TWI650125B - 用於延緩肺纖維化之發病及／或治療肺纖維化之藥劑 - Google Patents

用於延緩肺纖維化之發病及／或治療肺纖維化之藥劑 Download PDF

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Abstract

一種使用一活性成分於製造一藥劑的用途，其中該藥劑係用於延緩肺纖維化之發病及/或治療肺纖維化，且該活性成分係選自以下群組：式(I)化合物、其醫藥上可接受之鹽、及前述之組合， 其中，A係C5烷基或烯基，且視需要具一選自以下群組之取代基：-OH及=O；X係H、或OH；Y係O；以及R1係H或不存在，其條件為，當R1不存在時，Y係與A鍵結形成一五員環。

Description

用於延緩肺纖維化之發病及/或治療肺纖維化之藥劑
本發明係關於使用如下式(I)化合物以延緩肺纖維化之發病及/或治療肺纖維化的應用， 其中，A係C5烷基或烯基，且視需要具一選自以下群組之取代基：-OH及=O；X係H、或OH；Y係O；以及R1係H或不存在，其條件為，當R1不存在時，Y係與A鍵結形成一五員環。
肺纖維化(又稱為間質性肺病)是指膠原蛋白、彈性蛋白、纖網蛋白等胞外基質(extracellular matrix，ECM)在肺臟間質組織中沉積，從而在肺臟間質產生類似疤痕組織 (scar)的疾病。肺纖維化會使原來如海綿般柔軟的肺部組織變得如混凝土般堅硬且失去彈性，逐漸喪失收縮、舒張、及氣體交換的能力。
肺纖維化初期的患者一般會有呼吸急促、胸口悶痛、及咳嗽等症狀，惟，該等早期症狀不易辨識，50%以上的患者曾被誤診為氣喘、肺氣腫、慢性阻塞性肺病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD)、或是心臟疾病。大部分肺纖維化患者確診時，肺功能已下降，且有呼吸困難的症狀，造成慢性缺氧，而體內氧氣不足會使集中力、記憶力下降，且會導致細胞疲弱、身體機能衰退、新陳代謝減慢、加速衰老、以及各種併發症等。肺纖維化晚期之患者則因身體長期缺氧而導致心臟衰弱、呼吸功能衰竭，嚴重時甚至必須靠吸入高濃度氧氣方能維持生命。
肺纖維化患者的死亡率遠高於癌症，據統計，存活五年以上者低於50%，存活十年以上者更是低於10%。目前尚無可以有效治療肺纖維化的藥物，其中，商業化的吡非尼酮(Pirfenidone，商品名：Esbriet®)雖可改善肺纖維化患者的肺活量，但對於肺纖維化的治療多無明顯益處，且患者在使用後會產生許多副作用包括噁心、嘔吐、消化不良、厭食、紅疹、頭暈、見光敏感等。因此，臨床上仍需要一種可延緩肺纖維化之發病及/或治療肺纖維化的藥物。
本案發明人發現，本發明式(I)化合物具有提升肺泡細胞的抗氧化能力、提高肺泡細胞的存活率、減緩氧化壓 力對肺部組織所造成的損傷、抑制肺部纖維母細胞(Fibroblast)轉化成肌纖維母細胞(Myofibroblast)、抑制肺部纖維母細胞進行上皮-間質轉換(epithelial-mesenchymal transition，EMT)、及抑制胞外基質過度表現的效果，且可有效調控肺部組織中的免疫反應、減緩肺泡組織壁變厚、減緩肺部細胞異常浸潤、及減緩肺功能下降，故可用於延緩肺纖維化之發病及/或治療肺纖維化。
本發明之一目的，在於提供一種使用一活性成分於製造一藥劑的用途，其中該藥劑係用於延緩肺纖維化之發病及/或治療肺纖維化，且該活性成分係選自以下群組：式(I)化合物、其醫藥上可接受之鹽、及前述之組合， 其中，A係C5烷基或烯基，其係視需要具一選自以下群組之取代基：-OH及=O；X係H、或OH；Y係O；以及R1係H或不存在，其條件為，當R1不存在時，Y係與A鍵結形成一五員環。
於根據本發明之用途之一較佳實施態樣中，於所涉 之式(I)化合物中，A係、、或。
於根據本發明之用途之另一較佳實施態樣中，於所 涉之式(I)化合物中，A係；X係OH。
於根據本發明之用途之又一較佳實施態樣中，所涉之式(I)化合物係選自以下群組之至少一者： 、及。
本發明之另一目的，在於提供一種延緩肺纖維化之發病及/或治療肺纖維化的方法，其係包含於有需要之個體中投予有效量之活性成分，其中該活性成分係選自以下群組：如上所述之式(I)化合物、其醫藥上可接受之鹽、及前述之組合。
本發明之詳細技術內容及部分具體實施態樣，將描述於以下內容中，以供本發明所屬領域具通常知識者據以明瞭本發明之特徵。
第1圖係顯示以不同培養液培養之肺泡細胞存活率的長條圖，其中，控制組為F-12K培養液、第1組為含有H2O2(0.1毫莫耳濃度)之F-12K培養液、第2組為含有H2O2(0.1毫莫耳濃度)及化合物(1)(5微克/毫升)之F-12K培養液、第3組為含有H2O2(0.1毫莫耳濃度)及N-乙醯半胱氨酸(n-acetylcysteine，NAC)(2毫莫耳濃度)之F-12K培養液、第4組為含有H2O2(0.2毫莫耳濃度)及化合物(1)(5微克/毫升)之F-12K培養、第5 組為含有H2O2(0.2毫莫耳濃度)及NAC(2毫莫耳濃度)之F-12K培養液；第2圖係以西方墨點法(Western Blotting)分析人類正常纖維母細胞株(Normal Human lung fibroblasts，NHLF)經不同培養處理之第I型膠原蛋白及β-肌動蛋白表現的照片圖，其中，正控制組係未經TGF-β1誘導且未以化合物(1)進行培養、負控制組係經TGF-β1誘導但未以化合物(1)進行培養、低劑量組係經TGF-β1誘導且以低濃度(15微克/毫升)之化合物(1)進行培養、高劑量組係經TGF-β1誘導且以高濃度(25微克/毫升)之化合物(1)進行培養；第3圖係以西方墨點法分析經TGF-β1誘導之人類正常纖維母細胞株(NHLF)於不同培養液中培養後之第I型膠原蛋白、BMP-7蛋白、及TGF-β蛋白表現的照片圖，其中，控制組為FGM-2培養液、第I組為含有化合物(1)(15微克/毫升)之FGM-2培養液、第II組為含有化合物(1)(25微克/毫升)之FGM-2培養液、第III組為含有化合物(1)(35微克/毫升)之FGM-2培養液、第IV組為含有吡非尼酮(Pirfenidone)(100微克/毫升)之FGM-2培養液、第V組為含有吡非尼酮(250微克/毫升)之FGM-2培養液、第VI組為含有吡非尼酮(500微克/毫升)之FGM-2培養液；第4圖係以西方墨點法分析帶有pcDNA3.1空載體(控制組I及第A至C組)或pcDNA3.1-SOX2質體(控制組II及第D至F組)之人類正常纖維母細胞株(NHLF)於不同培養液中培養後之 Sox2蛋白、TGF-β蛋白、及第I型膠原蛋白表現的照片圖，其中，控制組I及控制組II係未經TGF-β1誘導且未以化合物(1)進行培養、第A組及第D組係經TGF-β1誘導但未以化合物(1)進行培養、第B組及第E組係經TGF-β1誘導且以15微克/毫升之化合物(1)進行培養、第C組及第F組係經TGF-β1誘導且以30微克/毫升之化合物(1)進行培養；第5圖係以西方墨點法分析以不同培養液培養之人類正常纖維母細胞株(NHLF)之BMP-7蛋白、TGF-β蛋白、及α-SMA蛋白表現的照片圖，其中，控制組為含有10%血清之FGM-2培養液、第i組為含有1%血清之FGM-2培養液、第ii組為含有1%血清及化合物(1)(15微克/毫升)之FGM-2培養液、第iii組為含有1%血清及化合物(1)(25微克/毫升)之FGM-2培養液、第iv組為含有1%血清及TGF-β1(5奈克/毫升)之FGM-2培養液、第v組為含有1%血清、TGF-β1(5奈克/毫升)、及化合物(1)(15微克/毫升)之FGM-2培養液、第vi組為含有1%血清、TGF-β1(5奈克/毫升)、及化合物(1)(25微克/毫升)之FGM-2培養液；第6圖係以半定量聚合酶鏈鎖反應(RT-PCR)分析以不同培養液培養之人類正常纖維母細胞株(NHLF)之α-SMA、TGF-β基因的表現的照片圖，其中，控制組為FGM-2培養液、第α組為含有化合物(1)(5微克/毫升)之FGM-2培養液、第β組為含有化合物(1)(10微克/毫升)之FGM-2培養液、第γ組為含有H2O2(0.1毫莫耳濃度)之F-12K培養液、第δ組為含有H2O2(0.1 毫莫耳濃度)及化合物(1)(5微克/毫升)之F-12K培養液、第ε組為含有H2O2(0.1毫莫耳濃度)及化合物(1)(10微克/毫升)之F-12K培養液；第7圖係以西方墨點法分析經不同培養處理之人類正常纖維母細胞株(NHLF)之BMP-7蛋白、TGF-β蛋白、及p-smad2/3蛋白表現的照片圖，其中控制組係未經TGF-β1誘導且未以化合物(1)或化合物(2)進行培養、第A組係經TGF-β1誘導但未以化合物(1)或化合物(2)進行培養、第B組係經TGF-β1誘導且以15微克/毫升之化合物(1)進行培養、第C組係經TGF-β1誘導且以30微克/毫升之化合物(1)進行培養、第D組係經TGF-β1誘導且以100微克/毫升之化合物(2)進行培養、第E組係經TGF-β1誘導且以200微克/毫升之化合物(2)進行培養；第8A至8D圖係顯示以全體呼吸測量系統(Unrestrained Whole Body Plethysmography，WBP)評估經不同處理之小鼠肺功能的結果，其中第8A圖顯示呼吸頻率(RR)及累積通氣量(AV)的長條圖、第8B圖顯示潮氣量(TV)及鬆弛時間(RT)的長條圖、第8C圖顯示最大吸氣量(PIF)及最大呼氣量(PEF)的長條圖、第8D圖顯示吸氣時間(Ti)及呼氣時間(Te)的長條圖，且第8A、8B、8C、及8D圖皆包含控制組、低劑量組、高劑量組、及Oil組的結果；第9圖係顯示注射硫酸博萊黴素(Bleomycin sulfate)以及服用化合物(1)後之小鼠肺臟的組織病理學結果的照片圖， 其中顯示控制組、低劑量組、高劑量組、及Oil組小鼠肺臟之蘇木素-伊紅染色(H&E stain)分析結果；第10圖係顯示注射硫酸博萊黴素(Bleomycin sulfate)以及服用化合物(1)後小鼠肺臟的組織病理學結果，其中顯示控制組、低劑量組、高劑量組、及Oil組小鼠之肺臟纖維化分數(「**」表示P value小於0.01，顯示不同組別間之數據具顯著差異；「***」表示P value小於0.001，顯示不同組別間之數據具顯著差異)；第11圖係以西方墨點法分析小鼠肺部組織樣本中TGF-β蛋白、smad3蛋白、及氣管擴張素C(surfactant C)之表現的照片圖，包括高劑量組、低劑量組、及Oil組的結果；以及第12圖係以半定量聚合酶鏈鎖反應(RT-PCR)分析小鼠肺部組織樣本中IL-β、IL-6等免疫相關基因之mRNA表現的照片圖，包括控制組、Oil組、低劑量組、及高劑量組的結果。
以下將描述根據本發明之部分具體實施態樣；惟，在不背離本發明精神下，本發明尚可以多種不同形式之態樣來實踐，不應將本發明保護範圍解釋為限於說明書所陳述者。此外，除非文中有另外說明，於本說明書中(尤其是在後述專利申請範圍中)所使用之「一」、「該」及類似用語應理解為包含單數及複數形式；所謂「治療」，不應被解釋為治療一個體直至完全恢復， 而應包括將一個體之疾病進展或症狀維持在一實質上靜態之程度、增加一個體之恢復速率、改善一具體病況的嚴重性、以及提高一患者之生命品質；所謂「延緩」疾病的發病，係指預防一具體病況的發作、以及維持敏感個體之良好健康狀態或建立該個體對疾病的耐受性；所謂「有效量」或「治療有效量」，係指投予至個體時，可有效地至少部分改善懷疑個體之病情的化合物數量；所謂「個體」係指哺乳動物，哺乳動物可為人類或非人動物。
本說明書中所使用之數值範圍(例如3至90)應理解為亦包含在該範圍中的所有有理數(例如3、3.1、6、6.5、7、7.9、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、及90)以及在該範圍中之任何有理數所組成的範圍(例如3.1至8、10至60.5、5.8至70.9、及15至90)，因此，本說明書中所使用之數值範圍係包含介於所列舉之最低值與最高值之間的數值的所有可能組合。另，本文所使用的「約」、「大約」或「近乎」等詞，係實質上代表與所述之數值相差在20%以內者，較佳在10%以內者，且更佳在5%以內者。
在本說明書中，當引用其他外部文件或其他資訊來源時，一般係出於為本發明之技術特徵提供背景敘述之目的。因此，除非文中有另外說明，否則對該等外部文件之引用，不應被解釋為承認該等文件或資訊來源在任何權限範圍內係先前技術或為該技術領域中通常知識。
有研究指出，肺纖維化可能與免疫反應、炎症、外來物刺激、吞嚥障礙、胃食道逆流等有關，亦有相關研究將其病 因概略地分為特發性、原發性、免疫性、藥物性、物理性等，其中包括隱源性致纖維性肺泡炎(cryptogenic fibrosing alveolitis，CFA)、尋常性間質性肺炎(usual interstitial pneumonia，UIP)、及間質性肺病(interstitial lung disease，ILD)所導致的肺纖維化。
舉例言之，當肺部發生過度免疫反應(immune overreaction)，組織中的巨噬細胞會異常活化並且釋放促轉化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)及介白素(interleukin)，因而吸引中性白血球到達肺部組織中並釋放氧自由基，造成肺部組織損傷。因應肺部組織損傷，組織中的細胞會分泌膠原蛋白、彈性蛋白、纖網蛋白等胞外基質以進行修復，惟，過度分泌會造成肺纖維化。前述可參見例如：Life Sci.2008 Jan 16；82(3-4)：210-7，該文獻之全文併於此處以供參考。
經研究證實，在肺纖維化的過程中，促轉化生長因子β(TGF-β)/果蠅抗成形素家族蛋白(drosophila mothers against decapentaplegic protein family，Smad)訊息傳導路徑的活化會促使肺部纖維母細胞進行上皮-間質轉換(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，且會刺激纖維母細胞(fibroblast)增生並轉化成肌纖維母細胞(myofibroblast)。其中，當肺部纖維母細胞進行上皮-間質轉換(EMT)，細胞與細胞之間的極性會漸漸喪失，且細胞的移行能力增加，而容易爬行及侵襲並參與組織纖維化。此外， 肌纖維母細胞是一種會表現平滑肌肌動蛋白(alpha smooth muscle actin，α-SMA)標記蛋白且具高度移動性的細胞，肺部的肌纖維母細胞活化後會分泌過多的膠原蛋白、彈性蛋白、纖網蛋白等胞外基質於肺臟間質組織中沉積，構成肺纖維化的微環境(microenvironment)並誘導細胞間質內的收縮，形成傷疤組織(scar)。
亦經證實，骨形態發生蛋白-7(bone morphogenetic protein-7，BMP-7)會抑制TGF-β/Smad訊息傳導路徑的活化。因此，若能增加BMP-7表現，將會有助於TGF-β/Smad訊息傳導路徑的抑制，達到延緩肺纖維化之發病的效果。
由上可知，肺纖維化的發生與肺部過度免疫反應及肺部纖維母細胞的上皮-間質轉換(EMT)密切相關，咸信若能調控肺部組織中的免疫反應、抑制肺部產生過度的免疫反應、抑制肺部纖維母細胞進行上皮-間質轉換(EMT)、及/或抑制肺部纖維母細胞轉化成肌纖維母細胞，即可減緩免疫反應對肺部組織所造成的損傷且抑制過多的胞外基質在肺臟間質組織中沉積，而達到延緩肺纖維化之發病及/或治療肺纖維化的效果。
本案發明人研究發現，以下式(I)化合物可有效提升肺泡細胞的抗氧化能力，從而減緩氧化壓力對肺部組織所造成的損傷，且可抑制肺部纖維母細胞(Fibroblast)轉化成肌纖維母細胞(Myofibroblast)、抑制肺部纖維母細胞進行上皮 -間質轉換(EMT)、及/或抑制胞外基質過度表現： 其中，A係C5烷基或烯基，其係視需要具一選自以下群組之取代基：-OH及=O；X係H、或OH；Y係O；以及R1係H或不存在，其條件為，當R1不存在時，Y係與A鍵結形成一五員環。
本案發明人另發現，對於經誘導肺纖維化之藥物處理的個體，根據本發明之式(I)化合物係可有效調控該個體中之肺部組織中的免疫反應、減緩肺泡組織壁變厚、減緩肺部細胞異常浸潤、及/或減緩肺功能下降。
因此，本發明係提供延緩肺纖維化之發病及/或治療肺纖維化之藥劑及方法。其中，該藥劑係包含一活性成分，該方法係包含將一有效量之活性成分投予至有需要之個體中。於根據本發明之藥劑及方法中，該活性成分係選自以下群組：式(I)化合物、其醫藥上可接受之鹽、及前述之組合， 其中，A係C5烷基或烯基，其係視需要具一選自以下群組之取代基：-OH及=O；X係H、或OH；Y係O；以及R1係H或不存在，其條件為，當R1不存在時，Y係與A鍵結形成一五員環。
於根據本發明之藥劑及方法之一較佳實施態樣 中，在式(I）中，A係、、或。
於根據本發明之藥劑及方法之另一較佳實施態 樣中，在式(I)中，A係；X係OH。
於根據本發明之式(I)化合物的具體態樣包括，但不限於：
於本發明部分具體實施態樣中，係使用化合物(1)及/或化合物(2)於延緩肺纖維化之發病及/或治療肺纖維化。
於本文中，所謂「醫藥可接受之鹽」，係包括「所述含有酸性官能基之化合物」與「有機或無機鹼」所形成之「醫藥可接受鹼加成鹽」、以及「所述含有鹼性官能基之化合物」與「有機或無機酸」所形成之「醫藥可接受酸加成鹽」。
其中，該與無機鹼所形成之「醫藥可接受鹼加成鹽」的例子包括，但不限於，鹼金屬鹽(如鈉鹽、鉀鹽)、鹼土金屬鹽 (如鈣鹽、鎂鹽)、過渡金屬鹽(如鐵鹽、鋅鹽、銅鹽、錳鹽及鋁鹽)、以及銨鹽。
該與有機鹼所產生所形成之「醫藥可接受鹼加成鹽」的例子包括，但不限於，與甲基胺、二甲基胺、三甲基胺、乙基胺、二乙基胺、三乙基胺、異丙基胺、三丙基胺、三丁基胺、乙醇胺、二乙醇胺、2-二甲基胺乙醇、2-二乙基胺乙醇、二環己基胺、離胺酸鹽、精胺酸鹽、組胺酸鹽、咖啡鹼、海巴胺(hydrabamine)、膽鹼、甜菜鹼、乙烯二胺、葡萄糖胺、甲基葡萄糖胺、可可鹼、嘌呤、哌啶、N-乙基哌啶、四甲基銨化合物、四乙基銨化合物、吡啶、N,N-二甲基苯胺、N-甲基哌啶、N-甲基嗎啉、二環己基胺、二苯甲基胺、N,N-二苯甲基苯乙基胺、1-伊芬胺(1-ephenamine)、N,N-二苯甲基乙烯二胺、聚胺樹脂及其類似物等所形成之鹽。
該與無機酸所形成之「醫藥可接受酸加成鹽」的例子包括，但不限於，與氫溴酸、鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸、過氯酸等所形成之鹽。
該與有機酸所形成之「醫藥可接受酸加成鹽」的例子包括，但不限於，與磺酸(如對甲苯磺酸、苯磺酸、甲磺酸、乙磺酸、2-羥基乙磺酸、萘磺酸)、羧酸(如乙酸、丙酸、富馬酸、馬來酸、苯甲酸、水楊酸、琥珀酸)、陰離子胺基酸(如穀胺酸、天門冬胺酸)、羥基酸(如檸檬酸、乳酸、酒石酸、乙醇酸、蘋果酸)、脂肪酸(如己酸、辛酸、癸酸、油酸、硬脂酸)、雙羥萘酸、樹脂酸等所形成之鹽。
當使用本發明之藥劑以延緩肺纖維化之發病及/或治療肺纖維化時，該藥劑可以呈任何合宜的型式，並無特殊的限制，端視所欲之用途而呈對應之合宜劑型。舉例言之，但不以此為限，該藥物可以口服或非經口服(例如皮下、靜脈內、肌肉、腹腔、鼻腔、或皮膚)之投藥方式施用至有需要之個體上。其中，口服投藥劑型可方便於病人按時自行服用。視使用形式及用途而定，可選用合宜之載劑以提供該藥劑，只要該載劑對本發明活性成分之所欲效益沒有不利的影響即可，其中該載劑包括賦形劑、稀釋劑、輔助劑、安定劑、吸收延遲劑、崩散劑、增溶劑、乳化劑、抗氧化劑、黏合劑、結合劑、增黏劑、分散劑、懸浮化劑、潤滑劑、吸濕劑等。
以適於口服投藥之劑型為例，該載劑的例子包括，但不限於，水、食鹽水、葡萄糖(dextrose)、甘油、乙醇或其類似物、纖維素、澱粉、糖膨潤土(sugar bentonite)、及前述之組合。可採用任何合宜的方法，以適於口服投藥的劑型提供該藥劑，例如固體形式之錠劑、丸劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑等、或是液體形式之口服液、糖漿劑、醑劑(spirit)、酏劑(elixir)、酊劑等，但不以此為限。
有關適於皮下、靜脈內、肌肉、或腹腔注射之針劑或點滴劑，則可於本發明所提供之藥劑中含有一或多種例如等張溶液、鹽類緩衝液(如磷酸鹽緩衝液或檸檬酸鹽緩衝液)、增溶劑、乳化劑、5%糖溶液、以及其他載劑等成分，以靜脈輸注液、乳劑 靜脈輸注液、乾粉注射劑、懸液注射劑、或乾粉懸液注射劑等劑型提供該藥劑。或者，將該藥劑製備成一注射前固體，以可溶於其他溶液或懸浮液中之劑型、或可乳化之劑型提供該注射前固體，並於投予至有需要之個體之前，將該注射前固體溶於其他溶液或懸浮液中或將其乳化，提供所欲之注射劑。此外，適於經鼻腔或經皮膚投予之外用劑型，則例如塗抹劑(例如乳液、乳霜、凝膠、分散膏、軟膏)、噴劑、貼劑、或溶液(例如洗液、懸浮液)。
至於適於皮下植入、或組織間植入之劑型，則可於本發明所提供之藥劑中另含有一或多種例如賦形劑、安定劑、緩衝劑、以及其他載劑等成分，以例如晶片(wafer)、錠劑、丸劑、膠囊等劑型提供，從而得以將該藥劑植入一個體中，以緩慢且持續的釋放所含活性成分至投藥部位周圍的組織，達到局部穩定高劑量之延緩肺纖維化之發病及/或治療肺纖維化的功效。舉例言之，但不以此為限，可將本發明所提供之藥劑與p(CPP-SA)共聚物混合，並將所得混合物溶於二氯甲烷中，再將混合物乾燥形成粉末，接著，將粉末裝填於一模具中，於輕微壓力下壓縮該乾燥粉末，來形成一供皮下植入、或組織間植入之晶片劑型。
視需要地，可於本發明所提供之藥劑中另含有合宜用量之添加劑，例如可提高該藥劑於服用時的口適感及視覺感受之調味劑、調色劑、著色劑等，以及可改善該藥劑的穩定性及儲存性之緩衝劑、保存劑、防腐劑、抗菌劑、抗真菌劑等。此外，該藥劑可視需要另含一或多種其他活性成分(例如免疫調節劑、 吡非尼酮(Pirfenidone；商品名：Esbriet®)、N-乙醯半胱氨酸(NAC；商品名：NAC 600mg/capsule))，或者與含該一或多種其他活性成分之藥物併用，以進一步加強該藥劑之功效或增加製劑配方的運用靈活性與調配度，只要該其他活性成分對本發明活性成分之所欲效益沒有不利的影響即可。
可以一日一次、一日多次、或數日一次等不同頻率施用本發明所提供之藥劑，端視投予個體之需求、年齡、體重、及健康況狀而異。舉例言之，當以口服方式施用至一個體以延緩肺纖維化之發病及/或治療肺纖維化時，以式(I)化合物計，其用量為每天約1毫克/公斤體重至約500毫克/公斤體重，較佳為每天約5毫克/公斤體重至約200毫克/公斤體重，更佳為每天約10毫克/公斤體重至約100毫克/公斤體重，其中，該單位『毫克/公斤體重』係指每公斤體重個體所須之投藥量。惟，對於急性患者而言，其用量可視實際需要而酌增，例如增加至數倍或數十倍。於本發明部分具體實施態樣中，係使用本發明所提供之藥劑於延緩肺纖維化之發病及/或治療肺纖維化，其中該藥劑之用量，以式(I)化合物計，為每天約10毫克/公斤體重或每天約50毫克/公斤體重。
根據本發明之延緩肺纖維化之發病及/或治療肺纖維化的方法中，有關該活性成分(即，式(I)化合物、其醫藥上可接受之鹽、或前述之組合)的投予途徑、投予形式、適用劑量、以及相關治療之應用，均如上述之說明。
茲以下列實施例進一步例示說明本發明。其中該等實施例僅提供作為說明，而非用以限制本發明之保護範圍。本發明保護範圍係如後附申請專利範圍所示。
實施例
[實驗材料]
實施例所用之材料、試劑、儀器來源如下：
(1)大鼠第二型肺泡細胞L2細胞株：美國菌種中心(American Type Culture Collection，ATCC)提供，ATCC® CCL-149TM。
(2)H2O2(Hydrogen peroxide 30%)：購自Scharlau公司(Barcelona，Spain)(產品編號：P201405020062)。
(3)N-乙醯半胱氨酸(n-acetylcysteine，NAC；目前臨床上用於治療肺纖維化之一藥物)：購自Sigma-Aldrich公司(產品編號：A9165)。
(4)化合物(1)：Lancaster Synthesis公司(Newgate Morecambe，UK)。
(5)化合物(2)：由台耀化學股份有限公司合成。
(6)3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，簡稱MTT)：購自ThermoFisher公司(產品編號：M6494)。
(7)二甲基亞碸(Dimethyl sulfoxide，簡稱DMSO)：購自波仕特公司(產品編號：Amresco 0231)。
(8)酵素免疫分析測讀儀(ELISA reader)：Thermo Fisher公司(Scientific Multiskan EX Microplate Reader)
(9)促轉化生長因子β1(TGF-β1)：購自PEPROTECH Inc.公司(產品編號：100-21)。
(10)人類正常纖維母細胞株(Normal Human lung fibroblasts，NHLF)：購自瑞士Lonza公司(產品編號：CC-2512)。
(11)FGM-2培養液：FGM-2 SingleQuot Kit Suppl.& Growth Factors，購自瑞士Lonza公司(產品編號：CC-4126)
(12)吡非尼酮(Pirfenidone；目前臨床上用於治療肺纖維化之一藥物)：購自Sigma-Aldrich公司(產品編號：P2116)。
(13)C57B/L6小鼠：購自國家動物中心。
(14)硫酸博萊黴素(Bleomycin sulfate；肺纖維化誘發劑)：購自Sigma-Aldrich公司(產品編號：B5507)。
(15)橄欖油(olive oil)：Olitalia extra vergine食用級橄欖油。
(16)全體呼吸測量系統(Unrestrained Whole Body Plethysmography，WBP)：購自Buxco公司。
(17)PRO-PREPTM蛋白質萃取套組(PRO-PREPTM Protein Extraction Kit)：購自iNtRON公司。
(18)RNeasy mini RNA萃取套組(RNeasy Mini Kit)：購自Qiagen公司。
(19)反轉錄套組(QuantiTect Reverse Transcription Kit)：購自Qiagen公司。
(20)細胞轉染試劑(Fugene HD transfection reagent)：購自Promega公司。
(21)SOX2基因質體(pcDNA3.1-SOX2)：由GENEWIZ公司合成(Accession No.：NM_003106.3)。
[細胞實驗]
實施例1：細胞存活測試(MTT分析)
已知氧化壓力會導致肺泡細胞死亡，對肺部組織造成的損傷，本細胞實驗係用以瞭解本發明式(I)化合物是否可減緩氧化壓力所造成的肺部組織損傷。
將大鼠第二型肺泡細胞L2細胞株(ATCC® CCL-149TM)接種於96孔盤中，每孔接種5×103個細胞(5×103cells/well)，共48孔(分成一控制組以及五實驗組，各組有8孔)，並培養至次日。移除培養液後，分別以如下條件處理各組，以進行後續實驗：
(1)控制組：以F-12K培養液(Kaighn's Modification of Ham's F-12 Medium，ATCC® 30-2004TM)進行培養，歷時24小時。
(2)第1組：以含有H2O2(0.1毫莫耳濃度)之F-12K培養液進行培養，歷時24小時。
(3)第2組：以含有H2O2(0.1毫莫耳濃度)及化合物(1)(5微克/毫升)之F-12K培養液進行培養，歷時24小時。
(4)第3組：以含有H2O2(0.1毫莫耳濃度)及N-乙醯半胱氨酸(n-acetylcysteine，NAC)(2毫莫耳濃度)之F-12K培養 液進行培養，歷時24小時。
(5)第4組：以含有H2O2(0.2毫莫耳濃度)及化合物(1)(5微克/毫升)之F-12K培養液進行培養，歷時24小時。
(6)第5組：以含有H2O2(0.2毫莫耳濃度)及NAC(2毫莫耳濃度)之F-12K培養液進行培養，歷時24小時。
於培養完畢之後，移除培養液，並分別對各組細胞進行如下處理：於各孔加入含10%之3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)之F-12K培養液，進行培養，歷時1小時。其後，將培養液移除，並加入適量之二甲基亞碸(DMSO)，然後以酵素免疫分析測讀儀(ELISA reader)偵測各組於595奈米波長之吸光值(OD595nm)，各組分別計算平均值(n=8)，再以控制組的結果為基準，計算其他各組的相對存活率，結果示於第1圖及表1。
由第1圖及表1可知，相較於控制組，第1組的存活率明顯降低。然而，相較於第1組，第2、3、4、5組的存活率皆明顯提升。前述結果顯示，H2O2會對肺部產生氧化壓力，導致肺泡細胞死亡，而本發明式(I)化合物則可有效提升肺泡細胞的抗氧化能力、提高肺泡細胞的存活率、及減緩氧化壓力對肺部組 織所造成的損傷的效果，且該效果與目前臨床上用於治療肺纖維化的藥物相當。
實施例2：式(I)化合物抑制膠原蛋白表現之效益
當肺部產生過度免疫反應，TGF-β訊息傳導路徑活化會導致肺部組織損傷，而肺部纖維母細胞會分泌膠原蛋白、彈性蛋白、纖網蛋白等胞外基質以修復組織，惟，過度修復(即，分泌過多的胞外基質)會造成肺纖維化。BMP-7則可抑制TGF-β訊息傳導路徑的活化。以下(2-1)及(2-2)之實驗係用以瞭解本發明式(I)化合物是否具有抑制肺部纖維母細胞過度分泌胞外基質(例如膠原蛋白)的能力。
(2-1)
將人類正常纖維母細胞株(Normal Human lung fibroblasts，NHLF)接種於6公分培養盤中，每盤接種20萬個細胞(2×105Cells/dish)，包括一控制組以及三實驗組(共4盤)，並培養至次日。移除培養液後，分別以如下條件處理各組，以進行後續實驗：
(1)正控制組：以含有1%血清之FGM-2培養液進行培養，歷時36小時。
(2)負控制組：以含有1%血清及TGF-β1(5奈克/毫升)之FGM-2培養液進行培養，歷時36小時。
(3)低劑量組：先以含有1%血清及TGF-β1(5奈克/毫升)之FGM-2培養液進行培養，歷時12小時，其後，於培養液中 添加化合物(1)至濃度為15微克/毫升，繼續培養24小時。
(4)高劑量組：先以含有1%血清及TGF-β1(5奈克/毫升)之FGM-2培養液進行培養，歷時12小時，其後，於培養液中添加化合物(1)至濃度為25微克/毫升，繼續培養24小時。
其後，萃取各組細胞之蛋白質，並以西方墨點法偵測各組NHLF細胞之第I型膠原蛋白的表現，且以β-肌動蛋白作為內部控制(internal control)。以正控制組的結果為基準，計算其他各組的相對表現量，結果示於第2圖及表2。
由第2圖及表2可知，相較於正控制組，經TGF-β1誘導之負控制組的膠原蛋白表現量係明顯提升。然而，相較於負控制組，低劑量組的膠原蛋白表現量則有下降的趨勢，且高劑量組下降的趨勢更為明顯。
前述結果顯示，TGF-β1會誘導肺部纖維母細胞大量表現膠原蛋白，本發明式(I)化合物則具有抑制膠原蛋白過度表現的效果，且該效果係隨著式(1)化合物濃度的增加而增強。
(2-2)
將人類正常纖維母細胞株(NHLF)接種於6公分培 養盤中，每盤接種20萬個細胞(2×105cells/dish)，包括一控制組以及六實驗組(共7盤)，並培養至次日。其後，移除培養液並分別以如下條件處理各組，以進行後續實驗：
(1)控制組：以含有1%血清及TGF-β1(5奈克/毫升)之FGM-2培養液進行培養，歷時36小時。
(2)第I組：先以含有1%血清及TGF-β1(5奈克/毫升)之FGM-2培養液進行培養，歷時12小時，其後，於培養液中添加化合物(1)至濃度為15微克/毫升，繼續培養24小時。
(3)第II組：先以含有1%血清及TGF-β1(5奈克/毫升)之FGM-2培養液進行培養，歷時12小時，其後，於培養液中添加化合物(1)至濃度為25微克/毫升，繼續培養24小時。
(4)第III組：先以含有1%血清及TGF-β1(5奈克/毫升)之FGM-2培養液進行培養，歷時培養12小時，其後，於培養液中添加化合物(1)至濃度為35微克/毫升，繼續培養24小時。
(5)第IV組：先以含有1%血清及TGF-β1(5奈克/毫升)之FGM-2培養液進行培養，歷時12小時，其後，於培養液中添加吡非尼酮(Pirfenidone)至濃度為100微克/毫升，繼續培養24小時。
(6)第V組：先以含有1%血清及TGF-β1(5奈克/毫升)之FGM-2培養液進行培養，歷時12小時，其後，於培養液中添加吡非尼酮(Pirfenidone)至濃度為250微克/毫升，繼續培養 24小時。
(7)第VI組：先以含有1%血清及TGF-β1(5奈克/毫升)之FGM-2培養液進行培養，歷時12小時，其後，於培養液中添加吡非尼酮(Pirfenidone)至濃度為500微克/毫升，繼續培養24小時。
其後，萃取各組細胞之蛋白質，並以西方墨點法偵測各組NHLF細胞之第I型膠原蛋白、BMP-7蛋白及TGF-β蛋白之表現，且以控制組的結果為基準，計算其他各組的相對表現量，結果示於第3圖及表3。
由第3圖及表3可知，相較於控制組，第I、II、III、IV、V、VI組之膠原蛋白表現量及TGF-β蛋白表現量皆明顯下降。 另一方面，相較於控制組，第I、II、III、IV、V、VI組之BMP-7蛋白表現量皆明顯上升。
上述結果顯示，本發明式(I)化合物可增加肺部纖維母細胞表現BMP-7蛋白，亦可抑制TGF-β1所誘導之膠原蛋白過度表現，且該抑制效果係隨著式(I)化合物濃度的增加而提升。此說明，本發明式(I)化合物可經由增加BMP-7表現而抑制TGF-β訊息傳導路徑，具有抑制膠原蛋白過度表現的效果，且效果優於目前臨床上用於治療肺纖維化的藥物。
(2-3)
以Fugene HD細胞轉染試劑，將pcDNA3.1空載體以及pcDNA3.1-SOX2質體(即，帶有SOX2基因之pcDNA3.1載體)分別轉染至人類正常纖維母細胞株(NHLF)，並進行篩選，以獲得帶有pcDNA3.1空載體或pcDNA3.1-SOX2質體之人類正常纖維母細胞株。
接著，將帶有pcDNA3.1空載體之人類正常纖維母細胞株接種於6公分培養盤中，每盤接種20萬個細胞(2×105cells/dish)，包括一控制組以及三實驗組(共4盤)，並培養至次日，其後，移除培養液並分別以如下條件處理各組，以進行後續實驗：
(1)控制組I：以含有1%血清之FGM-2培養液進行培養，歷時36小時。
(2)第A組：以含有1%血清及TGF-β1(5奈克/毫升)之FGM-2 培養液進行培養，歷時36小時。
(3)第B組：以含有1%血清及TGF-β1(5奈克/毫升)之FGM-2培養液進行培養，歷時12小時，其後，於培養液中添加化合物(1)至濃度為15微克/毫升，繼續培養24小時。
(4)第C組：以含有1%血清及TGF-β1(5奈克/毫升)之FGM-2培養液進行培養，歷時12小時，其後，於培養液中添加化合物(1)至濃度為30微克/毫升，繼續培養24小時。
另一方面，將帶有pcDNA3.1-SOX2質體之人類正常纖維母細胞株接種於6公分培養盤中，每盤接種20萬個細胞(2×105cells/dish)，包括一控制組以及三實驗組(共4盤)，並培養至次日，其後，移除培養液並分別以如下條件處理各組，以進行後續實驗：
(1)控制組II：以含有1%血清之FGM-2培養液進行培養，歷時36小時。
(2)第D組：以含有1%血清及TGF-β1(5奈克/毫升)之FGM-2培養液進行培養，歷時36小時。
(3)第E組：以含有1%血清及TGF-β1(5奈克/毫升)之FGM-2培養液進行培養，歷時12小時，其後，於培養液中添加化合物(1)至濃度為15微克/毫升，繼續培養24小時。
(4)第F組：以含有1%血清及TGF-β1(5奈克/毫升)之FGM-2培養液進行培養，歷時12小時，其後，於培養液中添加化 合物(1)至濃度為30微克/毫升，繼續培養24小時。
其後，萃取各組細胞之蛋白質，並以西方墨點法偵測各組NHLF細胞之Sox2蛋白、TGF-β蛋白及第I型膠原蛋白之表現，且以控制組的結果為基準，計算其他各組的相對表現量，結果示於第4圖及表4。
由第4圖可知，相較於帶有pcDNA3.1空載體之人類正常纖維母細胞株(控制組I及第A至C組)，帶有pcDNA3.1-SOX2質體之人類正常纖維母細胞株(控制組II及第D至F組)的Sox2蛋白表現量明顯較高，顯示前述轉染實驗已確實將pcDNA3.1-SOX2質體轉染至人類正常纖維母細胞株中。
另一方面，由第4圖及表4可知，相較於第A組，第C組之S0x2蛋白、TGF-β蛋白及第I型膠原蛋白表現量皆明顯下降；相較於第D組，第E、F組之TGF-β蛋白及第I型膠原蛋白表現量則未明顯下降。前述結果顯示，本發明式(I)化合物可抑制肺部纖維母細胞表現TGF-β蛋白及第I型膠原蛋白，但在過量表現Sox2蛋白的情況下，式(I)化合物則無法抑制TGF-β蛋白及第I型膠原蛋白。此說明，式(I)化合物可透過調控Sox2蛋白而抑制TGF-β及第I型膠原蛋白之表現，進而減緩肺纖維化。
實施例3：式(I)化合物抑制肺部纖維母細胞轉化成肌纖維母細胞的效益
已知TGF-β訊息傳導路徑的活化會刺激纖維母細胞增生並轉化成肌纖維母細胞，而BMP-7可抑制TGF-β訊息傳導路徑的活化。肌纖維母細胞是一種表現α-SMA標記蛋白且具高度移動性的細胞，其活化後會分泌過多的胞外基質於肺臟間質組織中沉積，而構成纖維化的微環境。因此，進行以下(3-1)及(3-2)之實驗，以瞭解本發明式(I)化合物是否具有抑制肺部纖維母細胞轉化成肌纖維母細胞的能力。
(3-1)
將人類正常纖維母細胞株(NHLF)接種於6公分培養盤中，每盤接種20萬個細胞(2×105cells/dish)，包括一控制組以及六實驗組(共7盤)，並培養至次日。移除培養液後，分別以如下條件處理各組，以進行後續實驗：
(1)控制組：以含有10%血清之FGM-2培養液進行培養，歷時36小時。
(2)第i組：以含有1%血清之FGM-2培養液進行培養，歷時36小時。
(3)第ii組：先以含有1%血清之FGM-2培養液進行培養，歷時12小時，其後，於培養液中添加化合物(1)至濃度為15微克/毫升，繼續培養24小時。
(4)第iii組：先以含有1%血清之FGM-2培養液進行培養，其後，於培養液中添加化合物(1)至濃度為25微克/毫升，繼續培養24小時。
(5)第iv組：以含有1%血清及TGF-β1(5奈克/毫升)之FGM-2培養液進行培養，歷時36小時。
(6)第v組：先以含有1%血清及TGF-β1(5奈克/毫升)之FGM-2培養液進行培養，歷時12小時，其後，於培養液中添加化合物(1)至濃度為15微克/毫升，繼續培養24小時。
(7)第vi組：先以含有1%血清及TGF-β1(5奈克/毫升)之FGM-2培養液進行培養，歷時12小時，其後，於培養液中添加化合物(1)至濃度為25微克/毫升，繼續培養24小時。
其後，萃取各組細胞之蛋白質，並以西方墨點法偵測各組NHLF細胞之BMP-7蛋白、TGF-β蛋白、及α-SMA蛋白之表現，且以β-肌動蛋白作為內部控制。以控制組的結果為基準，計算其他各組的相對表現量，結果示於第5圖及表5。
由第5圖及表5可知，相較於第iv組，第v組及第vi組之TGF-β蛋白表現量及α-SMA蛋白表現量皆較低。
前述結果顯示，本發明式(I)化合物可抑制肺部纖維母細胞之TGF-β訊息傳導路徑活化，且可抑制肌纖維母細胞之標記蛋白的表現。此說明，式(I)化合物具有抑制肺部纖維母細胞轉化成肌纖維母細胞的效果。
(3-2)
將人類正常纖維母細胞株(NHLF)接種於6孔盤中，每孔接種10萬個細胞(105cells/well)，包括一控制組以及五實驗組(共6孔)，並培養至次日。移除培養液後，分別以如下條件處理各組，以進行後續實驗：
(1)控制組：以含有1%血清之FGM-2培養液進行培養，歷時24小時。
(2)第α組：以含有1%血清及化合物(1)(5微克/毫升)之FGM-2培養液進行培養，歷時24小時。
(3)第β組：以含有1%血清及化合物(1)(10微克/毫升)之FGM-2培養液進行培養，歷時24小時。
(4)第γ組：以含有1%血清、H2O2(0.1毫莫耳濃度)之F-12K培養液進行培養，歷時24小時。
(5)第δ組：以含有1%血清、H2O2(0.1毫莫耳濃度)及化合物(1)(5微克/毫升)之F-12K培養液進行培養，歷時24小時。
(6)第ε組：以含有1%血清、H2O2(0.1毫莫耳濃度)及化合物(1)(10微克/毫升)之F-12K培養液進行培養，歷時24小時。
其後，萃取各組細胞之總RNA(Total RNA)，並以反轉錄套組(QuantiTect Reverse Transcription Kit)對該總RNA進行反轉錄作用以獲得cDNA。接著，對該cDNA進行即時定量聚合酶鏈鎖反應(Q-PCR)，以分析各組NHLF細胞之α-SMA、TGF-β等基因的mRNA表現量，並以GAPDH基因作為內部控制。以控制組的結果為基準，計算其他各組的相對表現量，結果示於第6圖及表6。
表6
由第6圖及表6可知，相較於控制組，各實驗組(即，第α、β、γ、δ、及ε組)之α-SMA及TGF-β基因的mRNA表現皆有下降的趨勢。
前述結果顯示，即使是在H2O2產生氧化壓力的情況下，本發明式(I)化合物仍可抑制肺部纖維母細胞表現α-SMA及TGF-β基因表現。此說明，式(I)化合物可抑制肺部纖維母細胞之TGF-β訊息傳導路徑活化，且可抑制肌纖維母細胞標記基因的表現。
上述實驗(3-1)及(3-2)的結果顯示，本發明式(I)化合物可抑制肺部纖維母細胞轉化成肌纖維母細胞，故具有防止過多細胞外基質(例如膠原蛋白、彈性蛋白、纖網蛋白等)在肺臟間質組織中沉積的效果。
實施例4：式(I)化合物抑制肺部纖維母細胞進行 上皮-間質轉換(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的效益
已知TGF-β/Smad訊息傳導路徑的活化會促進上皮-間質轉換，BMP-7則可抑制TGF-β/Smad訊息傳導路徑的活化。當細胞進行上皮-間質轉換，細胞與細胞之間的極性會漸漸喪失，且細胞的移行能力增加，而容易爬行及侵襲，參與組織中纖維化。因此，進行以下實驗，以瞭解本發明式(I)化合物是否具有抑制肺部纖維母細胞進行上皮-間質轉換的能力。
將人類正常纖維母細胞株(NHLF)接種於6公分培養盤中，每盤接種20萬個細胞(2×105cells/dish)，包括一控制組以及五實驗組(共6盤)，並培養至次日。移除培養液後，分別以如下條件處理各組，以進行後續實驗：
(1)控制組：以含有1%血清之FGM-2培養液進行培養，歷時36小時。
(2)第A組：以含有1%血清及TGF-β1(5奈克/毫升)之FGM-2培養液進行培養，歷時36小時。
(3)第B組：先以含有1%血清及TGF-β1(5奈克/毫升)之FGM-2培養液進行培養，歷時12小時，其後，於培養液中添加化合物(1)至濃度為15微克/毫升，繼續培養24小時。
(4)第C組：先以含有1%血清及TGF-β1(5奈克/毫升)之FGM-2培養液進行培養，歷時12小時，其後，於培養液中添加化合物(1)至濃度為30微克/毫升，繼續培養24小時。
(5)第D組：先以含有1%血清及TGF-β1(5奈克/毫升)之FGM-2培養液進行培養，歷時12小時，其後，於培養液中添加化合物(2)至濃度為100微克/毫升，繼續培養24小時。
(6)第E組：先以含有1%血清及TGF-β1(5奈克/毫升)之FGM-2培養液進行培養，歷時12小時，其後，於培養液中添加化合物(2)至濃度為200微克/毫升，繼續培養24小時。
其後，萃取各組細胞之蛋白質，並以西方墨點法偵測各組NHLF細胞之BMP-7蛋白、TGF-β蛋白、及p-smad2/3蛋白之表現，且以控制組的結果為基準，計算其他各組的相對表現量，結果示於第7圖及表7。
由第7圖及表7可知，相較於第A組，第B組及第C組之BMP-7蛋白表現量明顯較高，且TGF-β蛋白及p-smad2/3蛋白的表 現量則明顯較低。另外，相較於第A組，第D組及第E組之TGF-β蛋白及p-smad2/3蛋白的表現量亦明顯較低。
前述結果顯示，本發明式(I)化合物可抑制肺部纖維母細胞表現TGF-β蛋白，並抑制smad2及smad3蛋白的磷酸化。此說明，式(I)化合物可抑制肺部纖維母細胞之TGF-β/Smad訊息傳導路徑活化，故具有用以抑制肺部纖維母細胞進行上皮-間質轉換(EMT)的效果。
[動物實驗]
實施例5：動物模型之建立
將24隻C57B/L6小鼠(年齡：四週)隨機分成四組(各組6隻)，並分別以如下條件處理，以進行後續實驗：
(1)控制組(非肺纖維化之小鼠；即，正常小鼠)：以氣管內注射方式將50微升之PBS投予至小鼠。接著，飼養30天。
(2)Oil組：以氣管內注射方式將0.6活性單位/50微升(0.6U/50μl)之硫酸博萊黴素(Bleomycin sulfate，溶劑為PBS)投予至小鼠。接著，每天以口服方式將100微升之橄欖油投予至小鼠，連續30天。
(3)低劑量組：以氣管內注射方式將0.6活性單位/50微升(0.6U/50μl)之硫酸博萊黴素(Bleomycin sulfate，溶劑為PBS)投予至小鼠。接著，每天以口服方式將化合物(1)(10毫克/公斤體重，以橄欖油配製成100微升)投予至小鼠，連續30天。
(4)高劑量組：以氣管內注射方式將0.6活性單位/50微升(0.6U/50μl)之硫酸博萊黴素(Bleomycin sulfate，溶劑為PBS)投予至小鼠。接著，每天以口服方式將化合物(1)(50毫克/公斤體重，以橄欖油配製成100微升)投予至小鼠，連續30天。
實施例6：肺功能測定
大部分肺纖維化的患者於確診時，肺功能已下降，且有呼吸困難的症狀，晚期患者更因身體長期缺氧，導致心臟衰弱、呼吸功能衰竭等。因此，進行以下實驗，以瞭解本發明式(I)化合物是否可維持肺功能、減緩肺功能下降。
本實驗以全體呼吸測量系統(Unrestrained Whole Body Plethysmography，WBP)評估實施例5各組小鼠的肺功能，透過偵測特定空間(chamber)內外氣體變化，來推算出小鼠吸入與呼出的氣體量，從而進一步得知各呼吸參數的數值，包括最大吸氣量(PIF；即，一期間內最大吸入氣體之體積)、最大呼氣量(PEF；即，一期間內最大呼出氣體之體積)、吸氣時間(Ti；即，一期間內吸氣時間之平均值)、呼氣時間(Te；即，一期間內呼氣時間之平均值)、呼吸頻率(RR；即，每分鐘之呼吸次數)、累積通氣量(AV；即，每分鐘進出氣體之平均值)、潮氣量(TV；即，單次呼出氣體體積之平均值)、鬆弛時間(RT；即，氣艙壓力最大值升至40%的平均時間)等。結果示於第8圖。
由第8圖可知，相較於「Oil組」小鼠，「低劑量組」 及「高劑量組」小鼠之呼氣時間及鬆馳時間皆顯著下降(p<0.05)，累積通氣量也有顯著的提升(p<0.01)，其他呼吸參數亦與控制組(正常小鼠)較為接近。
前述結果顯示，本發明式(I)化合物可有效維持小鼠的肺功能、減緩硫酸博萊黴素(Bleomycin sulfate)引起的肺功能下降。
實施例7：組織切片觀察
於肺纖維化過程中，纖維化物質(例如膠原蛋白、彈性蛋白、纖網蛋白等胞外基質)會逐漸佔據肺臟間質組織，導致肺泡組織壁變厚。因此，進行以下實驗，以瞭解本發明式(I)化合物是否可有效延緩或改善前述肺纖維化的現象。
於完成實施例6之肺功能測定後，將小鼠犧牲，並取出小鼠之肺部組織樣本，分成二大組(各組樣本皆包含控制組、Oil組、低劑量組、高劑量組)。將其中一組樣本保存於-20℃，以進行後續之實驗分析；對另一組樣本進行蘇木素-伊紅染色(hematoxylin-sosin stain，H&E stain)分析，結果示於第9圖。
此外，為進一步觀察小鼠肺部之纖維化情形，係使用Ashcroft等人之文獻所記載的肺部纖維化評分方式對上述第9圖之結果給予0至8分的評分，分數越高表示肺部纖維化的情形越嚴重。結果示於第10圖。前述評分方式可參見例如Simple method of estimating severity of pulmonary fibrosis on a numerical scale.J Clin Pathol.1988 Apr；41(4)：467-70.，該文獻之全文併於此處以供 參考。
由第9圖可知，相較於「控制組」小鼠，「Oil組」小鼠肺泡組織壁明顯變厚且有明顯的細胞異常浸潤的現象，顯示肺部免疫細胞及纖維母細胞的異常增生。然而，相較於「Oil組」小鼠，「低劑量組」及「高劑量組」小鼠之肺部組織壁明顯較薄，細胞異常浸潤的現象亦明顯較少。前述結果說明，硫酸博萊黴素(Bleomycin sulfate)會造成肺部免疫細胞及纖維母細胞異常增生，進而導致肺部纖維化，而本發明式(I)化合物的使用則可有效延緩或改善前述肺部纖維化的狀況。
由第10圖可知，相較於「控制組」小鼠，「Oil組」小鼠之肺部纖維化分數明顯升高，然而，相較於「Oil組」小鼠，「低劑量組」及「高劑量組」小鼠之肺部纖維化分數皆明顯降低。
前述結果再次說明，本發明式(I)化合物的使用係可有效延緩或改善前述肺部纖維化的狀況。
實施例8：肺部組織之蛋白質及總RNA分析
如上述，肺部之TGF-β/Smad訊息傳導路徑的活化及過度免疫反應與肺纖維化之發病密切相關。咸信若能抑制肺部之TGF-β/Smad訊息傳導路徑的活化、調控肺部組織中的免疫反應，即可有效抑制肺部產生過度免疫反應，而達到延緩肺纖維化之發病的效果。此外，增加氣管擴張素C(surfactant C)的表現可抑制TGF-β/Smad訊息傳導路徑的活化。本實施例係用以瞭解本發明式(I)化合物是否可有效調控肺部組織中的免疫反應、延緩 肺纖維化之發病。
將實施例7所提供之保存於-20℃小鼠肺部組織樣本取出，於液態氮中磨碎。接著，取部分磨碎的樣本，以PRO-PREPTM蛋白質萃取套組(PRO-PREPTM Protein Extraction Kit)萃取各組樣本之蛋白質後，以西方墨點法偵測各組樣本中之TGF-β蛋白、smad3蛋白、及氣管擴張素C之表現，並以肌動蛋白作為內部控制(internal control)。結果示於第11圖。
再取部分磨碎的樣本，以RNeasy mini RNA萃取套組(RNeasy Mini Kit)萃取各組樣本之總RNA(Total RNA)，並以反轉錄套組(QuantiTect Reverse Transcription Kit)對該總RNA進行反轉錄作用以獲得cDNA。接著，對該cDNA進行半定量聚合酶鏈鎖反應(RT-PCR)，以分析各組樣本之IL-β、IL-6等免疫相關基因的mRNA表現量，並以β-肌動蛋白(β-actin)基因作為內部控制。以控制組的結果為基準，計算其他各組的相對表現量，結果示於第12圖及表8。
由第11圖可知，相較於Oil組，低劑量組以及高劑量組之TGF-β蛋白及smad3蛋白的表現量皆明顯較低，而氣管擴張素C的表現量則明顯較高。前述結果再次顯示，本發明式(I)化合物可抑制肺部之TGF-β/Smad訊息傳導路徑的活化。
由第12圖及表8可知，相較於控制組，Oil組之IL-β及IL-6基因的mRNA表現皆有上升的趨勢，然而，相較於Oil組，低劑量組以及高劑量組之IL-β及IL-6等免疫相關基因的mRNA表現則明顯下降。前述結果說明，本發明式(I)化合物具有調控肺部組織中的免疫反應、抑制肺部產生過度免疫反應的效果，故可用以延緩肺纖維化之發病。
由以上細胞實驗以及動物實驗的結果可知，本發明式(I)化合物具有提升肺泡細胞的抗氧化能力、提高肺泡細胞的存活率、減緩氧化壓力對肺部組織所造成的損傷、抑制肺部纖維母細胞(Fibroblast)轉化成肌纖維母細胞(Myofibroblast)、抑制肺部纖維母細胞進行上皮-間質轉換(EMT)、及抑制胞外基質過度表現的效果，且可有效調控肺部組織中的免疫反應、減緩肺泡組織壁變厚、減緩肺部細胞異常浸潤、及減緩肺功能下降，故可用以延緩肺纖維化之發病及/或治療肺纖維化。

Claims (6)

  1. 一種使用一活性成分於製造一藥劑的用途，其中該藥劑係用於治療肺纖維化，且該活性成分係選自以下群組：式(I)化合物、其醫藥上可接受之鹽、及前述之組合， 其中，該式(I)化合物係選自以下群組之至少一者：
  2. 如請求項1之用途，其中該藥劑係用於以下之至少一者：提高肺泡細胞的存活率、及抑制肺部纖維母細胞(Fibroblast)轉化成肌纖維母細胞(Myofibroblast)。
  3. 如請求項1之用途，其中該藥劑係用於以下之至少一者：減緩肺部組織壁變厚、減緩肺部細胞異常浸潤、及減緩肺功能下降。
  4. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該藥劑之用量，以式(I)化合物計，為每天約1毫克/公斤體重至約500毫克/公斤體重。
  5. 如請求項4之用途，其中該藥劑之用量，以式(I)化合物計，為每天約5毫克/公斤體重至約200毫克/公斤體重。
  6. 如請求項4之用途，其中該藥劑之用量，以式(I)化合物計，為每天約10毫克/公斤體重至約100毫克/公斤體重。
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