KR20230083613A - Nurr1 억제제를 포함하는 자폐 스펙트럼 장애의 치료 또는 예방용 약학 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 Nurr1 억제제를 포함하는 자폐 스펙트럼 장애의 치료 또는 예방용 약학 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 Nurr1 단백질 활성 또는 이 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 억제함으로써 사회적 상호 작용이 회복되고 반복 행동이 완화됨으로써 자폐 스펙트럼 장애를 치료 또는 예방할 수 있는 약학 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 자폐 스펙트럼 장애 치료제에 관한 것이다.
자폐 스펙트럼 장애는 의사소통의 어려움과 특정 행동을 반복하는 상동행동을 나타내며 발작, 불안, 우울증, 공격성, 인지 장애 등 다양한 공존 증상을 보이는 질환이다. 명확한 발병 기전은 규명되지 않았으며, 흥분성/억제성 신경의 불균형(Excitation/Inhibition imbalance)과 관련이 있는 것으로 알려져 있다.
그 동안 많은 연구가 이루어졌음에도 불구하고 현재까지 자폐 스펙트럼 장애의 치료 타겟이나 치료제가 충분히 제시되어 있지 않는 실정이다.
본 발명은 신규 자폐 스펙트럼 장애 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 Nurr1 단백질의 활성 억제 또는 Nurr1 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 억제를 통한 자폐 스펙트럼 장애의 치료 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. Nurr1(NR4A2) 또는 이를 코딩하는 유전자의 억제제를 포함하는 자폐 스펙트럼 장애 치료 또는 예방용 약학 조성물.
2. 위 1에 있어서, 억제제는 화합물, 단백질 또는 유전자인, 자폐 스펙트럼 장애 치료 또는 예방용 약학 조성물.
3. 위 1에 있어서, 억제제는 서열번호 1 내지 6으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 shRNA인, 자폐 스펙트럼 장애 치료 또는 예방용 약학 조성물.
4. 위 1에 있어서, 억제제는 서열번호 7 내지 15로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 siRNA인, 자폐 스펙트럼 장애 치료 또는 예방용 약학 조성물.
5. 위 3 또는 4에 있어서, 억제제의 전달체는 아데노 부속 바이러스, 아데노 바이러스, 단순 포진 바이러스 및 렌티 바이러스로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인, 자폐 스펙트럼 장애 치료 또는 예방용 약학 조성물.
6. 위 1에 있어서, 자폐 스펙트럼 장애는 낮은 언어능력, 낮은 사회성 또는 사회인지능력, 상동행동, 충동행동, 운동기능 항진 또는 저하, 불안감, 낮은 인지능력 또는 낮은 공간기억능력을 수반하는, 자폐 스펙트럼 장애 치료 또는 예방용 약학 조성물.
본 발명은 새로운 약리 기전에 기초한 자폐 스펙트럼 장애 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 신경 세포에서 신호 전달에 관여하는 Nurr1을 타겟으로 함으로써 자폐 스펙트럼 장애에 수반되는 증상이나 행동을 타겟으로 하는 경우에 비해 보다 근본적인 치료가 가능하다.
본 발명의 약학 조성물은 신규 약리 기전에 기초하므로 기존 자폐 스텍트럼 장애 치료제와의 병용 투여가 가능하다.
도 1은 자폐스펙트럼 장애 모델 신경회로 및 선조체 내 Nurr1 단백질의 발현을 억제한 후의 신경회로에 대한 개략도이다.
도 2는 임신 12.5일자의 어미 쥐에 발프로산 (VPA)을 피하주사함으로써 유도한 마우스 모델 (VPA 마우스)의 선조체 조직에서 시냅스 전도 손상이 나타남을 확인한 도면이다. 도 2의 A는 골지 염색을 통해 신경세포를 염색한 후, 배내측 선조체에서 수상돌기 가시 (dendritic spine) 밀도가 감소함을 나타낸다. 도 2의 B는 신경세포 수상돌기 가시의 대표 사진이다. 도 2의 C 및 D 는 신경세포 수상돌기 가시의 타입 분석을 통해 성숙도를 판단했을 때, 대조군 (SAL 마우스)에 비해 VPA 마우스의 배내측 선조체에서 성숙한 타입의 수상돌기 가시가 감소하고 미성숙한 타입의 수상돌기 가시는 차이가 없음을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM으로 나타내었다. 대조군과 비교하여 * p < 0.05.
도3은 VPA 마우스의 선조체 조직에서 Nurr1의 발현이 증가함을 나타낸다. 도 3의 A는 RNA sequencing을 통해 전사체 분석 시, SAL 마우스의 선조체 대비 VPA 마우스의 선조체에서 발현이 증가한 348개의 유전자와 발현이 감소한 258개의 유전자에 대한 volcano plot이다. 도 3의 B는 변화폭이 큰 상위 10개의 발현이 증가한 유전자 (빨간색)과 감소한 유전자 (파란색)이다. 도 3의 C는 선조체 조직에서 RNA sequencing과 RT-qPCR을 통해 확인된 Nurr1의 발현을 나타낸다. 대조군에 비해 VPA 마우스의 선조체에서 Nurr1의 발현이 유의하게 증가했다. 도 3의 D는 선조체 조직에서 웨스턴 블랏을 통해 Nurr1의 발현을 검사한 결과를 나타낸다. SAL 마우스에 비해 VPA 마우스의 선조체에서 Nurr1의 발현이 유의하게 증가했다. 데이터는 평균 ± SEM으로 나타내었다. SAL 마우스와 비교하여 * p < 0.05, ** p < 0.01.
도4는 Nurr1의 효현제인 Amodiaquine (AQ)를 주사한 마우스 (SAL AQ)에서 자폐 스펙트럼 장애의 주요 증상인 사회적 상호작용 저하를 나타낸다. Amodiaquine (AQ)를 매일 2회씩, 2주간 복강 투여하였다(도 4의 A). 도 4의 B는 AQ 주사 후 몸무게 변화를 나타낸다. 주사에 의한 몸무게의 변화는 없었다. 도 4의 C는 AQ 주사에 의한 뇌 무게의 변화를 나타낸다. 뇌 무게의 변화는 없었다. 도 4의 D는 3 chamber test를 이용하여 사회적 상호작용 정도를 측정한 결과를 나타낸다. SAL AQ 마우스는 대조군 (SAL veh 마우스)에 비해 새로운 마우스와의 사회적 상호작용이 유의하게 감소하였다. 각각 familiar 마우스와 비교하여 *** p < 0.01.
도5는 AQ를 주사한 마우스에서 배내측 선조체의 성숙한 타입의 수상돌기 가시 밀도가 감소함을 나타낸다. 도 5의 A는 골지 염색을 통해 신경세포를 염색한 후, 배내측 선조체에서 신경세포 수상돌기 가시 밀도를 측정한 결과이다. 전체 가시의 수에는 차이가 없었다. 도 5의 B는 신경세포 수상돌기 가시의 대표 사진이다. 도 5의 C 및 D는 성숙한 타입과 미성숙한 타입의 수상돌기 가시 수를 나타낸다. 수상돌기 가시의 형태에 의한 타입 분석을 통해 성숙도를 판단했을 때, 대조군 (SAL veh 마우스)에 비해 AQ를 주사한 SAL AQ 마우스의 배내측 선조체에서 성숙한 타입의 수상돌기 가시가 감소하고 미성숙한 타입의 수상돌기 가시는 차이가 없음을 알 수 있다. 데이터는 평균 ± SEM으로 나타내었다. 대조군과 비교하여 * p < 0.05.
도6은 Nurr1 shRNA를 포함하는 렌티바이러스를 선조체 내에 주사하여 Nurr1의 발현 저해가 VPA 마우스에서 나타나는 사회적 상호작용 감소를 회복시킴을 나타낸다. 3주령의 SAL 마우스 또는 VPA 마우스의 선조체에 뇌정위수술을 통해 scrambled shRNA를 포함하는 바이러스 (sh-sc) 또는 Nurr1 shRNA를 포함하는 바이러스 (sh-Nurr1)을 주사한 후, 8~9주령의 마우스를 이용하여 사회적 상호작용을 측정하는 행동실험을 수행하였다 도 6의 a). 도 6의 b는 바이러스 주사 방법 및 위치에 관한 도식이다 도 6의 c는 면역화학형광 염색법을 사용하여 Nurr1 단백질의 발현량을 비교한 결과이다. VPA 마우스의 선조체에서 증가한 Nurr1의 발현이 Nurr1 shRNA 렌티바이러스 주사에 의해 감소하였다. SAL sh-sc 마우스와 비교하여 *** p < 0.001,VPA sh-sc 마우스와 비교하여 ### p < 0.001. 도 6의 D는 3 chamber test를 이용하여 사회적 상호작용 정도를 측정한 결과이다. VPA sh-sc 마우스는 대조군 (SAL sh-sc 마우스)에 비해 새로운 마우스와의 사회적 상호작용이 유의하게 감소하는 반면, VPA sh-Nurr1 마우스에서는 대조군과 유사한 수준으로 사회적 상호작용하는 것을 확인하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 나타내었다. 각각 familiar 마우스와 비교하여 * p < 0.05.
도7은 VPA sh-Nurr1 마우스에서 배내측 선조체의 성숙한 타입의 수상돌기 가시 밀도가 증가함을 나타낸다. 골지 염색을 통해 신경세포를 염색한 후, 배내측 선조체에서 신경세포 수상돌기 가시 밀도를 측정했을 때 전체 가시의 수가 증가하였다(도 7의 a). 도 7의 b는 신경세포 수상돌기 가시의 대표 사진이다. 도 7의 C 및 D는 성숙한 신경세포 수상돌기 및 미성숙한 신경세포 수상돌기 가시의 수를 나타낸다. 신경세포 수상돌기 가시의 타입 분석을 통해 성숙도를 판단했을 때, VPA sh-sc 마우스에 비해 VPA sh-Nurr1 마우스의 배내측 선조체에서 성숙한 타입의 수상돌기 가시가 증가하고 미성숙한 타입의 수상돌기 가시는 차이가 없음을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM으로 나타내었다. VPA sh-sc 마우스와 비교하여 * p < 0.05.
도8은 PatDp+/- 마우스의 선조체 조직에서 Nurr1의 발현이 증가함을 나타낸다. 웨스턴 블랏을 통해 Nurr1의 발현을 검사하였으며, Wild-type 마우스에 비해 PatDp+/- 마우스의 선조체에서 Nurr1의 발현이 유의하게 증가함을 보여준다. 데이터는 평균 ± SEM으로 나타내었다. Wild-type 마우스와 비교하여 ** p < 0.01.
도 2는 임신 12.5일자의 어미 쥐에 발프로산 (VPA)을 피하주사함으로써 유도한 마우스 모델 (VPA 마우스)의 선조체 조직에서 시냅스 전도 손상이 나타남을 확인한 도면이다. 도 2의 A는 골지 염색을 통해 신경세포를 염색한 후, 배내측 선조체에서 수상돌기 가시 (dendritic spine) 밀도가 감소함을 나타낸다. 도 2의 B는 신경세포 수상돌기 가시의 대표 사진이다. 도 2의 C 및 D 는 신경세포 수상돌기 가시의 타입 분석을 통해 성숙도를 판단했을 때, 대조군 (SAL 마우스)에 비해 VPA 마우스의 배내측 선조체에서 성숙한 타입의 수상돌기 가시가 감소하고 미성숙한 타입의 수상돌기 가시는 차이가 없음을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM으로 나타내었다. 대조군과 비교하여 * p < 0.05.
도3은 VPA 마우스의 선조체 조직에서 Nurr1의 발현이 증가함을 나타낸다. 도 3의 A는 RNA sequencing을 통해 전사체 분석 시, SAL 마우스의 선조체 대비 VPA 마우스의 선조체에서 발현이 증가한 348개의 유전자와 발현이 감소한 258개의 유전자에 대한 volcano plot이다. 도 3의 B는 변화폭이 큰 상위 10개의 발현이 증가한 유전자 (빨간색)과 감소한 유전자 (파란색)이다. 도 3의 C는 선조체 조직에서 RNA sequencing과 RT-qPCR을 통해 확인된 Nurr1의 발현을 나타낸다. 대조군에 비해 VPA 마우스의 선조체에서 Nurr1의 발현이 유의하게 증가했다. 도 3의 D는 선조체 조직에서 웨스턴 블랏을 통해 Nurr1의 발현을 검사한 결과를 나타낸다. SAL 마우스에 비해 VPA 마우스의 선조체에서 Nurr1의 발현이 유의하게 증가했다. 데이터는 평균 ± SEM으로 나타내었다. SAL 마우스와 비교하여 * p < 0.05, ** p < 0.01.
도4는 Nurr1의 효현제인 Amodiaquine (AQ)를 주사한 마우스 (SAL AQ)에서 자폐 스펙트럼 장애의 주요 증상인 사회적 상호작용 저하를 나타낸다. Amodiaquine (AQ)를 매일 2회씩, 2주간 복강 투여하였다(도 4의 A). 도 4의 B는 AQ 주사 후 몸무게 변화를 나타낸다. 주사에 의한 몸무게의 변화는 없었다. 도 4의 C는 AQ 주사에 의한 뇌 무게의 변화를 나타낸다. 뇌 무게의 변화는 없었다. 도 4의 D는 3 chamber test를 이용하여 사회적 상호작용 정도를 측정한 결과를 나타낸다. SAL AQ 마우스는 대조군 (SAL veh 마우스)에 비해 새로운 마우스와의 사회적 상호작용이 유의하게 감소하였다. 각각 familiar 마우스와 비교하여 *** p < 0.01.
도5는 AQ를 주사한 마우스에서 배내측 선조체의 성숙한 타입의 수상돌기 가시 밀도가 감소함을 나타낸다. 도 5의 A는 골지 염색을 통해 신경세포를 염색한 후, 배내측 선조체에서 신경세포 수상돌기 가시 밀도를 측정한 결과이다. 전체 가시의 수에는 차이가 없었다. 도 5의 B는 신경세포 수상돌기 가시의 대표 사진이다. 도 5의 C 및 D는 성숙한 타입과 미성숙한 타입의 수상돌기 가시 수를 나타낸다. 수상돌기 가시의 형태에 의한 타입 분석을 통해 성숙도를 판단했을 때, 대조군 (SAL veh 마우스)에 비해 AQ를 주사한 SAL AQ 마우스의 배내측 선조체에서 성숙한 타입의 수상돌기 가시가 감소하고 미성숙한 타입의 수상돌기 가시는 차이가 없음을 알 수 있다. 데이터는 평균 ± SEM으로 나타내었다. 대조군과 비교하여 * p < 0.05.
도6은 Nurr1 shRNA를 포함하는 렌티바이러스를 선조체 내에 주사하여 Nurr1의 발현 저해가 VPA 마우스에서 나타나는 사회적 상호작용 감소를 회복시킴을 나타낸다. 3주령의 SAL 마우스 또는 VPA 마우스의 선조체에 뇌정위수술을 통해 scrambled shRNA를 포함하는 바이러스 (sh-sc) 또는 Nurr1 shRNA를 포함하는 바이러스 (sh-Nurr1)을 주사한 후, 8~9주령의 마우스를 이용하여 사회적 상호작용을 측정하는 행동실험을 수행하였다 도 6의 a). 도 6의 b는 바이러스 주사 방법 및 위치에 관한 도식이다 도 6의 c는 면역화학형광 염색법을 사용하여 Nurr1 단백질의 발현량을 비교한 결과이다. VPA 마우스의 선조체에서 증가한 Nurr1의 발현이 Nurr1 shRNA 렌티바이러스 주사에 의해 감소하였다. SAL sh-sc 마우스와 비교하여 *** p < 0.001,VPA sh-sc 마우스와 비교하여 ### p < 0.001. 도 6의 D는 3 chamber test를 이용하여 사회적 상호작용 정도를 측정한 결과이다. VPA sh-sc 마우스는 대조군 (SAL sh-sc 마우스)에 비해 새로운 마우스와의 사회적 상호작용이 유의하게 감소하는 반면, VPA sh-Nurr1 마우스에서는 대조군과 유사한 수준으로 사회적 상호작용하는 것을 확인하였다. 데이터는 평균 ± SEM으로 나타내었다. 각각 familiar 마우스와 비교하여 * p < 0.05.
도7은 VPA sh-Nurr1 마우스에서 배내측 선조체의 성숙한 타입의 수상돌기 가시 밀도가 증가함을 나타낸다. 골지 염색을 통해 신경세포를 염색한 후, 배내측 선조체에서 신경세포 수상돌기 가시 밀도를 측정했을 때 전체 가시의 수가 증가하였다(도 7의 a). 도 7의 b는 신경세포 수상돌기 가시의 대표 사진이다. 도 7의 C 및 D는 성숙한 신경세포 수상돌기 및 미성숙한 신경세포 수상돌기 가시의 수를 나타낸다. 신경세포 수상돌기 가시의 타입 분석을 통해 성숙도를 판단했을 때, VPA sh-sc 마우스에 비해 VPA sh-Nurr1 마우스의 배내측 선조체에서 성숙한 타입의 수상돌기 가시가 증가하고 미성숙한 타입의 수상돌기 가시는 차이가 없음을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM으로 나타내었다. VPA sh-sc 마우스와 비교하여 * p < 0.05.
도8은 PatDp+/- 마우스의 선조체 조직에서 Nurr1의 발현이 증가함을 나타낸다. 웨스턴 블랏을 통해 Nurr1의 발현을 검사하였으며, Wild-type 마우스에 비해 PatDp+/- 마우스의 선조체에서 Nurr1의 발현이 유의하게 증가함을 보여준다. 데이터는 평균 ± SEM으로 나타내었다. Wild-type 마우스와 비교하여 ** p < 0.01.
본 발명은 Nurr1(NR4A2) 단백질 활성 또는 이 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 억제함으로써 사회적 상호 작용이 회복되고 반복 행동이 완화됨으로써 자폐 스펙트럼 장애를 치료 또는 예방할 수 있는 약학 조성물에 관한 것이다.
Nurr1(NR4A2) 단백질은 올펀 핵 리셉터 패밀리(orphan nuclear receptor family)에 속하는 전사 인자이다. 중뇌에서 발현되며 중뇌 도파민 뉴런 발생에 결정적인 인자이다.
본 발명의 약학 조성물은 Nurr1 또는 이를 코딩하는 유전자의 억제제를 유효성분으로 포함한다.
본 발명의 약학 조성물은 Nurr1을 억제함으로써 자폐 스펙트럼 장애를 가지고 있는 동물의 사회적 상호작용을 향상시킬 수 있고 시냅스 전도 손상을 회복시킬 수 있다.
Nurr1 또는 이를 코딩하는 유전자의 억제제는 Nurr1 단백질에 결합하여 그 활성을 저감, 억제 또는 소멸시킬 수 있는 모든 물질을 포함하고, Nurr1을 코딩하는 유전자에 결합하여 Nurr1의 발현을 저감, 억제 또는 차단하는 모든 물질을 포함한다.
Nurr1(NR4A2) 또는 이를 코딩하는 유전자의 억제제는 화합물, 단백질(항체, scFv 등 포함) 또는 유전자일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 Nurr1(NR4A2) 단백질의 활성 억제제를 유효성분으로 포함한다.
Nurr1(NR4A2) 단백질의 활성 억제제는 예컨대 parecoxib, oxaprozin 또는 camptothecin 등일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 Nurr1(NR4A2)을 코딩하는 유전자의 발현 억제제를 유효성분으로 포함한다.
Nurr1(NR4A2)을 코딩하는 유전자의 발현 억제제는 예컨대 Nurr1 pre-mRNA 또는 mRNA의 발현을 억제하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)이거나 Nurr1 mRNA에 결합하여 Nurr1 mRNA를 분해하거나 발현을 억제하는 siRNA, shRNA 또는 miRNA일 수 있다.
Nurr1(NR4A2)을 코딩하는 유전자의 발현 억제제는 서열번호 1 내지 6으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 shRNA일 수 있다.
Nurr1(NR4A2)을 코딩하는 유전자의 발현 억제제는 서열번호 7 내지 13으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 siRNA일 수 있다.
Nurr1(NR4A2)을 코딩하는 유전자의 발현 억제제는 서열번호 14 또는 15의 서열을 갖는 siRNA일 수 있다. 서열번호 14의 서열을 갖는 siRNA는 NuIP mRNA의 1464 내지 1482번째 뉴클레오티드, 서열번호 15의 서열을 갖는 siRNA는 NuIP mRNA의 3236 내지 3254번째 뉴클레오티드로 NuIP mRNA의 발현을 억제함으로써, Nurr1을 억제할 수 있다. NuIP mRNA의 발현을 억제함으로써 Nurr1의 발현을 억제할 수 있음은 미국공개특허 제 2011-0268748의 결과를 통해 알 수 있다.
본 발명의 자폐 스펙트럼 장애는 심각한 사회 부적응을 나타내는 대표적인 발달 장애를 의미한다. 근본적으로 사회적 상호작용 및 의사소통 기술의 결함과 제한적이고 반복적이며 상동적인 행동 특성과 성장에 따라 요구되는 행동, 기술, 선호, 기능수행, 학습 등에서 매우 다양한 특성을 보인다. 예를 들어 낮은 언어능력, 낮은 사회성 또는 사회인지능력, 상동행동, 충동행동, 운동기능 항진 또는 저하, 불안감, 낮은 인지능력 또는 낮은 공간기억능력 등을 보일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 서열번호 1 또는 2의 염기서열로 이루어진 shRNA를 발현하는 렌티바이러스를 마우스 선조체 내 주입 후 Nurr1의 발현이 억제됨을 확인하였으며, Nurr1의 발현 저해가 마우스의 사회적 상호작용을 회복시켰음을 확인했다.
본 발명의 약학 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 보조제를 포함할 수 있다. 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 충진제, 항응집제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제, 향미제 등이 있다.
본 발명의 약학 조성물은 유효 성분 이외에 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제제화할 수 있다.
약학적으로 유효한 양은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 단독 또는 병용 투여될 수 있다. 다른 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 투여량은 부작용 없이 최소량으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양이 바람직하다. 이는 당업자에 의해 적절히 결정될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있다. 예컨대 체중 1kg 당 0.001 내지 150mg, 바람직하게는 0.01 내지 100mg을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있다.
담체, 부형제 및 희석제로는 예컨대 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 인간을 포함하는 개체에 투여된 후 유효 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출되도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캡슐, 멸균 주사용액, 멸균 분말일 수 있다.
본 발명의 유효성분은 아데노 부속 바이러스, 아데노 바이러스, 단순 포진 바이러스 및 렌티 바이러스로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 전달체로 전달될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예로 보다 상세하게 설명한다.
실시예
1. 재료 및 방법
1.1. 실험 동물
모든 동물 실험 절차는 서울대학교 동물실험윤리위원회 및 생물안전위원회에 의해 승인받았다(승인 번호: SNU-190426-10-1). BALB/c 마우스는 코아텍 (평택, 한국)으로부터 구입하여, 교배하였다. 임신 12.5일에 vehicle saline 또는 VPA (600mg/kg)를 피하투여하였다. 동물 처리 및 유지는 서울대학교(서울, 한국)의 동물 보호 및 사용 기준에 따라 수행하였다. PatDP+/- 마우스의 선조체 조직은 한국뇌연구원 라종철 책임연구원 연구실로부터 공급받았다.
1.2. RNA 서열 분석
10주령의 수컷 마우스를 전신마취를 유도하기위해 졸레틸(Zoletil) 50과 룸푼(Rumpun)을 주사하였다. 브레그마로부터 0.86-0.14 mm 앞을 포함하는 약 1 mm의 관상면 조직을 분리함으로써 선조체 조직을 얻었다. 전체 RNA는 miRNeasy 미니 키트 (cat no. 217004, Qiagen, CA, USA)를 통해 추출하였다. RNA 라이브러리 제작, 클러스터 생산, 서열 분석은 테라젠 이텍스 (수원, 한국)에서 진행하였다.
1.3. 생물정보학적 분석
차등 발현 유전자의 온톨로지는 DAVID 소프트웨어 (6.8 버전)을 이용해 분석했다. 또한, 차등 발현 유전자 관련 마우스 표현형 분석은 Enrichr (http://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/)의 마우스 유전 정보학 마우스 표현형 분석을 이용하였다. p값 0.05를 컷오프 기준으로 하였다.
1.4. AQ 투여
6주령의 SAL 마우스 또는 VPA 마우스에 AQ (20 mg/kg)를 12시간 간격으로 총 2주간 복강투여하였다. AQ는 투여 직전에 0.9% saline에 녹여 준비했다. 마지막 투여로부터 1주 후에 행동 실험을 수행하였다.
1.5. 렌티바이러스의 뇌정위투여
Scrambled shRNA 또는 Nurr1 shRNA를 발현하는 렌티바이러스는 Sirion Biotech (마틴슈리드, 독일)로부터 구입하였다. 양쪽의 선조체 (좌표: AP +0.3, ML ±1.9, DV -3.25 mm)에 바이러스를 각각 1.5 ul (1.1~1.3E+11 GC/ml)씩 0.15 μl/분의 속도로 투여했다 (Kopf instruments, CA, USA).
1.6. 골지 염색
10주령의 마우스를 심장 관류 후 뇌를 분리했다. 반구를 골지 염색에 이용하였다. 염색을 제조업체의 정보에 따라 수행하였다 (FD Rapid GolgiStain Kit, FD Neurotechnologies, MD, USA).
1.7. qPCR
분리된 total RNA 0.7~1ug를 이용하여 제조업체의 정보에 따라 cDNA를 합성하였다 (AccuPower RocketScript RT PreMix, 바이오니아, 대전, 한국). Real-time PCR의 반응은 CFX96 (Bio-rad, CA, USA) 기기를 이용하여 제조업체의 정보 (iQ?? SYBR® Green Supermix, Bio-rad, CA, USA)에 따라 수행한 후 △△Ct-value를 이용하여 18S rRNA의 발현양을 기준으로 하여 각각의 유전자 발현양을 비교하였다. 프라이머는 NCBI primer blast software (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)를 이용해 디자인했다. 각 프라이머의 특이성은 PCR product를 아가로오즈 젤에 로딩하여 확인하였다.
1.8. 웨스턴 블랏
선조체 추출 샘플을 변성 10% SDS-PAGE 겔에 전기영동하고 NC막 또는 PVDF 막(Millipore, MA, USA)으로 옮겼다. 각각의 막은 일차 항체로 프로빙하였다; Nurr1 (#PA5-13416, Thermo Fisher Scientific, IL, USA), GAPDH (#LF-PA-0018, AB frontier, 서울, 한국). 세척 이후, 상기 막을 HRP가 표지된 이차 항체로 프로빙하였다 (Molecular Probes, NY, USA). HRP 신호를 강화된 화학 발광(ECL) 기질(Thermo Fisher Scientific, IL, USA)을 사용하여 시각화하였다.
1.9. 행동 실험 (3 chamber test)
실험 장치는 개폐 가능한 문이 있는 3개의 칸 (chamber)로 된 플렉시 글락스 상자이다. 첫번째 phase에서는 한쪽 칸에는 나이와 성별이 같은 마우스 (familiar 마우스)를 넣고 다른 한쪽 칸에는 물체만 넣은 후, 실험 마우스를 가운데 칸에 넣어 10분간 자유롭게 돌아다닐 수 있도록 한다. 2번째 phase에서는 familiar 마우스는 그대로 두고 물체만 있던 칸에 나이와 성별이 같은 새로운 마우스 (stranger 마우스)를 넣어준 후, 실험 마우스를 가운데 칸에 넣어 10분간 더 돌아다니도록 한다. 실험장치는 각 trial 사이에 70% 에탄올로 닦아주었다.
1.10. 면역형광염색
9~10주령의 마우스에서 뇌를 적출한 후, 4% paraformaldehyde에 넣고 4 ℃에서 24시간 둔다. 그 후, 30% sucrose-PBS 용액으로 옮겨 4 °C에 3일 이상 둔다. 그 후, 크라이오스탯 (Thermo Fisher Scientific, IL, USA)를 이용해 30 μm 두께의 관상면 동결박편을 얻는다.
뇌 박편은 10 mM sodium citrate buffer (pH 6.0)에 넣어 95°C에서 10분간 antigen retrieval하고 2% BSA 또는 10% serum이 담긴 0.3% Triton X-100-PBS 용액에 넣어 실온에서 1시간동안 blocking한다. 그 후, 일차 항체가 희석된 blocking buffer에 조직을 넣어 4°C에서 밤새 반응시킨다. 다음으로, 2차 항체가 희석된 PBS에 조직을 넣어 실온에서 2~3시간 반응시키고 Topro3 (diluted 1:1000; Thermo Fisher Scientific, IL, USA) 또는 DAPI (1:1000, Thermo Fisher, IL, USA)로 염색한다. 마지막으로 mounting solution (Merck, Darmstadt, Germany)을 이용해 슬라이드 글라스에 부착한다. 이미지는 공초점 현미경 (LSM510, Zeiss, Oberkochen, Germany 또는 Nikon A1 confocal microscope, Nikon, Melville, NY, USA)를 이용하여 얻었다. 각 절편당 2~3개의 선조체 부위의 이미지를 얻었고 각 부위의 intensity를 분석하였다. 일차 항체: Nurr1 (Thermo Fisher Scientific, IL, USA). 이차 항체 goat anti-rabbit Alexa 555 (Thermo Fisher Scientific, IL, USA).
1.11. 통계 분석
데이터를 평균(SEM) 값의 평균 ± 표준 오차로 나타내었다. 통계적 유의성을 결정하기 위해 크루스칼 왈리스 테스트, LSD 사후 비교를 사용하는 원-웨이 ANOVA, LSD 사후 비교를 사용하는 투-웨이 ANOVA, 또는 Bonferroni 사후 비교를 사용하는 반복 측정 ANOVA (IBM SPSS Statistics 23, IL, USA)를 사용하였다. 실험 결과는 p < 0.05일 경우 통계적으로 유의한 것으로 보았다.
2.결과
2.1. 10주령 VPA 마우스의 선조체 내 신경세포 수상돌기 가시 밀도 감소
선조체의 구조적 이상은 자폐 스펙트럼 장애 환자의 뇌에서 보이는 주요 이상 중 하나이다. 수상돌기 가시의 밀도와 모양은 시냅스 가소성의 마커이다. VPA 마우스의 선조체 내 수상돌기의 구조적 변화를 확인하기 위해 10주령 마우스의 뇌를 이용하여 골지 염색을 수행하였다. VPA 마우스의 배내측 선조체에서 대조군인 SAL 마우스에 비해 수상돌기 가시 밀도가 감소한 것 (p=0.036)을 확인하였다 (도 2의 A). 도 2의 B는 골지 염색된 뉴런의 대표 사진이다. 다음으로 구조적 변화를 확인하였다. VPA 마우스의 배내측 선조체에서 SAL 마우스에 비해 성숙한 타입의 수상돌기 가시 밀도가 감소한 것 (p=0.033)을 확인하였다 (도 2의 C). 반면, 비성숙한 타입의 수상돌기 가시 밀도에는 차이가 없었다 (도 2의 D).
2.2. 10주령 VPA 마우스의 선조체 내 전사체 변화
SAL 마우스와 VPA 마우스의 선조체 내 전사체를 비교하기 위해 RNA sequencing을 수행하였다. 그 결과, 348개의 유전자가 VPA 마우스의 선조체에서 증가하고 258개의 유전자가 감소하는 것을 확인하였다 (도 3의 A). 도 3의 B는 증가한 유전자와 감소한 유전자 중 각각 상위 10개의 유전자를 나타낸 도식이다. 다음으로 유의하게 증가한 유전자들의 gene ontology를 분석하였다. 분자 및 생리학적 특성으로 비교한 경우, 증가한 유전자에서는 "이온 채널 활성", "화학적 시냅스 전달", "축삭돌기 생성"이 확인되었다. 세포 구성요소로 분석했을 때에는 증가한 유전자에서 대부분 신경세포 관련 요소인 "수상돌기 막", "축삭돌기", "수상돌기", "랑비에 결절"이 확인되었다. 또한, 마우스 표현형으로 확인했을 때에는 2개의 자폐 스펙트럼 관련 표현형에 해당하는 "비정상적인 불안 반응"과 "과도한 긁는 행동"이 확인되었다 (도 3의 C). 감소한 유전자들의 gene ontology를 분석하였을 때, 생물학적 특성에서는 "소포체로의 단백질 이동", "생합성", "mRNA 분해 과정"이 확인되었다. 분자적 기능에서는 "혈소판유래성장인자, 액틴, 트로포미오신, 칼슘 이온의 결합", "뉴로펩티드 호르몬 활성"이 확인되었고, 세포 구성요소에서는 "세포질 내 리보좀"이 확인되었다. 마우스 표현형에서는 뼈 발달 관련 표현형 ("뼈돌출증", "비정상적 궁둥뼈 형태", "비정상적 두덩뼈 형태", "비정상적 공통각 형태"가 확인되었다 (도 3의 D). 증가한 유전자들 중 Nurr1 유전자가 mRNA 수준 (p=0.007) (도 3의 E)와 단백질 수준 (p=0.047) (도3F)에서도 유의하게 증가하는 것으로 확인되었다.
2.3. AQ 투여에 의한 자폐 스펙트럼 장애 증상 유도
Nurr1의 활성화가 행동에 미치는 영향을 확인하기 위해, 10주령의 SAL 마우스에 20mg/kg의 AQ를 매일 2회씩, 2주간 복강투여 후 행동 실험을 수행하였다 (도 4의 A). AQ를 투여한 SAL 마우스 (SAL AQ 마우스)는 vehicle만 투여한 대조군 마우스 (SAL Veh 마우스)와 몸무게와 뇌의 무게에는 차이가 없었다(도 4의 B-C). AQ에 의한 자폐 스펙트럼 장애 유도를 확인하기 위해 사회성을 확인할 수 있는 3 chamber test를 수행하였다. SAL Veh 마우스는 기존의 마우스 (familiar mouse)에 비해 새로운 마우스 (stranger mouse)가 있는 칸에서 더 오랜 시간을 보내는 반면, SAL AQ 마우스는 familiar mouse가 있는 칸과 stranger mouse가 있는 칸에서 보내는 시간에 유의한 차이가 없었다 (SAL Veh; p = 0.00005, SAL AQ; p = 0.317) (도 4의 D).
2.4. AQ 투여에 의한 선조체 내 수상돌기 가시 밀도 변화
AQ를 투여한 마우스에서 사회적 상호작용이 감소하는 분자적 기전을 확인하기 위해 배내측 선조체의 수상돌기 가시를 측정하였다. 전체 수상돌기 가시와 비성숙한 타입의 수상돌기 가시의 수에는 차이가 없었으나, 성숙한 타입의 수상돌기 가시의 수는 SAL Veh 마우스에 비해 SAL AQ마우스의 배내측 선조체에서 감소했다 (p = 0.007) (도 5의 A-C).
2.5. Nurr1 발현 저해에 의한 자폐 스펙트럼 장애 증상 완화
Nurr1 유전자의 발현 저해에 의한 치료 효과를 확인하기 위해, Nurr1 shRNA를 발현하는 렌티바이러스를 선조체 내에 주입 후 행동 실험을 수행하였다 (도 6의 A-B). 면역형광염색법을 이용하여 Nurr1의 발현이 shRNA에 의해 감소한 것을 확인하였다 (p = 4.75 x 10-8) (도 6의 C). 3 chamber test로 사회적 상호작용 확인 시, scrambled shRNA 렌티바이러스를 주사한 VPA 마우스 (VPA sh-sc)는 familiar mouse가 있는 칸과 stranger mouse가 있는 칸에서 보내는 시간에 차이가 없는 것과 달리 Nurr1 shRNA 렌티바이러스를 주사한 VPA 마우스 (VPA sh-Nurr1)는 stranger mouse가 있는 칸에서 유의적으로 더 오랜 시간을 보냈다 SAL sh-sc, p = 0.020; SAL sh-Nurr1, p = 0.014; VPA sh-sc, p = 0.205; VPA sh-Nurr1; p = 0.039) (도 6의 D). 이 결과를 통해 Nurr1의 발현 저해가 VPA 마우스에서 관찰되는 사회적 상호작용 결여를 회복시켰음을 알 수 있었다.
2.6. Nurr1 발현 저해에 의한 선조체 내 수상돌기 가시 밀도 변화
Nurr1 유전자의 발현 저해에 의한 수상돌기 가시 밀도 변화를 확인한 결과, VPA sh-sc 마우스에 비해 VPA sh-Nurr1 마우스의 배내측 선조체 내에서 전체 (p = 0.007), 성숙한 타입 (p = 0.00003)의 수상돌기 가시 수가 유의하게 증가했다. 반면, 미성숙한 타입의 수상돌기 가시 수에는 차이가 없었다 (도 7).
2.7. 유전적 자폐 스펙트럼 마우스 모델인 PatDp
+/-
마우스의 선조체 내 Nurr1 발현 증가
자폐 스펙트럼 장애의 병리생리학에서 Nurr1의 중요성을 확인하기 위해 유전적 마우스 모델인 PatDp+/- 마우스의 선조체에서도 Nurr1의 발현이 증가하는지 확인하였다. PatDp+/- 마우스는 인간의 염색체 중 15q11-q13 부위에 상응하는 6.3Mb의 paternal duplication을 갖는 마우스 모델이다. 이 부위의 염색체 이상은 자폐 스펙트럼 장애, 프레더-윌리 증후군, 엔젤만증후군을 유도하는 것으로 보고되어 있다. PatDp+/- 마우스의 선조체 조직에서 Nurr1의 발현이 증가되어 있었다 (p = 0.008) (도 8).
| 서열번호 | ||
| shRNA | cgatttctta actccagagt t 21 | 1 |
| shRNA | agaatacagc tccgatttct t 21 | 2 |
| shRNA | gtacagctcc gatttcttaa ttcaagagat taagaaatcg gagctgtatt tttt 54 | 3 |
| shRNA | gcgcgaaata tgtgtgttta ttcaagagat aaacacacat atttcgcgtt tttt 54 | 4 |
| shRNA | gaccatgtga ctttcaatat tcaagagata ttgaaagtca catggtcttt ttt 53 | 5 |
| shRNA | gggaatggat tgattccatt tcaagagaat ggaatcaatc cattcccttt ttt 53 | 6 |
| siRNA | tacagctccg atttcttaa 19 | 7 |
| siRNA | cgcgaaatat gtgtgttta 19 | 8 |
| siRNA | gaccatgtga ctttcaata 19 | 9 |
| siRNA | gacctcacca acactgaaa 19 | 10 |
| siRNA | cagcaataat tgacaaact 19 | 11 |
| siRNA | gtcctccatt aaggtagaa 19 | 12 |
| siRNA | gggaatggat tgattccat 19 | 13 |
| siRNA | catgg tctag gagag gtct 19 | 14 |
| siRNA | gggcc ctgga gcacg tatt 19 | 15 |
<110> SEOUL NATIONAL UNIVERSITY R&DB FOUNDATION
<120> Pharmaceutical Composition for treating or preventing autism
spectrum disorder comprising Nurr1 inhibitor
<130> 21P10032
<160> 15
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> shRNA
<400> 1
cgatttctta actccagagt t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> shRNA
<400> 2
agaatacagc tccgatttct t 21
<210> 3
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> shRNA
<400> 3
gtacagctcc gatttcttaa ttcaagagat taagaaatcg gagctgtatt tttt 54
<210> 4
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> shRNA
<400> 4
gcgcgaaata tgtgtgttta ttcaagagat aaacacacat atttcgcgtt tttt 54
<210> 5
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> shRNA
<400> 5
gaccatgtga ctttcaatat tcaagagata ttgaaagtca catggtcttt ttt 53
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> shRNA
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gggaatggat tgattccatt tcaagagaat ggaatcaatc cattcccttt ttt 53
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> siRNA
<400> 15
gggccctgga gcacgtatt 19
Claims (6)
- Nurr1(NR4A2) 또는 이를 코딩하는 유전자의 억제제를 포함하는 자폐 스펙트럼 장애 치료 또는 예방용 약학 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 억제제는 화합물, 단백질 또는 유전자인, 자폐 스펙트럼 장애 치료 또는 예방용 약학 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 억제제는 서열번호 1 내지 6으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 shRNA인, 자폐 스펙트럼 장애 치료 또는 예방용 약학 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 억제제는 서열번호 7 내지 15로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 siRNA인, 자폐 스펙트럼 장애 치료 또는 예방용 약학 조성물.
- 청구항 3 또는 4에 있어서, 상기 억제제의 전달체는 아데노 부속 바이러스, 아데노 바이러스, 단순 포진 바이러스 및 렌티 바이러스로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인, 자폐 스펙트럼 장애 치료 또는 예방용 약학 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 자폐 스펙트럼 장애는 낮은 언어능력, 낮은 사회성 또는 사회인지능력, 상동행동, 충동행동, 운동기능 항진 또는 저하, 불안감, 낮은 인지능력 또는 낮은 공간기억능력을 수반하는, 자폐 스펙트럼 장애 치료 또는 예방용 약학 조성물.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210171764A KR20230083613A (ko) | 2021-12-03 | 2021-12-03 | Nurr1 억제제를 포함하는 자폐 스펙트럼 장애의 치료 또는 예방용 약학 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210171764A KR20230083613A (ko) | 2021-12-03 | 2021-12-03 | Nurr1 억제제를 포함하는 자폐 스펙트럼 장애의 치료 또는 예방용 약학 조성물 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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| KR20230083613A true KR20230083613A (ko) | 2023-06-12 |
Family
ID=86770051
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020210171764A KR20230083613A (ko) | 2021-12-03 | 2021-12-03 | Nurr1 억제제를 포함하는 자폐 스펙트럼 장애의 치료 또는 예방용 약학 조성물 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20230083613A (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20210113154A (ko) | 2018-09-06 | 2021-09-15 | 제이디에스 테라퓨틱스, 엘엘씨 | 비오틴 조성물을 사용한 자폐증 및 자폐 스펙트럼 장애의 치료 |
-
2021
- 2021-12-03 KR KR1020210171764A patent/KR20230083613A/ko not_active Application Discontinuation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20210113154A (ko) | 2018-09-06 | 2021-09-15 | 제이디에스 테라퓨틱스, 엘엘씨 | 비오틴 조성물을 사용한 자폐증 및 자폐 스펙트럼 장애의 치료 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E902 | Notification of reason for refusal |