical Cell Model 5040的ESACoulArray，并且将操作电位设定在1500mV。使用标准校准曲线和ESA软件从每种代谢物的峰面积确定样品浓度，然后针对蛋白质浓度校准。根据需要将一些样品稀释在流动相中，或者注入至多50μL的样品以确保硫醇浓度在标准曲线的范围内。
基因组DNA的分离
从培养的细胞中分离基因组DNA以测定全基因组(global)DNA甲基化。使用FitAmpBlood&Cultured Cell DNA Extraction Kits(Epigentek，Farmingdale，NY)从收获的细胞中分离DNA。通过用RNAase酶处理清除分离的DNA的任何污染的RNA，并且使用ND-1000NanoDrop分光光度计(Thermo Scientific)定量。
全基因组DNA甲基化的测定
根据制造商的说明书(Epigentek)使用MethylFlash methylated DNAQuantification Kits进行全基因组DNA甲基化分析。简言之，使用100ng洁净的基因组DNA，并且使用5-甲基胞嘧啶单克隆抗体在酶联免疫吸附测定法样反应中定量DNA甲基化。基于450nm处微量读板仪上每孔的光密度计算甲基化的DNA水平。将结果相对于使用范围为0％至100％的试剂盒甲基化标准品制备的标准曲线校准。
数据分析
结果表示为来自一式三份或一式四份的独立试验的每种抗体的阳性细胞的直接计数的平均值±平均值的标准误差。在指出的情况下，将数据相对于相关对照组校准。在每种培养物中，在共焦显微镜下计数25个预定视野。使用Hoechst核染色法将同一区域中阳性细胞数对细胞总数校正。适当使用Bonferroni事后检验或Student’s t检验的方差分析进行统计分析。差异在P<0.05被认为具有显著性。所有的统计分析均使用Prism 6.0软件(Graph-Pad Software，San Diego，CA)进行。结果如图4至6所示。
尽管已经通过实施例描述了本发明，但是应当理解，在不脱离如权利要求所限定的本发明的范围的情况下，可以进行变化和修饰。此外，在对于特定特征存在已知等同物的情况下，如同在本说明书中特别提到的那样并入这类等同物。
Claims (16)
1.婴儿配方组合物，其包含一种或多种人β-酪啡肽或其前体肽。
2.如权利要求1中所要求的组合物，其中一种或多种人β-酪啡肽选自BCM-4、BCM-5、BCM-6、BCM-7、BCM-8、BCM-9、BCM-10、BCM-11、BCM-12、BCM-13、BCM-14、BCM-15、BCM-16、BCM-17、BCM-18、BCM-19、BCM-20、BCM-21、BCM-22、BCM-23和BCM-24。
3.如权利要求1或权利要求2中所要求的组合物，其中一种或多种人β-酪啡肽选自BCM-5和BCM-7。
4.如权利要求1-3任一项中所要求的组合物，其包含BCM-5和BCM-7二者。
5.如权利要求1-4任一项中所要求的组合物，其中一种或多种人β-酪啡肽或其前体肽选自BCM-4、BCM-5、BCM-6、BCM-7、BCM-8、BCM-9、BCM-10、BCM-11、BCM-12、BCM-13、BCM-14、BCM-15、BCM-16、BCM-17、BCM-18、BCM-19、BCM-20、BCM-21、BCM-22、BCM-23和BCM-24的任一种的结构类似物。
6.如权利要求1-5任一项中所要求的组合物，其还包含衍生自牛科动物乳的β-酪蛋白，其中乳的总β-酪蛋白含量包含至少50％w/w A2β-酪蛋白。
7.如权利要求6中所要求的组合物，其中乳的总β-酪蛋白含量包含至少90％w/w A2β-酪蛋白。
8.如权利要求6或权利要求7中所要求的组合物，其中A2β-酪蛋白是在β-酪蛋白氨基酸序列的第67位具有脯氨酸的任何β-酪蛋白。
9.如权利要求6-8任一项中所要求的组合物，其中牛科动物乳得自已知具有β-酪蛋白A2A2基因型的牛科动物母牛。
10.如权利要求1-9任一项中所要求的组合物，其中一种或多种人β-酪啡肽通过化学合成制备。
11.如权利要求1-9任一项中所要求的组合物，其中一种或多种人β-酪啡肽使用重组DNA技术制备。
12.用于制备婴儿配方组合物的方法，包括向成分混合物中添加一种或多种人β-酪啡肽的步骤。
13.如权利要求12中所要求的方法，其中一种或多种人β-酪啡肽选自BCM-4、BCM-5、BCM-6、BCM-7、BCM-8、BCM-9、BCM-10、BCM-11、BCM-12、BCM-13、BCM-14、BCM-15、BCM-16、BCM-17、BCM-18、BCM-19、BCM-20、BCM-21、BCM-22、BCM-23和BCM-24。
14.如权利要求12或权利要求13中所要求的方法，其中一种或多种人β-酪啡肽选自BCM-5和BCM-7。
15.如权利要求1-11任一项中所要求的组合物作为婴儿食品的用途。
16.一种或多种人β-酪啡肽或其前体肽在制备婴儿配方组合物中的用途。
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