CN108467890A

CN108467890A - Vat1基因及vat1基因的干扰物的应用和应用vat1基因的产品

Info

Publication number: CN108467890A
Application number: CN201810413901.1A
Authority: CN
Inventors: 王江飞; 杨沛; 佟学志
Original assignee: Beijing Tiantan Hospital
Current assignee: Beijing Tiantan Hospital
Priority date: 2018-05-02
Filing date: 2018-05-02
Publication date: 2018-08-31

Abstract

本发明提供了一种VAT1基因及VAT1基因的干扰物的应用和应用VAT1基因的产品，涉及生物医药工程技术领域，本发明提供的VAT1基因通过实验发现在脑胶质瘤患者的病变区域中表达急剧上升，通过对VAT1基因进行特异性检测能够达到诊断脑胶质瘤的目的。同时，VAT1的干扰物具有抑制VAT1基因表达的作用，将VAT1基因的干扰物作为药物，能够起到预防和/或治疗脑胶质瘤的作用。因此，VAT1基因可以作为一种新的生物标志物，应用于脑胶质瘤的诊断；而与之相对于的VAT1基因的干扰物，可以作为一种新型的药物，对脑胶质瘤具有潜在的预防和/或治疗价值。

Description

VAT1基因及VAT1基因的干扰物的应用和应用VAT1基因的产品

技术领域

本发明涉及生物医药工程技术领域，尤其是涉及一种VAT1基因及VAT1基因的干扰物的应用和应用VAT1基因的产品。

背景技术

脑胶质瘤是由于大脑和脊髓胶质细胞癌变所产生的、最常见的原发性颅脑肿瘤。年发病率约为3-8人/10万人口。如同其他肿瘤(疾病)一样，胶质瘤也是由于先天的遗传高危因素和环境的致癌因素相互作用所导致的。一些已知的遗传疾病，例如神经纤维瘤病(I型)以及结核性硬化疾病等，为脑胶质瘤的遗传易感因素。

脑胶质瘤的诊断在脑胶质瘤的治疗中起着至关重要的作用。目前，常用的诊断方式包括核磁共振、组织活检等。

通过核磁共振成像获取肿瘤信息，包括肿瘤的局部信息、大小和分子水平的生物化学成分等，为肿瘤手术做术前准备。但由于核磁共振与手术有一定的时间差，手术时，肿瘤的组织、轮廓和位置会有一定的偏移，手术期间肿瘤的实际情况会与核磁共振成像的肿瘤信息有一定的偏差。组织活检是对脑组织做活检，活检过程基于组织结构的可视化和活检技术的形态，活检结果强烈依赖医生的经验。在手术过程中，肿瘤切除后，取未切除的脑组织做活检，医生等待活检结果，如果活检结果为正常脑组织则手术结束，如果活检结果为病变脑组织则继续切除部分脑组织，通常通过组织活检确定病变组织是否被切除干净。但是，等待活检结果的时间较长，增长了整个手术过程的时间，病人在等待过程中也有一定的风险。

同样，目前对于脑胶质瘤的治疗，包括手术、放疗、化疗等手段。然而，无论是哪种手段对患者的身体都会造成巨大的损伤及长期的副作用。并且，具体的治疗，还需要综合考虑患者的功能状态、对治疗的预期结果以及肿瘤所处的脑区部位、恶性程度级别等多种因素，进行综合考虑判断，过程繁琐，费时费力。

因此，无论是对脑胶质瘤的诊断还是治疗，目前都尚缺乏一种安全、有效、准确度高且缩短治疗时间的方式。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供VAT1基因在制备用于诊断脑胶质瘤的产品中的应用，以缓解现有技术中存在的缺少快速、有效，且准确度高的诊断脑胶质瘤的产品的技术问题。

本发明的第二个目的在于提供一种用于诊断脑胶质瘤的试剂，本发明的第三个目的在于提供一种用于诊断脑胶质瘤的试剂盒，以缓解现有技术中存在的缺少能够快速准确地诊断脑胶质瘤的产品的技术问题。

本发明的第四个目的在于提供VAT1基因的干扰物在制备预防和/或治疗脑胶质瘤的药物中的应用，以缓解现有技术中存在的缺乏一种安全、有效、快速、副作用小、治疗过程简单的治疗脑胶质瘤的手段的技术问题。

本发明提供了VAT1基因在制备用于诊断脑胶质瘤的产品中的应用。

进一步地，所述产品为试剂或试剂盒。

本发明还提供了一种用于诊断脑胶质瘤的试剂，所述试剂包括用于特异性检测VAT1基因的引物。

进一步地，所述用于特异性检测VAT1基因的引物包括VAT1基因的上游引物和VAT1基因的下游引物；

所述VAT1基因的上游引物具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述VAT1基因的下游引物具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一种用于诊断脑胶质瘤的试剂盒，所述试剂盒包括用于特异性检测VAT1基因的引物或上述的用于诊断脑胶质瘤的试剂；

其中，用于特异性检测VAT1基因的引物包括具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的VAT1基因的上游引物和具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的VAT1基因的下游引物。

另外，本发明还提供了VAT1基因的干扰物在制备预防和/或治疗脑胶质瘤的药物中的应用。

进一步地，所述VAT1基因的干扰物包括miRNA。

进一步地，所述VAT1基因的干扰物包括miR-218和/或miR-218的模拟物。

进一步地，所述miR-218的模拟物具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

进一步地，所述miR-218和/或miR-218的模拟物在制备通过抑制VAT1基因的表达来预防和/或治疗脑胶质瘤的药物中的应用。

本发明提供的VAT1基因通过实验发现在脑胶质瘤患者的病变区域中表达急剧上升，通过对VAT1基因进行特异性检测能够达到诊断脑胶质瘤的目的。同时，VAT1的干扰物具有抑制VAT1基因表达的作用，将VAT1基因的干扰物作为药物，能够起到预防和/或治疗脑胶质瘤的作用。因此，VAT1基因可以作为一种新的生物标志物，应用于脑胶质瘤的诊断；而与之相对于的VAT1基因的干扰物，可以作为一种新型的药物，对脑胶质瘤具有潜在的预防和/或治疗价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1提供的免疫组化检测的结果图；

图2为本发明实施例1提供的Western Blot检测蛋白表达的结果图；

图3为本发明实施例1提供的Western Blot检测蛋白表达的条带图；

图4为本发明实施例2提供的qPCR检测mRNA表达的结果图；

图5为本发明实施例2提供的Western Blot检测蛋白表达的结果图；

图6为本发明实施例3提供的CCK8检测的结果图；

图7为本发明实施例3提供的细胞侵袭检测镜检结果图；

图8为本发明实施例3提供的细胞侵袭检测结果的条带图；

图9为本发明实施例3提供的细胞迁移检测镜检结果图；

图10为本发明实施例3提供的细胞迁移检测结果的条带图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供的VAT1基因通过实验发现在脑胶质瘤患者的病变区域中表达急剧上升。因此，VAT1基因可以作为一种新的生物标志物，应用于脑胶质瘤的诊断，通过对VAT1基因进行特异性检测能够达到诊断脑胶质瘤的目的。

在本发明的一个实施方式中，VAT1基因具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。需要说明的是，VAT1基因可以为：与SEQ ID NO.4所示序列完全相同的序列，或者含有SEQ IDNO.4所示序列的序列，或者SEQ ID NO.4所示序列的生物活性功能片段，或者SEQ ID NO.4所示序列的变体。凡是具备SEQ ID NO.4所示序列功能的序列，都应当理解为本发明的保护范围，而不应当仅理解为与SEQ ID NO.4所示序列完全相同的序列。

在一个优选的实施方式中，产品为试剂或试剂盒。

本发明提供的一种用于诊断脑胶质瘤的试剂，包括用于特异性检测VAT1基因的引物。

本发明提供的一种用于诊断脑胶质瘤的试剂盒，包括用于特异性检测VAT1基因的引物或上述的用于诊断脑胶质瘤的试剂。

在一个优选的实施方式中，上述用于特异性检测VAT1基因的引物包括VAT1基因的上游引物和VAT1基因的下游引物：

名称	序号	序列
			VAT1-F	SEQ ID NO.1	5’-TGCCGTACAGTGGAGAATGT-3’
VAT1-R	SEQ ID NO.2	5’-TAGGTGACGACTTTGCCCAT-3’

VAT1的干扰物具有抑制VAT1基因表达的作用，将VAT1基因的干扰物作为一种新型的药物，对脑胶质瘤具有潜在的预防和/或治疗价值。

在一个优选的实施方式中，VAT1基因的干扰物包括miRNA。

microRNA(miRNA)是一类长度在22nt左右的内源非编码小RNA，广泛存在于动物、植物、病毒等多种有机体中。它主要通过与靶基因的3'UTR的完全或不完全配对，降解靶标基因mRNA或抑制其翻译，从而参与调控机体发育、细胞凋亡、增殖及分化等生命活动。

在一个优选的实施方式中，VAT1基因的干扰物包括miR-218和/或miR-218的模拟物。

miR-218的模拟物(mimics或者agomir)为人工合成的具有天然miR-218序列的核苷酸片段，其具有天然miR-218的所有生物活性功能。添加miR-218的模拟物能够起到过表达miR-218的效果。

在一个优选的实施方式中，miR-218的模拟物具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。需要说明的是，miR-218的模拟物可以为：与SEQ ID NO.3所示序列完全相同的序列，或者含有SEQ ID NO.3所示序列的序列，或者SEQ ID NO.3所示序列的生物活性功能片段，或者SEQ ID NO.3所示序列的变体。凡是具备SEQ ID NO.3所示序列功能的序列，都应当理解为本发明的保护范围，而不应当仅理解为与SEQ ID NO.3所示序列完全相同的序列。

在一个优选的实施方式中，miR-218和/或miR-218的模拟物在制备通过抑制VAT1基因的表达来预防和/或治疗脑胶质瘤的药物中的应用。

本发明通过实验发现，在脑胶质瘤的病变区域VAT1基因的表达较正常细胞明显升高，通过抑制VAT1基因的表达能够有效抑制脑胶质瘤细胞的分化和迁移。而miR-218作为VAT1基因的抑制剂能够抑制VAT1基因的表达，从而制脑胶质瘤细胞的分化和迁移。因此，将miR-218和/或miR-218的模拟物制备为药物，能够通过抑制VAT1基因的表达达到预防和/或治疗脑胶质瘤的目的。

为了有助于更清楚的理解本发明的内容，现结合具体的实施例详细介绍如下。

实施例1 VAT1基因的表达量

本实施例所用的正常(非胶质瘤)脑组织和脑胶质瘤临床样本由杭州百替生物技术有限公司实验室提供。

(一)免疫组化检测

(a)将正常脑组织和脑胶质瘤临床样本随机分为6组，分别制备组织切片，于37℃烤过夜；

(b)二甲苯1，2，3各10min，乙醇100％，95％，90％，80％，70％，50％各2min，蒸馏水1min；

(c)PBS洗3次，每次5min；

(d)抗原修复(高火至沸，转为低火20min)，自然冷却；

(e)PBS洗3次，每次5min；

(f)切片放入3％H₂O₂溶液，室温孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶；

(g)PBS洗3次，每次5min，甩干后5％BSA封闭20min；

(h)去除BSA液，每张切片加入50μL稀释的一抗覆盖组织(1：100)，4℃过夜；

(i)PBS洗3次，每次5min；

(j)去除PBS液，每张切片加50-100μL相应种属的二抗，室温孵育50min；

(k)PBS洗3次，每次5min；

(l)去除PBS液，每张切片加50-100μL新鲜配制DAB溶液，显微镜控制显色，用蒸馏水冲洗；

(m)苏木素染色25s，用自来水流水冲洗3-5min返蓝；

(n)用蒸馏水洗1min，然后50％，70％，80％，90％，100％浸泡1min，二甲苯1，2浸泡几分钟，晾干，滴加中性树胶，封片。

结果如图1所示，其中，Control表示正常(非胶质瘤)脑组织；Glioma表示胶质瘤组织。从图中可以看出VAT1蛋白主要分布在细胞质。并且，与正常(非胶质瘤)脑组织比较，胶质瘤组织中VAT1蛋白表达总体来讲显著增加。说明通过对脑胶质瘤中VAT1基因进行特异性检测能够达到诊断脑胶质瘤的目的。

(二)Western Blot检测

1、实体组织蛋白提取

(a)在每1mL冷Lysis Buffer加入5μL磷酸酶抑制剂，1μL蛋白酶抑制剂和5μL100mM PMSF，混匀。冰上保存数分钟待用；

(b)每100mg固体组织置于培养皿中，手术剪剪碎成3mm×3mm左右的小块，加入0.5-1mL冷Lysis Buffer，玻璃匀浆器上下手动匀浆15次，注意低温操作；

(c)取组织匀浆液转移到1.5mL预冷的离心管，离心12,000g，4℃离心5min；

(d)取上清转移至新的预冷的离心管中，即为组织全蛋白提取物，分装保存于-70℃备用，避免反复冻融。

2、蛋白浓度测定

(a)将蛋白样品进行适当稀释，样品各取2μL，与PBS 18μL混合进行稀释，即测试样品稀释10倍。

(b)将BSA标准品进行稀释，制成蛋白浓度为1，0.8，0.6，0.4，0.2标准蛋白。

(c)将PBS稀释过的蛋白样品、稀释过的标准蛋白分别加入96孔板内，标准品各设2个平行孔，待测样品设3个平行孔，每孔加入体积20μL。加入PBS的2个平行孔为空白对照。

(d)按50:1比例将BCA试剂盒中A液和B液进行混合，将混合液加入96孔板内，每孔加入200μL，注意不要产生气泡，以免影响反应。

(e)37℃避光孵育30min。

(f)用DG-3022A酶标仪测定OD568。

(g)根据标准蛋白浓度和相应的OD值计算直线回归方程，根据蛋白样品OD值，利用回归方程计算出样品蛋白浓度。

3、蛋白变性

将提取的蛋白上清与5×蛋白上样缓冲液，放入沸水中进行沸水浴10min，检查样品是否透亮然后用移液枪吸取看是否粘稠，若不透亮或粘稠则需延长煮样时间。变性完后冷却至室温再放入-20℃保存。

4、电泳

将制备好的胶固定到电泳槽上，储液池中倒入电泳液。用微量加样器将制备好的蛋白样品和Marker加入上样孔，各样品总蛋白量为40μg。加样后先恒压80V电泳至溴酚蓝指示剂在浓缩胶与分离胶交界处成线状，改为恒压120V至溴酚蓝到凝胶底部，此过程约用时1.5h。

取出凝胶根据Marker切下目的条带，用蒸馏水冲洗，剪与PAGE凝胶相同大小的PVDF膜和滤纸，PVDF膜用甲醇浸泡数秒后和滤纸一同浸泡于电转缓冲液中。按照黑色板-纤维垫-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-纤维垫-白色板依次放好，夹紧板后放入转膜仪内，黑色板的一面对照黑色负极。在转膜槽中加满电转液开始转膜。

用含5％脱脂奶粉的TBST(封闭液)浸泡PVDF膜，室温摇床封闭2h。

用封闭液稀释相应的一抗，使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4℃孵育过夜。一抗稀释比例：GADPH：1:1000，VAT1：1:800。

TBST充分洗涤PVDF膜5-6次，5min/次。一个皿中最多放3张膜，洗膜过程中注意膜是否贴到皿壁或膜是否重叠到一起。

用封闭液稀释相应的HRP标记二抗——1:50000稀释，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，37℃摇床孵育2h。

TBST充分洗涤PVDF膜5-6次，5min/次。

将ECL试剂中增强液与稳定的过氧化物酶溶液按1:1比例混匀，滴加工作液于PVDF膜上，反应数分钟待荧光带明显后，用滤纸吸去多余的底物液，覆上保鲜膜，X光胶片压片后依次放入显影液显影、定影液定影，冲洗胶片。

结果如图2和图3所示，其中，Control表示正常(非胶质瘤)脑组织；Glioma表示胶质瘤组织。从图中可以看出与正常(非胶质瘤)脑组织比较，胶质瘤组织中VAT1蛋白表达显著增加。结果提示，VAT1蛋白在胶质瘤组织中高表达。同样说明通过对脑胶质瘤中VAT1基因进行特异性检测能够达到诊断脑胶质瘤的目的。

实施例2 miR-218的模拟物对VAT1基因的抑制实验

本实施例所用的胶质瘤细胞LN229购自拜力。miR-218的模拟物为序列为：5’-UUGUGCUUGAUCUAACCAUGUAUGGUUAGAUCAAGCACAA UU-3’(SEQ ID NO.3)的小RNA分子。同时，设置miR-218的模拟物的对照序列，即不具有miR-218功能的小RNA分子，序列为：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTTACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’(SEQ I D NO.5)。

将LN229细胞转染miR-218的模拟物，得到的细胞命名为LN229+mi R-218mimics，将LN229细胞转染miR-218的模拟物的对照序列，命名为LN229细胞+NC。

(一)qPCR检测

1、Trizol法提取RNA

(a)加入1mL Trizol试剂，用枪吹打混匀，移至无RNase的1.5mL EP管中，裂解10min。

(b)加入200μL氯仿，剧烈颠倒混匀数次，室温放置5min。

(c)4℃，12000rpm，离心15min，可见分成上(RNA)中(蛋白)下(DNA)三相。

(d)转移上层水相(约400μL)于另一新1.5mL EP管中，加入400μL异丙醇，混匀后室温静置10min。

(e)4℃，12000rpm，离心10min，管底可见白色的RNA沉淀。

(f)弃上清，加入无RNase的75％乙醇1mL，涡旋混匀后，4℃，10000rpm，离心5min。

(g)重复步骤(f)一次。

(h)弃上清，空气中干燥RNA沉淀5-10min，将沉淀溶于20μL D EPC水中。

(i)取溶解后的RNA1μL用DEPC水稀释200倍后，用紫外分光光度计测定OD260、OD280以及OD260/OD280值，计算RNA的纯度和浓度。

(j)根据OD260/OD280比值，估测RNA质量，比值在1.8-2.0之间满足实验要求。根据吸光光度值按下列公式计算样品RNA的浓度：总RN A浓度(μg/μL)＝OD260×40×200×10^-3。将总RNA放于-80℃冰箱内保存以备用。

2、逆转录成cDNA

逆转录反应体系：

反应条件：25℃5min，50℃15min，85℃5min，4℃10min。

3、实时荧光定量PCR检测

cDNA做2倍稀释。

反应体系：

反应条件：50℃2min，95℃10min；95℃30sec，60℃30s ec，40cycles。

绘制溶解曲线，最终数据以2^-△△Ct进行分析。

4、引物

检测结果如图4所示，结果可见，与LN229+NC组相比，经过miR-218mimics转染后，LN229细胞中VAT1mRNA表达显著降低。说明miR-218mimics能够有效抑制VAT1基因的表达。

(二)Western Blot检测

应用本发明实施例1提供的Western Blot检测的方法，对LN229+miR-218mimics和LN229细胞+NC进行检测，结果如图5所示。结果可见，与LN229+NC组相比，经过miR-218mimics转染后，LN229细胞中VAT1蛋白表达明显降低。说明miR-218mimics能够有效抑制VAT1蛋白的表达。

实施例3 miR-218的模拟物通过抑制VAT1基因抑制胃癌细胞增殖的实验

本实施例应用本发明实施例2提供的细胞模型：将LN229细胞转染miR-218的模拟物，得到的细胞命名为LN229+miR-218mimics，将LN229细胞转染miR-218的模拟物的对照序列，命名为LN229细胞+NC。

(一)CCK8检测

(a)细胞转染48h后，向每孔加入10μL CCK-8反应液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数)。

(b)将培养板在培养箱内孵育2h。

(c)酶标仪测定各孔吸光值OD 450。

结果如图6所示，结果可见，与LN229+NC组相比，经过miR-218mimics转染后，LN229细胞OD值显著降低，说明细胞增殖降低，提示miR-218高表达能通过抑制VAT1的表达抑制脑胶质瘤细胞的增殖。

(二)Transwell检测

1、细胞侵袭检测

(a)0.25％胰酶分别消化收集细胞，1000rpm，5min离心，去上清，PBS润洗两次，清洗掉残余血清；

(b)无血清DMEM培养基重悬细胞，细胞计数板计数，用无血清DMEM培养基稀释细胞浓度至5×10⁵cells/mL，备用；

(c)在24孔板中放入transwell小室，在transwell小室上室底部中央垂直加入100μL终浓度为1mg/mL的Matrigel。等Matrigel干成胶状后，在transwell下室加入800μL含10％FBS的DMEM培养基(含双抗)，在transwell上室分别接入200μL各组细胞悬液，37℃，5％CO₂培养箱培养24h；

(d)取出transwell，用PBS小心清洗小室一遍，用干净的棉球将上室一侧的未迁移的细胞擦干净，用10％甲醇溶液固定细胞30min；

(e)小心切下膜，在膜上滴一滴5％结晶紫染液，室温中放置20min，PBS清洗后显微镜下观察拍照。

结果如图7和图8所示，结果可见，与LN229+NC组相比，经过miR-218mimics处理后，细胞侵袭能力减弱。说明miR-218的模拟物能够通过降低VAT1的表达显著抑制脑胶质瘤细胞的侵袭能力。

2、细胞迁移检测

(b)无血清DMEM培养基重悬细胞，细胞计数板计数，用无血清DMEM培养基稀释细胞浓度至5×10⁵cells/mL，备用。

(c)在24孔板中预先加入800μL含10％FBS的DMEM培养基(含双抗)，并放入transwell小室，1h后在transwell上室分别接入200μL各组细胞悬液，37℃，5％CO₂培养箱培养24h；

(d)取出transwell，用PBS小心清洗小室一遍，用干净的棉球将上室一侧的未迁移的细胞擦干净，用10％甲醇溶液固定细胞30min。

结果如图9和图10所示，结果可见，与LN229+NC组相比，经过miR-218mimics处理后，细胞迁移能力减弱。说明miR-218的模拟物能够通过降低VAT1的表达显著抑制脑胶质瘤细胞的迁移能力。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 首都医科大学附属北京天坛医院

<120> VAT1基因及VAT1基因的干扰物的应用和应用VAT1基因的产品

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgccgtacag tggagaatgt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

taggtgacga ctttgcccat 20

<210> 3

<211> 42

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 3

uugugcuuga ucuaaccaug uaugguuaga ucaagcacaa uu 42

<210> 4

<211> 7838

<212> DNA

<213> 人

<400> 4

ctcgcccggc gccccgcccc tcccgctgga tcccgcagcc gcggctcttc ccgacgcgtt 60

ccgccttccc cagctgtgca ctctccatcc agctgtgcgc tctcgtcggg agtcccagcc 120

atgtccgacg agagagaggt agccgaggca gcgaccgggg aagacgcctc ttcgccgcct 180

ccgaaaaccg aggcagcgag cgacccccag catcccgcgg cctccgaagg ggccgccgcc 240

gccgccgcct cgccgccact gctgcgctgc ctagtgctca ccggctttgg aggctacgac 300

aaggtgaagc tgcagagccg gccggcagcg cccccggccc ctgggcccgg ccagctgacg 360

ctgcgtctgc gggcctgcgg gctcaacttc gcagacctca tggctaggca ggggctgtac 420

gaccgtctcc cgcctctgcc tgtcactccg ggcatggagg gcgcgggtgt tgtgatcgca 480

gtgggcgagg gagtcagcga ccgcaaggtg agcgggttgc gtagggcagg gcagggctgc 540

gcaggccact gggcagtggg gcacgagtgg gcgagcgccg ggggtgtggc agggcgggag 600

aaactggcgc ggacctgggt gcacgagcgt ggaaagcgta gccaaggaac ttgtgtttgg 660

gggctcctgg agagcggcat ttatgtgggg aggggagacg aaattatcgc cccttcccca 720

accattttta gttgtggccg ccgcccagaa gctgtgctgg tgggggggaa aacaataagg 780

tgcccatgcg catgcgcaca accacactac cgtccccacc cccccccccc ccccccatta 840

aaaccacacc tgtaccccta cccaccaaac actctctggg taattgtggt ctgtgactat 900

gagtgacggt tagtgccccc tttccccgag ggagcttgag gggctatgtc gtcggggttg 960

ggcgggggca cagcggccgt gccagagtcc tggtcacatg cagccccgtg gtctgtgggg 1020

gtgtgaggcg gcccctccca aagcaaggcc aaagagacga gacacgccca tcacggagga 1080

gagagagcct ttgctacccc accgccacca gccttacacc gccgatctga ttttggggtg 1140

ggggaggcgg gattgggtca tccgatcttt gtcttgggct ctgtgtctcc cgtgactgca 1200

gtatctcctc ctcctgtgac tcagccctca gccttcgggc cacgacccgg ggctgccctt 1260

gggaatgcct ggggcgggga gtggaagggg ggacccacct ctgccttcct cctgcagagg 1320

acccccactt cagaaacccc agtgccaggg gtttggactg gaacggagag gtgcggcgcc 1380

ttgaactggt tggccaagtc tgcaggcctg tttctccttc tcatttatca ttaatcttgg 1440

ccacaaccct ggacaccaga gagctcaaaa tgatcagctt tttgagagac ctgggatgag 1500

gcctcagcac gccatttgtt tagaggtttc tttttttttt ctttttcttt tttttttttt 1560

ttttttttag acggagtttc gctcttgttg cccaggctgg agtgcaatgg cgcgatctcg 1620

gctcaccgca acctctgcct cccgggttca agcgattctc ctgcctcagc ctctcgagta 1680

gctgggatta caggcatgcg ccaccatgcc tggctaattt tgtattttag tagagatggg 1740

tttctccatg tcggtcagtc tggtctcgaa ctcccgacct caggtgatct gcccacctcg 1800

gcctccctaa gtgctggggt tacagacata agccactgcg cttggccagg agtttccttt 1860

ttaaatcaga cccctcaatg agaggcccca cagatgcagc ctcttgcaga cctgccagcc 1920

caattctgga gccaggtttg ttggattcat cctgtatgca aacagcttct ccttaaggct 1980

ttcctctgaa ttcagctctg gccccaccct caaactgact tctaaatgat cccactcttg 2040

agcaggcgtc taagaggaat attttcggga ggtagttgta gttcatgtta ctgctgaagg 2100

ccacccacct cacctcccct ccatacactt tccgcctggt aaatacagga tatcctgtcc 2160

agggcaagaa tctgatgtaa gagcctggat tctgcgggga gggcccttcc ctctctctcc 2220

ctcctcctcc ttcctggtgt ctgggttggg gaggggtcat ggccctgatt tggatggcct 2280

gagggttagc atgagccagg gtaagtgaga cttgttctgg gtcaaatctg ggactggcca 2340

tgaccctaaa tgaccaatgc actcctcgca gctctcctgg gttgttctgt atctgctagt 2400

cctgagtccc tgggtggagg gcttccgttc ttgttctcca gacctcatct caggccagaa 2460

cttggaagga aagaccccag catgccctca gttctcgtat tcagtggagt gtgggggctt 2520

gaggacatga aaaagggcgt aagtggcagt cccatccccc ttccccatgg accctaactc 2580

ttgttaatat acagaattcc catcattcct ggcagggatc aagacagacc cagattgtcc 2640

cagaacagca cccacacctc cctcttcatg ctcttcagag agcgcagaga agtcttttct 2700

cctgacgctc cctccttttc cctgcccttc ccttgacccc acttgctaag ctggagagaa 2760

aggttctgtt atctttgtcc cctttccctc ctgcacagag gctctcgtgg gggtgggggg 2820

gaagcctttt actgctgcgt aggcctctgt agcccttctt gtctgttgcc cctcctgcac 2880

catctctgag tgaagatgtt ttctgggctc ccagtgctgg ctcaaacaca cttctcccga 2940

ggtgaccaca ccctgctgta agcgctcaga gaactttgcc tgcactttgg tatggccctg 3000

accacacagt gccgtcttct tttggttgtg tgacttcctt gctgctatta tattattatt 3060

attattattg ttagctaaca ttattaagtg cttattatgt gccagacatt gtgctaaaat 3120

tttttttttc catttggaaa aactgcccta attgacagat aagaaaactg gagctggaaa 3180

agtggagctc aaaaagatta agtaattttt atgcatccga agtcacacag tcagtaaaca 3240

gttgagaccg cttttgtaac cacagcagtt tgatcttttc cacaatactt catgctgccc 3300

taactgtaag cttcttgcat tcagggatct tacacaatag tgacatgtaa gatctgtaag 3360

aagatgataa ggatagtatc tgcctcaaag aactgatgta agggttaatt aagcattata 3420

tataaagcac ttgaaatcgg gctcggccct cagtcagcac tcagtaaagg tgagttgtta 3480

ttgttgttga tgatgatgtt attattatta ttattaccat gactattgct gcttctcctg 3540

ctacttcatt tggaagaagg tagccttgta cctaggggga aatcagtaaa tagcctgtgg 3600

gtgaatgaat gagtgactga atgatactct tctgttcttc aaggcaggag accgggtgat 3660

ggtgttgaac cggtcaggga tgtggcagga agaggtgact gtgccctcgg tccagacctt 3720

cctgattcct gaggccatga cctttgagga agctgctgcc ttgctcgtca attacattac 3780

agcctacatg gtcctctttg acttcggcaa cctacagcct ggccacagcg tcttggtaca 3840

catggctgca ggtgacaggt cccctcactt tatcacccct taccccaccc agatttcctt 3900

ccaggcccct tccctgcagc ctgtctgggt tgttgtcatg gcaacaccag gctgccttgg 3960

cctgtggctc ccagaggcct ctgctgtgta gttgccgtgg taacattcag gcaccaggtc 4020

tagtctggtg tgctatcctt agcaacgtgc cctcacccca cacccccacc tctctagcta 4080

ccttccccac cacttctcag tcatggaaat tagacacggc cctaaaatga gcgtaggcaa 4140

aatgaaggtg acaggctgag tccctgggag gctagaatgg agtggttggt ggccagggca 4200

actccatatc ccctgcttat gggtgtcttg ctgcaggggg tgtgggtatg gctgccgtgc 4260

agctgtgccg tacagtggag aatgtgacag tgttcggaac ggcctcggcc agcaagcacg 4320

aggcactgaa ggagaatggg gtcacacatc ccatcgacta tcacacgact gactacgtgg 4380

atgagatcaa gaagatttcc cctaaaggtg gggggcataa tatgggaggg ggtagggagg 4440

cacaggacag ggaggggagc tccagatctg tggatcctaa tgttgttctt gggttcccct 4500

actctatgac aggagtggac attgtcatgg accctctggg tgggtcagat actgccaagg 4560

gctacaacct cctgaaaccc atgggcaaag tcgtcaccta tggtgagtta gtgggccagg 4620

gatggagaga gcatgtgagg gcaggaggga gggtctaagg ggtgggatat agaggccagg 4680

gcttttgaat gaagaagggg tagggactca ggtgctctgt agacgatcag ggttaggaat 4740

ggtcctgtat gctgcattca gattgctgac tcttgggtac cagctctttt cattctctgt 4800

cacaactttt catatgagtg atagtaaatt ctacattctt tttttttttt tttttttttt 4860

gagatggagt ttcgctcttg tcgcccaggc tggagtgcaa tggcatgatc tcgatcagtg 4920

caacctctgc ctcctgggtt caagcgattc tcctgcctca ccctcccgag tagctggaat 4980

tacaggtgtc tgccaccacg cccaactaat ttttgtattt ttagtagagg cggtgtttca 5040

ccatgttggc caggctggtc ttgaactcct gatctcaggt gatccagccg cctcagcctc 5100

ccaaagtgct gggattatag gcgtgagcca ccacgcctgg ccaaattcta cattcttgtt 5160

tggggattat tcttgaacaa ccagcctgcc ttctttctgt cctacctccc tgagcatctt 5220

aggcagggtg cattttcatt taaaaaagta tttcatacaa caaaataagc caggcatggt 5280

ggctcatgcc tgtaatccca gcactttgga aggccagggc aggcagatgg cttgagccta 5340

gaacccgcct cccgggttca agcgattctc ctgcctcaga cttcctgagt agctgggatt 5400

acaggcatgt accaccatgc ccagctaatt ttgtattttc agtagagacg gggtttctcc 5460

atgttggtca cgctggtctc gaactcctga cgtccagtga tccgcccacc tcggcctccc 5520

aaagtgctgg gattataggc gtgagccacc atacccggcc aacacctggc taattttcgt 5580

attttttagt agagacaagg tttcaccatt ttgggcaggc tggtctcgaa ctcctgacct 5640

caagtgatcc ccccaccttg gcttcccaga gtgctgggat tatggatgtg agccatagca 5700

cccagcccct agagcaattt aaagtcagcc agggttggtt tgggcctggt aaccagcagt 5760

ttgagaatta tccaatcact ccctggcact ggtgtggaga attgcaaggg gatcacaggg 5820

aacagagagc acagatgcag acacacaggg atgtgcctgg gggggttcac aggctatgtc 5880

accttgtcct tcaggaatgg ccaacctgct gacgggcccc aaacggaacc tgatggccct 5940

ggcccggaca tggtggaatc agttcagcgt gacagctctg cagctgctgc aggccaaccg 6000

ggctgtgtgt ggcttccacc tgggctacct ggatggtgag gtggagctgg tcagtggtgt 6060

ggtggcccgc ctcctggctc tgtacaacca gggccacatc aagccccaca ttgactcagt 6120

ctggcccttc gagaaggtga atgtgaggac tttgcaggga gggcttgggt aggactcatg 6180

aaggctgggg tcccaagggg cagattcctg gggaagagga gggctgcctg catcacactg 6240

gctcttgttg gatgagggtt ggatagcact gggagccgca tctttccttc ctccccaggt 6300

ggctgatgcc atgaaacaga tgcaggagaa gaagaatgtg ggcaaggtcc tcctggttcc 6360

agggccagag aaggagaact agggcaagtg gctgtgagac cctagagacc agcgaaggga 6420

gaagttggga agctacgttc tgttggccac cagacttgca tttcagcctc tgtcataatg 6480

ctctgccctc cctcccccga aggtctctgt ggtgatgacc gctctcccct gcccctcccc 6540

gcttcctgac ctctgaagag gttgggaagt gaccatttgg atgtctgggc cctgccaagg 6600

cgacagggag ggtcagaggg aggccggctg cttcctgccc ccaccctttc cccgggcctg 6660

ctgtgctgct tttgtgccaa ggttagccag tcccccctgt tgtgttccat gtgctttcac 6720

ctctgcctca tctttcctcc cgtccctgcc ccgccacctc cccaaagaat tgaaacgtca 6780

gctcaggata tggggccaat ctctgtgagt ccagcatgta cctgtctctc cctagtgtcc 6840

cttcagcctg ggctgaccag tgcccgcctc tgggcttgac cagttcccaa tctcgtcctc 6900

tgtccccaac ttcttaagca caattgggct tcttccatct ccaggttttc tgccattctt 6960

aaccaaggct gcctcttcca acagggcggg aatcagacct actcccctag gtcacaactc 7020

tgggaaggat acagagcccc cacccttcac tgagttctct ggatttgttc tcagtgcctt 7080

agcaacgaaa acctgtgctt gtgtgtgtgt ggcggcgggg agggaggatc ctgtttccca 7140

cctccttctc ctcccctgta ctccccagtg ccttccttgt tctggtggag ctggggtttc 7200

tctcctcccc agtcccacaa cactgccaaa aatctgtgta tgtgccattg ggtggggcag 7260

ccccaagcct cctggggagg cagggcaaaa acaggtgccc tcatcgtggt ctgtgccatg 7320

tcccgtctct atggtggttg aggagaaagg cggggaagct tcctcagcct tgcagatatg 7380

tgtggcattt actagccaga gctctgaaag gcagtgctgt ctgtttcttg tactgggacc 7440

aaagtaaaaa tccaagcaca ttccccttgc agttagggga ggccctactg ccttctcaaa 7500

gcagagaggc agcttatcaa actcagccca aaactctgtt tacatgggtg gggagatgga 7560

gcagggaagt acagagtggg atggtcagga cctgggccat tgcaaccaaa atggggactt 7620

cctgggtagg gaggtcactc cctctactca ctgagctagg attagggagg gttattgccc 7680

caaccattgc aatgggaggt ggagggacag gctcagcctc ctcattgtct aaatgaggcc 7740

taaatgtgtg aagtgcgatt tctgcttttg tgtaccccac caccccatta ccacagctgc 7800

ctttgtgtgt ttgtgtcaat aaaaagccaa accctggg 7838

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

uucuccgaac gugucacgut tacgugacac guucggagaa tt 42

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

agcgagcatc ccccaaagtt 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gggcacgaag gctcatcatt 20

Claims

1.VAT1基因在制备用于诊断脑胶质瘤的产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品为试剂或试剂盒。

3.一种用于诊断脑胶质瘤的试剂，其特征在于，所述试剂包括用于特异性检测VAT1基因的引物。

4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，所述用于特异性检测VAT1基因的引物包括VAT1基因的上游引物和VAT1基因的下游引物；

5.一种用于诊断脑胶质瘤的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于特异性检测VAT1基因的引物或权利要求3或4所述的用于诊断脑胶质瘤的试剂；

6.VAT1基因的干扰物在制备预防和/或治疗脑胶质瘤的药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述VAT1基因的干扰物包括miRNA。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述VAT1基因的干扰物包括miR-218和/或miR-218的模拟物。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述miR-218的模拟物具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述miR-218和/或miR-218的模拟物在制备通过抑制VAT1基因的表达来预防和/或治疗脑胶质瘤的药物中的应用。