TW202408522A - 一種稠環嘧啶類化合物的用途 - Google Patents
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Abstract
本發明揭示了一種稠環嘧啶類化合物或其可藥用鹽的用途。所述的稠環嘧啶類化合物的結構如式
I所示，其可用於製備治療或預防纖維化疾病或2019冠狀病毒病(COVID-19)的藥物。
Description
本申請要求申請日為2022/8/25的中國專利申請2022110276934和申請日為2023/8/16的中國專利申請2023110376246的優先權。本申請引用上述中國專利申請的全文。
本發明涉及一種稠環嘧啶類化合物在製備藥物中的用途。
纖維化是指由於發炎導致器官實質細胞發生壞死，組織內細胞外基質異常增多和過度沉積的病理過程。輕者成為纖維化，重者引起組織結構破壞而發生器官硬化。纖維化可發生於多種器官和組織，但是在經常受到化學和生物損傷的包括肺、皮膚、消化道、腎和肝中尤其普遍。
肺纖維化是以成纖維細胞增殖及大量細胞外基質聚集並伴發炎損傷、組織結構破壞為特徵的一大類肺疾病的終末期改變，也就是正常的肺泡組織被損壞後經過異常修復導致結構異常(疤痕形成)。絕大部分肺纖維化病人病因不明(特發性)，這組疾病稱為特發性間質性肺炎(IIP)，是間質性肺病中一大類。而特發性間質性肺炎(IIP)中最常見的以肺纖維化病變為主要表現形式的疾病類型為特發性肺纖維化(IPF)，是一種能導致肺功能進行性喪失的嚴重的間質性肺疾病。肺纖維化嚴重影響人體呼吸功能，表現為乾咳、進行性呼吸困難，且隨著病情和肺部損傷的加重，患者呼吸功能不斷惡化。特發性肺纖維化發病率和死亡率逐年增加，診斷後的平均生存期僅2.8年，死亡率高於大多數腫瘤，被稱為一種“類腫瘤疾病”。目前獲批的有效治療IPF的藥物僅有吡非尼酮和尼達尼布，雖然這些藥物可以延緩肺功能下降速度，但是這些藥物由於副作用和適應症都選擇的比較窄，而且價格比較昂貴，在使用上並不能完全推廣。因此急需尋找到新的有效藥物，用於治療纖維化相關疾病，例如肺纖維化，尤其是特發性肺纖維化(IPF)。
隨著2019冠狀病毒病(COVID-19)疫情結束後，很多患者正在遭受後遺症慢性疾病(肺纖維化疾病)的折磨，有研究證明，嚴重COVID-19導致的肺纖維化疾病與IPF有著共同的基礎宿主免疫反應和肺泡細胞病變特徵，他們共同的特徵是間質性肺病，並且在肺部和血液中顯示出相似的基因表達模式(Saptarshi Sinha等人，eBioMedicine 2022;82:104185)。COVID-19感染是特發性肺纖維化急性加重的原因，特發性肺纖維化與COVID-19感染後的肺纖維化在細胞內外的生理病理學中促纖維化過程、遺傳特徵以及對纖維化治療的效果非常相似(Peter M George, Lancet Respir Med. 2020; 8 (8): 807–815； Patrucco, F.等Microorganisms 2023, 11, 895)。大規模全基因組關聯研究(GWAS)已經確定了20個與IPF風險相關的全基因組顯著信號，同時研究了與嚴重COVID-19相關的全基因組顯著信號，發現感染肺纖維化與感染COVID-19的風險因素的基因變化是相似的(Allen RJ, Guillen-Guio B, Croot E, et al. Eur Respir J 2022; 60: 2103132)。WO2017012559A1揭示了一種多標的酪胺酸激酶抑制劑，其中包括如下式所示的化合物，其化學名為N-[7-(4-氟-2-甲氧基苯基)-6-甲基噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基]-1-(呱啶-4-基)-1H-吡唑-4-胺，並揭示了其具有治療各類腫瘤的潛力。
WO2019228171A1揭示了如下結構化合物的晶型及治療腫瘤的用途。
然而這些文獻均沒有揭示該化合物具有治療纖維化相關的疾病，例如肺纖維化，尤其是特發性肺纖維化的相關作用。
本發明提供了一種如式
I所示的化合物或其可藥用鹽在製備治療或預防纖維化疾病的藥物中的用途，
。
本發明所述可藥用鹽選自但不限於富馬酸鹽、己二酸鹽、磷酸鹽、酒石酸鹽、馬來酸鹽、鹽酸鹽、檸檬酸鹽、硫酸鹽、甲磺酸鹽、苯磺酸鹽以及對甲苯磺酸鹽。
在一些實施方案中，所述的如式
I所示的化合物的可藥用鹽為如下式
I-a所示的化合物，為N-[7-(4-氟-2-甲氧基苯基)-6-甲基噻吩并[3,2-d]嘧啶-2-基]-1-(呱啶-4-基)-1H-吡唑-4-胺富馬酸鹽，
。
在一些實施方案中，所述的纖維化疾病可為肺纖維化、肝硬化、硬皮病或腎纖維化。
在一些實施方案中，所述的纖維化疾病可為特發性肺纖維化(IPF)。
在一些實施方案中，所述的纖維化疾病可為特發性間質性肺炎(IIP)引起的肺纖維化疾病。
在一些實施方案中，所述的纖維化疾病可為由2019冠狀病毒病(COVID-19)導致的肺纖維化疾病。
在一些實施方案中，所述的纖維化疾病具有以下一個或多個特徵：
(1)細胞激素TGF-β位準異常；
(2)細胞激素IL-1β位準異常；
(3)細胞激素TNF-α位準異常；
(4)細胞激素IFN-γ位準異常；
(5)羥脯胺酸位準異常；或
(6)肺臟器係數異常。
在一些實施方案中，所述的如式I所示的化合物或其可藥用鹽在人類受試者中以每天10-200mg的總劑量施用，給藥頻率可以是一日一次、一日兩次、一日三次，優選一日兩次。
在一些實施方案中，所述的如式I所示的化合物或其可藥用鹽在人類受試者中以每天20-160mg的總劑量施用，例如20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg、140mg、145mg、150mg、155mg或160mg，給藥頻率可以是一日一次、一日兩次、一日三次，優選一日兩次。
在一些實施方案中，所述的藥物中，所述的如式I所示的化合物或其可藥用鹽的劑量為10-200mg，例如20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg、140mg、145mg、150mg、155mg或160mg；
本發明所述的如式I所示的化合物或其可藥用鹽的給藥方式可為口服、胃腸外給藥、經皮給藥，所述胃腸外給藥包括但不限於靜脈注射、皮下注射、肌肉注射；優選口服。
在一些實施方案中，所述的如式I所示的化合物或其可藥用鹽在人類受試者中以口服的方式給藥，給藥頻率可以是一日一次、一日兩次、一日三次，優選一日兩次，所述的如式I所示的化合物或其可藥用鹽以每天20-160mg的總劑量施用。
本發明還提供了一種藥物組成物在製備治療或預防纖維化疾病的藥物中的用途，所述的藥物組成物含如式I所示的化合物或其可藥用鹽和至少一種藥學上可接受的載劑，所述的如式I所示的化合物或其可藥用鹽為治療有效量的。
所述的藥物組成物包括(治療有效量的)如式I-a所示的化合物和藥學上可接受的載劑。
所述的藥物組成物可以為膠囊、片劑、顆粒劑、注射劑、吸入劑等。
所述藥物組成物的給藥方式如上所述。
所述藥物組成物的給藥頻率如上所述。
在一些實施方案中，所述藥物組成物在人類受試者中以口服的方式給藥，給藥頻率可以是一日一次、一日兩次、一日三次，優選一日兩次，所述的如式I所示的化合物或其可藥用鹽以每天20-160mg的總劑量施用。
本發明還提供了一種用於治療或預防纖維化疾病的方法，包括向需要治療的對象，施用(治療有效量的)如式I所示的化合物或其可藥用鹽或藥物組成物。
所述的纖維化疾病的定義如上所述。
所述的如式I所示的化合物或其可藥用鹽或藥物組成物如上任一方案所述。
在一些實施方案中，所述的如式I所示的化合物或其可藥用鹽在人類受試者中以每天10-200mg的總劑量施用，給藥頻率可以是一日一次、一日兩次、一日三次，優選一日兩次。
在一些實施方案中，所述的如式I所示的化合物或其可藥用鹽在人類受試者中以每天20-160mg的總劑量施用，例如20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg、140mg、145mg、150mg、155mg或160mg，給藥頻率可以是一日一次、一日兩次、一日三次，優選一日兩次。
在一些實施方案中，所述的方法中，所述的如式I所示的化合物或其可藥用鹽的劑量為10-200mg，例如20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg、140mg、145mg、150mg、155mg或160mg；
本發明所述的如式I所示的化合物或其可藥用鹽或藥物組成物的給藥方式可為口服、胃腸外給藥、經皮給藥，所述胃腸外給藥包括但不限於靜脈注射、皮下注射、肌肉注射；優選口服。
在一些實施方案中，所述的如式I所示的化合物或其可藥用鹽或藥物組成物在人類受試者中以口服的方式給藥，給藥頻率可以是一日一次、一日兩次、一日三次，優選一日兩次，所述的如式I所示的化合物或其可藥用鹽以每天20-160mg的總劑量施用。
本發明還提供了一種如式I所示的化合物或其可藥用鹽在製備治療或預防2019冠狀病毒病(COVID-19)的藥物中的用途。
所述的如式I所示的化合物或其可藥用鹽如上任一方案所述。
在一些實施方案中，所述的2019冠狀病毒病(COVID-19)可為由2019冠狀病毒病(COVID-19)導致的肺纖維化疾病。
在一些實施方案中，所述的COVID-19具有以下一個或多個特徵：
(1)細胞激素TGF-β位準異常；
(2)細胞激素IL-1β位準異常；
(3)細胞激素TNF-α位準異常；
(4)細胞激素IFN-γ位準異常；
(5)羥脯胺酸位準異常；或
(6)肺臟器係數異常。
在一些實施方案中，所述的如式I所示的化合物或其可藥用鹽在人類受試者中以每天10-200mg的總劑量施用，給藥頻率可以是一日一次、一日兩次、一日三次，優選一日兩次。
在一些實施方案中，所述的如式I所示的化合物或其可藥用鹽在人類受試者中以每天20-160mg的總劑量施用，例如20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg、140mg、145mg、150mg、155mg或160mg，給藥頻率可以是一日一次、一日兩次、一日三次，優選一日兩次。
在一些實施方案中，所述的藥物中，所述的如式I所示的化合物或其可藥用鹽的劑量為10-200mg，例如20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg、140mg、145mg、150mg、155mg或160mg；
本發明所述的如式I所示的化合物或其可藥用鹽的給藥方式可為口服、胃腸外給藥、經皮給藥，所述胃腸外給藥包括但不限於靜脈注射、皮下注射、肌肉注射；優選口服。
在一些實施方案中，所述的如式I所示的化合物或其可藥用鹽在人類受試者中以口服的方式給藥，給藥頻率可以是一日一次、一日兩次、一日三次，優選一日兩次，所述的如式I所示的化合物或其可藥用鹽以每天20-160mg的總劑量施用。
本發明還提供了一種藥物組成物在製備治療或預防2019冠狀病毒病(COVID-19)的藥物中的用途，所述的藥物組成物含如式I所示的化合物或其可藥用鹽和至少一種藥學上可接受的載劑，所述的如式I所示的化合物或其可藥用鹽為治療有效量的。
所述的藥物組成物包括(治療有效量的)如式I-a所示的化合物和藥學上可接受的載劑。
所述的藥物組成物可以為膠囊、片劑、顆粒劑、注射劑、吸入劑等。
所述的藥物組成物的給藥方式如上所述。
所述的藥物組成物的給藥頻率如上所述。
在一些實施方案中，所述藥物組成物在人類受試者中以口服的方式給藥，給藥頻率可以是一日一次、一日兩次、一日三次，優選一日兩次，所述的如式I所示的化合物或其可藥用鹽以每天20-160mg的總劑量施用。
在一些實施方案中，所述的2019冠狀病毒病(COVID-19)可為由2019冠狀病毒病(COVID-19)導致的肺纖維化疾病。
本發明還提供了一種用於治療或預防2019冠狀病毒病(COVID-19)的方法，包括向需要治療的對象，施用(治療有效量的)如式I所示的化合物或其可藥用鹽或藥物組成物。
所述的如式I所示的化合物或其可藥用鹽或藥物組成物如上任一方案所述。
在一些實施方案中，所述的2019冠狀病毒病(COVID-19)可為由2019冠狀病毒病(COVID-19)導致的肺纖維化疾病。
在一些實施方案中，所述的如式I所示的化合物或其可藥用鹽在人類受試者中以每天10-200mg的總劑量施用，給藥頻率可以是一日一次、一日兩次、一日三次，優選一日兩次。
在一些實施方案中，所述的如式I所示的化合物或其可藥用鹽在人類受試者中以每天20-160mg的總劑量施用，例如20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg、140mg、145mg、150mg、155mg或160mg，給藥頻率可以是一日一次、一日兩次、一日三次，優選一日兩次。
在一些實施方案中，所述的方法中，所述的如式I所示的化合物或其可藥用鹽的劑量為10-200mg，例如20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg、140mg、145mg、150mg、155mg或160mg；
本發明所述的如式I所示的化合物或其可藥用鹽或藥物組成物的給藥方式可為口服、胃腸外給藥、經皮給藥，所述胃腸外給藥包括但不限於靜脈注射、皮下注射、肌肉注射；優選口服。
在一些實施方案中，所述的如式I所示的化合物或其可藥用鹽或藥物組成物在人類受試者中以口服的方式給藥，給藥頻率可以是一日一次、一日兩次、一日三次，優選一日兩次，所述的如式I所示的化合物或其可藥用鹽以每天20-160mg的總劑量施用。
本發明還提供了一種用於治療2019冠狀病毒病(COVID-19)的物質X，所述物質X為如式I所示的化合物或其可藥用鹽，或所述的藥物組成物。
在一些實施方案中，所述的2019冠狀病毒病(COVID-19)可為由2019冠狀病毒病(COVID-19)導致的肺纖維化疾病。
在一些實施方案中，所述的2019冠狀病毒病(COVID-19)具有以下一個或多個特徵：
(1)細胞激素TGF-β位準異常；
(2)細胞激素IL-1β位準異常；
(3)細胞激素TNF-α位準異常；
(4)細胞激素IFN-γ位準異常；
(5)羥脯胺酸位準異常；或
(6)肺臟器係數異常。
所述的如式I所示的化合物或其可藥用鹽或藥物組成物如上任一方案所述。
定義和說明
除非另有說明，本文所用的下列術語和短語旨在具有下列含義。一個特定的術語或短語在沒有特別定義的情況下不應該被認為是不確定的或不清楚的，而應該按照普通的含義去理解。當本文中出現商品名時，意在指代其對應的商品或其活性成分。
本發明中，所述的可藥用鹽包括但不限於：富馬酸鹽、己二酸鹽、磷酸鹽、酒石酸鹽、馬來酸鹽、鹽酸鹽、檸檬酸鹽、硫酸鹽、甲磺酸鹽、苯磺酸鹽以及對甲苯磺酸鹽。
本發明中，所述的治療或預防纖維化疾病的藥物可為本領域中常規劑型，如膠囊、片劑、顆粒劑、注射劑等。
術語“治療”指治療性療法。涉及具體病症時，治療指：(1)緩解疾病或者病症的一種或多種生物學表現，(2)干擾(a)導致或引起病症的生物級聯中的一個或多個點或(b)病症的一種或多種生物學表現，(3)改善與病症相關的一種或多種症狀、影響或副作用，或者與病症或其治療相關的一種或多種症狀、影響或副作用，或(4)減緩病症或者病症的一種或多種生物學表現發展。
術語“預防”是指獲得或發生疾病或障礙的風險降低。
術語“治療有效量”是指在給予受試者時足以有效治療本文所述的疾病或病症的化合物的量。“治療有效量”將根據化合物、病症及其嚴重度、以及欲治療患者的年齡而變化，但可由本領域技術人員根據需要進行調整。
在不違背本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實例。
本發明所用試劑和原料均市售可得。
本發明的積極進步效果在於：化合物Ⅰ或其可藥用鹽對肺纖維化疾病具有良好的預防或治療作用。
具體實施方式
下面通過實施例的方式進一步說明本發明，但並不因此將本發明限制在所述的實施例範圍之中。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照商品說明書選擇。
實施例 1
化合物MAX-40279-01對博來黴素誘導的小鼠肺纖維化的作用
1 、材料1.1 動物：
種屬：C57小鼠；等級：SPF；體重：24g；來源：斯貝福(北京)生物技術有限公司；合格證號：110324210107154553；許可證號：SCXK(京)2019-0010。
1.2 儀器：
名稱：TGF-β Elisa Kit，來源：南京建成生物工程研究所，規格：96T，批號：20220115；名稱：TNF-α Elisa Kit，來源：南京建成生物工程研究所，規格：96T，批號：20220115；名稱：IL1-β Elisa Kit，來源：南京建成生物工程研究所，規格：96T，批號：20220115；名稱：IFN-γ Elisa Kit，來源：南京建成生物工程研究所，規格：96T，批號：20220115；名稱：羥脯胺酸套組X2，來源：南京建成生物工程研究所，規格：50T/48樣，批號：20220114；名稱：ELISA讀取儀，來源：Themo Scientific，型號：Varioskan Flash。
1.3 試劑
(1)化合物MAX-40279-01：根據WO2019/228171A1揭示的方法合成。
(2)名稱：Bleomycin (hydrochloride)(鹽酸博來黴素，BLM)，來源：MedChem Express，形狀：白色粉末，規格：50mg，批號：111561。
(3)名稱：DEX(醋酸地塞米松片)，來源：浙江仙琚製藥股份有限公司，形狀：白色片劑，規格：0.75mg，批號：200906
(4)名稱：Pirfenidone(吡非尼酮)，來源：MedChem Express，形狀：白色粉末，規格：3g，批號：HY-B0673/cs-2905
(5)名稱：Nintedanib(尼達尼布)，來源：MedChem Express，形狀：黃色粉末，規格：500mg，批號：HY-50904/cs-0104
2 、實驗方法2.1 分組給藥
C57BL/6雄性小鼠適應性飼養後繼續飼養至體重達24g左右，麻醉後固定於手術臺上，酒精棉消毒頸部後，逐層分離肌肉，暴露氣管，經氣管軟骨環間隙向心端進針，以博來黴素(BLM) 3.5mg/kg(20ul/10g體重)的劑量注入後，迅速將動物直立，隨即沿身體長軸旋轉1分鐘使溶液均勻分佈於肺內，縫合切口，消毒後放回籠中。假手術組暴露氣管，以生理鹽水代替博來黴素溶液做同樣操作。待動物甦醒後空白組和模型組分開飼養，一周後博來黴素小鼠按體重平均隨機分組，分為模型組、1.2mg/kg DEX組、50mg/kg Nintedanib組、300mg/kg Pirfenidone組、20mg/kg MAX-40279-01組、15mg/kg MAX-40279-01組、10mg/kg MAX-40279-01組、5mg/kg MAX-40279-01組，每組入組10隻，和空白對照組一起於模型建立後7天給予治療，共給藥21天，模型組及空白對照組給予相應溶劑。分組情況如下表1所示：
表1 動物分組
2.2 藥效學評價指標
(1)體重：
| 組別 | 模型建立 | 治療(經口灌胃每天一次) | N |
| Vehicle組(空白對照) | 生理鹽水 | 生理鹽水 | 10 |
| Model(模型)組 | BLM | 生理鹽水 | 10 |
| 1.2mg/kg DEX組 | BLM | DEX(地塞米松) | 10 |
| 50mg/kg Nintedanib組 | BLM | Nintedanib | 10 |
| 300mg/kg Pirfenidone組 | BLM | Pirfenidone | 10 |
| 20mg/kg MAX-40279-01 | BLM | 20mg/kg MAX-40279-01 | 10 |
| 15mg/kg MAX-40279-01 | BLM | 15mg/kg MAX-40279-01 | 10 |
| 10mg/kg MAX-40279-01 | BLM | 10mg/kg MAX-40279-01 | 10 |
| 5mg/kg MAX-40279-01 | BLM | 5mg/kg MAX-40279-01 | 10 |
每天觀察動物一般情況，體重7天記錄一次。
(2)肺重、肺組織病理及評分：
末次給藥一小時後麻醉處死動物，頸部切開，逐層分離肌肉，暴露氣管，解剖取肺，秤量肺重用於計算肺組織臟器係數(肺組織臟器係數=肺組織重量/體重)；取1ml生理鹽水對肺部進行反復灌洗，收集肺部灌洗液，用以檢測發炎細胞及發炎因子等。另一側肺臟由支氣管注入10%甲醛溶液，直至胸膜平展後結紮支氣管，肺組織固定後自肺尖致肺底縱行取材待做病理檢查(HE染色、masson染色和病理評分)。Ashcroft score評分，評分標準如下表2所示：
表2 Ashcroft score評分標準
Ashcroft score評分
(3)檢測羥脯胺酸及發炎因子的含量：
| 分級 | 參數 |
| 0 | 肺泡間隔：在一些肺泡壁最脆弱的小纖維處沒有纖維化負擔 肺結構：正常肺 |
| 1 | 肺泡間隔：孤立的輕度纖維化改變(間隔厚度小於正常值的3倍) 肺結構：肺泡部分增大和稀薄，但無纖維化腫塊 |
| 2 | 肺泡間隔：明顯的纖維化改變(間隔厚度大於正常值的3倍)，形成結節狀結構，但彼此不相連 肺結構：肺泡部分增大和稀疏，但無纖維化腫塊 |
| 3 | 肺泡間隔：在整個顯微鏡視野中，相鄰的纖維化壁(間隔厚度大於正常值的3倍)佔優勢 肺結構：肺泡部分增大和稀疏，但無纖維化腫塊 |
| 4 | 肺泡間隔：可變 肺結構：單個纖維化腫塊(＜顯微鏡視野的10%) |
| 5 | 肺泡間隔：可變 肺結構：融合性纖維化腫塊(顯微鏡視野＞10%和＜50%)肺結構嚴重受損，但仍保存完好 |
| 6 | 肺泡間隔：可變，基本上不存在 肺結構：大的連續性纖維化腫塊(＞顯微鏡視野的50%)肺結構大多未保存 |
| 7 | 肺泡隔：不存在 肺結構：肺泡幾乎被纖維團塊覆蓋，但仍有多達五個氣泡 |
| 8 | 肺泡隔：不存在 肺結構：顯微鏡下視野完全閉塞，伴有纖維化腫塊 |
解剖動物，一側肺臟取材100mg，冷凍乾燥12h去除水分後按照套組要求檢測羥脯胺酸含量。用肺部灌洗液檢測其中發炎因子： TGF-β和IL-1β、TNF-α和IFN-γ。(collagen一般測肺組織中的膠原含量，可以用檢測肺組織中羥脯胺酸的含量確定)。
2.3 統計方法
數據以平均值±標準差(
±SD)表示，數據差異統計採用單因子變異數分析(ANOVA)，組間差異用t檢驗，以P ＜0.05為有統計學差異。
3 、實驗結果3.1 化合物MAX-40279-01對博來黴素導致的小鼠肺纖維化模型體重的影響
小鼠模型建立後，模型組的體重均低於空白組，統計上有極顯著差異(P＜0.01)，說明博來黴素模型建立會使小鼠的體重降低。在模型建立後7天模型建立小鼠秤重分組，各給藥組小鼠組間體重沒有差異。給藥一周和二周後，15mg/kg MAX-40279-01組以及Pirfenidone組的小鼠體重降低較少，和模型組的體重相比有顯著差異(P＜0.01或P＜0.05)；給藥三周後，二個劑量的(20 mg/kg和15mg/kg)MAX-40279-01組和模型組的體重相比有明顯改善(P＜0.05)，達到了與Pirfenidone組相當的效果，並且比Nintedanib組具有更優的效果。見表3和圖1。
表3 MAX-40279-01對BLM導致的肺纖維化小鼠模型體重的影響
3.2 化合物MAX-40279-01對博來黴素導致的肺纖維化小鼠模型肺重及臟器係數的影響
| 組別 | 體重(g) 治療後天數 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| Vehicle組(空白對照) | 0天 | 24.4 | 23.1 | 23.3 | 23.4 | 23.9 | 24.8 | 23.1 | 25.3 | 23.4 | 25.7 |
| 7天 | 25.8 | 24.4 | 25.3 | 26.0 | 28.0 | 24.8 | 25.2 | 25.0 | 26.2 | 23.8 | |
| 14天 | 26.2 | 24.2 | 25.4 | 25.4 | 25.4 | 25.6 | 25.1 | 25.9 | 26.3 | 24.2 | |
| 21天 | 26.0 | 26.0 | 25.5 | 25.9 | 24.8 | 22.8 | 25.3 | 25.2 | 24.7 | 23.8 | |
| Model(模型)組 | 0天 | 23.4 | 23.4 | 22.0 | 21.5 | 19.7 | 20.1 | 22.2 | 21.2 | 19.5 | 22.0 |
| 7天 | 21.3 | 24.2 | 15.8 | 22.9 | 21.2 | 17.4 | 21.7 | 17.2 | 16.0 | 15.1 | |
| 14天 | 22.4 | 18.2 | 19.5 | 17.6 | 20.3 | 19.9 | 16.9 | 16.2 | 18.5 | 19.0 | |
| 21天 | 21.9 | 18.3 | 21.1 | 17.3 | 17.1 | 23.8 | 22.6 | 20.5 | 17.9 | 19.2 | |
| 1.2mg/kg DEX組 | 0天 | 22.7 | 23.4 | 21.0 | 24.2 | 24.7 | 20.4 | 21.4 | 24.3 | 21.4 | 21.4 |
| 7天 | 24.8 | 24.1 | 20.7 | 16.0 | 23.9 | 22.2 | 22.6 | 19.8 | 21.5 | 24.0 | |
| 14天 | 23.3 | 22.9 | 24.2 | 24.6 | 16.2 | 23.4 | 21.2 | 17.9 | 22.1 | 20.7 | |
| 21天 | 21.7 | 22.4 | 21.2 | 21.5 | 22.7 | 19.9 | 21.3 | 16.5 | 20.8 | 16.4 | |
| 50mg/kg Nintedanib組 | 0天 | 20.9 | 24.0 | 24.2 | 24.0 | 20.9 | 25.4 | 22.7 | 20.9 | 20.9 | 23.7 |
| 7天 | 16.6 | 25.6 | 18.5 | 24.5 | 22.9 | 24.6 | 22.1 | 18.2 | 16.9 | 24.8 | |
| 14天 | 27.2 | 14.8 | 25.6 | 26.8 | 21.2 | 23.1 | 16.5 | 24.1 | 24.8 | 16.4 | |
| 21天 | 26.1 | 26.1 | 25.7 | 23.8 | 18.6 | 22.0 | 17.6 | 15.6 | 24.7 | 21.3 | |
| 300mg/kg Pirfenidone組 | 0天 | 23.4 | 20.7 | 20.9 | 24.3 | 22.8 | 22.6 | 20.9 | 23.4 | 20.8 | 24.2 |
| 7天 | 25.3 | 23.8 | 24.3 | 23.4 | 26.4 | 25.2 | 26.0 | 16.8 | 25.3 | 21.1 | |
| 14天 | 26.1 | 26.4 | 26.8 | 22.6 | 26.4 | 24.4 | 27.4 | 19.1 | 18.9 | 18.2 | |
| 21天 | 26.7 | 24.2 | 22.7 | 25.8 | 26.6 | 17.9 | 18.7 | 23.2 | 20.2 | 22.9 | |
| 20mg/kg MAX-40279-01 | 0天 | 21.4 | 20.0 | 21.1 | 21.2 | 20.7 | 20.8 | 21.7 | 21.0 | 21.4 | 22.5 |
| 7天 | 20.3 | 19.1 | 22.6 | 20.3 | 21.5 | 21.7 | 20.7 | 20.6 | 23.3 | 25.1 | |
| 14天 | 26.1 | 22.2 | 23.1 | 24.9 | 20.3 | 19.5 | 24.5 | 17.2 | 23.2 | 18.9 | |
| 21天 | 23.7 | 22.6 | 24.9 | 20.1 | 25.8 | 21.7 | 22.6 | 26.3 | 17.2 | 24.1 | |
| 15mg/kg MAX-40279-01 | 0天 | 20.6 | 21.9 | 24.2 | 22.8 | 19.8 | 20.6 | 21.8 | 20.8 | 21.2 | 21.0 |
| 7天 | 26.0 | 23.4 | 23.1 | 21.6 | 19.6 | 22.2 | 20.5 | 25.5 | 17.3 | 24.0 | |
| 14天 | 21.3 | 26.6 | 23.1 | 23.1 | 22.4 | 22.9 | 25.7 | 23.7 | 23.4 | 18.5 | |
| 21天 | 22.3 | 26.2 | 24.1 | 20.6 | 21.7 | 23.4 | 23.4 | 17.8 | 21.7 | 22.4 | |
| 10mg/kg MAX-40279-01 | 0天 | 23.2 | 22.4 | 22.8 | 19.8 | 21.6 | 22.5 | 23.4 | 21.9 | 21.4 | 22.0 |
| 7天 | 14.4 | 21.4 | 20.0 | 19.2 | 18.5 | 22.6 | 16.0 | 23.5 | 16.2 | 22.8 | |
| 14天 | 21.9 | 14.7 | 24.7 | 24.1 | 23.8 | 22.9 | 17.3 | 23.5 | 24.8 | 23.3 | |
| 21天 | 23.5 | 23.8 | 22.4 | 21.4 | 22.7 | 15.0 | 23.2 | 23.8 | 24.7 | 18.0 | |
| 5mg/kg MAX-40279-01 | 0天 | 22.0 | 23.3 | 20.5 | 21.9 | 23.8 | 21.3 | 23.5 | 22.7 | 19.9 | 20.5 |
| 7天 | 15.9 | 15.8 | 16.0 | 22.5 | 19.8 | 15.0 | 22.7 | 20.1 | 15.6 | 17.2 | |
| 14天 | 18.1 | 22.4 | 21.6 | 20.3 | 24.2 | 23.0 | 16.4 | 22.1 | 23.5 | 19.3 | |
| 21天 | 16.6 | 21.3 | 24.3 | 22.7 | 22.5 | 23.2 | 19.6 | 25.3 | 15.6 | 17.1 |
小鼠取肺後，肺秤重並計算臟器係數。結果顯示模型組的肺重顯著大於空白對照組(P＜0.01)。相比於模型組，兩個劑量MAX-40279-01(20 mg/kg、15mg/kg)組以及DEX組和Pirfenidone組的小鼠的肺組織顯著降低(P＜0.01)；肺臟器係數結果顯示，三個劑量MAX-40279-01(20 mg/kg、15 mg/kg和10mg/kg)組以及DEX組和Pirfenidone組的肺臟器係數小於模型組，有顯著差異(P＜0.01或P＜0.05)。見表4，表5和圖2。
表4 MAX-40279-01對BLM導致的對肺纖維化小鼠模型肺重的影響
表5 MAX-40279-01對BLM導致的對肺纖維化小鼠模型肺臟器係數的影響
3.3 化合物MAX-40279-01對博來黴素(BLM)致小鼠肺纖維化小鼠肺部masson染色病理片Ashcroft Score的評分
| 小鼠編號 肺重(mg) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| Vehicle組 | 267.72 | 304.28 | 258.83 | 328.98 | 294.91 | 242.94 | 270.97 | 346.91 | 210.74 | 247.00 |
| Model組 | 343.30 | 429.36 | 363.79 | 535.00 | 399.00 | 425.87 | 269.00 | 366.00 | 432.00 | 484.00 |
| 1.2mg/kg DEX組 | 359.99 | 256.05 | 358.10 | 341.67 | 208.00 | 277.00 | 285.00 | 320.00 | 259.00 | 346.00 |
| 50mg/kg Nintedanib組 | 327.92 | 325.06 | 235.31 | 378.00 | 398.00 | 345.00 | 434.00 | 317.00 | 351.00 | 299.00 |
| 300mg/kg Pirfenidone組 | 338.42 | 329.76 | 282.39 | 273.05 | 235.14 | 229.53 | 350.00 | 364.00 | 268.00 | 296.00 |
| 20mg/kg MAX-40279-01 | 331.62 | 309.85 | 378.43 | 368.06 | 273.69 | 301.00 | 285.00 | 281.00 | 406.00 | 358.00 |
| 15mg/kg MAX-40279-01 | 238.87 | 256.23 | 382.30 | 363.00 | 360.00 | 334.00 | 332.00 | 365.00 | 331.00 | 294.00 |
| 10mg/kg MAX-40279-01 | 219.27 | 315.98 | 348.79 | 334.34 | 287.00 | 302.00 | 308.00 | 388.00 | 456.00 | 504.00 |
| 5mg/kg MAX-40279-01 | 397.13 | 244.89 | 519.56 | 294.00 | 389.00 | 355.00 | 464.00 | 286.00 | 384.00 | 360.00 |
| 小鼠編號 肺臟器係數 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| Vehicle組 | 10.297 | 11.703 | 10.150 | 12.702 | 11.892 | 10.655 | 10.710 | 13.766 | 8.532 | 10.378 |
| Model組 | 15.676 | 23.462 | 17.241 | 30.925 | 23.333 | 17.894 | 11.903 | 17.854 | 24.134 | 25.208 |
| 1.2mg/kg DEX組 | 16.589 | 11.431 | 16.892 | 15.892 | 9.163 | 13.920 | 13.380 | 19.394 | 12.452 | 21.098 |
| 50mg/kg Nintedanib組 | 12.564 | 12.454 | 9.156 | 15.882 | 21.398 | 15.682 | 24.659 | 20.321 | 14.211 | 14.038 |
| 300mg/kg Pirfenidone組 | 12.675 | 13.626 | 12.440 | 10.583 | 8.840 | 12.823 | 18.717 | 15.690 | 13.267 | 12.926 |
| 20mg/kg MAX-40279-01 | 13.992 | 13.710 | 15.198 | 18.311 | 10.608 | 13.871 | 12.611 | 10.684 | 23.605 | 14.855 |
| 15mg/kg MAX-40279-01 | 10.712 | 9.780 | 15.863 | 17.621 | 16.590 | 14.274 | 14.188 | 20.506 | 15.253 | 13.125 |
| 10mg/kg MAX-40279-01 | 9.331 | 13.276 | 15.571 | 15.623 | 12.643 | 20.133 | 13.276 | 16.303 | 18.462 | 28.000 |
| 5mg/kg MAX-40279-01 | 23.923 | 11.497 | 21.381 | 12.952 | 17.289 | 15.302 | 23.673 | 11.304 | 24.615 | 21.053 |
按照Ashcroft Score標準進行評分，小鼠模型建立後，模型組的動物肺部完全閉塞，肺泡幾乎被纖維團塊覆蓋，伴有纖維化腫塊，多數受影響面積達50%以上，肺泡結構不能辨認。二個劑量MAX-40279-01(15 mg/kg和10mg/kg)以及Nintedanib組的病理評分較模型組明顯降低(P＜0.05)。高劑量MAX-40279-01(20 mg/kg)組的病理評分較模型組顯著降低(P＜0.01)，治療效果明顯優於Pirfenidone組和Nintedanib組。見表6，圖3和圖4。
表6 MAX-40279-01對BLM導致的肺纖維化小鼠模型病理評分的影響
3.4 化合物MAX-40279-01對小鼠肺泡灌洗液中細胞激素的影響
| 小鼠編號 Ashcroft Score | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| Vehicle組 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 0 |
| Model組 | 8 | 7 | 6 | 8 | 7 | 8 | 7 | 7 | 8 | 0 |
| 1.2mg/kg DEX組 | 3 | 8 | 5 | 5 | 6 | 6 | 6 | 6 | 2 | 7 |
| 50mg/kg Nintedanib組 | 3 | 3 | 5 | 7 | 8 | 6 | 7 | 7 | 7 | 6 |
| 300mg/kg Pirfenidone組 | 8 | 6 | 4 | 3 | 5 | 8 | 8 | 8 | 7 | 7 |
| 20mg/kg MAX-40279-01 | 3 | 3 | 6 | 4 | 4 | 5 | 4 | 2 | 1 | 8 |
| 15mg/kg MAX-40279-01 | 3 | 5 | 3 | 4 | 8 | 8 | 6 | 6 | 8 | 4 |
| 10mg/kg MAX-40279-01 | 8 | 3 | 5 | 5 | 7 | 7 | 5 | 5 | 8 | 6 |
| 5mg/kg MAX-40279-01 | 8 | 8 | 8 | 6 | 6 | 5 | 6 | 4 | 6 | 7 |
小鼠模型組的TNF-α高於空白組，統計上有極顯著差異(P＜0.01)。與模型組相比，三個劑量的MAX-40279-01(20 mg/kg、15 mg/kg和10mg/kg)組以及DEX組和Nintedanib組表現出顯著降低了TNF-α含量，統計上具有顯著差異(P＜0.01)。見表7和圖5。
小鼠模型組的TGF-β高於空白組，統計上有極顯著差異(P＜0.01)。與模型組相比，三個劑量的MAX-40279-01(20 mg/kg、15 mg/kg和10mg/kg)組、DEX組、Pirfenidone和Nintedanib組均表現出顯著降低了TGF-β含量，統計上具有顯著差異(P＜0.01)。見表7和圖5。
小鼠模型組的IL1-β高於空白組，統計上有極顯著差異(P＜0.01)。與模型組相比，四個劑量的MAX-40279-01(20 mg/kg、15 mg/kg、10mg/kg和5mg/kg)組以及DEX組和Nintedanib組表現出明顯降低了IL1-β(P＜0.01或P＜0.05)。見表7和圖5。
小鼠模型組的IFN-γ低於空白組，統計上有極顯著差異(P＜0.01)。二個劑量的MAX-40279-01(20和15mg/kg)組以及DEX組和Nintedanib組表現出顯著上調了IFN-γ(P＜0.01或P＜0.05)。見表7和圖5。
表7 MAX-40279-01對BLM導致的肺纖維化小鼠模型肺灌洗液細胞激素的影響
| 組別 | 小鼠編號 細胞激素(ng/ml) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| Vehicle組(空白對照) | TNF-α | 3.1746 | 3.1769 | 2.9058 | 2.6388 | 3.4553 | 3.1304 | 2.8301 | 2.9199 | 2.6416 | 2.2231 |
| TGF-β | 133.3709 | 141.3804 | 114.9292 | 152.5979 | 166.1809 | 146.1724 | 161.6831 | 119.3527 | 155.7575 | 160.6425 | |
| IL1-β | 60.0241 | 94.2761 | 92.6263 | 78.4889 | 76.2344 | 46.2118 | 74.8671 | 60.4058 | 92.8229 | 55.3341 | |
| IFN-γ | 744.9985 | 771.5062 | 727.2220 | 925.4274 | 828.8899 | 787.5337 | 773.1956 | 717.9974 | 759.4639 | 646.5471 | |
| Model(模型)組 | TNF-α | 6.9496 | 8.3516 | 6.4242 | 6.6931 | 6.8791 | 6.0400 | 7.5263 | 6.9383 | 6.3778 | 5.5334 |
| TGF-β | 137.5267 | 165.3458 | 162.8902 | 155.9891 | 182.1403 | 169.7469 | 196.0894 | 190.8737 | 170.7028 | 189.4829 | |
| IL1-β | 63.3400 | 246.7092 | 145.9632 | 132.2426 | 199.9761 | 66.7817 | 118.9529 | 127.4907 | 152.9731 | 74.5167 | |
| IFN-γ | 442.6425 | 583.7733 | 558.6563 | 593.7056 | 562.6362 | 502.2517 | 562.6141 | 518.1039 | 593.5757 | 396.4767 | |
| 1.2mg/kg DEX組 | TNF-α | 4.2476 | 3.2189 | 2.8925 | 2.5794 | 2.7590 | 1.9025 | 2.8402 | 3.2665 | 3.2923 | 3.2263 |
| TGF-β | 146.0386 | 155.0091 | 157.1409 | 132.5753 | 151.6437 | 143.1980 | 149.2408 | 126.6003 | 144.1577 | 169.6819 | |
| IL1-β | 68.4477 | 55.5318 | 62.9389 | 57.7931 | 56.2272 | -3.95 67 | 51.9022 | 39.2678 | 115.1174 | 62.0034 | |
| IFN-γ | 602.9016 | 724.8755 | 660.6956 | 589.4465 | 632.3478 | 608.7280 | 675.0752 | 586.7599 | 746.1698 | 613.1260 | |
| 50mg/kg Nintedanib組 | TNF-α | 4.7828 | 5.1324 | 3.7266 | 3.7118 | 4.6053 | 3.0866 | 5.8319 | 4.6737 | 5.5694 | 3.7158 |
| TGF-β | 123.7142 | 164.5313 | 145.4398 | 142.9629 | 146.6032 | 141.8188 | 159.3517 | 145.8300 | 148.5819 | 170.7242 | |
| IL1-β | 79.7591 | 59.6308 | 78.2757 | 88.0407 | 57.5686 | 24.7991 | 121.4973 | 134.6557 | 58.3235 | 82.9798 | |
| IFN-γ | 558.3433 | 647.8611 | 647.2872 | 588.1350 | 651.2944 | 466.3948 | 666.6193 | 662.4239 | 619.4563 | 566.9135 | |
| 300mg/kg Pirfenidone組 | TNF-α | 6.6427 | 8.1994 | 6.0777 | 6.1244 | 7.6410 | 5.8084 | 7.7401 | 4.8998 | 7.1385 | 5.0400 |
| TGF-β | 121.4207 | 135.0464 | 123.3127 | 134.8392 | 135.0708 | 146.5761 | 151.1451 | 149.0702 | 158.6653 | 144.5245 | |
| IL1-β | 126.4371 | 108.5174 | 151.2295 | 112.4676 | 139.6668 | 77.5515 | 157.2059 | 78.6695 | 141.3899 | 104.9542 | |
| IFN-γ | 649.5245 | 340.2747 | 536.8128 | 588.6921 | 676.9139 | 554.6115 | 723.8134 | 482.9053 | 689.9756 | 493.5336 | |
| 20mg/kg MAX-40279-01 | TNF-α | 2.2931 | 3.8171 | 3.5346 | 1.7247 | 3.4439 | 2.8554 | 3.3740 | 3.7946 | 3.9927 | 3.8804 |
| TGF-β | 104.9497 | 106.2996 | 97.4967 | 123.8828 | 127.2726 | 121.6076 | 121.2635 | 106.1351 | 129.6687 | 134.4724 | |
| IL1-β | 88.7019 | 72.6863 | 94.7475 | 102.1297 | 70.9081 | 11.7358 | 74.0229 | 135.1861 | 98.2947 | 110.4732 | |
| IFN-γ | 745.4504 | 572.6736 | 554.3790 | 689.8055 | 638.2976 | 596.4000 | 639.3871 | 682.7312 | 717.0131 | 689.8133 | |
| 15mg/kg MAX-40279-01 | TNF-α | 3.5422 | 4.6812 | 3.3171 | 4.1121 | 3.7386 | 2.5600 | 3.8039 | 2.7331 | 3.7158 | 2.5975 |
| TGF-β | 109.6154 | 120.7277 | 131.8940 | 102.2770 | 108.7768 | 123.5828 | 127.9901 | 111.1182 | 101.6036 | 115.7695 | |
| IL1-β | 64.4375 | 69.8936 | 43.1897 | 71.6591 | 83.3844 | -0.87 61 | 92.3110 | 26.4763 | 57.9580 | 50.3255 | |
| IFN-γ | 667.6971 | 692.5674 | 631.9817 | 699.9040 | 666.0870 | 477.8567 | 675.9335 | 527.4285 | 586.3950 | 588.2298 | |
| 10mg/kg MAX-40279-01 | TNF-α | 6.4823 | 5.0787 | 4.5549 | 5.1202 | 4.6096 | 5.1271 | 6.4172 | 3.3841 | 5.0051 | 5.1079 |
| TGF-β | 138.7738 | 106.9503 | 148.9346 | 174.7179 | 145.5984 | 147.4566 | 154.1685 | 154.4434 | 131.3183 | 124.2786 | |
| IL1-β | 72.1900 | 99.9748 | 78.0634 | 73.5784 | 67.7919 | 50.1854 | 59.8382 | 48.8757 | 92.1968 | 67.0028 | |
| IFN-γ | 659.3724 | 644.6577 | 576.0550 | 718.3999 | 663.0276 | 511.5971 | 636.2096 | 445.8667 | 403.3977 | 440.1117 | |
| 5mg/kg MAX-40279-01 | TNF-α | 7.4888 | 7.0081 | 5.8352 | 5.7816 | 5.9801 | 7.1639 | 7.0591 | 7.5498 | 4.4688 | 5.8994 |
| TGF-β | 205.4240 | 176.0018 | 142.2544 | 207.3517 | 189.8621 | 174.7960 | 159.2021 | 197.6313 | 157.6006 | 100.4167 | |
| IL1-β | 147.8971 | 56.6415 | 56.3931 | 61.6882 | 78.7168 | 55.8802 | 80.0583 | 58.2098 | 60.4253 | 103.1896 | |
| IFN-γ | 738.0658 | 553.1675 | 229.1030 | 547.3333 | 512.0269 | 519.9413 | 540.3746 | 626.8058 | 485.9685 | 569.6274 |
總體表明，化合物MAX-40279-01達到了與Nintedanib相當的效果，更是達到了比Pirfenidone更優的效果。
3.5 化合物MAX-40279-01對博來黴素(BLM)小鼠肺纖維化小鼠肺部羥脯胺酸的影響
小鼠模型組的羥脯胺酸高於空白組，統計上有極顯著差異(P＜0.01)。相比於模型組，所有劑量的MAX-40279-01組(20 mg/kg、15 mg/kg、10 mg/kg和5mg/kg)以及DEX組、Nintedanib和Pirfenidone組中小鼠肺組織的羥脯胺酸含量顯著降低(P＜0.01或P＜0.05)。其中三個劑量的MAX-40279-01組(20 mg/kg、15 mg/kg和10 mg/kg)達到了與Nintedanib和Pirfenidone組相當甚至更優的效果。見表8和圖6。
表8 MAX-40279-01對BLM導致的肺纖維化小鼠模型肺羥脯胺酸的影響
4 、結論
| 小鼠 編號 羥脯 胺酸 含量(μg/ml) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| Vehicle組 | 58.33393 | 69.42120 | 70.56807 | 63.79757 | 65.66521 | 68.31638 | 67.49508 | 71.46920 | 62.23709 | 61.19108 |
| Model組 | 122.00470 | 106.92390 | 112.78310 | 103.78130 | 136.65510 | 121.06440 | 111.70450 | 105.50270 | 90.87955 | 100.90180 |
| 1.2mg/kg DEX組 | 84.75953 | 62.13492 | 67.67806 | 72.41600 | 66.07849 | 86.54636 | 68.16329 | 79.87409 | 72.60096 | 80.87641 |
| 50mg/kg Nintedanib組 | 82.43393 | 77.02515 | 78.13161 | 67.16918 | 83.36890 | 68.08806 | 59.56194 | 80.99336 | 88.44094 | 76.65951 |
| 300mg/kg Pirfenidone組 | 100.34130 | 78.12340 | 96.56725 | 93.45845 | 77.72688 | 102.52990 | 85.77467 | 88.45671 | 105.67290 | 81.90862 |
| 20mg/kg MAX-40279-01 | 78.50941 | 73.98765 | 70.44717 | 71.40317 | 74.48141 | 80.03146 | 74.99522 | 72.92882 | 77.22227 | 61.61454 |
| 15mg/kg MAX-40279-01 | 64.03016 | 74.96270 | 59.80538 | 77.36912 | 74.96960 | 64.61526 | 72.88217 | 75.34247 | 70.49940 | 65.10049 |
| 10mg/kg MAX-40279-01 | 71.68405 | 63.60046 | 46.68653 | 70.75368 | 70.32660 | 63.62641 | 75.57145 | 63.87346 | 70.02765 | 64.97926 |
| 5mg/kg MAX-40279-01 | 112.26830 | 76.25247 | 85.79602 | 73.27311 | 116.83010 | 96.56856 | 85.06276 | 94.05734 | 90.11870 | 131.25910 |
化合物MAX-40279-01能夠改善小鼠BLM模型建立後的體重降低；降低模型小鼠的肺臟器係數和肺重；改善模型組的動物肺部顯微結構，降低纖維化腫塊；降低模型建立小鼠肺部TNF-α、TGF-β、IL1-β，升高小鼠肺部IFN-γ的含量；降低了小鼠肺部的羥脯胺酸的含量；這些結果表明MAX-40279-01對肺纖維化有治療作用，具有比Nintedanib和 Pirfenidone更優的效果。
實施例 2
化合物MAX-40279-01對博來黴素誘導的大鼠肺纖維化的作用
1.1、動物：
種屬：SD大鼠；等級：SPF；體重：230g；來源：浙江維通利華實驗動物技術有限公司；合格證號：20220113Aazz0619000416；許可證號：SCXK(浙)2019-0001。
1.2、儀器：
名稱：TGF-β Elisa Kit，來源：南京建成生物工程研究所，規格：96T，批號：20220118；名稱：TNF-α Elisa Kit，來源：南京建成生物工程研究所，規格：96T，批號：20220118；名稱：IL1-β Elisa Kit，來源：南京建成生物工程研究所，規格：96T，批號：20220118；名稱：IFN-γ Elisa Kit，來源：南京建成生物工程研究所，規格：96T，批號：20220118；名稱：羥脯胺酸套組X2，來源：南京建成生物工程研究所，規格：50T/48樣，批號：20220114；名稱：ELISA讀取儀，來源：Themo Scientific，型號：Varioskan Flash。
1.3、試劑：
(1)化合物MAX-40279-01：根據WO2019/228171A1揭示的方法合成。
(2)名稱：Bleomycin (hydrochloride)(鹽酸博來黴素)，來源：MedChem Express，形狀：白色粉末，規格：50mg，批號：111561。
(3)名稱：醋酸地塞米松片(DEX)，來源：浙江仙琚製藥股份有限公司，形狀：白色片劑，規格：0.75mg，批號：200906
(4)名稱：Pirfenidone(吡非尼酮)，來源：MedChem Express，形狀：白色粉末，規格：3g，批號：HY-B0673/cs-2905
(5)名稱：Nintedanib(尼達尼布)，來源：MedChem Express，形狀：黃色粉末，規格：500mg，批號：HY-50904/cs-0104
2 、實驗方法2.1 分組給藥
SD雄性大鼠160隻適應性飼養後繼續飼養至體重達240g左右，麻醉後固定於手術臺上，酒精棉消毒頸部後，逐層分離肌肉，暴露氣管，經氣管軟骨環間隙向心端進針，以博來黴素2.5mg/kg(20ul/100g體重)的劑量注入後，迅速將動物直立，隨即沿身體長軸旋轉1分鐘使溶液均勻分佈於肺內，縫合切口，消毒後放回籠中。假手術組暴露氣管，以生理鹽水代替博來黴素溶液做同樣操作。待動物甦醒後空白組和模型組分開飼養，一周後博來黴素大鼠按體重隨機分組，分為模型(Model)組、0.6mg/kg DEX(地塞米松)組、25mg/kg Nintedanib組、150mg/kg Pirfenidone組、10mg/kg MAX-40279-01組、7.5mg/kg MAX-40279-01組、5mg/kg MAX-40279-01組、2.5mg/kg MAX-40279-01組，每組入組10隻，和空白對照組一起於模型建立後7天給予治療，共給藥21天，模型組及空白對照組給予相應溶劑。分組情況如下表9所示：
表9 動物分組
2.2 藥效學評價指標
(1)體重
| 組別 | 模型建立 | 治療(經口灌胃每天一次) | N |
| Vehicle組(空白對照) | 生理鹽水 | 生理鹽水 | 10 |
| Model（模型）組 | BLM | 生理鹽水 | 10 |
| 0.6mg/kg DEX組 | BLM | DEX | 10 |
| 25mg/kg Nintedanib組 | BLM | Nintedanib | 10 |
| 150mg/kg Pirfenidone組 | BLM | Pirfenidone | 10 |
| 10mg/kg MAX-40279-01 | BLM | 10mg/kg MAX-40279-01 | 10 |
| 7.5mg/kg MAX-40279-01 | BLM | 7.5mg/kg MAX-40279-01 | 10 |
| 5mg/kg MAX-40279-01 | BLM | 5mg/kg MAX-40279-01 | 10 |
| 2.5mg/kg MAX-40279-01 | BLM | 2.5mg/kg MAX-40279-01 | 10 |
每天觀察動物一般狀況，體重7天記錄一次。
(2)肺重、肺組織病理及評分
末次給藥一小時後麻醉處死動物，頸部切開，逐層分離肌肉，暴露氣管，解剖取肺，秤量肺重用於計算肺組織臟器係數(肺組織臟器係數=肺組織重量/體重)；取10ml生理鹽水對肺部進行反復灌洗，收集肺部灌洗液，用以檢測發炎細胞及發炎因子等。另一側肺臟由支氣管注入10%甲醛溶液，直至胸膜平展後結紮支氣管，肺組織固定後自肺尖致肺底縱行取材待做病理檢查(HE染色、masson染色和病理評分)。Szapiel評分系統及Ashcroft score評分，評分標準如下表10：
表10 Szapiel評分系統和Ashcroft score評分標準
Szapiel評分系統
Ashcroft score評分
(3)檢測羥脯胺酸及發炎因子的含量
| 肺泡炎程度 | 組織病理學特徵 |
| 0 級 | 肺組織正常 |
| 1 級 | 輕度肺泡炎（＋），肺泡間隔炎細胞浸潤變寬，受影響面積＜20% 肺葉 |
| 2 級 | 中度肺泡炎（++），受影響面積 20%~50% 肺葉 |
| 3 級 | 重度肺泡炎（+++），受影響面積＞50% 肺葉 |
| 分級 | 特徵 |
| 0 | 肺泡間隔：在一些肺泡壁最脆弱的小纖維處沒有纖維化負擔 肺結構：正常肺 |
| 1 | 肺泡間隔：孤立的輕度纖維化改變(間隔厚度小於正常值的3倍) 肺結構：肺泡部分增大和稀薄，但無纖維化腫塊 |
| 2 | 肺泡間隔：明顯的纖維化改變(間隔厚度大於正常值的3倍)，形成結節狀結構，但彼此不相連 肺結構：肺泡部分增大和稀疏，但無纖維化腫塊 |
| 3 | 肺泡間隔：在整個顯微鏡視野中，相鄰的纖維化壁(間隔厚度大於正常值的3倍)佔優勢 肺結構：肺泡部分增大和稀疏，但無纖維化腫塊 |
| 4 | 肺泡間隔：可變 肺結構：單個纖維化腫塊(＜顯微鏡視野的10%) |
| 5 | 肺泡間隔：可變 肺結構：融合性纖維化腫塊(顯微鏡視野＞10%和＜50%)肺結構嚴重受損，但仍保存完好 |
| 6 | 肺泡間隔：可變，基本上不存在 肺結構：大的連續性纖維化腫塊(＞顯微鏡視野的50%)肺結構大多未保存 |
| 7 | 肺泡隔：不存在 肺結構：肺泡幾乎被纖維團塊覆蓋，但仍有多達五個氣泡 |
| 8 | 肺泡隔：不存在 肺結構：顯微鏡下視野完全閉塞，伴有纖維化腫塊 |
解剖動物，一側肺臟取材100mg，冷凍乾燥12h去除水分後按照套組要求檢測羥脯胺酸含量。用肺部灌洗液檢測其中發炎細胞、發炎因子： TGF-β和IL-1β，TNF-α和IFN-γ。(collagen一般測肺組織中的膠原含量，可以用檢測肺組織中羥脯胺酸的含量確定)。
2.3 統計方法
數據以平均值±標準差(
±SD)表示，數據差異統計採用單因子變異數分析(ANOVA)，組間差異用t檢驗，以P ＜0.05為有統計學差異。
3 、實驗結果3.1 化合物MAX-40279-01對博來黴素(BLM)導致的大鼠肺纖維化模型體重的影響
大鼠模型建立後，模型組的體重都低於空白組，統計上有極顯著差異(P＜0.01)，說明BLM模型建立對大鼠的體重降低。在模型建立後7天模型建立大鼠秤重分組，各給藥組大鼠體重沒有差異。給藥後7天，10mg/kg和7.5mg/kg MAX-40279-01組的大鼠體重降低較少，其中7.5mg/kg MAX-40279-01組的大鼠和模型組的體重相比有顯著差異(P＜0.05)；給藥14天後以及21天後，10mg/kg和7.5mg/kg MAX-40279-01組中的大鼠體重降低較少，和模型組的體重相比有極顯著差異(P＜0.01)。給藥之後，0.6mg/kg DEX組的大鼠卻導致體重持續下降，和模型組相比有極顯著差異(P＜0.01)；說明化合物MAX-40279-01能夠更好的減少大鼠體重的降低，具有比Nintedanib和Pirfenidone更好的效果。見表11和圖7。
表11 MAX-40279-01對BLM導致的肺纖維化大鼠模型體重的影響
3.2 化合物MAX-40279-01對博來黴素(BLM)導致大鼠肺纖維化模型肺重及臟器係數的影響
| 組別 | 大鼠體重(g) 治療後天數 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| Vehicle組(空白對照) | 0天 | 314.0 | 305.0 | 301.0 | 299.0 | 313.0 | 317.0 | 307.0 | 323.0 | 304.0 | 308.0 |
| 7天 | 383.0 | 352.0 | 386.0 | 375.0 | 388.0 | 391.0 | 412.0 | 453.0 | 391.0 | 383.0 | |
| 14天 | 433.0 | 383.0 | 429.0 | 416.0 | 421.0 | 451.0 | 461.0 | 493.0 | 421.0 | 416.0 | |
| 21天 | 452.0 | 419.0 | 465.0 | 450.0 | 459.0 | 473.0 | 487.0 | 517.0 | 449.0 | 432.0 | |
| Model (模型)組 | 0天 | 242.0 | 224.0 | 224.0 | 238.0 | 237.0 | 238.0 | 229.0 | 233.0 | 237.0 | 229.0 |
| 7天 | 269.0 | 254.0 | 243.0 | 391.0 | 268.0 | 284.0 | 232.0 | 244.0 | 307.0 | 266.0 | |
| 14天 | 322.0 | 290.0 | 278.0 | 370.0 | 323.0 | 313.0 | 262.0 | 270.0 | 367.0 | 297.0 | |
| 21天 | 361.0 | 319.0 | 305.0 | 401.0 | 359.0 | 335.0 | 307.0 | 309.0 | 393.0 | 335.0 | |
| 0.6mg/kg DEX組 | 0天 | 221.0 | 211.0 | 270.0 | 274.0 | 193.0 | 258.0 | 236.0 | 233.0 | 238.0 | 283.0 |
| 7天 | 230.0 | 226.0 | 257.0 | 236.0 | 189.0 | 258.0 | 216.0 | 219.0 | 206.0 | 263.0 | |
| 14天 | 240.0 | 209.0 | 258.0 | 229.0 | 200.0 | 260.0 | 213.0 | 238.0 | 218.0 | 265.0 | |
| 21天 | 238.0 | 210.0 | 247.0 | 218.0 | 183.0 | 257.0 | 208.0 | 228.0 | 215.0 | 271.0 | |
| 25mg/kg Nintedanib組 | 0天 | 220.0 | 277.0 | 267.0 | 259.0 | 225.0 | 222.0 | 249.0 | 218.0 | 241.0 | 241.0 |
| 7天 | 211.0 | 346.0 | 340.0 | 315.0 | 291.0 | 249.0 | 291.0 | 236.0 | 283.0 | 334.0 | |
| 14天 | 238.0 | 378.0 | 374.0 | 348.0 | 318.0 | 289.0 | 339.0 | 287.0 | 321.0 | 383.0 | |
| 21天 | 244.0 | 370.0 | 377.0 | 343.0 | 310.0 | 324.0 | 363.0 | 328.0 | 340.0 | 421.0 | |
| 150mg/kg Pirfenidone組 | 0天 | 228.0 | 223.0 | 238.0 | 237.0 | 255.0 | 226.0 | 264.0 | 229.0 | 203.0 | 233.0 |
| 7天 | 280.0 | 283.0 | 295.0 | 293.0 | 321.0 | 279.0 | 316.0 | 289.0 | 179.0 | 296.0 | |
| 14天 | 319.0 | 317.0 | 338.0 | 336.0 | 365.0 | 331.0 | 337.0 | 331.0 | 205.0 | 333.0 | |
| 21天 | 356.0 | 331.0 | 369.0 | 368.0 | 392.0 | 353.0 | 343.0 | 343.0 | 235.0 | 361.0 | |
| 10mg/kg MAX-40279-01 | 0天 | 229.0 | 275.0 | 237.0 | 268.0 | 284.0 | 247.0 | 238.0 | 256.0 | 213.0 | 244.0 |
| 7天 | 263.0 | 318.0 | 315.0 | 234.0 | 343.0 | 313.0 | 329.0 | 376.0 | 253.0 | 321.0 | |
| 14天 | 339.0 | 381.0 | 378.0 | 322.0 | 359.0 | 377.0 | 385.0 | 387.0 | 286.0 | 384.0 | |
| 21天 | 391.0 | 413.0 | 411.0 | 427.0 | 370.0 | 403.0 | 418.0 | 427.0 | 319.0 | 403.0 | |
| 7.5mg/kg MAX-40279-01 | 0天 | 262.0 | 249.0 | 233.0 | 224.0 | 256.0 | 269.0 | 272.0 | 274.0 | 263.0 | 227.0 |
| 7天 | 356.0 | 313.0 | 320.0 | 289.0 | 319.0 | 337.0 | 349.0 | 323.0 | 315.0 | 263.0 | |
| 14天 | 417.0 | 369.0 | 363.0 | 343.0 | 309.0 | 379.0 | 393.0 | 351.0 | 338.0 | 363.0 | |
| 21天 | 461.0 | 397.0 | 383.0 | 385.0 | 327.0 | 402.0 | 421.0 | 361.0 | 350.0 | 387.0 | |
| 5mg/kg MAX-40279-01 | 0天 | 225.0 | 205.0 | 231.0 | 221.0 | 234.0 | 237.0 | 235.0 | 255.0 | 226.0 | 247.0 |
| 7天 | 218.0 | 283.0 | 283.0 | 227.0 | 267.0 | 361.0 | 237.0 | 335.0 | 209.0 | 297.0 | |
| 14天 | 319.0 | 275.0 | 334.0 | 265.0 | 295.0 | 350.0 | 265.0 | 379.0 | 195.0 | 357.0 | |
| 21天 | 342.0 | 330.0 | 394.0 | 304.0 | 330.0 | 380.0 | 305.0 | 420.0 | 203.0 | 391.0 | |
| 2.5mg/kg MAX-40279-01 | 0天 | 254.0 | 209.0 | 237.0 | 260.0 | 252.0 | 213.0 | 208.0 | 210.0 | 269.0 | 202.0 |
| 7天 | 305.0 | 248.0 | 290.0 | 335.0 | 277.0 | 201.0 | 245.0 | 253.0 | 355.0 | 200.0 | |
| 14天 | 338.0 | 294.0 | 349.0 | 389.0 | 345.0 | 208.0 | 307.0 | 313.0 | 401.0 | 266.0 | |
| 21天 | 356.0 | 327.0 | 384.0 | 418.0 | 385.0 | 226.0 | 331.0 | 344.0 | 427.0 | 313.0 |
大鼠取肺後，肺秤重，計算臟器係數。結果顯示空白對照組的肺重輕於模型組，有極顯著差異(P＜0.01)。所有劑量的MAX-40279-01(10 mg/kg、7.5 mg/kg、5 mg/kg和2.5mg/kg)組以及DEX組、Nintedanib組和Pirfenidone組的大鼠的肺組織小於模型組，有極顯著差異(P＜0.01)。見表12和圖8。
表12 MAX-40279-01對BLM導致肺纖維化大鼠模型肺重的影響
| 大鼠編號 肺重(g) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| Vehicle組(空白對照) | 2.351 | 2.100 | 2.275 | 2.570 | 2.685 | 3.229 | 2.746 | 2.570 | 2.648 | 2.455 |
| Model(模型)組 | 4.088 | 3.475 | 3.858 | 3.250 | 3.568 | 3.208 | 3.658 | 3.945 | 3.991 | 3.972 |
| 0.6mg/kg DEX組 | 3.225 | 2.091 | 3.035 | 2.674 | 3.695 | 2.901 | 2.725 | 2.692 | 2.800 | 3.437 |
| 25mg/kg Nintedanib組 | 3.471 | 3.136 | 3.203 | 2.581 | 2.731 | 3.431 | 3.413 | 3.518 | 3.016 | 2.597 |
| 150mg/kg Pirfenidone組 | 2.850 | 3.192 | 3.291 | 3.338 | 3.049 | 3.144 | 2.742 | 2.549 | 2.590 | 3.056 |
| 10mg/kg MAX-40279-01 | 2.719 | 3.660 | 2.951 | 3.304 | 3.401 | 2.306 | 2.931 | 2.425 | 2.345 | 3.085 |
| 7.5mg/kg MAX-40279-01 | 2.911 | 3.122 | 2.976 | 2.287 | 2.416 | 2.785 | 3.145 | 2.580 | 2.848 | 2.349 |
| 5mg/kg MAX-40279-01 | 3.461 | 2.874 | 3.363 | 2.518 | 4.214 | 2.515 | 2.742 | 1.864 | 2.225 | 2.841 |
| 2.5mg/kg MAX-40279-01 | 3.105 | 3.734 | 2.743 | 3.536 | 2.964 | 3.303 | 2.732 | 2.541 | 2.762 | 2.528 |
計算肺臟器係數結果顯示，空白對照組的肺的臟器係數小於模型組，有極顯著差異(P＜0.01)，所有劑量的MAX-40279-01(10 mg/kg、7.5 mg/kg、5 mg/kg和2.5mg/kg)組以及Pirfenidone組中大鼠的肺組織小於模型組，有顯著差異(P＜0.01或P＜0.05)。0.6mg/kg DEX由於大鼠體重較小，所以臟器係數反而比模型組要高，和模型組相比有顯著差異(P＜0.05)。見表13和圖8。
表13 MAX-40279-01對BLM導致肺纖維化大鼠模型肺臟器係數的影響
3.3 化合物MAX-40279-01對博來黴素(BLM)導致大鼠肺纖維化大鼠肺部病理評分的影響
| 大鼠編號 肺臟器係數 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| Vehicle組(空白對照) | 0.005 | 0.005 | 0.005 | 0.006 | 0.006 | 0.007 | 0.006 | 0.005 | 0.006 | 0.006 |
| Model（模型）組 | 0.011 | 0.011 | 0.013 | 0.008 | 0.01 | 0.01 | 0.012 | 0.013 | 0.01 | 0.012 |
| 0.6mg/kg DEX組 | 0.014 | 0.01 | 0.012 | 0.012 | 0.02 | 0.011 | 0.013 | 0.012 | 0.013 | 0.013 |
| 25mg/kg Nintedanib組 | 0.014 | 0.008 | 0.008 | 0.008 | 0.009 | 0.011 | 0.009 | 0.011 | 0.009 | 0.006 |
| 150mg/kg Pirfenidone組 | 0.008 | 0.01 | 0.009 | 0.009 | 0.008 | 0.008 | 0.008 | 0.007 | 0.008 | 0.013 |
| 10mg/kg MAX-40279-01 | 0.007 | 0.009 | 0.007 | 0.008 | 0.009 | 0.006 | 0.007 | 0.006 | 0.007 | 0.008 |
| 7.5mg/kg MAX-40279-01 | 0.006 | 0.008 | 0.008 | 0.006 | 0.007 | 0.007 | 0.007 | 0.007 | 0.008 | 0.006 |
| 5mg/kg MAX-40279-01 | 0.01 | 0.009 | 0.009 | 0.008 | 0.013 | 0.007 | 0.007 | 0.006 | 0.005 | 0.014 |
| 2.5mg/kg MAX-40279-01 | 0.009 | 0.011 | 0.007 | 0.008 | 0.008 | 0.015 | 0.008 | 0.007 | 0.006 | 0.008 |
按照Szapiel評分系統標準進行初步評分，與空白組相比，模型組的動物肺部有彌漫性的發炎浸潤和滲出，大部分受影響面積達50%以上。三個劑量的MAX-40279-01組(10 mg/kg、7.5mg/kg和5mg/kg)以及DEX組和Pirfenidone組病理評分較模型組顯著降低(P＜0.05)； Nintedanib組和2.5mg/kg MAX-40279-01組病理評分較模型組稍有降低，但和模型相比無顯著差異(P＞0.05)。見表14，圖9和圖10。
表14 MAX-40279-01對肺纖維化大鼠模型Szapiel病理評分的影響
3.4 化合物MAX-40279-01對博來黴素(BLM)導致的大鼠肺纖維化肺部masson染色病理片Ashcroft Score的評分
| 大鼠編號 Szapiel評分 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| Vehicle組(空白對照) | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Model(模型)組 | 3 | 2 | 1 | 2 | 3 | 3 | 3 | 3 | 2 | 1 |
| 0.6mg/kg DEX組 | 0 | 2 | 0 | 2 | 2 | 0 | 1 | 0 | 3 | 1 |
| 25mg/kg Nintedanib組 | 3 | 2 | 1 | 1 | 2 | 3 | 0 | 0 | 1 | 3 |
| 150mg/kg Pirfenidone組 | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 | 1 | 3 | 3 | 1 | 3 |
| 10mg/kg MAX-40279-01 | 0 | 0 | 1 | 3 | 2 | 2 | 1 | 0 | 1 | 2 |
| 7.5mg/kg MAX-40279-01 | 0 | 1 | 3 | 2 | 1 | 0 | 1 | 1 | 1 | 2 |
| 5mg/kg MAX-40279-01 | 2 | 1 | 1 | 1 | 0 | 0 | 1 | 1 | 3 | 2 |
| 2.5mg/kg MAX-40279-01 | 3 | 1 | 3 | 1 | 0 | 1 | 2 | 3 | 2 | 0 |
按照Ashcroft Score的標準進行初步評分，模型組的肺部完全閉塞，肺泡幾乎被纖維團塊覆蓋，伴有纖維化腫塊，大部分受影響面積達50%以上，肺泡結構不能辨認。所有劑量的MAX-40279-01(10 mg/kg、7.5 mg/kg、5 mg/kg和2.5mg/kg)組以及DEX組和Pirfenidone組的病理評分較模型組有顯著降低(P＜0.01或P＜0.05)； Nintedanib組病理評分較模型組稍有降低，但和模型相比沒有差異(P＞0.05)。見表15，圖11和圖12。
表15 MAX-40279-01對肺纖維化大鼠模型Ashcroft Score病理評分的影響
3.5 化合物MAX-40279-01對博來黴素(BLM)導致的肺纖維化大鼠肺泡灌洗液中細胞激素的影響
| 大鼠編號 Ashcroft Score | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| Vehicle組(空白對照) | 0 | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 |
| Model(模型)組 | 6 | 5 | 2 | 6 | 6 | 5 | 7 | 8 | 5 | 3 |
| 0.6mg/kg DEX組 | 1 | 3 | 1 | 2 | 3 | 1 | 4 | 2 | 5 | 2 |
| 25mg/kg Nintedanib組 | 6 | 6 | 5 | 2 | 4 | 5 | 3 | 3 | 2 | 5 |
| 150mg/kg Pirfenidone組 | 3 | 2 | 2 | 3 | 2 | 2 | 5 | 5 | 3 | 3 |
| 10mg/kg MAX-40279-01 | 6 | 2 | 3 | 3 | 2 | 3 | 3 | 3 | 4 | 2 |
| 7.5mg/kg MAX-40279-01 | 3 | 2 | 3 | 3 | 2 | 2 | 3 | 3 | 2 | 5 |
| 5mg/kg MAX-40279-01 | 5 | 3 | 2 | 4 | 3 | 3 | 2 | 3 | 3 | 2 |
| 2.5mg/kg MAX-40279-01 | 5 | 3 | 4 | 4 | 3 | 3 | 2 | 4 | 4 | 5 |
大鼠模型組的TNF-α高於空白組，統計上有極顯著差異(P＜0.01)。與模型組相比，三個劑量的MAX-40279-01組(10 mg/kg、7.5 mg/kg和5mg/kg)以及DEX組、Nintedanib組和Pirfenidone組都顯著降低了大鼠的肺泡灌洗液的TNF-α，統計上有顯著差異(P＜0.01或P＜0.05)。見表16和圖13。
大鼠模型組的TGF-β高於空白組，統計上有極顯著差異(P＜0.01)。與模型組相比，三個劑量的MAX-40279-01組(10 mg/kg、7.5 mg/kg和5mg/kg)以及DEX組、Nintedanib組和Pirfenidone組都顯著降低了大鼠的肺泡灌洗液的TGF-β(P＜0.01)。見表16和圖13。
大鼠模型組的IL1-β高於空白組，統計上有極顯著差異(P＜0.01)。與模型組相比，三個劑量的MAX-40279-01組(10 mg/kg、7.5 mg/kg和5mg/kg)以及DEX組顯著降低了大鼠的肺泡灌洗液的IL1-β(P＜0.01或P＜0.05)，而Nintedanib組和Pirfenidone組與模型組相比卻沒有差異(P＞0.05)。見表16和圖13。
大鼠模型組的IFN-γ低於空白組，統計上有極顯著差異(P＜0.01)。與模型組相比，二個劑量的MAX-40279-01組(10 mg/kg和7.5 mg/kg)以及DEX組顯著升高了大鼠的肺泡灌洗液的IFN-γ(P＜0.05)，而Nintedanib組和Pirfenidone組與模型組相比卻沒有差異(P＞0.05)。見表16和圖13。
表16 MAX-40279-01對BLM導致的肺纖維化大鼠模型肺灌洗液細胞激素的影響
3.6 化合物MAX-40279-01對博來黴素(BLM)導致的肺纖維化大鼠肺部羥脯胺酸的影響
| 組別 | 大鼠 編號 細胞 激素(ng/ml) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| Vehicle組(空白對照) | TNF-α | 129.7289 | 115.7051 | 99.8588 | 125.3896 | 109.7880 | 140.1040 | 101.2231 | 99.5240 | 119.7622 | 101.5754 |
| TGF-β | 117.3080 | 132.7242 | 91.9087 | 149.3581 | 160.0006 | 106.2266 | 136.7851 | 92.6749 | 136.4862 | 128.0465 | |
| IL1-β | 45.1694 | 62.5413 | 58.7285 | 59.7422 | 86.8167 | 53.7754 | 49.2029 | 63.4228 | 63.7865 | 55.8431 | |
| IFN-γ | 160.3740 | 142.7665 | 126.4524 | 155.1965 | 160.9590 | 178.6577 | 159.0150 | 159.1693 | 159.0999 | 177.4736 | |
| Model（模型）組 | TNF-α | 172.3870 | 164.0633 | 127.0020 | 162.3348 | 149.2852 | 155.8623 | 192.2595 | 155.9942 | 199.5485 | 164.5363 |
| TGF-β | 142.0528 | 188.3280 | 155.7650 | 170.5093 | 179.7042 | 172.9953 | 181.7717 | 178.1308 | 194.1795 | 172.8049 | |
| IL1-β | 49.4522 | 95.4416 | 52.0950 | 63.5823 | 119.8998 | 164.3195 | 88.4987 | 113.0184 | 202.0641 | 119.2698 | |
| IFN-γ | 101.9421 | 108.5467 | 79.9580 | 95.5831 | 116.7249 | 120.1770 | 117.7959 | 118.7075 | 128.0904 | 118.8399 | |
| 0.6mg/kg DEX組 | TNF-α | 76.2871 | 127.5023 | 123.8451 | 133.6110 | 111.8114 | 100.7760 | 111.5405 | 127.2977 | 110.4052 | 103.1369 |
| TGF-β | 147.8193 | 159.4829 | 151.8221 | 128.6742 | 153.5119 | 143.1558 | 148.8185 | 123.2806 | 158.6962 | 155.3905 | |
| IL1-β | 3.6236 | 41.5311 | 59.6516 | 69.8342 | 67.6988 | 57.2756 | 53.7573 | 106.9905 | 52.0885 | 57.2123 | |
| IFN-γ | 119.0250 | 119.5779 | 129.9366 | 115.3222 | 137.1326 | 126.1259 | 147.5544 | 154.4984 | 140.3224 | 103.7755 | |
| 25mg/kg Nintedanib組 | TNF-α | 88.7293 | 128.8737 | 102.6304 | 131.9371 | 112.0722 | 131.7893 | 159.2919 | 149.8605 | 137.6592 | 96.5693 |
| TGF-β | 121.9967 | 171.6264 | 147.2655 | 144.5640 | 152.1698 | 139.3812 | 165.8143 | 148.0239 | 150.1480 | 161.5520 | |
| IL1-β | 28.5126 | 119.9574 | 77.8532 | 73.3601 | 77.8540 | 58.0479 | 112.2688 | 62.2360 | 58.5570 | 78.8537 | |
| IFN-γ | 92.2381 | 139.8608 | 111.8290 | 112.6441 | 132.8886 | 130.3493 | 138.6330 | 121.2904 | 129.6602 | 103.2226 | |
| 150mg/kg Pirfenidone組 | TNF-α | 111.4079 | 72.0351 | 88.8766 | 144.1635 | 104.4910 | 162.9830 | 171.3386 | 144.2295 | 170.5426 | 129.6288 |
| TGF-β | 144.8346 | 141.7696 | 141.4612 | 143.0095 | 139.6235 | 161.7565 | 155.6737 | 165.1708 | 175.3286 | 148.1324 | |
| IL1-β | 74.5287 | 76.1361 | 96.1670 | 113.2000 | 136.2451 | 129.2430 | 145.2293 | 129.4717 | 94.6004 | 104.9793 | |
| IFN-γ | 112.4089 | 97.6711 | 96.5268 | 141.2571 | 107.3420 | 146.3188 | 158.1600 | 144.4816 | 60.4494 | 113.8540 | |
| 10mg/kg MAX-40279-01 | TNF-α | 100.2538 | 146.3878 | 148.7280 | 119.2989 | 146.9973 | 142.5988 | 119.4838 | 145.0801 | 151.5571 | 74.9493 |
| TGF-β | 120.6421 | 129.5915 | 109.2805 | 159.3020 | 167.5655 | 160.2964 | 158.0008 | 129.3697 | 161.8761 | 140.7107 | |
| IL1-β | 12.7588 | 63.0523 | 51.9332 | 77.5625 | 87.4114 | 66.8849 | 70.1585 | 85.9023 | 62.5597 | 91.9193 | |
| IFN-γ | 115.4624 | 147.4348 | 148.1407 | 170.5103 | 106.1347 | 129.0238 | 128.3681 | 143.6678 | 107.2276 | 132.5363 | |
| 7.5mg/kg MAX-40279-01 | TNF-α | 87.6279 | 99.1087 | 92.6001 | 136.9974 | 136.0399 | 143.2948 | 138.2004 | 131.4232 | 161.6162 | 140.5770 |
| TGF-β | 116.9398 | 145.7440 | 132.7037 | 118.0145 | 109.0115 | 128.8992 | 168.7817 | 114.5624 | 128.8819 | 142.9512 | |
| IL1-β | 5.1302 | 33.8381 | 50.1876 | 63.1307 | 45.3384 | 82.2552 | 85.7813 | 57.8863 | 66.1477 | 65.3770 | |
| IFN-γ | 97.3175 | 112.7213 | 123.0042 | 137.7009 | 134.6795 | 137.5595 | 143.2910 | 126.8484 | 134.6872 | 147.1905 | |
| 5mg/kg MAX-40279-01 | TNF-α | 136.3151 | 91.9880 | 144.2773 | 189.3439 | 126.0809 | 125.4464 | 178.2796 | 130.4657 | 139.2148 | 137.4886 |
| TGF-β | 102.4583 | 139.6660 | 95.9759 | 147.7910 | 99.9566 | 129.1353 | 153.1878 | 125.2427 | 123.5717 | 131.8431 | |
| IL1-β | 49.5347 | 50.6011 | 65.4614 | 64.6670 | 76.2597 | 61.2140 | 58.2637 | 90.4132 | 89.3829 | 69.0868 | |
| IFN-γ | 100.7734 | 90.0444 | 94.3553 | 149.7850 | 117.9900 | 135.7865 | 131.4139 | 80.3425 | 120.1191 | 146.5323 | |
| 2.5mg/kg MAX-40279-01 | TNF-α | 169.2190 | 128.5804 | 134.6526 | 180.4788 | 157.7613 | 121.6093 | 180.7085 | 185.0001 | 128.8260 | 84.5860 |
| TGF-β | 179.9764 | 106.7804 | 136.4169 | 123.6834 | 162.1451 | 155.4755 | 164.9599 | 177.4464 | 151.4319 | 97.7476 | |
| IL1-β | 136.3659 | 34.1294 | 77.3055 | 77.5959 | 57.3483 | 93.2088 | 55.7241 | 55.3818 | 92.3796 | 64.0621 | |
| IFN-γ | 149.8403 | 43.3630 | 102.8704 | 102.0630 | 106.7647 | 98.8295 | 104.6755 | 126.4151 | 112.7303 | 79.4624 |
大鼠模型組的羥脯胺酸高於空白組，統計上有極顯著差異(P＜0.01)。與模型組相比，三個劑量的MAX-40279-01組(10 mg/kg、7.5 mg/kg和5mg/kg)以及DEX組、Nintedanib組和Pirfenidone組都顯著降低了大鼠肺組織羥脯胺酸含量(P＜0.01)。見表17和圖14。
表17 MAX-40279-01對BLM導致的大鼠肺纖維化羥脯胺酸的影響
4 、結論
| 羥脯胺酸含量(ng/ml) 大鼠編號 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| Vehicle組(空白對照) | 83.83341 | 82.10610 | 85.90514 | 84.08306 | 74.65617 | 71.93884 | 86.68261 | 74.58163 | 84.73479 | 77.86021 |
| Model(模型)組 | 115.92230 | 150.91320 | 123.22230 | 135.85820 | 124.35160 | 121.15460 | 116.05820 | 113.64140 | 139.09650 | 137.86550 |
| 0.6mg/kg DEX組 | 97.74634 | 86.13976 | 79.40320 | 90.54974 | 104.94330 | 73.36314 | 82.46923 | 76.69875 | 102.03610 | 79.32590 |
| 25mg/kg Nintedanib組 | 92.87510 | 91.03769 | 66.28614 | 103.40030 | 70.91509 | 95.08300 | 94.32393 | 100.56390 | 88.27436 | 78.59628 |
| 150mg/kg Pirfenidone組 | 93.40936 | 99.88216 | 92.31814 | 93.16769 | 77.41151 | 96.80846 | 90.59573 | 75.58331 | 114.98840 | 72.68105 |
| 10mg/kg MAX-40279-01 | 88.43906 | 99.15223 | 83.57027 | 88.22406 | 81.47093 | 100.65070 | 88.23203 | 83.69846 | 72.71448 | 100.59220 |
| 7.5mg/kg MAX-40279-01 | 96.31530 | 88.16917 | 96.56342 | 92.44143 | 98.38734 | 88.93928 | 86.80774 | 94.16230 | 78.58095 | 83.47611 |
| 5mg/kg MAX-40279-01 | 90.48349 | 105.13650 | 84.72620 | 94.09206 | 82.73084 | 81.41389 | 77.64522 | 70.07260 | 85.75915 | 84.48268 |
| 2.5mg/kg MAX-40279-01 | 117.74900 | 140.99220 | 125.89510 | 104.00630 | 112.30790 | 92.15160 | 97.68745 | 84.98137 | 135.06470 | 131.05620 |
化合物MAX-40279-01能夠很好的改善大鼠經博來黴素(BLM)模型建立誘發的體重降低；降低模型大鼠的肺臟器係數和肺重；很好的改善模型組的動物肺部顯微結構，降低纖維化腫塊；降低模型建立大鼠肺部TNF-α、TGF-β、IL1-β，升高IFN-γ的含量；降低了模型大鼠肺部的羥脯胺酸的含量；這些結果表明MAX-40279-01對肺纖維化有治療作用，具有比Nintedanib和Pirfenidone更優治療效果。
雖然以上描述了本發明的具體實施方式，但是本領域的技術人員應當理解，這些是舉例說明，在不背離本發明的原理和實質的前提下，可以對這些實施方式做出多種變更或修改。因此，本發明的保護範圍由所附申請專利範圍限定。
圖1為化合物MAX-40279-01對博來黴素(BLM)導致的肺纖維化小鼠模型體重的影響，與模型組比較，** P＜0.01、 * P＜0.05。
圖2為化合物MAX-40279-01對博來黴素(BLM)導致的肺纖維化小鼠模型肺重及臟器係數的影響，與模型組比較，** P＜0.01、 * P＜0.05。
圖3為化合物MAX-40279-01對博來黴素(BLM)導致的肺纖維化小鼠模型病理評分的影響，與模型組比較，** P＜0.01、 * P＜0.05。
圖4為化合物MAX-40279-01對博來黴素(BLM)導致的肺纖維化小鼠模型Masson染色評分的影響(Masson’s, 200 X)。
圖5為化合物MAX-40279-01對博來黴素(BLM)導致的肺纖維化小鼠模型肺灌洗液細胞激素(TNF-α、IL1-β、TGF-β、IFN-γ)的影響，與模型組比較，** P＜0.01、 * P＜0.05。
圖6為化合物MAX-40279-01對博來黴素(BLM)導致的肺纖維化小鼠模型肺羥脯胺酸的影響，與模型組比較，** P＜0.01、 * P＜0.05。
圖7為化合物MAX-40279-01對博來黴素(BLM)導致的肺纖維化大鼠模型體重的影響，與模型組比較，** P＜0.01、 * P＜0.05。
圖8為化合物MAX-40279-01對博來黴素(BLM)導致的肺纖維化大鼠模型肺重及臟器係數的影響，與模型組比較，** P＜0.01、 * P＜0.05。
圖9為化合物MAX-40279-01對博來黴素(BLM)導致的肺纖維化大鼠肺組織結構改變的影響(H.E.染色，200X)。
圖10為化合物MAX-40279-01對博來黴素(BLM)導致的肺纖維化大鼠模型Szapiel病理評分的影響，與模型組比較，** P＜0.01、 * P＜0.05。
圖11為化合物MAX-40279-01對博來黴素(BLM)導致的肺纖維化大鼠模型Masson染色評分的影響(Masson’s, 200 X)。
圖12為化合物MAX-40279-01對博來黴素(BLM)導致的肺纖維化大鼠模型病理評分的影響，與模型組比較，** P＜0.01、 * P＜0.05。
圖13為化合物MAX-40279-01對博來黴素(BLM)導致的肺纖維化大鼠模型肺灌洗液細胞激素(TNF-α、IL1-β、TGF-β、IFN-γ)的影響，與模型組比較，** P＜0.01、 * P＜0.05。
圖14為化合物MAX-40279-01對博來黴素(BLM)導致的肺纖維化大鼠模型肺羥脯胺酸的影響，與模型組比較，** P＜0.01、 * P＜0.05。
Claims (10)
- 一種如式 I所示的化合物或其可藥用鹽或藥物組成物在製備治療或預防纖維化疾病的藥物中的用途，所述的藥物組成物含如式 I所示的化合物或其可藥用鹽和至少一種藥學上可接受的載劑， 。
- 如請求項1所述的用途，其特徵在於，所述的可藥用鹽選自富馬酸鹽、己二酸鹽、磷酸鹽、酒石酸鹽、馬來酸鹽、鹽酸鹽、檸檬酸鹽、硫酸鹽、甲磺酸鹽、苯磺酸鹽以及對甲苯磺酸鹽。
- 如請求項2所述的用途，其特徵在於，所述的可藥用鹽為富馬酸鹽。
- 如請求項2或3所述的用途，其特徵在於，所述的如式 I所示的化合物的可藥用鹽為如下式 I-a所示的化合物， 。
- 如請求項1-4中任一項所述的用途，其特徵在於，所述的用途滿足以下條件中的一種或多種： (1)所述的纖維化疾病為肺纖維化、肝硬化、硬皮病或腎纖維化； (2)所述的藥物中，所述的如式 I所示的化合物或其可藥用鹽的劑量為10-200mg； (3)所述的如式 I所示的化合物或其可藥用鹽或藥物組成物在人類受試者中的給藥頻率為一日一次、一日兩次、一日三次； (4)所述的藥物組成物為膠囊、片劑、顆粒劑、注射劑、吸入劑；和 (5)所述的如式 I所示的化合物或其可藥用鹽或藥物組成物的給藥方式為口服、胃腸外給藥、經皮給藥，所述胃腸外給藥包括靜脈注射、皮下注射、肌肉注射。
- 如請求項5所述的用途，其特徵在於，所述的藥物中，所述的如式 I所示的化合物或其可藥用鹽的劑量為20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg、140mg、145mg、150mg、155mg或160mg。
- 如請求項1-4中任一項所述的用途，其特徵在於，所述的用途滿足以下條件中的一種或多種： (1)所述的纖維化疾病為特發性肺纖維化疾病； (2)所述的如式 I所示的化合物或其可藥用鹽或藥物組成物在人類受試者中的給藥頻率為一日兩次； (3)所述的藥物組成物為膠囊、片劑、顆粒劑、注射劑；和 (4)所述的如式 I所示的化合物或其可藥用鹽或藥物組成物的給藥方式為口服。
- 如請求項1-4中任一項所述的用途，其特徵在於，所述的用途滿足以下條件中的一種或兩種： (1)所述的纖維化疾病為特發性間質性肺炎引起的肺纖維化疾病；和 (2)所述的纖維化疾病為2019冠狀病毒病導致的肺纖維化疾病。
- 一種如式 I所示的化合物或其可藥用鹽或藥物組成物在製備治療或預防2019冠狀病毒病的藥物中的用途；所述的藥物組成物含如式 I所示的化合物或其可藥用鹽和至少一種藥學上可接受的載劑， 。
- 如請求項9所述的用途，其特徵在於，其滿足以下條件中的一種或多種： (1)所述的2019冠狀病毒病為2019冠狀病毒病導致的肺纖維化疾病； (2)所述的如式 I所示的化合物或其可藥用鹽如請求項2-4中任一項所述； (3)所述的藥物組成物如請求項5或7所述； (4)所述用途中如式 I所示的化合物或其可藥用鹽的劑量如請求項5或6所述； (5)所述用途中如式 I所示的化合物或其可藥用鹽或藥物組成物的給藥頻率如請求項5或7所述；和 (6)所述用途中如式 I所示的化合物或其可藥用鹽或藥物組成物的給藥方式如請求項5或7所述。
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