CN108472276B

CN108472276B - 用于延缓肺纤维化的发病及／或治疗肺纤维化的药剂

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Publication number: CN108472276B
Application number: CN201780006838.3A
Authority: CN
Inventors: 苏鸿麟; 林欣荣; 韩鸿志; 邱紫文; 庄弘盟
Original assignee: Everfront Biotech Inc
Current assignee: Everfront Biotech Inc
Priority date: 2016-05-19
Filing date: 2017-05-12
Publication date: 2021-07-23
Anticipated expiration: 2037-05-12
Also published as: EP3459539A1; EP3459539B1; JP6718522B2; TWI650125B; WO2017198114A1; US20170333391A1; JP2019514940A; US10463645B2; TW201740937A; EP3459539A4; CN108472276A

Abstract

一种使用一活性成分于制造一药剂的用途，其中该药剂是用于延缓肺纤维化的发病及／或治疗肺纤维化，且该活性成分是选自以下群组：式（I）化合物、其医药上可接受的盐、及前述的组合，

（I），其中，A是C5烷基或烯基，且视需要具有一选自以下群组的取代基：‑OH及=O；X是H、或OH；Y是O；以及R1是H或不存在，其条件为，当R1不存在时，Y与A键结形成一五元环。

Description

用于延缓肺纤维化的发病及/或治疗肺纤维化的药剂

技术领域

本发明关于使用如下式(I)化合物以延缓肺纤维化的发病及/或治疗肺纤维化的应用，

其中，

A是C5烷基或烯基，且视需要具有一选自以下群组的取代基：-OH及＝O；

X是H、或OH；

Y是O；以及

R1是H或不存在，其条件为，当R1不存在时，Y与A键结形成一五元环。

背景技术

肺纤维化(又称为间质性肺病)是指胶原蛋白、弹性蛋白、纤网蛋白等胞外基质(extracellular matrix，ECM)在肺脏间质组织中沉积，从而在肺脏间质产生类似疤痕组织(scar)的疾病。肺纤维化会使原来如海绵般柔软的肺部组织变得如混凝土般坚硬且失去弹性，逐渐丧失收缩、舒张、及气体交换的能力。

肺纤维化初期的患者一般会有呼吸急促、胸口闷痛、及咳嗽等症状，但是，这些早期症状不易辨识，50％以上的患者曾被误诊为气喘、肺气肿、慢性阻塞性肺病(ChronicObstructive Pulmonary Disease，COPD)、或是心脏疾病。大部分肺纤维化患者确诊时，肺功能已下降，且有呼吸困难的症状，造成慢性缺氧，而体内氧气不足会使集中力、记忆力下降，且会导致细胞疲弱、身体机能衰退、新陈代谢减慢、加速衰老、以及各种并发症等。肺纤维化晚期的患者则因身体长期缺氧而导致心脏衰弱、呼吸功能衰竭，严重时甚至必须靠吸入高浓度氧气方能维持生命。

肺纤维化患者的死亡率远高于癌症，据统计，存活五年以上者低于50％，存活十年以上者更是低于10％。目前尚无可以有效治疗肺纤维化的药物，其中，商业化的吡非尼酮(Pirfenidone，商品名：

)虽可改善肺纤维化患者的肺活量，但对于肺纤维化的治疗多无明显益处，且患者在使用后会产生许多副作用包括恶心、呕吐、消化不良、厌食、红疹、头晕、见光敏感等。因此，临床上仍需要一种可延缓肺纤维化的发病及/或治疗肺纤维化的药物。

本申请发明人发现，本发明式(I)化合物具有提升肺泡细胞的抗氧化能力、提高肺泡细胞的存活率、减缓氧化压力对肺部组织所造成的损伤、抑制肺部纤维母细胞(Fibroblast)转化成肌纤维母细胞(Myofibroblast)、抑制肺部纤维母细胞进行上皮-间质转换(epithelial-mesenchymal transition，EMT)、及抑制胞外基质过度表现的效果，且可有效调控肺部组织中的免疫反应、减缓肺泡组织壁变厚、减缓肺部细胞异常浸润、及减缓肺功能下降，故可用于延缓肺纤维化的发病及/或治疗肺纤维化。

发明内容

本发明的一个目的，在于提供一种使用一活性成分于制造一药剂的用途，其中该药剂是用于延缓肺纤维化的发病及/或治疗肺纤维化，且该活性成分是选自以下群组：式(I)化合物、其医药上可接受的盐、及前述的组合，

其中，A是C5烷基或烯基，其视需要具有一选自以下群组的取代基：-OH及＝O；X是H、或OH；Y是O；以及R1是H或不存在，其条件为，当R1不存在时，Y与A键结形成一五元环。

根据本发明的用途的较佳实施例中，于所涉的式(I)化合物中，A是

根据本发明的用途的另外的较佳实施例中，于所涉的式(I)化合物中，A是

X是OH。

根据本发明的用途的又一较佳实施例中，所涉的式(I)化合物选自以下群组的至少一种：

及

其中，该药剂是用于以下的至少一种：提升肺泡细胞的抗氧化能力、提高肺泡细胞的存活率、减缓氧化压力对肺部组织所造成的损伤、抑制肺部纤维母细胞(Fibroblast)转化成肌纤维母细胞(Myofibroblast)、抑制肺部纤维母细胞进行上皮-间质转换(EMT)、及抑制胞外基质过度表现。

其中，该药剂是用于以下的至少一种：调控细胞中Sox2蛋白的表现量、抑制胶原蛋白表现、及抑制TGF-β蛋白表现。

其中，该药剂的用量，以式(I)化合物计，为每天约1毫克/公斤体重至约500毫克/公斤体重。

其中，该药剂的用量，以式(I)化合物计，为每天约5毫克/公斤体重至约200毫克/公斤体重。

其中，该药剂的用量，以式(I)化合物计，为每天约10毫克/公斤体重至约100毫克/公斤体重。

本发明的另外一个目的，在于提供一种延缓肺纤维化的发病及/或治疗肺纤维化的方法，其包含于有需要的个体中投予有效量的活性成分，其中该活性成分是选自以下群组：如上所述的式(I)化合物、其医药上可接受的盐、及前述的组合。

本发明的有益效果是：

本发明式(I)化合物具有提升肺泡细胞的抗氧化能力、提高肺泡细胞的存活率、减缓氧化压力对肺部组织所造成的损伤、抑制肺部纤维母细胞(Fibroblast)转化成肌纤维母细胞(Myofibroblast)、抑制肺部纤维母细胞进行上皮-间质转换(EMT)、及抑制胞外基质过度表现的效果，且可有效调控肺部组织中的免疫反应、减缓肺泡组织壁变厚、减缓肺部细胞异常浸润、及减缓肺功能下降，故可用以延缓肺纤维化的发病及/或治疗肺纤维化。

本发明的详细技术内容及部分具体实施例，将描述于以下内容中，以供本发明所属领域普通技术人员了解本发明的特征。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是显示以不同培养液培养的肺泡细胞存活率的直方图，其中，控制组为F-12K培养液、第1组为含有H₂O₂(0.1毫莫耳浓度)的F-12K培养液、第2组为含有H₂O₂(0.1毫莫耳浓度)及化合物(1)(5微克/毫升)的F-12K培养液、第3组为含有H₂O₂(0.1毫莫耳浓度)及N-乙酰半胱氨酸(n-acetylcysteine，NAC)(2毫莫耳浓度)的F-12K培养液、第4组为含有H₂O₂(0.2毫莫耳浓度)及化合物(1)(5微克/毫升)的F-12K培养、第5组为含有H₂O₂(0.2毫莫耳浓度)及NAC(2毫莫耳浓度)的F-12K培养液；

图2是以西方墨点法(Western Blotting)分析人类正常纤维母细胞株(NormalHuman lung fibroblasts，NHLF)经不同培养处理的第I型胶原蛋白及β-肌动蛋白表现的照片图，其中，正控制组未经TGF-β1诱导且未以化合物(1)进行培养、负控制组经TGF-β1诱导但未以化合物(1)进行培养、低剂量组经TGF-β1诱导且以低浓度(15微克/毫升)的化合物(1)进行培养、高剂量组经TGF-β1诱导且以高浓度(25微克/毫升)的化合物(1)进行培养；

图3是以西方墨点法分析经TGF-β1诱导的人类正常纤维母细胞株(NHLF)于不同培养液中培养后的第I型胶原蛋白、BMP-7蛋白、及TGF-β蛋白表现的照片图，其中，控制组为FGM-2培养液、第I组为含有化合物(1)(15微克/毫升)的FGM-2培养液、第II组为含有化合物(1)(25微克/毫升)的FGM-2培养液、第III组为含有化合物(1)(35微克/毫升)的FGM-2培养液、第IV组为含有吡非尼酮(Pirfenidone)(100微克/毫升)的FGM-2培养液、第V组为含有吡非尼酮(250微克/毫升)的FGM-2培养液、第VI组为含有吡非尼酮(500微克/毫升)的FGM-2培养液；

图4是以西方墨点法分析带有pcDNA3.1空载体(控制组I及第A至C组)或pcDNA3.1-SOX2质体(控制组II及第D至F组)的人类正常纤维母细胞株(NHLF)于不同培养液中培养后的Sox2蛋白、TGF-β蛋白、及第I型胶原蛋白表现的照片图，其中，控制组I及控制组II未经TGF-β1诱导且未以化合物(1)进行培养、第A组及第D组经TGF-β1诱导但未以化合物(1)进行培养、第B组及第E组经TGF-β1诱导且以15微克/毫升的化合物(1)进行培养、第C组及第F组经TGF-β1诱导且以30微克/毫升的化合物(1)进行培养；

图5是以西方墨点法分析以不同培养液培养的人类正常纤维母细胞株(NHLF)的BMP-7蛋白、TGF-β蛋白、及α-SMA蛋白表现的照片图，其中，控制组为含有10％血清的FGM-2培养液、第i组为含有1％血清的FGM-2培养液、第ii组为含有1％血清及化合物(1)(15微克/毫升)的FGM-2培养液、第iii组为含有1％血清及化合物(1)(25微克/毫升)的FGM-2培养液、第iv组为含有1％血清及TGF-β1(5奈克/毫升)的FGM-2培养液、第v组为含有1％血清、TGF-β1(5奈克/毫升)、及化合物(1)(15微克/毫升)的FGM-2培养液、第vi组为含有1％血清、TGF-β1(5奈克/毫升)、及化合物(1)(25微克/毫升)的FGM-2培养液；

图6是以半定量聚合酶链锁反应(RT-PCR)分析以不同培养液培养的人类正常纤维母细胞株(NHLF)的α-SMA、TGF-β基因的表现的照片图，其中，控制组为FGM-2培养液、第α组为含有化合物(1)(5微克/毫升)的FGM-2培养液、第β组为含有化合物(1)(10微克/毫升)的FGM-2培养液、第γ组为含有H₂O₂(0.1毫莫耳浓度)的F-12K培养液、第δ组为含有H₂O₂(0.1毫莫耳浓度)及化合物(1)(5微克/毫升)的F-12K培养液、第ε组为含有H₂O₂(0.1毫莫耳浓度)及化合物(1)(10微克/毫升)的F-12K培养液；

图7是以西方墨点法分析经不同培养处理的人类正常纤维母细胞株(NHLF)的BMP-7蛋白、TGF-β蛋白、及p-smad2/3蛋白表现的照片图，其中控制组未经TGF-β1诱导且未以化合物(1)或化合物(2)进行培养、第A组经TGF-β1诱导但未以化合物(1)或化合物(2)进行培养、第B组经TGF-β1诱导且以15微克/毫升的化合物(1)进行培养、第C组经TGF-β1诱导且以30微克/毫升的化合物(1)进行培养、第D组经TGF-β1诱导且以100微克/毫升的化合物(2)进行培养、第E组经TGF-β1诱导且以200微克/毫升的化合物(2)进行培养；

图8A至8D是显示以全体呼吸测量系统(Unrestrained Whole BodyPlethysmography，WBP)评估经不同处理的小鼠肺功能的结果，其中图8A显示呼吸频率(RR)及累积通气量(AV)的直方图、图8B显示潮气量(TV)及松弛时间(RT)的直方图、图8C显示最大吸气量(PIF)及最大呼气量(PEF)的直方图、图8D显示吸气时间(Ti)及呼气时间(Te)的直方图，且图8A、8B、8C、及8D皆包含控制组、低剂量组、高剂量组、及Oil组的结果；

图9是显示注射硫酸博莱霉素(Bleomycin sulfate)以及服用化合物(1)后的小鼠肺脏的组织病理学结果的照片图，其中显示控制组、低剂量组、高剂量组、及Oil组小鼠肺脏的苏木素-伊红染色(H&E stain)分析结果；

图10是显示注射硫酸博莱霉素(Bleomycin sulfate)以及服用化合物(1)后小鼠肺脏的组织病理学结果，其中显示控制组、低剂量组、高剂量组、及Oil组小鼠的肺脏纤维化分数(“＊＊”表示P value小于0.01，显示不同组别间的数据具有显著差异；“＊＊＊”表示Pvalue小于0.001，显示不同组别间的数据具有显著差异)；

图11是以西方墨点法分析小鼠肺部组织样本中TGF-β蛋白、smad3蛋白、及气管扩张素C(surfactant C)的表现的照片图，包括高剂量组、低剂量组、及Oil组的结果；以及

图12是以半定量聚合酶链锁反应(RT-PCR)分析小鼠肺部组织样本中IL-β、IL-6等免疫相关基因的mRNA表现的照片图，包括控制组、Oil组、低剂量组、及高剂量组的结果。

具体实施方式

以下将描述本发明的部分具体实施例；但是，在不背离本发明精神下，本发明尚可以多种不同形式的例来实践，不应将本发明保护范围解释为限于说明书所陈述的内容。此外，除非文中有另外说明，于本说明书中(尤其是在权利要求书中)所使用的“一”、“该”及类似用语应理解为包含单数及复数形式；所谓“治疗”，不应被解释为治疗一个个体直至完全恢复，而应包括将个体的疾病进展或症状维持在一实质上静态的程度、增加个体的恢复速率、改善一具体病况的严重性、以及提高患者的生命质量；所谓“延缓”疾病的发病，是指预防一具体病况的发作、以及维持敏感个体的良好健康状态或建立该个体对疾病的耐受性；所谓“有效量”或“治疗有效量”，是指投予至个体时，可有效地至少部分改善怀疑个体的病情的化合物数量；所谓“个体”指哺乳动物，哺乳动物可为人类或非人动物。

本说明书中所使用的数值范围(例如3至90)应理解为也包含在该范围中的所有有理数(例如3、3.1、6、6.5、7、7.9、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、及90)以及在该范围中的任何有理数所组成的范围(例如3.1至8、10至60.5、5.8至70.9、及15至90)，因此，本说明书中所使用的数值范围包含介于所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能组合。另外，本文所使用的“约”、“大约”或“近乎”等词，系实质上代表与所述之的数值相差在20％以内者，较佳在10％以内者，且更佳在5％以内者。

在本说明书中，当引用其他外部文件或其他信息来源时，一般出于为本发明的技术特征提供背景叙述的目的。因此，除非文中有另外说明，否则对这些外部文件的引用，不应被解释为承认这些文件或信息来源在任何权限范围内是先前技术或为该技术领域中公知常识。

有研究指出，肺纤维化可能与免疫反应、炎症、外来物刺激、吞咽障碍、胃食道逆流等有关，也有相关研究将其病因概略地分为特发性、原发性、免疫性、药物性、物理性等，其中包括隐源性致纤维性肺泡炎(cryptogenic fibrosing alveolitis，CFA)、寻常性间质性肺炎(usual interstitial pneumonia，UIP)、及间质性肺病(interstitial lungdisease，ILD)所导致的肺纤维化。

举例言之，当肺部发生过度免疫反应(immune overreaction)，组织中的巨噬细胞会异常活化并且释放促转化生长因子β(transforming growth factorβ，TGF-β)及介白素(interleukin)，因而吸引中性白血球到达肺部组织中并释放氧自由基，造成肺部组织损伤。因应肺部组织损伤，组织中的细胞会分泌胶原蛋白、弹性蛋白、纤网蛋白等胞外基质以进行修复，但是，过度分泌会造成肺纤维化。前述可参见例如：Life Sci.2008 Jan 16；82(3-4)：210-7，该文献的全文并于此处以供参考。

经研究证实，在肺纤维化的过程中，促转化生长因子β(TGF-β)/果蝇抗成形素家族蛋白(drosophila mothers against decapentaplegic protein family，Smad)讯息传导路径的活化会促使肺部纤维母细胞进行上皮-间质转换(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)，且会刺激纤维母细胞(fibroblast)增生并转化成肌纤维母细胞(myofibroblast)。其中，当肺部纤维母细胞进行上皮-间质转换(EMT)，细胞与细胞之间的极性会渐渐丧失，且细胞的移行能力增加，而容易爬行及侵袭并参与组织纤维化。此外，肌纤维母细胞是一种会表现平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin，α-SMA)标记蛋白且具高度移动性的细胞，肺部的肌纤维母细胞活化后会分泌过多的胶原蛋白、弹性蛋白、纤网蛋白等胞外基质于肺脏间质组织中沉积，构成肺纤维化的微环境(microenvironment)并诱导细胞间质内的收缩，形成伤疤组织(scar)。

经证实，骨形态发生蛋白-7(bone morphogenetic protein-7，BMP-7)会抑制TGF-β/Smad讯息传导路径的活化。因此，若能增加BMP-7表现，将会有助于TGF-β/Smad讯息传导路径的抑制，达到延缓肺纤维化的发病的效果。

由上可知，肺纤维化的发生与肺部过度免疫反应及肺部纤维母细胞的上皮-间质转换(EMT)密切相关，相信若能调控肺部组织中的免疫反应、抑制肺部产生过度的免疫反应、抑制肺部纤维母细胞进行上皮-间质转换(EMT)、及/或抑制肺部纤维母细胞转化成肌纤维母细胞，即可减缓免疫反应对肺部组织所造成的损伤且抑制过多的胞外基质在肺脏间质组织中沉积，而达到延缓肺纤维化的发病及/或治疗肺纤维化的效果。

本申请发明人研究发现，以下式(I)化合物可有效提升肺泡细胞的抗氧化能力，从而减缓氧化压力对肺部组织所造成的损伤，且可抑制肺部纤维母细胞(Fibroblast)转化成肌纤维母细胞(Myofibroblast)、抑制肺部纤维母细胞进行上皮-间质转换(EMT)、及/或抑制胞外基质过度表现：

本申请发明人还发现，对于经诱导肺纤维化的药物处理的个体，根据本发明的式(I)化合物可有效调控该个体中的肺部组织中的免疫反应、减缓肺泡组织壁变厚、减缓肺部细胞异常浸润、及/或减缓肺功能下降。

因此，本发明提供延缓肺纤维化的发病及/或治疗肺纤维化的药剂及方法。其中，该药剂包含一活性成分，该方法包含将有效量的活性成分投予至有需要的个体中。于本发明的药剂及方法中，该活性成分是选自以下群组：式(I)化合物、其医药上可接受的盐、及前述的组合，

于本发明的药剂及方法的一个较佳实施例中，在式(I)中，A是

于根据本发明的药剂及方法的另一个较佳实施例中，在式(I)中，A是

X是OH。

于根据本发明的式(I)化合物的具体例包括，但不限于：

及

于本发明部分具体实施例中，使用化合物(1)及/或化合物(2)于延缓肺纤维化的发病及/或治疗肺纤维化。

于本文中，所谓“医药可接受的盐”，包括“所述含有酸性官能基的化合物”与“有机或无机碱”所形成的“医药可接受碱加成盐”、以及“所述含有碱性官能基的化合物”与“有机或无机酸”所形成的“医药可接受酸加成盐”。

其中，该与无机碱所形成的“医药可接受碱加成盐”的例子包括，但不限于，碱金属盐(如钠盐、钾盐)、碱土金属盐(如钙盐、镁盐)、过渡金属盐(如铁盐、锌盐、铜盐、锰盐及铝盐)、以及铵盐。

该与有机碱所产生所形成的“医药可接受碱加成盐”的例子包括，但不限于，与甲基胺、二甲基胺、三甲基胺、乙基胺、二乙基胺、三乙基胺、异丙基胺、三丙基胺、三丁基胺、乙醇胺、二乙醇胺、2-二甲基胺乙醇、2-二乙基胺乙醇、二环己基胺、离胺酸盐、精胺酸盐、组胺酸盐、咖啡碱、海巴胺(hydrabamine)、胆碱、甜菜碱、乙烯二胺、葡萄糖胺、甲基葡萄糖胺、可可碱、嘌呤、哌啶、N-乙基哌啶、四甲基铵化合物、四乙基铵化合物、吡啶、N，N-二甲基苯胺、N-甲基哌啶、N-甲基吗啉、二环己基胺、二苯甲基胺、N，N-二苯甲基苯乙基胺、1-伊芬胺(1-ephenamine)、N，N-二苯甲基乙烯二胺、聚胺树脂及其类似物等所形成的盐。

该与无机酸所形成的“医药可接受酸加成盐”的例子包括，但不限于，与氢溴酸、盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、过氯酸等所形成的盐。

该与有机酸所形成的“医药可接受酸加成盐”的例子包括，但不限于，与磺酸(如对甲苯磺酸、苯磺酸、甲磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、萘磺酸)、羧酸(如乙酸、丙酸、富马酸、马来酸、苯甲酸、水杨酸、琥珀酸)、阴离子胺基酸(如谷胺酸、天门冬胺酸)、羟基酸(如柠檬酸、乳酸、酒石酸、乙醇酸、苹果酸)、脂肪酸(如己酸、辛酸、癸酸、油酸、硬脂酸)、双羟萘酸、树脂酸等所形成的盐。

当使用本发明的药剂以延缓肺纤维化的发病及/或治疗肺纤维化时，该药剂可以呈任何适宜的形式，并无特殊的限制，端视所需要的用途而呈对应的适宜剂型。举例言之，但不以此为限，该药物可以口服或非经口服(例如：皮下、静脉内、肌肉、腹腔、鼻腔或皮肤)的投药方式施用至有需要的个体上。其中，口服投药剂型可方便于病人按时自行服用。视使用形式及用途而定，可选用适宜的载剂以提供该药剂，只要该载剂对本发明活性成分的所需要效益没有不利的影响即可，其中该载剂包括赋形剂、稀释剂、辅助剂、安定剂、吸收延迟剂、崩散剂、增溶剂、乳化剂、抗氧化剂、黏合剂、结合剂、增黏剂、分散剂、悬浮化剂、润滑剂、吸湿剂等。

以适于口服投药的剂型为例，该载剂的例子包括，但不限于，水、食盐水、葡萄糖(dextrose)、甘油、乙醇或其类似物、纤维素、淀粉、糖膨润土(sugar bentonite)、及前述的组合。可采用任何适宜的方法，以适于口服投药的剂型提供该药剂，例如固体形式的锭剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂等、或是液体形式的口服液、糖浆剂、醑剂(spirit)、酏剂(elixir)、酊剂等，但不以此为限。

有关适于皮下、静脉内、肌肉、或腹腔注射的针剂或点滴剂，则可于本发明所提供的药剂中含有一种或多种例如等张溶液、盐类缓冲液(如磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液)、增溶剂、乳化剂、5％糖溶液、以及其他载剂等成分，以静脉输注液、乳剂静脉输注液、干粉注射剂、悬液注射剂、或干粉悬液注射剂等剂型提供该药剂。或者，将该药剂制备成一注射前固体，以可溶于其他溶液或悬浮液中的剂型、或可乳化的剂型提供该注射前固体，并于投予至有需要的个体之前，将该注射前固体溶于其他溶液或悬浮液中或将其乳化，提供所需要的注射剂。此外，适于经鼻腔或经皮肤投予的外用剂型，则例如涂抹剂(例如乳液、乳霜、凝胶、分散膏、软膏)、喷剂、贴剂、或溶液(例如洗液、悬浮液)。

至于适于皮下植入、或组织间植入的剂型，则可于本发明所提供的药剂中另外含有一种或多种例如赋形剂、安定剂、缓冲剂、以及其他载剂等成分，以例如芯片(wafer)、锭剂、丸剂、胶囊等剂型提供，从而得以将该药剂植入一个个体中，以缓慢且持续的释放所含活性成分至投药部位周围的组织，达到局部稳定高剂量的延缓肺纤维化的发病及/或治疗肺纤维化的功效。举例言之，但不以此为限，可将本发明所提供的药剂与p(CPP-SA)共聚物混合，并将所得混合物溶于二氯甲烷中，再将混合物干燥形成粉末，接着，将粉末装填于一个模具中，于轻微压力下压缩该干燥粉末，来形成供皮下植入、或组织间植入的芯片剂型。

视需要地，可于本发明所提供的药剂中另外含有适宜用量的添加剂，例如可提高该药剂于服用时的口适感及视觉感受的调味剂、调色剂、着色剂等，以及可改善该药剂的稳定性及储存性的缓冲剂、保存剂、防腐剂、抗菌剂、抗真菌剂等。此外，该药剂可视需要另外含一种或多种其他活性成分(例如免疫调节剂、吡非尼酮(Pirfenidone；商品名：

)、N-乙酰半胱氨酸(NAC；商品名：NAC 600mg/capsule))，或者与含该一种或多种其他活性成分的药物并用，以进一步加强该药剂的功效或增加制剂配方的运用灵活性与调配度，只要该其他活性成分对本发明活性成分的所需要效益没有不利的影响即可。

可以一日一次、一日多次、或数日一次等不同频率施用本发明所提供的药剂，端视投予个体的需求、年龄、体重、及健康况状而异。举例言之，当以口服方式施用至一个个体以延缓肺纤维化的发病及/或治疗肺纤维化时，以式(I)化合物计，其用量为每天约1毫克/公斤体重至约500毫克/公斤体重，较佳为每天约5毫克/公斤体重至约200毫克/公斤体重，更佳为每天约10毫克/公斤体重至约100毫克/公斤体重，其中，该单位『毫克/公斤体重』指每公斤体重的个体所须的投药量。但是，对于急性患者而言，其用量可视实际需要而酌增，例如增加至数倍或数十倍。于本发明部分具体实施例中，使用本发明所提供的药剂于延缓肺纤维化的发病及/或治疗肺纤维化，其中该药剂的用量，以式(I)化合物计，为每天约10毫克/公斤体重或每天约50毫克/公斤体重。

本发明的延缓肺纤维化的发病及/或治疗肺纤维化的方法中，有关该活性成分(即，式(I)化合物、其医药上可接受的盐、或前述的组合)的投予途径、投予形式、适用剂量、以及相关治疗的应用，均如上述的说明。

现以下列实施例进一步例示说明本发明。其中这些实施例仅提供作为说明，而非用以限制本发明的保护范围。本发明保护范围如权利要求书所示。

实施例

[实验材料]

实施例所用的材料、试剂、仪器来源如下：

(1)大鼠第二型肺泡细胞L2细胞株：美国菌种中心(American Type CultureCollection，ATCC)提供，

CCL-1449^TM。

(2)H₂O₂(Hydrogen peroxide 30％)：购自Scharlau公司(Barcelona，Spain)(产品编号：P201405020062)。

(3)N-乙酰半胱氨酸(n-acetylcysteine，NAC；目前临床上用于治疗肺纤维化的一种药物)：购自Sigma-Aldrich公司(产品编号：A9165)。

(4)化合物(1)：Lancaster Synthesis公司(Newgate Morecambe，UK)。

(5)化合物(2)：由台耀化学股份有限公司合成。

(6)3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4，5-Dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide，简称MTT)：购自ThermoFisher公司(产品编号：M6494)。

(7)二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，简称DMSO)：购自波仕特公司(产品编号：Amresco 0231)。

(8)酵素免疫分析测读仪(ELISA reader)：Thermo Fisher公司(ScientificMultiskan EX Microplate Reader)

(9)促转化生长因子β1(TGF-β1)：购自PEPROTECH Inc.公司(产品编号：100-21)。

(10)人类正常纤维母细胞株(Normal Human lung fibroblasts，NHLF)：购自瑞士Lonza公司(产品编号：CC-2512)。

(11)FGM-2培养液：FGM-2 SingleQuot Kit Suppl.&Growth Factors，购自瑞士Lonza公司(产品编号：CC-4126)

(12)吡非尼酮(Pirfenidone；目前临床上用于治疗肺纤维化的一种药物)：购自Sigma-Aldrich公司(产品编号：P2116)。

(13)C57B/L6小鼠：购自国家动物中心。

(14)硫酸博莱霉素(Bleomycin sulfate；肺纤维化诱发剂)：购自Sigma-Aldrich公司(产品编号：B5507)。

(15)橄榄油(olive oil)：Olitalia extra vergine食用级橄榄油。

(16)全体呼吸测量系统(Unrestrained Whole Body Plethysmography，WBP)：购自Buxco公司。

(17)PRO-PREPTM蛋白质萃取套组(PRO-PREPTM Protein Extraclion Kit)：购自iNtRON公司。

(18)RNeasy mini RNA萃取套组(RNeasy Mini Kit)：购自Qiagen公司。

(19)反转录套组(QuantiTect Reverse Transcription Kit)：购自Qiagen公司。

(20)细胞转染试剂(Fugene HD transfection reagent)：购自Promega公司。

(21)SOX2基因质体(pcDNA3.1-SOX2)：由GENEWIZ公司合成(Accession No.：NM_003106.3)。

[细胞实验]

实施例1：细胞存活测试(MTT分析)

已知氧化压力会导致肺泡细胞死亡，对肺部组织造成的损伤，本细胞实验是用以了解本发明式(I)化合物是否可减缓氧化压力所造成的肺部组织损伤。

将大鼠第二型肺泡细胞L2细胞株(

CCL-149^TM)接种于96孔盘中，每孔接种5×10³个细胞(5×10³cells/well)，共48孔(分成一个控制组以及五个实验组，各组有8孔)，并培养至次日。移除培养液后，分别以如下条件处理各组，以进行后续实验：

(1)控制组：以F-12K培养液(Kaighn′s Modification of Ham′s F-12 Medium，

30-2004^TM)进行培养，历时24小时。

(2)第1组：以含有H₂O₂(0.1毫莫耳浓度)的F-12K培养液进行培养，历时24小时。

(3)第2组：以含有H₂O₂(0.1毫莫耳浓度)及化合物(1)(5微克/毫升)的F-12K培养液进行培养，历时24小时。

(4)第3组：以含有H₂O₂(0.1毫莫耳浓度)及N-乙酰半胱氨酸(n-acetylcysteine，NAC)(2毫莫耳浓度)的F-12K培养液进行培养，历时24小时。

(5)第4组：以含有H₂O₂(0.2毫莫耳浓度)及化合物(1)(5微克/毫升)的F-12K培养液进行培养，历时24小时。

(6)第5组：以含有H₂O₂(0.2毫莫耳浓度)及NAC(2毫莫耳浓度)的F-12K培养液进行培养，历时24小时。

培养完毕之后，移除培养液，并分别对各组细胞进行如下处理：于各孔加入含10％的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)的F-12K培养液，进行培养，历时1小时。其后，将培养液移除，并加入适量的二甲基亚砜(DMSO)，然后以酵素免疫分析测读仪(ELISA reader)侦测各组于595奈米波长的吸光值(OD_595nm)，各组分别计算平均值(n＝8)，再以控制组的结果为基准，计算其他各组的相对存活率，结果示于图1及表1。

表1

组别

控制组

第1组

第2组

第3组

第4组

第5组

相对存活率

100％

38.9％

109.4％

101.9％

80.6％

83.1％

由图1及表1可知，相较于控制组，第1组的存活率明显降低。然而，相较于第1组，第2、3、4、5组的存活率皆明显提升。前述结果显示，H₂O₂会对肺部产生氧化压力，导致肺泡细胞死亡，而本发明式(I)化合物则可有效提升肺泡细胞的抗氧化能力、提高肺泡细胞的存活率、及减缓氧化压力对肺部组织所造成的损伤的效果，且该效果与目前临床上用于治疗肺纤维化的药物相当。

实施例2：式(I)化合物抑制胶原蛋白表现的效益

当肺部产生过度免疫反应，TGF-β讯息传导路径活化会导致肺部组织损伤，而肺部纤维母细胞会分泌胶原蛋白、弹性蛋白、纤网蛋白等胞外基质以修复组织，但是，过度修复(即，分泌过多的胞外基质)会造成肺纤维化。BMP-7则可抑制TGF-β讯息传导路径的活化。以下(2-1)及(2-2)的实验是用以了解本发明式(I)化合物是否具有抑制肺部纤维母细胞过度分泌胞外基质(例如胶原蛋白)的能力。

(2-1)

将人类正常纤维母细胞株(Normal Human lung fibroblasts，NHLF)接种于6公分培养盘中，每盘接种20万个细胞(2×10⁵Cells/dish)，包括一个控制组以及三个实验组(共4盘)，并培养至次日。移除培养液后，分别以如下条件处理各组，以进行后续实验：

(1)正控制组：以含有1％血清的FGM-2培养液进行培养，历时36小时。

(2)负控制组：以含有1％血清及TGF-β1(5奈克/毫升)的FGM-2培养液进行培养，历时36小时。

(3)低剂量组：先以含有1％血清及TGF-β1(5奈克/毫升)的FGM-2培养液进行培养，历时12小时，其后，于培养液中添加化合物(1)至浓度为15微克/毫升，继续培养24小时。

(4)高剂量组：先以含有1％血清及TGF-β1(5奈克/毫升)的FGM-2培养液进行培养，历时12小时，其后，于培养液中添加化合物(1)至浓度为25微克/毫升，继续培养24小时。

其后，萃取各组细胞的蛋白质，并以西方墨点法侦测各组NHLF细胞的第I型胶原蛋白的表现，且以β-肌动蛋白作为内部控制(internal control)。以正控制组的结果为基准，计算其他各组的相对表现量，结果示于图2及表2。

表2

由图2及表2可知，相较于正控制组，经TGF-β1诱导的负控制组的胶原蛋白表现量明显提升。然而，相较于负控制组，低剂量组的胶原蛋白表现量则有下降的趋势，且高剂量组下降的趋势更为明显。

前述结果显示，TGF-β1会诱导肺部纤维母细胞大量表现胶原蛋白，本发明式(I)化合物则具有抑制胶原蛋白过度表现的效果，且该效果随着式(1)化合物浓度的增加而增强。

(2-2)

将人类正常纤维母细胞株(NHLF)接种于6公分培养盘中，每盘接种20万个细胞(2×10⁵cells/dish)，包括一个控制组以及六个实验组(共7盘)，并培养至次日。其后，移除培养液并分别以如下条件处理各组，以进行后续实验：

(1)控制组：以含有1％血清及TGF-β1(5奈克/毫升)的FGM-2培养液进行培养，历时36小时。

(2)第I组：先以含有1％血清及TGF-β1(5奈克/毫升)的FGM-2培养液进行培养，历时12小时，其后，于培养液中添加化合物(1)至浓度为15微克/毫升，继续培养24小时。

(3)第II组：先以含有1％血清及TGF-β1(5奈克/毫升)的FGM-2培养液进行培养，历时12小时，其后，于培养液中添加化合物(1)至浓度为25微克/毫升，继续培养24小时。

(4)第III组：先以含有1％血清及TGF-β1(5奈克/毫升)的FGM-2培养液进行培养，历时培养12小时，其后，于培养液中添加化合物(1)至浓度为35微克/毫升，继续培养24小时。

(5)第IV组：先以含有1％血清及TGF-β1(5奈克/毫升)的FGM-2培养液进行培养，历时12小时，其后，于培养液中添加吡非尼酮(Pirfenidone)至浓度为100微克/毫升，继续培养24小时。

(6)第V组：先以含有1％血清及TGF-β1(5奈克/毫升)的FGM-2培养液进行培养，历时12小时，其后，于培养液中添加吡非尼酮(Pirfenidone)至浓度为250微克/毫升，继续培养24小时。

(7)第VI组：先以含有1％血清及TGF-β1(5奈克/毫升)的FGM-2培养液进行培养，历时12小时，其后，于培养液中添加吡非尼酮(Pirfenidone)至浓度为500微克/毫升，继续培养24小时。

其后，萃取各组细胞的蛋白质，并以西方墨点法侦测各组NHLF细胞的第I型胶原蛋白、BMP-7蛋白及TGF-β蛋白的表现，且以控制组的结果为基准，计算其他各组的相对表现量，结果示于图3及表3。

表3

由图3及表3可知，相较于控制组，第I、II、III、IV、V、VI组的胶原蛋白表现量及TGF-β蛋白表现量皆明显下降。另一方面，相较于控制组，第I、II、III、IV、V、VI组的BMP-7蛋白表现量皆明显上升。

上述结果显示，本发明式(I)化合物可增加肺部纤维母细胞表现BMP-7蛋白，也可抑制TGF-β1所诱导的胶原蛋白过度表现，且该抑制效果随着式(I)化合物浓度的增加而提升。此说明，本发明式(I)化合物可通过增加BMP-7表现而抑制TGF-β讯息传导路径，具有抑制胶原蛋白过度表现的效果，且效果优于目前临床上用于治疗肺纤维化的药物。

(2-3)

以Fugene HD细胞转染试剂，将pcDNA3.1空载体以及pcDNA3.1-SOX2质体(即，带有SOX2基因的pcDNA3.1载体)分别转染至人类正常纤维母细胞株(NHLF)，并进行筛选，以获得带有pcDNA3.1空载体或pcDNA3.1-SOX2质体的人类正常纤维母细胞株。

接着，将带有pcDNA3.1空载体的人类正常纤维母细胞株接种于6公分培养盘中，每盘接种20万个细胞(2×10⁵cells/dish)，包括一个控制组以及三个实验组(共4盘)，并培养至次日，其后，移除培养液并分别以如下条件处理各组，以进行后续实验：

(1)控制组I：以含有1％血清的FGM-2培养液进行培养，历时36小时。

(2)第A组：以含有1％血清及TGF-β1(5奈克/毫升)的FGM-2培养液进行培养，历时36小时。

(3)第B组：以含有1％血清及TGF-β1(5奈克/毫升)的FGM-2培养液进行培养，历时12小时，其后，于培养液中添加化合物(1)至浓度为15微克/毫升，继续培养24小时。

(4)第C组：以含有1％血清及TGF-β1(5奈克/毫升)的FGM-2培养液进行培养，历时12小时，其后，于培养液中添加化合物(1)至浓度为30微克/毫升，继续培养24小时。

另一方面，将带有pcDNA3.1-SOX2质体的人类正常纤维母细胞株接种于6公分培养盘中，每盘接种20万个细胞(2×10⁵cells/dish)，包括一个控制组以及三个实验组(共4盘)，并培养至次日，其后，移除培养液并分别以如下条件处理各组，以进行后续实验：

(1)控制组II：以含有1％血清的FGM-2培养液进行培养，历时36小时。

(2)第D组：以含有1％血清及TGF-β1(5奈克/毫升)的FGM-2培养液进行培养，历时36小时。

(3)第E组：以含有1％血清及TGF-β1(5奈克/毫升)的FGM-2培养液进行培养，历时12小时，其后，于培养液中添加化合物(1)至浓度为15微克/毫升，继续培养24小时。

(4)第F组：以含有1％血清及TGF-β1(5奈克/毫升)的FGM-2培养液进行培养，历时12小时，其后，于培养液中添加化合物(1)至浓度为30微克/毫升，继续培养24小时。

其后，萃取各组细胞的蛋白质，并以西方墨点法侦测各组NHLF细胞的Sox2蛋白、TGF-β蛋白及第I型胶原蛋白的表现，且以控制组的结果为基准，计算其他各组的相对表现量，结果示于图4及表4。

表4

由图4可知，相较于带有pcDNA3.1空载体的人类正常纤维母细胞株(控制组I及第A至C组)，带有pcDNA3.1-SOX2质体的人类正常纤维母细胞株(控制组II及第D至F组)的Sox2蛋白表现量明显较高，显示前述转染实验已确实将pcDNA3.1-SOX2质体转染至人类正常纤维母细胞株中。

另一方面，由图4及表4可知，相较于第A组，第C组的Sox2蛋白、TGF-β蛋白及第I型胶原蛋白表现量皆明显下降；相较于第D组，第E、F组的TGF-β蛋白及第I型胶原蛋白表现量则未明显下降。前述结果显示，本发明式(I)化合物可抑制肺部纤维母细胞表现TGF-β蛋白及第I型胶原蛋白，但在过量表现Sox2蛋白的情况下，式(I)化合物则无法抑制TGF-β蛋白及第I型胶原蛋白。此说明，式(I)化合物可通过调控Sox2蛋白而抑制TGF-β及第I型胶原蛋白的表现，进而减缓肺纤维化。

实施例3：式(I)化合物抑制肺部纤维母细胞转化成肌纤维母细胞的效益

已知TGF-β讯息传导路径的活化会刺激纤维母细胞增生并转化成肌纤维母细胞，而BMP-7可抑制TGF-β讯息传导路径的活化。肌纤维母细胞是一种表现α-SMA标记蛋白且具高度移动性的细胞，其活化后会分泌过多的胞外基质于肺脏间质组织中沉积，而构成纤维化的微环境。因此，进行以下(3-1)及(3-2)的实验，以了解本发明式(I)化合物是否具有抑制肺部纤维母细胞转化成肌纤维母细胞的能力。

(3-1)

将人类正常纤维母细胞株(NHLF)接种于6公分培养盘中，每盘接种20万个细胞(2×10⁵cells/dish)，包括一个控制组以及六个实验组(共7盘)，并培养至次日。移除培养液后，分别以如下条件处理各组，以进行后续实验：

(1)控制组：以含有10％血清的FGM-2培养液进行培养，历时36小时。

(2)第i组：以含有1％血清的FGM-2培养液进行培养，历时36小时。

(3)第ii组：先以含有1％血清的FGM-2培养液进行培养，历时12小时，其后，于培养液中添加化合物(1)至浓度为15微克/毫升，继续培养24小时。

(4)第iii组：先以含有1％血清的FGM-2培养液进行培养，其后，于培养液中添加化合物(1)至浓度为25微克/毫升，继续培养24小时。

(5)第iv组：以含有1％血清及TGF-β1(5奈克/毫升)的FGM-2培养液进行培养，历时36小时。

(6)第v组：先以含有1％血清及TGF-β1(5奈克/毫升)的FGM-2培养液进行培养，历时12小时，其后，于培养液中添加化合物(1)至浓度为15微克/毫升，继续培养24小时。

(7)第vi组：先以含有1％血清及TGF-β1(5奈克/毫升)的FGM-2培养液进行培养，历时12小时，其后，于培养液中添加化合物(1)至浓度为25微克/毫升，继续培养24小时。

其后，萃取各组细胞的蛋白质，并以西方墨点法侦测各组NHLF细胞的BMP-7蛋白、TGF-β蛋白、及α-SMA蛋白的表现，且以β-肌动蛋白作为内部控制。以控制组的结果为基准，计算其他各组的相对表现量，结果示于图5及表5。

表5

由图5及表5可知，相较于第iv组，第v组及第vi组的TGF-β蛋白表现量及α-SMA蛋白表现量皆较低。

前述结果显示，本发明式(I)化合物可抑制肺部纤维母细胞的TGF-β讯息传导路径活化，且可抑制肌纤维母细胞的标记蛋白的表现。此说明，式(I)化合物具有抑制肺部纤维母细胞转化成肌纤维母细胞的效果。

(3-2)

将人类正常纤维母细胞株(NHLF)接种于6孔盘中，每孔接种10万个细胞(10⁵cells/well)，包括一个控制组以及五个实验组(共6孔)，并培养至次日。移除培养液后，分别以如下条件处理各组，以进行后续实验：

(1)控制组：以含有1％血清的FGM-2培养液进行培养，历时24小时。

(2)第α组：以含有1％血清及化合物(1)(5微克/毫升)的FGM-2培养液进行培养，历时24小时。

(3)第β组：以含有1％血清及化合物(1)(10微克/毫升)的FGM-2培养液进行培养，历时24小时。

(4)第γ组：以含有1％血清、H₂O₂(0.1毫莫耳浓度)的F-12K培养液进行培养，历时24小时。

(5)第δ组：以含有1％血清、H₂O₂(0.1毫莫耳浓度)及化合物(1)(5微克/毫升)的F-12K培养液进行培养，历时24小时。

(6)第ε组：以含有1％血清、H₂O₂(0.1毫莫耳浓度)及化合物(1)(10微克/毫升)的F-12K培养液进行培养，历时24小时。

其后，萃取各组细胞的总RNA(Total RNA)，并以反转录套组(QuantiTect ReverseTranscription Kit)对该总RNA进行反转录作用以获得cDNA。接着，对该cDNA进行实时定量聚合酶链锁反应(Q-PCR)，以分析各组NHLF细胞的α-SMA、TGF-β等基因的mRNA表现量，并以GAPDH基因作为内部控制。以控制组的结果为基准，计算其他各组的相对表现量，结果示于图6及表6。

表6

由图6及表6可知，相较于控制组，各实验组(即，第α、β、γ、δ、及ε组)的α-SMA及TGF-β基因的mRNA表现皆有下降的趋势。

前述结果显示，即使是在H₂O₂产生氧化压力的情况下，本发明式(I)化合物仍可抑制肺部纤维母细胞表现α-SMA及TGF-β基因表现。此说明，式(I)化合物可抑制肺部纤维母细胞的TGF-β讯息传导路径活化，且可抑制肌纤维母细胞标记基因的表现。

上述实验(3-1)及(3-2)的结果显示，本发明式(I)化合物可抑制肺部纤维母细胞转化成肌纤维母细胞，故具有防止过多细胞外基质(例如胶原蛋白、弹性蛋白、纤网蛋白等)在肺脏间质组织中沉积的效果。

实施例4：式(I)化合物抑制肺部纤维母细胞进行上皮-间质转换(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的效益

已知TGF-β/Smad讯息传导路径的活化会促进上皮-间质转换，BMP-7则可抑制TGF-β/Smad讯息传导路径的活化。当细胞进行上皮-间质转换，细胞与细胞之间的极性会渐渐丧失，且细胞的移行能力增加，而容易爬行及侵袭，参与组织中纤维化。因此，进行以下实验，以了解本发明式(I)化合物是否具有抑制肺部纤维母细胞进行上皮-间质转换的能力。

将人类正常纤维母细胞株(NHLF)接种于6公分培养盘中，每盘接种20万个细胞(2×10⁵cells/dish)，包括一个控制组以及五个实验组(共6盘)，并培养至次日。移除培养液后，分别以如下条件处理各组，以进行后续实验：

(1)控制组：以含有1％血清的FGM-2培养液进行培养，历时36小时。

(3)第B组：先以含有1％血清及TGF-β1(5奈克/毫升)的FGM-2培养液进行培养，历时12小时，其后，于培养液中添加化合物(1)至浓度为15微克/毫升，继续培养24小时。

(4)第C组：先以含有1％血清及TGF-β1(5奈克/毫升)的FGM-2培养液进行培养，历时12小时，其后，于培养液中添加化合物(1)至浓度为30微克/毫升，继续培养24小时。

(5)第D组：先以含有1％血清及TGF-β1(5奈克/毫升)的FGM-2培养液进行培养，历时12小时，其后，于培养液中添加化合物(2)至浓度为100微克/毫升，继续培养24小时。

(6)第E组：先以含有1％血清及TGF-β1(5奈克/毫升)的FGM-2培养液进行培养，历时12小时，其后，于培养液中添加化合物(2)至浓度为200微克/毫升，继续培养24小时。

其后，萃取各组细胞的蛋白质，并以西方墨点法侦测各组NHLF细胞的BMP-7蛋白、TGF-β蛋白、及p-smad2/3蛋白的表现，且以控制组的结果为基准，计算其他各组的相对表现量，结果示于图7及表7。

表7

由图7及表7可知，相较于第A组，第B组及第C组的BMP-7蛋白表现量明显较高，且TGF-β蛋白及p-smad2/3蛋白的表现量则明显较低。另外，相较于第A组，第D组及第E组的TGF-β蛋白及p-smad2/3蛋白的表现量也明显较低。

前述结果显示，本发明式(I)化合物可抑制肺部纤维母细胞表现TGF-β蛋白，并抑制smad2及smad3蛋白的磷酸化。此说明，式(I)化合物可抑制肺部纤维母细胞的TGF-β/Smad讯息传导路径活化，故具有用以抑制肺部纤维母细胞进行上皮-间质转换(EMT)的效果。

[动物实验]

实施例5：动物模型的建立

将24只C57B/L6小鼠(年龄：四周)随机分成四组(各组6只)，并分别以如下条件处理，以进行后续实验：

(1)控制组(非肺纤维化的小鼠；即，正常小鼠)：以气管内注射方式将50微升的PBS投予至小鼠。接着，饲养30天。

(2)Oil组：以气管内注射方式将0.6活性单位/50微升(0.6U/50μl)的硫酸博莱霉素(Bleomycin sulfate，溶剂为PBS)投予至小鼠。接着，每天以口服方式将100微升的橄榄油投予至小鼠，连续30天。

(3)低剂量组：以气管内注射方式将0.6活性单位/50微升(0.6U/50μl)的硫酸博莱霉素(Bleomycin sulfate，溶剂为PBS)投予至小鼠。接着，每天以口服方式将化合物(1)(10毫克/公斤体重，以橄榄油配制成100微升)投予至小鼠，连续30天。

(4)高剂量组：以气管内注射方式将0.6活性单位/50微升(0.6U/50μl)的硫酸博莱霉素(Bleomycin sulfate，溶剂为PBS)投予至小鼠。接着，每天以口服方式将化合物(1)(50毫克/公斤体重，以橄榄油配制成100微升)投予至小鼠，连续30天。

实施例6：肺功能测定

大部分肺纤维化的患者于确诊时，肺功能已下降，且有呼吸困难的症状，晚期患者更因身体长期缺氧，导致心脏衰弱、呼吸功能衰竭等。因此，进行以下实验，以了解本发明式(I)化合物是否可维持肺功能、减缓肺功能下降。

本实验以全体呼吸测量系统(Unrestrained Whole Body Plethysmography，WBP)评估实施例5各组小鼠的肺功能，通过侦测特定空间(chamber)内外气体变化，来推算出小鼠吸入与呼出的气体量，从而进一步得知各呼吸参数的数值，包括最大吸气量(PIF；即，一个期间内最大吸入气体的体积)、最大呼气量(PEF；即，一个期间内最大呼出气体的体积)、吸气时间(Ti；即，一个期间内吸气时间的平均值)、呼气时间(Te；即，一个期间内呼气时间的平均值)、呼吸频率(RR；即，每分钟的呼吸次数)、累积通气量(AV；即，每分钟进出气体的平均值)、潮气量(TV；即，单次呼出气体体积的平均值)、松弛时间(RT；即，气舱压力最大值升至40％的平均时间)等。结果示于图8。

由图8可知，相较于“Oil组”小鼠，“低剂量组”及“高剂量组”小鼠的呼气时间及松驰时间皆显著下降(p＜0.05)，累积通气量也有显著的提升(p＜0.01)，其他呼吸参数也与控制组(正常小鼠)较为接近。

前述结果显示，本发明式(I)化合物可有效维持小鼠的肺功能、减缓硫酸博莱霉素(Bleomycin sulfate)引起的肺功能下降。

实施例7：组织切片观察

于肺纤维化过程中，纤维化物质(例如胶原蛋白、弹性蛋白、纤网蛋白等胞外基质)会逐渐占据肺脏间质组织，导致肺泡组织壁变厚。因此，进行以下实验，以了解本发明式(I)化合物是否可有效延缓或改善前述肺纤维化的现象。

于完成实施例6的肺功能测定后，将小鼠牺牲，并取出小鼠的肺部组织样本，分成二个大组(各组样本皆包含控制组、Oil组、低剂量组、高剂量组)。将其中一组样本保存于-20℃，以进行后续的实验分析；对另一组样本进行苏木素-伊红染色(hematoxylin-sosinstain，H&E stain)分析，结果示于图9。

此外，为进一步观察小鼠肺部的纤维化情形，使用Ashcroft等人的文献所记载的肺部纤维化评分方式对上述图9的结果给予0至8分的评分，分数越高表示肺部纤维化的情形越严重。结果示于图10。前述评分方式可参见例如Simple method of estimatingseverity of pulmonary fibrosis on a numerical scale.J Clin Pathol.1988 Apr；41(4)：467-70.，该文献的全文并于此处以供参考。

由图9可知，相较于“控制组”小鼠，“Oil组”小鼠肺泡组织壁明显变厚且有明显的细胞异常浸润的现象，显示肺部免疫细胞及纤维母细胞的异常增生。然而，相较于“Oil组”小鼠，“低剂量组”及“高剂量组”小鼠的肺部组织壁明显较薄，细胞异常浸润的现象也明显较少。前述结果说明，硫酸博莱霉素(Bleomycin sulfate)会造成肺部免疫细胞及纤维母细胞异常增生，进而导致肺部纤维化，而本发明式(I)化合物的使用则可有效延缓或改善前述肺部纤维化的状况。

由图10可知，相较于“控制组”小鼠，“Oil组”小鼠的肺部纤维化分数明显升高，然而，相较于“Oil组”小鼠，“低剂量组”及“高剂量组”小鼠的肺部纤维化分数皆明显降低。

前述结果再次说明，本发明式(I)化合物的使用可有效延缓或改善前述肺部纤维化的状况。

实施例8：肺部组织的蛋白质及总RNA分析

如上述，肺部的TGF-β/Smad讯息传导路径的活化及过度免疫反应与肺纤维化的发病密切相关。若能抑制肺部的TGF-β/Smad讯息传导路径的活化、调控肺部组织中的免疫反应，即可有效抑制肺部产生过度免疫反应，而达到延缓肺纤维化的发病的效果。此外，增加气管扩张素C(surfactant C)的表现可抑制TGF-β/Smad讯息传导路径的活化。本实施例用以了解本发明式(I)化合物是否可有效调控肺部组织中的免疫反应、延缓肺纤维化的发病。

将实施例7所提供的保存于-20℃小鼠肺部组织样本取出，于液态氮中磨碎。接着，取部分磨碎的样本，以PRO-PREP^TM蛋白质萃取套组(PRO-PREPTM Protein Extraction Kit)萃取各组样本的蛋白质后，以西方墨点法侦测各组样本中的TGF-β蛋白、smad3蛋白、及气管扩张素C的表现，并以肌动蛋白作为内部控制(internal control)。结果示于图11。

再取部分磨碎的样本，以RNeasy mini RNA萃取套组(RNeasy Mini Kit)萃取各组样本的总RNA(Total RNA)，并以反转录套组(QuantiTect Reverse Transcription Kit)对该总RNA进行反转录作用以获得cDNA。接着，对该cDNA进行半定量聚合酶链锁反应(RT-PCR)，以分析各组样本的IL-β、IL-6等免疫相关基因的mRNA表现量，并以β-肌动蛋白(β-actin)基因作为内部控制。以控制组的结果为基准，计算其他各组的相对表现量，结果示于图12及表8。

表8

由图11可知，相较于Oil组，低剂量组以及高剂量组的TGF-β蛋白及smad3蛋白的表现量皆明显较低，而气管扩张素C的表现量则明显较高。前述结果再次显示，本发明式(I)化合物可抑制肺部的TGF-β/Smad讯息传导路径的活化。

由图12及表8可知，相较于控制组，Oil组的IL-β及IL-6基因的mRNA表现皆有上升的趋势，然而，相较于Oil组，低剂量组以及高剂量组的IL-β及IL-6等免疫相关基因的mRNA表现则明显下降。前述结果说明，本发明式(I)化合物具有调控肺部组织中的免疫反应、抑制肺部产生过度免疫反应的效果，故可用以延缓肺纤维化的发病。

由以上细胞实验以及动物实验的结果可知，本发明式(I)化合物具有提升肺泡细胞的抗氧化能力、提高肺泡细胞的存活率、减缓氧化压力对肺部组织所造成的损伤、抑制肺部纤维母细胞(Fibroblast)转化成肌纤维母细胞(Myofibroblast)、抑制肺部纤维母细胞进行上皮-间质转换(EMT)、及抑制胞外基质过度表现的效果，且可有效调控肺部组织中的免疫反应、减缓肺泡组织壁变厚、减缓肺部细胞异常浸润、及减缓肺功能下降，故可用以延缓肺纤维化的发病及/或治疗肺纤维化。

Claims

1.一种使用一活性成分于制造一药剂的用途，其特征在于，该药剂是用于延缓肺纤维化的发病及/或治疗肺纤维化，且该活性成分是以下的至少一种：式(I)化合物、及其医药上可接受的盐，

该式(I)化合物是选自以下群组的至少一种：

及

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，该药剂是用于以下的至少一种：提升肺泡细胞的抗氧化能力、提高肺泡细胞的存活率、减缓氧化压力对肺部组织所造成的损伤、抑制肺部纤维母细胞(Fibroblast)转化成肌纤维母细胞(Myofibroblast)、抑制肺部纤维母细胞进行上皮-间质转换(EMT)、及抑制胞外基质过度表现。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，该药剂是用于以下的至少一种：调控肺部组织中的免疫反应、减缓肺泡组织壁变厚、减缓肺部细胞异常浸润、及减缓肺功能下降。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，该药剂是用于以下的至少一种：调控细胞中Sox2蛋白的表现量、抑制胶原蛋白表现、及抑制TGF-β蛋白表现。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，该药剂的用量，以式(I)化合物计，为每天1毫克/公斤体重至500毫克/公斤体重。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，该药剂的用量，以式(I)化合物计，为每天5毫克/公斤体重至200毫克/公斤体重。

7.如权利要求5所述的用途，其特征在于，该药剂的用量，以式(I)化合物计，为每天10毫克/公斤体重至100毫克/公斤体重。