CN102666873A - 用于高效率蛋白质表达的分泌蛋白质生物标记物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及重组蛋白质生产领域，特别是涉及用于改善宿主细胞中表达的重组蛋白质的生产水平的组合物和方法。

Description

用于高效率蛋白质表达的分泌蛋白质生物标记物
1. 相关申请的交叉引用
本申请要求2009年11月9日提交的美国临时申请系列号NO. 12/259,527和2010年11月8日提交的美国申请NO. 12/941,347的权益，通过完全引用将它们的公开内容通过引用合并在此。
2. 引言
本发明涉及蛋白质生产领域，特别是涉及用于改善宿主细胞中表达的蛋白质的生产水平的组合物和方法。
3. 发明背景
生物药物应用的重组蛋白质生产一般涉及使用具有可变蛋白质表达效率的细胞培养物。基因作图、生物成像和整体蛋白质组分析的技术发展提供了独特的机会来理解与使用细胞培养物大规模生产重组蛋白质相关的许多瓶颈。新近的会议（IBC-Antibody Development and Production, San Diego, Mar 12-14, 2008）以及同行评审刊物（Gupta, P. and K. H. Lee（2007）, "Genomics and proteomics in process development: opportunities and challenges" Trends Biotechnol 25（7）: 324-30.）中的公开文献展现了这样的技术在生物药物产业中的实用性。许多这些研究的目的包括改善细胞生产力、改善细胞培养物存活和增殖、以及引入快速可靠的技术用于选择高产细胞系和实时监控细胞的生存力和生理机能。
即使根据上述进展，本领域仍然需要鉴定与高效率蛋白质表达相关的生物标记物，特别是在用于商业生产的重组生物治疗剂的细胞培养过程的情境下。本发明通过提供与高效率蛋白质表达相关的分泌蛋白质生物标记物解决了这一需求。
4. 发明概述
本发明涉及与高效率蛋白质表达相关的分泌蛋白质生物标记物，以及使用这样的生物标记物来促进宿主细胞中高效率的蛋白质表达、特别是重组蛋白质表达的方法。
在某些实施方式中，分泌蛋白质生物标记物是居留于内质网部分的蛋白质。在某些实施方式，所述分泌蛋白质生物标记物是居留于高尔基体部分的蛋白质。在某些实施方式中，所述分泌蛋白质生物标记物来源于全细胞部分。在某些实施方式中，所述分泌蛋白质生物标记物在高效率细胞或细胞培养物中被增量调节。在某些实施方式中，所述分泌蛋白质生物标记物在高效率细胞或细胞培养物中被减量调节。
在本发明的某些实施方式中，采用分泌蛋白质生物标记物来鉴定高效率细胞或细胞培养物。在某些实施方式中，采用多个分泌蛋白质生物标记物来鉴定高效率细胞或细胞培养物。在某些实施方式中，采用分泌蛋白质生物标记物的增量调节来鉴定高效率细胞或细胞培养物。在某些实施方式中，采用分泌蛋白质生物标记物的减量调节来鉴定高效率细胞或细胞培养物。在采用多个分泌蛋白质生物标记物来鉴定高效率细胞或细胞培养物的某些实施方式中，所有分泌蛋白质生物标记物是增量调节的。在涉及多个分泌蛋白质生物标记物的其他实施方式中，所有分泌蛋白质生物标记物是减量调节的。在涉及多个分泌蛋白质生物标记物的再进一步的实施方式中，一种或更多种分泌蛋白质生物标记物是增量调节的，而一种或更多种分泌蛋白质生物标记物是减量调节的。
5. 附图的简要描述
附图1描绘了不同的细胞培养处理对开发的生物反应器中产品滴度的影响。（IVC=活细胞密度的积分，Qp =单位生产率）。
附图2描绘了纯化的ER和高尔基体部分的透射电子显微镜（TEM）图像。
附图3描绘了总细胞溶胞产物对比分级的ER和高尔基体样品的2D-凝胶电泳。
附图4描绘了鉴定从2D凝胶上切下的差异表达的蛋白质斑点的质谱工艺流程图。
附图5描绘了在小节7.2.2中描绘的细胞系1的培养过程期间获得的产品滴度的相对值（培养物1/培养物2）、单位生产率（qp）和活细胞密度的积分（IVC）。
附图6描绘了在小节7.2.2中描述的细胞系1的培养过程第5、8和11天采集的内质网富集部分样品中，小于-0.4或大于0.4的相对表达（x-轴）对比蛋白质数（y-轴）。
附图7描绘了在小节7.2.2中描述的细胞系1的培养过程第5、8和11天采集的高尔基体富集部分样品中，小于-0.4或大于0.4的相对表达（x-轴）对比蛋白质数（y-轴）。
附图8描绘了在小节7.2.3中描绘的细胞系2的培养过程期间获得的产品滴度的相对值（培养物1/培养物2）、单位生产率（qp）和活细胞密度的积分（IVC）。
附图9描绘了在小节7.2.3中描述的细胞系2的培养过程第8和11天采集的内质网富集部分样品中，小于-0.4或大于0.4的相对表达式（x-轴）对比蛋白质数（y-轴）。
附图10描绘了在小节7.2.3中描述的细胞系2的培养过程第5、8和11天采集的高尔基体富集部分样品中，小于-0.4或大于0.4的相对表达（x-轴）对比蛋白质数（y-轴）。
附图11描绘了在小节7.2.4中描绘的细胞系3的培养过程期间获得的产品滴度的相对值（培养物1/培养物2）、单位生产率（qp）和活细胞密度的积分（IVC）。
附图12描绘了在小节7.2.4中描述的细胞系3的培养过程第5/6、8/9和11/13天采集的内质网富集部分样品中，小于-0.4或大于0.4的相对表达（x-轴）对比蛋白质数（y-轴）。
附图13描绘了在小节7.2.4中描述的细胞系3的培养过程第5/6、8/9和11/13天采集的高尔基体网状构造富集部分样品中，小于-0.4或大于0.4的相对表达（x-轴）对比蛋白质数（y-轴）。
6. 发明的详细说明
5.1 定义
如在此使用的，术语“高效率蛋白质表达”是指细胞或细胞培养物的表型，其中所述细胞或细胞培养物以比其他可比较细胞更高的浓度表达目标蛋白质。这种表型可以在一般细胞培养条件观察到，或可能需要使用特定的细胞培养条件来引发所述表型。显现高效率蛋白质表达的细胞在此称为“高效率细胞”，所述细胞的培养物被称为“高效率细胞培养物”。
如在此使用的，术语“重组宿主细胞”（或简称“宿主细胞”）是指其中已经导入重组表达载体的细胞。要理解的是，这种术语不仅仅意图指特定的主题细胞，还指这种细胞的子代。由于突变或环境影响在继承的代中可能出现某些改变，实际上，这种子代可能不与母细胞相同，但仍然包括在此处使用的术语“宿主细胞”的范围内。在某些实施方式中，在细胞培养的情境中采用宿主细胞。
如在此使用的，术语“细胞培养”是指被采用以产生和维持能生产目标重组蛋白质的宿主细胞群体的方法和技术，以及优化目标蛋白质的生产和采集的方法和技术。例如，一旦表达载体被整合到合适的宿主中，宿主可以维持在适合于相关核苷酸编码序列的高水平表达、期望的重组蛋白质的采集和纯化的条件下。哺乳动物细胞对于本发明的重组体的表达和生产是优选的，然而其他真核细胞类型也可以在本发明的情境中采用。参见，例如，Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y.（1987）。用于表达根据本发明的重组蛋白质的适合的哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢（CHO细胞）（包括在Urlaub and Chasin,（1980）PNAS USA 77:4216-4220中描述的dhfr-CHO细胞，与例如在Kaufman and Sharp（1982）Mol. Biol. 159:601-621中描述的DHFR选择标记一起使用，其全部教导通过引用合并在此）、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例有SV40转化的猴肾CV1系（COS-7，ATCC CRL 1651）；人类胚肾系（293，或亚克隆用于在悬浮培养中生长的293细胞，Graham et al., J. Gen Virol. 36:59（1977））；婴儿仓鼠肾脏细胞（BHK, ATCC CCL 10）；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR（CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216（1980））；小鼠sertoli细胞（TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251（1980））；猴肾脏细胞（CV1 ATCC CCL 70）；非洲绿猴肾脏细胞（VERO-76, ATCC CRL-1587）；人类宫颈癌细胞（HELA, ATCC CCL 2）；犬肾脏细胞（MDCK, ATCC CCL 34）；水牛大鼠肝细胞（BRL 3A, ATCC CRL 1442）；人类肺细胞（W138, ATCC CCL 75）；人类肝细胞（Hep G2, HB 8065）；小鼠乳腺肿瘤（MMT 060562, ATCC CCL51）；TRI细胞（Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68（1982））；MRC 5细胞；FS4细胞；和人类肝细胞瘤系（Hep G2），它们的全部教导通过引用合并在此。
如在此使用的，“重组表达载体”可以是任何适合的重组表达载体，并且可以用于转化或转染任何适合的宿主。例如，本领域普通技术人员将理解，转化或转染是一种过程，通过所述过程，外源的核酸例如DNA被导入细胞，其中转化或转染过程涉及用外源核酸例如在此描述的重组表达载体接触细胞的过程。这样的表达载体的非限制性实例包括pUC系列载体（Fermentas Life Sciences），pBluescript系列载体（Stratagene, LaJolla, Calif.）、pET系列载体（Novagen, Madison, Wis.）、pGEX系列载体（Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden）和pEX系列载体（Clontech, Palo Alto, Calif.）。
如在此使用的，术语“重组蛋白质”是指作为被导入宿主细胞中的重组表达载体所携带基因的转录作用和翻译的结果而产生的蛋白质。在某些实施方式中，重组蛋白质是抗体，优选的嵌合的、人源化的或完全人类的抗体。在某些实施方式中，重组蛋白质是选自以下构成的组的同种型的抗体：IgG（例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4）、IgM、IgA1、IgA2、IgD或IgE。在某些实施方式中，抗体分子是全长抗体（例如，IgG1或IgG4免疫球蛋白），或作为选择，抗体可以是片段（例如，Fc片段或Fab片段）。
如在此使用的，术语“分泌蛋白质”是指居留于、即使短暂地居留于真核细胞的分泌机构中的蛋白质。真核细胞的分泌机构由内质网（ER）、ER-高尔基体中间区室（ERGIC）、高尔基体（Ladinsky, et al.（1999）, "Golgi structure in three dimensions: functional insights from the normal rat kidney cell" J Cell Biol 144（6）: 1135-49），以及涉及它们之间的转运的泡囊，和通过蛋白酶体和溶酶体的蛋白质降解机构组成。电子显微镜和分级分离技术也已经用于描述分泌途径的大细胞器（Sabatini, D. D.（1999）, "George E. Palade: charting the secretory pathway" Trends Cell Biol 9（10）: 413-7）。大量的蛋白和其他效应分子涉及分泌转运。近来, McGill大学的研究人员记录了分泌途径蛋白质体中超过1400种蛋白质的存在（Gilchrist, A., C. E. Au, et al.（2006）, "Quantitative proteomics analysis of the secretory pathway" Cell 127（6）: 1265-81）。作者进一步展现了在细胞的不同区室中蛋白质的精巧的空间信息。在鉴定的1400种蛋白质中，超过300种是未知功能的。
如在此使用的，术语“内质网”或“ER”是指真核细胞细胞器，其形成细胞内小管、泡囊和囊腔的互连网络，涉及磷脂和蛋白质的生产以及其他功能。ER促进了正确的蛋白质折叠和蛋白质加工的质量控制（QC）。在翻译期间，在信号识别颗粒帮助翻译复合体与ER膜上它的受体对接之后，蛋白质被转位到ER腔中。新生的多肽被转移到转位子，在此它随后在肽延伸期间穿入ER的腔，用于在高度氧化的微环境中正确的折叠和糖基化。细胞控制机制帮助阻止解折叠的、错误折叠的或未组装的蛋白质转运出ER。在多肽链被转位到ER腔中之后，蛋白质折叠和糖基化起始直接在ER中发生。通过这些蛋白质与其他的协同作用，产生相互作用的网络，分子货物被加工和筛选。许多侣伴蛋白质促进了蛋白质折叠，包括热激蛋白，其在折叠期间暂时阻断分子间相互作用，蛋白质二硫化物异构酶（PDI），其催化正确二硫键的形成，以及钙联结蛋白和钙网织蛋白，它们充当质量控制步骤用以确保蛋白质在离开ER之前被正确折叠（Hossler, P.（2006）, "Experimental and Theoretical Exploration of Protein Glycosylation in Mammalian Cell Culture" Ph.D. Thesis ProQuest/UMI）。侣伴蛋白质是主要的ER居留的蛋白质，用于确保重组蛋白质的正确的折叠结构。最丰富的ER侣伴蛋白是GRP78/BiP，其利用ATP水解来促进蛋白质折叠，防止未折叠的蛋白质在ER内聚集。
如在此使用的，术语“高尔基器”或“高尔基体”是指真核细胞的化学膜性细胞质的细胞器，由分布在或多或少规则的层叠中的扁平、无核糖体的泡囊组成。一旦蛋白质进入高尔基器，它们被无数的蛋白质糖基化酶加工。在高尔基体中N-和O-聚糖被进一步延伸，进一步提高了糖形式分布的多样性。N-聚糖加工的第一个反应是ER加工剩余的甘露糖糖类的进一步的脱除。在脱除之后，少量的糖基转移酶与聚糖反应，但是以可变的顺序，产生各种系列的产物聚糖。早先已经记载了这种反应网络以及酶底物特异性（Hossler, P., L. T. Goh, et al.（2006）, "GlycoVis: visualizing glycan distribution in the protein N-glycosylation pathway in mammalian cells" Biotechnol Bioeng 95（5）: 946-60）。这种最终的糖形式分布已经显示了受到这种网络的性质、以及许多其他因素的影响，包括跨越高尔基体囊腔的酶的位置、核苷酸-糖类相对浓度，以及细胞器内的蛋白质留存时间。
如在此使用的，术语“增量调节”是指特定成分，例如但不限于蛋白质的量的提高。蛋白质量的这种提高可以是以下的结果，例如但不限于：编码蛋白质的DNA或mRNA的转录或翻译率的分别的改变；编码蛋白质的mRNA的稳定性的改变；和/或蛋白质本身的稳定性的改变。在某些实施方式中，量的提高可以是约1%、约10%、约25%、约50%、约100%或更高。在优选的实施方式中，量的提高是至少约100%到约1000%的提高。
如在此使用的，术语“减量调节”是指特定成分，例如但不限于蛋白质的量的降低。蛋白质量的这种降低可以是以下的结果，例如但不限于：编码蛋白质的DNA或mRNA的转录或翻译率的分别的改变；编码蛋白质的mRNA的稳定性的改变；和/或蛋白质本身的稳定性的改变。在某些实施方式中，量的降低可以是约1%、约10%、约25%、约50%、约100%或更大。在优选的实施方式中，量的降低是至少约100%到约1000%的降低。
如在此使用的，术语“约”意图指大于或小于参考值约10-20%的范围。在某些情况下，本领域技术人员将认识到，由于参考值的性质，该术语“约”可以比10-20%或多或少地偏离该值。
6.2 生物标记物
本发明涉及与高效率蛋白质表达相关的分泌蛋白质生物标记物，以及使用这样的生物标记物来促进细胞中高效率的蛋白质表达、特别是重组蛋白质表达的方法。这样的生物标记物可以使用多种技术来鉴定。例如，但不是限制，可以采用高效率细胞培养物的蛋白质组分析来鉴定与较低效率的细胞培养物相比，在高效率细胞培养物中展现差异表达的分泌蛋白质。
为了鉴定用于本发明的情况的特定高效率细胞或细胞培养物，产生目标蛋白质的细胞，例如，产生目标重组蛋白质的宿主细胞可以在多种不同的培养基中培养来鉴定在产生的细胞培养物（其包括原始细胞或其子代）中引发高效率表型的培养基。商业上可获得的培养基例如 Ham's F10™（Sigma）、Minimal Essential Medium™（（MEM）（Sigma）、RPMI-1640（Sigma）和Dulbecco's Modified Eagle's Medium™（（DMEM）, Sigma）适合于培养细胞。此外，Ham et al., Meth. Enz. 58:44（1979），Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255（1980），美国专利Nos. 4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利No. Re. 30,985中描述的任何培养基可以用作细胞的培养基，它们的全部教导通过引用合并在此。任何这些培养基类型可以根据需要补充激素和/或其他生长因子（例如，但不限于，胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子）、盐（例如，但不限于，氯化钠、钙、镁和磷酸盐）、缓冲物（例如，但不限于，HEPES）、核苷酸（例如，但不限于，腺嘌呤核苷和胸腺嘧啶核苷）、抗生素（例如，但不限于，庆大霉素）、痕量元素（定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物）以及葡萄糖或任何相当的能量来源。任何其他必要的增补剂也可以以合适的浓度包括，这是本领域技术人员已知的。
除了培养基类型的变化之外，其他培养条件，例如温度、pH值等等，可以被调节以试图引发在本发明的情境中使用的高表达细胞培养物表型。将与任何一种特定宿主细胞相关的这种条件的任何特定改变的类型和程度将取决于为表达所选择的特定宿主细胞，对于普通技术人员是显而易见的。
当使用本发明的细胞培养技术时，目标蛋白质可以细胞内地、在周质间隙中地、或直接分泌到培养基中产生。在目标蛋白质细胞内地产生的实施方式中，颗粒碎屑，宿主细胞或裂解的细胞（例如，由均质化产生），可以通过各种方式除去，包括但不限于通过离心或超滤。当目标蛋白质被分泌到培养基中时，来自这样的表达系统的上清液可以首先使用商业上可获得的蛋白质浓缩过滤器，例如，Amicon™或Millipore Pellicon™超滤单元来浓缩。确定特定细胞培养物是否是高效率细胞培养物中使用的目标蛋白质的量，在分泌的蛋白质的情况下，可以通过直接分析培养基来计算，或在宿主细胞被裂解以及培养基经历离心或超滤之后分析培养基来计算。
一旦鉴定了高效率细胞或细胞培养物，或建立了高效率蛋白质表达的条件，所述条件使得细胞培养物以高效率方式生产目标蛋白质，可以进行蛋白质组分析来确定与较低效率的细胞培养物相比，在高效率细胞培养物中是否有差异表达的特定蛋白质。术语“蛋白质组分析”被用于指生物样品中一种或更多种蛋白质的表达模式的分析。例如，这样的分析可以使用质谱、二维凝胶电泳、免疫分析，或通过鉴定样品中蛋白质表达水平的任何其他方式来实现。
蛋白质组分析可以得到在高效率和低效率细胞培养物中差异表达的一种或更多种蛋白质的鉴定。例如但不是限制，这样的分析可以鉴定在特定的细胞培养物样品中至少2种、或至少5种或至少10种或至少15种、或至少20种、或至少25种、或至少30种、或至少35种、或至少40种、或至少45种、或至少50种、或至少60种、或至少65种、或至少70种、或至少75种、或至少80种、或至少85种、或至少85种、或至少90种、或至少95种、或至少100种、或至少125种、或至少150种、或至少175种、或至少200种差异表达的蛋白质。
蛋白质组分析可以针对特定种类的蛋白质，例如，分泌蛋白质。为了进行候选的分泌蛋白质生物标记物的蛋白质组分析，必需首先获得含有这样的蛋白质的样品。在某些实施方式中，候选的分泌蛋白质生物标记物获自总细胞溶胞产物。在优选的实施方式中，所述候选的生物标记物分泌蛋白质获自富集了分泌细胞器的样品。文献中报道了生产总细胞溶胞产物以及生产含有富集（也称为“纯化”）了分泌细胞器、或这样的细胞器的子集的样品的许多公认的方案。一般地，这样的方案涉及通过化学或机械手段的某些形式的细胞破坏，随后差异化或密度梯度离心用于纯化和随后的评估。其他方法包括使用细胞破坏，随后通过针对特定细胞器蛋白质的抗体来免疫磁性分离（Vitale, N., K. Horiba, et al.（1998）, "Localization of ADP-ribosylation factor domain protein 1（ARD1）in lysosomes and Golgi apparatus" Proc Natl Acad Sci USA 95（15）: 8613-8）。在某些实施方式中，采用商业上可获得的分析试剂盒，例如，高尔基体分离试剂盒™或内质网分离试剂盒™，都来自Sigma-Aldrich，它们利用了缓冲液和/或蔗糖梯度超速离心来纯化含有ER的和含有高尔基体的部分。在某些实施方式中，这样的实验的源细胞可以使用小的、大的或商业规模的生物反应器，例如但不限于，3L 桌面Applikon生物反应器来获得。在纯化特定细胞器的实施方式中，细胞器富集的验证可以使用多种方法来实现，包括但不限于通过透射电子显微镜（TEM）形态测量学的可视验证。
一旦制备了样品用于蛋白质组分析，样品的蛋白质组成可以使用各种方式来鉴定，包括但不限于2DGE。2DGE是可以分辨复杂混合物中1000-2000种蛋白质的公认的分析方法，通过第一维度的等电点，然后通过在第二维度上利用SDS-PAGE的它们的分子量。在2D凝胶上跑动的蛋白质的检测可以通过许多不同的技术来实现，其实例在proteomeconsult.com公开。银染色是检测低丰度蛋白质斑点的最常使用的方法。银染色具有良好的敏感性（<1 ng蛋白质/斑点），然而，线性动力学定量范围不好（~一个数量级）。相比之下，Coomassie R-250染色是更广泛使用的，具有更好的线性动力学定量范围（~两个数量级），然而，敏感性低（~200 ng蛋白质/斑点）。Coomassie G-250染色提供了更高的敏感性（~25 ng蛋白质/斑点）并且与质谱操作相容。引入SYPRO®-Ruby，荧光染色已经成为基于2D-凝胶的蛋白质定量的选择。Sypro® Ruby染色提供了良好的敏感性（~1 ng蛋白质/斑点）和~3个数量级的线性动力学定量范围。然而，荧光染料给2D-凝胶过程增加了显著的成本。最后，放射标记组合了高敏感性（<0.1 ng/斑点）和高线性动力学定量范围（4-5个数量级）。然而，在凝胶操作、染色、扫描、保存和处理期间需要更多的工作以确保操作员安全和符合环境保护法规。
2-D分析中的关键目的是除去主观性，以控制变化的凝胶跑动以及凝胶图像质量，来提供对低水平蛋白质表达的高敏感性，以及鉴定蛋白质水平的真实改变。被设计以满足这些挑战的技术由Nonlinear Inc.开发了。例如，Progenesis Discovery™是特别的软件解决方案，是为需要精确地分析大量凝胶的蛋白质组领域的研究人员专门开发的。这个软件的特征包括Intelligent Noise Correction Algorithm（INCA），其控制图像噪声的影响并且进行精确的分析，以及Data Quality Control（Data QC），其中用户接收关于斑点中的变化与凝胶的总体质量相比是否显著的统计度量。INCA和Data QC的优点在于在斑点检测中的高水平精度，对2D分析的自动化手段，以及从噪声图像产生有价值的数据。在某些实施方式中，使用Progenesis软件指派(assign)差异表达，随后物理切除斑点用于质谱鉴定。在某些实施方式中，可以用来指派差异表达的筛截指标是来自2D凝胶的标准化斑点体积强度的至少约2倍、约3倍、或约5倍提高或降低。在可选择的实施方式中，可以用于指派差异表达的筛截指标是两种培养条件之间的相对表达水平（正的或负的）0.01、0.05、0.10、0.2、0.4、0.6、0.8或1.0。在某些实施方式中，相对表达式可以使用以下公式来确定：
蛋白质的相对表达“i” = Log10 [(标准化的斑点体积) i , 培养物 1 /(标准化的斑点体积) i , 培养物 2 ] 。
在切除之后，目标生物标记物的身份可以使用多种技术来获得，包括但不限于质谱法。“质谱”或“MS”是指一种分析技术，其中要分析的样品被电离，然后利用电力或磁力被导入以产生基于质量的差异，因而分析离子的质量。有各种MS原理可以用于本发明，包括但不限于，离子阱MS、傅里叶变换离子回旋共振质谱（FT-ICR/MS）、离子扫描MS，以及Q-TOF MS。在本发明的方法中，MS分析可以使用仅一种技术来进行（也就是说，仅一个质谱仪），或通过使用多个相互连接的质谱仪来进行，其中这样的分析被称为“MS/MS分析”。
在某些实施方式中，采用的质谱的具体类型是纳米流ESI Q-TOF MS/MS分析。电喷射电离（ESI）是将稀释在液体中的生物分子转移到气相中的技术。这种去溶剂化方法通常用于蛋白质的质谱分析鉴定。例如，采用蛋白水解酶来将蛋白质消化成独特的肽段。这种片段然后通过反相高压液相层析（HPLC）来分离，并连续电喷雾到质谱仪中。通过测定特定肽段的氨基酸序列，质谱仪产生足够的信息来以高置信度鉴定蛋白质。ESI过程的基础物理学是许多研究的主题（这个领域的近期发展的综述参见 Bruins A.P. , "Mechanistic aspects of electrospray ionization," Journal of Chromatography A, vol.794, pp. 345-347, 1998；and Cech et al., "Practical implications of some recent studies in electrospray ionization fundamentals," Mass Spectrometry Reviews, vol. 20, pp. 362-387, 2001）。电喷雾产生气相中的离子的云。在蛋白质组中的应用有利的纳米-ESI模式中，通过以缓慢的流速（100-1000nl/分钟）将被分析物溶液泵送通过置于高电场内的小口径毛细管来建立电喷雾。这种特定的质谱技术可以结合使用各种软件程序，例如，但不限于，Spectrum Mill软件（Agilent），用于SwissProt数据库中生物标记物的鉴定。
在高效率细胞或细胞系中调节的分泌生物标记物的特定的、非限制性实例在表1中列出。
表1. 分泌生物标记物的实例。
内质素（Endoplasmin）前体（GRP 94） 26S蛋白酶体非ATP-酶调节亚基13/SH3结构域GRB2-样蛋白质B1/COP9 sinalosome复合物亚基4
丝氨酰-tRNA合成酶 细胞质动力蛋白1中间链
二氢硫辛酰基赖氨酸残基乙酰基转移酶/甲硫氨酸氨基肽酶2 核糖体结合蛋白1
F-肌动蛋白加帽蛋白质亚基α2 醇脱氢酶（NADP+）
60s酸性核糖体蛋白PO 谷氨酸脱氢酶1（线粒体前体）
核不均一核糖核蛋白K 蛋白酶体激活物复合物亚基1
真核翻译起始因子3亚基7 细胞质2，肌动蛋白
内质素前体（GRP 94） 膜联蛋白 A5/Coatomer亚基ε
延伸因子1 β 葡糖苷酶2
丝氨酰tRNA合成酶/RAS GTPase-活化蛋白质结合2 磷酸丙糖异构酶
真核翻译因子3亚基7 核不均一核糖核蛋白F
前mRNA加工因子19/T-复合物蛋白质1亚基β 分选Nexin 6/突触小泡膜VAT-1同源物
延伸因子1 γ 14-3-3蛋白质ζ/δ
微管蛋白γ-1链/真核翻译起始因子2亚基2 波形蛋白/微管蛋白α-2链
肌球蛋白调节轻链 Vaculoar ATP合酶
鸟苷酸结合蛋白亚基β 1 Ig-G γ-1链C
26S蛋白酶调节亚基6B 蛋白质二硫化物异构酶A-6前体/蛋白质NDRG1（N-myc下游调节基因1蛋白质）
真核肽链释放因子亚基1 60 kDa热激蛋白、线粒体前体（Hsp60）
蛋白质二硫化物异构酶A-3前体 T-复合物蛋白质1亚基ε
微管蛋白 α-2 UPF0027蛋白质
内质素前体（GRP 94）
其他示范性的生物标记物包括，但不限于，含EH-结构域的蛋白质4；热激蛋白β 1；翻译起始因子3亚基3；ATP合酶亚基β；60S酸性核糖体蛋白PO；Ezrin；Nucleophosmin；钙网织蛋白；14-3-3蛋白质γ；Septin-11；膜联蛋白 A2；ADP-核糖基化因子-样蛋白质2R；热激相关的71kDa蛋白质；肌球蛋白轻多肽6；以及Major Vault蛋白质。
根据本发明的特定的非限制性实施方式，至少一种、或至少两种、或至少三种、或至少四种、或至少五种、或至少十种、任选的多达五种、多达十种、或多达二十种、或多达三十种、或多达四十种、或多达四十六种上述分泌蛋白质生物标记物（其中超过一种生物标记物被称为“组（panel）”）可以用于鉴定高效率细胞或细胞培养物。
在某些实施方式中，这样的组包括，但不限于，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或所有八个的：含EH结构域的蛋白4；热激蛋白β1；肌球蛋白调节轻链；鸟苷酸结合蛋白β 1；翻译起始因子3亚基3；波形蛋白；ATP合酶亚基β；和延伸因子1 γ。在某些这样的实施方式中，含EH结构域的蛋白4；热激蛋白β 1；肌球蛋白调节轻链；和/或鸟苷酸结合蛋白β 1被增量调节；而翻译起始因子3亚基3；波形蛋白；ATP合酶亚基β；和/或延伸因子1 γ被减量调节。
在某些实施方式中，这样的组包括，但不限于，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或所有八个的：含EH结构域的蛋白4；热激蛋白β1；肌球蛋白调节轻链；鸟苷酸结合蛋白β 1；翻译起始因子3亚基3；波形蛋白；ATP合酶亚基β；和/或延伸因子1 γ。在某些实施方式中，含EH结构域的蛋白4；热激蛋白β 1；肌球蛋白调节轻链；和/或鸟苷酸结合蛋白β 1被增量调节；而翻译起始因子3亚基3；波形蛋白；ATP合酶亚基β；和/或延伸因子1 γ被减量调节。
在某些实施方式中，这样的组包括，但不限于，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或所有八个的：含EH结构域的蛋白4；60S酸性核糖体蛋白PO；核不均一核糖核蛋白K；Ezrin；ATP合酶亚基β；Nucleophosmin；波形蛋白；和/或钙网织蛋白。在某些实施方式中，含EH结构域的蛋白4；60S酸性核糖体蛋白PO；核不均一核糖核蛋白K；和/或Ezrin被增量调节，而ATP合酶亚基β；Nucleophosmin；波形蛋白；和/或钙网织蛋白被减量调节。
在某些实施方式中，这样的组包括，但不限于，一个、两个、三个、四个、五个、六个或所有七个的： 14-3-3蛋白质γ；蛋白质二硫化物异构酶A3前体；Septin-11；膜联蛋白 A2；ADP-核糖基化因子-样蛋白质2R；热激相关的71kDa蛋白质；和/或肌球蛋白轻多肽6。在某些实施方式中，14-3-3蛋白质γ；蛋白质二硫化物异构酶A3前体；Septin-11；膜联蛋白 A2；和/或ADP-核糖基化因子-样蛋白质2R被增量调节，而热激相关的71kDa蛋白质；和/或肌球蛋白轻多肽6被减量调节。
在某些实施方式中，这样的组包括，但不限于，一个、两个或所有三个的：热激相关的71kDa蛋白质；Major Vault蛋白质；和/或真核翻译起始因子5A-1。在某些实施方式中，热激相关的71kDa蛋白质；Major Vault蛋白质；和/或真核翻译起始因子5A-1被减量调节。
在某些实施方式中，这样的组包括，但不限于，一个、两个或所有三个的：鸟苷酸-结合蛋白；热激蛋白β-1；和/或14-3-3蛋白质ζ/δ。在某些实施方式中，鸟苷酸-结合蛋白被减量调节，而热激蛋白β-1；和/或14-3-3蛋白质ζ/δ被增量调节。
在某些实施方式中，要分析的生物标记物的表达水平将在培养过程期间的特定时点测量。例如，但不是限制，生物标记物的表达水平可以在细胞培养过程的第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天、第14天或第15天分析。在某些实施方式中，生物标记物的表达将在细胞培养过程期间的一个、两个、三个或更多个时点分析。在某些实施方式中，特定的生物标记物不必都在所有时点被分析，而是某些生物标记物在某些时点被分析，其他生物标记物在不必完全重叠的其他时点分析。
在相关的、特定的、非限制性实施方式中，本发明提供了试剂盒，用于鉴定上文列出的分泌蛋白质生物标记物的一个或一组的表达方面的调节。例如，这样的试剂盒可以包含针对所述生物标记物的可检测的抗体和检测所述抗体的工具。在非限制性的特定实施方式中，在所述试剂盒中提供的组中，上文列出的生物标记物代表了要测试的整个组中生物标记物的达到约百分之20，或达到约百分之30，或达到约百分之50，或达到约百分之75，或达到约百分之90，或达到约百分之100。所述试剂盒可以任选地进一步包含一种或更多种阳性和/或一种或更多种阴性对照样品。
6.3 使用生物标记物组合物的方法
在本发明的某些实施方式中，采用一种或更多种蛋白质生物标记物，优选地一种或更多种分泌蛋白质生物标记物来鉴定高效率细胞或细胞培养物。这样的鉴定常常在重组蛋白质生产的商业扩大的情境下是有用的。例如，但不是限制，启动起初的、小规模细胞培养来促进重组蛋白质生产的效率。这可以通过监测与目标蛋白质的高效率表达相关的一种或更多种分泌蛋白质生物标记物的表达水平来便利化。在某些实施方式中，采用分泌蛋白质生物标记物的增量调节来鉴定高效率细胞培养物。在可选择的实施方式中，采用分泌蛋白质生物标记物的减量调节来鉴定高效率细胞培养物。在优选的实施方式中，采用多个分泌蛋白质生物标记物来鉴定高效率细胞培养物。在采用多个分泌蛋白质生物标记物的这样的实施方式中，所有的生物标记物可以是增量调节的，所有的分泌蛋白质生物标记物可以是减量调节的，或一种或更多种分泌蛋白质生物标记物是增量调节、而一种或更多种分泌蛋白质生物标记物是减量调节的。
在本发明的可选择的实施方式中，采用分泌蛋白质生物标记物来监测已建立的大规模细胞培养物的表达效率，例如，商业的细胞培养物。在这样的实施方式中，一种或更多种分泌的蛋白质生物标记物的周期性监测可以确保细胞培养物持续展现高效率细胞培养物表型。在某些实例中，生物标记物的表达方面的改变可以表明需要调整一种或更多种细胞培养物条件，例如，但不限于，培养基类型、温度和pH值。在某些实施方式中，采用分泌蛋白质生物标记物的增量调节来鉴定高效率细胞培养物。在可选择的实施方式中，采用分泌蛋白质生物标记物的减量调节来鉴定高效率细胞培养物。在优选的实施方式中，采用多个分泌蛋白质生物标记物来鉴定高效率细胞培养物。在采用多种分泌蛋白质生物标记物的实施方式中，所有的生物标记物可以是增量调节的，所有的分泌蛋白质生物标记物可以是减量调节的，或一种或更多种分泌蛋白质生物标记物。
6.4 高效率细胞和细胞培养物
本发明进一步提供了高效率细胞或细胞培养物，其显现了与高效率蛋白质表达相关的生物标记物分布。特别地，本发明提供了高效率细胞或细胞培养物，其显现了与高效率蛋白质表达相关的分泌生物标记物分布。例如，而不是限制性的，所述细胞或细胞培养物展现了表1-7所列一种或更多种分泌蛋白质生物标记物的表达的调节。
根据本发明的特定的非限制性实施方式，至少一种、或至少两种、或至少三种、或至少四种、或至少五种、或至少十种的上文列出的分泌生物标记物的表达可以在本发明的细胞或细胞培养物中被调节。在本发明的特定的非限制性的实施方式中，所述细胞是CHO细胞。
7. 实施例
7.1 实施例 1
7.1.1 细胞器分级
在以下的实施例中采用产生目标重组糖蛋白的两种中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系。两种细胞系都显示了产生g/L水平的期望产物，但是培养条件在产品滴度方面促成了大的提高（附图1）。使用相同的克隆，但在不同的培养条件下比较分泌途径蛋白质水平中的差异，容许利用具有相同遗传组成和基因扩增水平的细胞找到在细胞水平上存在什么样的差异。
为了确定重组蛋白质生产细胞系的细胞器内部候选生物标记物分泌蛋白质的相对分布，首先必需纯化这些细胞器。文献中报道了用于细胞器纯化的许多公认的方案。一般地，这样的方案涉及通过化学或机械手段的某些形式的细胞破坏，随后差异化或密度梯度离心用于纯化和随后的评估。其他方法包括使用细胞破坏，随后通过针对特定细胞器蛋白质的抗体来免疫磁性分离（Vitale, N., K. Horiba, et al.（1998）. "Localization of ADP-ribosylation factor domain protein 1（ARD1）in lysosomes and Golgi apparatus." Proc Natl Acad Sci USA 95（15）: 8613-8）。在本实施例中，商业上可获得的分析试剂盒利用专有的缓冲液和/或蔗糖梯度超速离心来纯化ER和高尔基体。这些实验的源细胞来自3L桌面Applikon生物反应器，从中产生大量的源细胞用于细胞器分级。分析的任何产量限制都超过了产生的大量细胞所补偿的。细胞器富集的验证使用透射电子显微镜（TEM）形态测量学的可视证实来实现。（附图2）。
7.1.2. 二维凝胶电泳的分泌过程的差异作图
实施例1中描述的细胞器富集随后是2D凝胶电泳（2DGE）（附图3）。2DGE是公认的分析方法，其可以分辨复杂混合物中1000-2000种蛋白质，通过在第一维度上蛋白质的等电点，以及在第二维度上使用SDS-PAGE通过蛋白质的分子量。在2D凝胶上跑动的蛋白质的检测可以通过许多不同的技术实现，包括在附图3中包括的凝胶中采用的银染色技术。
2-D分析中的关键目的是除去主观性，以控制变化的凝胶跑动以及凝胶图像质量，来提供对低水平蛋白质表达的高敏感性，以及鉴定蛋白质水平的真实改变。被设计以满足这些挑战的技术由Nonlinear Inc.开发了，包括Progenesis软件。对于当前的样品来说，使用Progenesis软件指派差异表达，随后物理切除斑点用于质谱鉴定。用来指派差异表达的筛截指标是来自在ER或高尔基体富集的部分中至少一个时间进程样品上2D凝胶的标准化斑点体积强度的至少2倍提高或降低。
7.1.3. 差异表达的蛋白质的质谱（ MS ）分析
实施例6.1.2. 中鉴定和切下的蛋白质斑点然后使用Nano-flow ESI Q-TOF MS/MS分析进行加工来鉴定特定的生物标记物分泌蛋白质。使用Spectrum Mill软件（Agilent）和SwissProt数据库（附图4）进行单独的蛋白质指派。上文的小节6.2中的表1列出了生物标记物分泌蛋白质，其具有在ER或高尔基体富集部分的至少一个时间进程样品上2D凝胶的标准化斑点体积强度至少2倍提高或降低的差异表达，随后使用质谱分析来鉴定。
7.2. 实施例 2
7.2.1. 三种独特的蛋白质生产细胞系的比较
这个实施例描述了在具有不同富集水平的培养基中培养的三种独特的蛋白质生产细胞系的比较，以及复合培养基对比成分已知的培养基的比较。细胞培养、细胞器分离、蛋白质分析和蛋白质鉴定如上文的实施例1，小节7.1.1.-7.1.3.中所描述的进行，除非另有描述。
7.2.2. 细胞系 1 分析
细胞系1使用两种独特的过程方式和两种独特的培养基来培养。细胞系1的培养物1采用给料分批过程方式以及复合的丰富培养基。相比之下，细胞系1的培养物2采用分批过程方式，以及复合的贫乏培养基。在附图5中提供了用于细胞系1的比较的产物滴度的相对值（培养物1/培养物2）、单位生产率（qp）和活细胞密度的积分（IVC）。为了鉴定差异表达蛋白质，在第5、8和11天采集每个培养物的样品，通过2-D凝胶电泳分析这些样品。与差异表达蛋白质相关的概述数据在附图6（内质网富集的部分）和附图7（高尔基体富集的部分）中呈现。被鉴定为差异表达的特定蛋白质在表2（内质网富集部分）和表3（高尔基体富集部分）中呈现。
表2. 细胞系1；示范性的差异表达的蛋白质-ER部分。
代表性的蛋白质 相对表达（样品天） 功能
含EH结构域的蛋白质4 0.94（8） 蛋白质转运
热激蛋白β1 0.79（8） 细胞应激反应
肌球蛋白调节轻链 0.61（5） 细胞组织
鸟苷酸结合蛋白β 1 0.56（5） 信号传导
翻译起始因子3亚基3 -0.46（8） 蛋白质翻译
波形蛋白 -0.70（11） 细胞组织
ATP 合酶亚基 β -0.70（11） 新陈代谢
延伸因子 1 γ -0.83（8） 蛋白翻译
表3. 细胞系1；示范性的差异表达的蛋白质-高尔基体部分。
代表性的蛋白质 相对表达（样品天） 功能
含EH结构域的蛋白质4 0.94（8） 蛋白质转运
热激蛋白β 1 0.79（8） 细胞应激反应
肌球蛋白调节轻链 0.61（5） 细胞组织
鸟苷酸结合蛋白β 1 0.56（5） 信号传导
翻译起始因子3亚基3 -0.46（8） 蛋白质翻译
波形蛋白 -0.70（11） 细胞组织
ATP合酶亚基β -0.70（11） 新陈代谢
延伸因子1 γ -0.83（8） 蛋白质翻译
7.2.3. 细胞系 2 分析
使用相同的分批过程，但是用不同的培养基来培养细胞系2两次。细胞系2的培养物1采用复合的丰富培养基，而培养物2采用复合的贫乏培养基。在附图8中提供了用于细胞系2的比较的产物滴度的相对值（培养物1/培养物2）、单位生产率（qp）和活细胞密度的积分（IVC）。为了鉴定差异表达蛋白质，每个培养物的样品在第8和11天（内质网富集的部分）和在第5、8和11天（高尔基体富集的部分）采集，通过2-D凝胶电泳分析这些样品。与差异表达蛋白质相关的概述数据在附图9（内质网富集的部分）和附图10（高尔基体富集的部分）中呈现。被鉴定为差异表达的特定蛋白质在表4（内质网富集部分）和表5（高尔基体富集部分）中呈现。
表4. 细胞系2；示范性的差异表达的蛋白质-ER部分。
代表性的蛋白质 相对表达（样品天） 功能
含EH结构域的蛋白4 0.80（8） 蛋白质转运
60s酸性核糖体蛋白PO 0.72（11） 蛋白质翻译
核不均一核糖核蛋白K 0.60（8） mRNA加工
Ezrin 0.58（8） 细胞组织
ATP合酶亚基β -0.41（11） 新陈代谢
Nucleophosmin -0.57（11） 蛋白质翻译
波形蛋白 -0.73（11） 细胞组织
钙网织蛋白 -1.13（11） 蛋白质折叠
表5.细胞系2；示范性的差异表达的蛋白质-高尔基体部分。
代表性的蛋白质 相对表达（样品天） 功能
14-3-3蛋白质γ 0.69（8） 信号传导
蛋白质二硫化物异构酶A3前体 0.68（5） 蛋白质折叠
Septin-11 0.66（11） 细胞组织
膜联蛋白 A2 0.58（8） 信号传导
ADP-核糖基化因子-样蛋白质2R 0.46（5） 蛋白质加工
热激相关的71kDa蛋白质 -0.64（5） 蛋白质折叠
肌球蛋轻多肽6 -0.67（5） 细胞组织
7.2.4. 细胞系 3 分析
细胞系3使用两种独特的过程方式和两种独特的培养基来培养。细胞系3的培养物1采用分批过程方式以及复合的培养基。相比之下，细胞系3的培养物2采用给料分批过程方式，以及化学成分已知的培养基。在附图11中提供了用于细胞系3的比较的产物滴度的相对值（培养物1/培养物2）、单位生产率（qp）和活细胞密度的积分（IVC）。为了鉴定差异表达蛋白质，在第5/6、8/9和11/13天采集每个培养物的样品，通过2-D凝胶电泳分析这些样品。与差异表达蛋白质相关的概述数据在附图12（内质网富集的部分）和附图13（高尔基体富集的部分）中呈现。被鉴定为差异表达的特定蛋白质在表6（内质网富集部分）和表7（高尔基体富集部分）中呈现。
表6. 细胞系3；示范性的差异表达的蛋白质-ER部分。
代表性的蛋白质 相对表达（样品天） 功能
热激相关的71 kDa蛋白质 -1.41（13） 蛋白质折叠
Major Vault蛋白质 -1.18（9） 信号传导
真核翻译起始因子5A-1 -0.94（6） 蛋白质翻译
表7. 细胞系3；示范性的差异表达的蛋白质-高尔基体部分
代表性的蛋白质 相对表达（样品天） 功能
鸟苷酸-结合蛋白 -1.32（9） 信号传导
热激蛋白β-1 1.24（9） 细胞应激反应
14-3-3蛋白质ζ/δ 0.96（9） 信号传导
* * *
本说明书中引用的所有专利、专利申请、出版物、产品说明书和方案通过完全引用合并在此。在术语有冲突的情况下，以当前的公开内容为准。
显而易见的是在此描述的发明被很好地计划以实现上文所列的效益和优点，本发明不限于在此描述的特定实施方式的范围。要理解的是，本发明可在不背离其精神的情况下进行修改、变化和改变。

Claims (16)

1.一种鉴定高效率细胞或细胞培养物的方法，包括：
（a）测定所述细胞或细胞培养物中高效率细胞或细胞培养物生物标记物的表达水平，和
（b）比较所述细胞或细胞培养物中该高效率细胞或细胞培养物生物标记物的表达水平和已知的高效率细胞或细胞培养物中所述生物标记物的表达水平，
其中生物标记物表达水平高于所述已知的高效率细胞或细胞培养物中的水平是高效率细胞或细胞培养物的指示，并且生物标记物表达水平低于所述已知的高效率细胞或细胞培养物中的水平是较低效率细胞或细胞培养物的指示。
2.权利要求1的方法，其中所述生物标记物是分泌蛋白质。
3.权利要求2的方法，其中所述分泌蛋白质生物标记物是内质网部分居留的蛋白质。
4.权利要求2的方法，其中所述分泌蛋白质生物标记物是高尔基体部分居留的蛋白质。
5.权利要求2的方法，其中所述分泌蛋白质生物标记物在高效率细胞或细胞培养物中被增量调节。
6.权利要求2的方法，其中所述分泌蛋白质生物标记物在高效率细胞或细胞培养物中被减量调节。
7.权利要求2的方法，其中测定和比较多个分泌蛋白质生物标记物的水平。
8.权利要求7的方法，其中所有的所述分泌蛋白质生物标记物在高效率细胞或细胞培养物中被减量调节。
9.权利要求7的方法，其中所有的所述分泌蛋白质生物标记物在高效率细胞或细胞培养物中被增量调节。
10.权利要求7的方法，其中在所述高效率细胞或细胞培养物中一种或更多种所述分泌蛋白质生物标记物被增量调节，而一种或更多种所述分泌蛋白质生物标记物被减量调节。
11.权利要求2的方法，其中所述分泌蛋白质生物标记物选自以下构成的组： 内质素前体（GRP 94）；丝氨酰-tRNA合成酶；二氢硫辛酰基赖氨酸残基乙酰基转移酶/甲硫氨酸氨基肽酶2；F-肌动蛋白加帽蛋白质亚基α2；60s酸性核糖体蛋白PO；核不均一核糖核蛋白K；真核翻译起始因子3亚基7；内质素前体（GRP 94）；延伸因子1β；丝氨酰-tRNA合成酶/RAS GTPase-活化蛋白结合2；真核翻译因子3亚基3；前mRNA加工因子19/T-复合物蛋白质1亚基β；延伸因子1 γ；微管蛋白γ-1链/真核翻译起始因子2亚基2；波形蛋白；肌球蛋白调节轻链；鸟苷酸结合蛋白亚基β1；26S蛋白酶调节亚基6B；真核肽链释放因子亚基1；蛋白质二硫化物异构酶A-3前体；微管蛋白α-2；内质素前体（GRP 94）；蛋白质二硫化物异构酶A-6前体/蛋白质NDRG1（N-myc下游调节的基因1蛋白质）；60 kDa热激蛋白、线粒体前体（Hsp60）；T-复合物蛋白质1亚基ε；UPF0027蛋白质；26S蛋白酶体非ATP-ase调节亚基13；SH3结构域GRB2-样蛋白质B1；COP9 sinalosome复合物亚基4；细胞质的动力蛋白1中间链；核糖体结合蛋白1；醇脱氢酶（NADP+）；谷氨酸脱氢酶1（线粒体前体）；蛋白酶体激活物复合物亚基1；细胞质2、肌动蛋白；膜联蛋白A5；Coatomer亚基ε；葡糖苷酶2；磷酸丙糖异构酶；核不均一核糖核蛋白F；细胞质2/肌动蛋白；分选Nexin 6/突触小泡膜VAT-1同源物；14-3-3蛋白质ζ/δ；波形蛋白/微管蛋白α-2链；Vaculoar ATP合酶；Ig-G γ-1链C；含EH-结构域的蛋白质4；热激蛋白β1；翻译起始因子3亚基3；ATP合酶亚基β；60S酸性核糖体蛋白PO；Ezrin；Nucleophosmin；钙网织蛋白；14-3-3蛋白质γ；Septin-11；膜联蛋白A2；ADP-核糖基化因子-样蛋白质2R；热激相关的71kDa蛋白质；肌球蛋白轻多肽6；以及Major Vault蛋白质。
12.一种用于鉴定高效率蛋白质表达的分泌蛋白质生物标记物的表达方面的调节的试剂盒，包括：
（a）针对高效率蛋白质表达的分泌蛋白质生物标记物的可检测的抗体；和
（b）检测所述抗体的工具。
13.权利要求12的试剂盒，其中所述高效率蛋白质表达的分泌蛋白质生物标记物选自以下构成的组： 内质素前体（GRP 94）；丝氨酰-tRNA合成酶；二氢硫辛酰基赖氨酸残基乙酰基转移酶/甲硫氨酸氨基肽酶2；F-肌动蛋白加帽蛋白质亚基α2；60s酸性核糖体蛋白PO；核不均一核糖核蛋白K；真核翻译起始因子3亚基7；内质素前体（GRP 94）；延伸因子1β；丝氨酰-tRNA合成酶/RAS GTPase-活化蛋白结合2；真核翻译因子3亚基3；前mRNA加工因子19/T-复合物蛋白质1亚基β；延伸因子1 γ；微管蛋白γ-1链/真核翻译起始因子2亚基2；波形蛋白；肌球蛋白调节轻链；鸟苷酸结合蛋白亚基β1；26S蛋白酶调节亚基6B；真核肽链释放因子亚基1；蛋白质二硫化物异构酶A-3前体；微管蛋白α-2；内质素前体（GRP 94）；蛋白质二硫化物异构酶A-6前体/蛋白质NDRG1（N-myc下游调节的基因1蛋白质）；60 kDa热激蛋白、线粒体前体（Hsp60）；T-复合物蛋白质1亚基ε；UPF0027蛋白质；26S蛋白酶体非ATP-ase调节亚基13；SH3结构域GRB2-样蛋白质B1；COP9 sinalosome复合物亚基4；细胞质的动力蛋白1中间链；核糖体结合蛋白1；醇脱氢酶（NADP+）；谷氨酸脱氢酶1（线粒体前体）；蛋白酶体激活物复合物亚基1；细胞质2、肌动蛋白；膜联蛋白A5；Coatomer亚基ε；葡糖苷酶2；磷酸丙糖异构酶；核不均一核糖核蛋白F；细胞质2/肌动蛋白；分选Nexin 6/突触小泡膜VAT-1同源物；14-3-3蛋白质ζ/δ；波形蛋白/微管蛋白α-2链；Vaculoar ATP合酶；Ig-G γ-1链C；含EH-结构域的蛋白质4；热激蛋白β1；翻译起始因子3亚基3；ATP合酶亚基β；60S酸性核糖体蛋白PO；Ezrin；Nucleophosmin；钙网织蛋白；14-3-3蛋白质γ；Septin-11；膜联蛋白A2；ADP-核糖基化因子-样蛋白质2R；热激相关的71kDa蛋白质；肌球蛋白轻多肽6；以及Major Vault蛋白质。
14.权利要求13的试剂盒，其中所述试剂盒包含多种可检测的抗体，其中每个抗体特异性结合选自以下构成的组的不同的分泌蛋白质生物标记物：内质素前体（GRP 94）；丝氨酰-tRNA合成酶；二氢硫辛酰基赖氨酸残基乙酰基转移酶/甲硫氨酸氨基肽酶2；F-肌动蛋白加帽蛋白质亚基α2；60s酸性核糖体蛋白PO；核不均一核糖核蛋白K；真核翻译起始因子3亚基7；内质素前体（GRP 94）；延伸因子1β；丝氨酰-tRNA合成酶/RAS GTPase-活化蛋白结合2；真核翻译因子3亚基3；前mRNA加工因子19/T-复合物蛋白质1亚基β；延伸因子1 γ；微管蛋白γ-1链/真核翻译起始因子2亚基2；波形蛋白；肌球蛋白调节轻链；鸟苷酸结合蛋白亚基β1；26S蛋白酶调节亚基6B；真核肽链释放因子亚基1；蛋白质二硫化物异构酶A-3前体；微管蛋白α-2；内质素前体（GRP 94）；蛋白质二硫化物异构酶A-6前体/蛋白质NDRG1（N-myc下游调节的基因1蛋白质）；60 kDa热激蛋白、线粒体前体（Hsp60）；T-复合物蛋白质1亚基ε；UPF0027蛋白质；26S蛋白酶体非ATP-ase调节亚基13；SH3结构域GRB2-样蛋白质B1；COP9 sinalosome复合物亚基4；细胞质的动力蛋白1中间链；核糖体结合蛋白1；醇脱氢酶（NADP+）；谷氨酸脱氢酶1（线粒体前体）；蛋白酶体激活物复合物亚基1；细胞质2、肌动蛋白；膜联蛋白A5；Coatomer亚基ε；葡糖苷酶2；磷酸丙糖异构酶；核不均一核糖核蛋白F；细胞质2/肌动蛋白；分选Nexin 6/突触小泡膜VAT-1同源物；14-3-3蛋白质ζ/δ；波形蛋白/微管蛋白α-2链；Vaculoar ATP合酶；Ig-G γ-1链C；含EH-结构域的蛋白质4；热激蛋白β1；翻译起始因子3亚基3；ATP合酶亚基β；60S酸性核糖体蛋白PO；Ezrin；Nucleophosmin；钙网织蛋白；14-3-3蛋白质γ；Septin-11；膜联蛋白A2；ADP-核糖基化因子-样蛋白质2R；热激相关的71kDa蛋白质；肌球蛋白轻多肽6；以及Major Vault蛋白质。
15.权利要求13的试剂盒，其中所述试剂盒包含阳性对照样品。
16.权利要求13的试剂盒，其中所述试剂盒包含阴性对照样品。
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