JP2013510324A - 高効率タンパク質発現の分泌タンパク質バイオマーカー - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2009年11月9日出願の米国仮出願番号第61/259,527号および2010年11月8日出願の米国特許出願第12/941,347号の利益を主張するものであり、前記仮出願および出願は、これら全体が参照により本明細書に援用されている。
本明細書において用いる場合、用語「高効率タンパク質発現」は、細胞または細胞培養物が目的のタンパク質を他の比較対象となる細胞より高い濃度で発現する、細胞または細胞培養物の表現型を指す。この表現型は、一般細胞培養条件下で観察されることがあり、または該表現型を誘発するために特定の細胞培養条件の使用を必要とすることがある。高効率タンパク質発現を明示する細胞を本明細書では「高効率細胞」と呼び、該細胞の培養物は「高効率細胞培養物」と呼ぶ。
本発明は、高効率タンパク質発現と相関する分泌タンパク質バイオマーカー、ならびに細胞における高効率タンパク質発現、特に組換えタンパク質発現を容易にするためのこのようなバイオマーカーの使用方法に関する。様々な技術を用いてこのようなバイオマーカーを同定することができる。例えば、限定としてではないが、高効率細胞培養物のプロテオーム解析を用いて、より低効率の細胞培養物と比較して高効率培養物において差次的発現を示す分泌タンパク質を同定することができる。
タンパク質「i」の相対発現=Log10[(正規化スポット体積)i、培養物1/(正規化スポット体積)i、培養物2]
本発明の一定の実施形態では、1つ以上のタンパク質バイオマーカー、好ましくは1つ以上の分泌タンパク質バイオマーカーを利用して高効率細胞または細胞培養物を同定する。このような同定は、組換えタンパク質生産の商業的スケールアップの状況下で有用であることが多い。例えば、限定としてではないが、初期小規模細胞培養を開始して、組換えタンパク質生産の効率を促進する。この培養を、目的のタンパク質の高効率発現と関連づけられる1つ以上の分泌タンパク質バイオマーカーの発現レベルを監視することによって容易にすることができる。一定の実施形態では、高効率細胞培養物を同定するために分泌タンパク質バイオマーカーのアップレギュレーションを利用する。代替実施形態では、高効率細胞培養物を同定するために分泌タンパク質バイオマーカーのダウンレギュレーションを利用する。好ましい実施形態では、多数の分泌タンパク質バイオマーカーを利用して、高効率細胞培養物を同定する。多数の分泌タンパク質バイオマーカーを利用するこのような実施形態において、バイオマーカーのすべてがアップレギュレートされる場合があり、分泌タンパク質バイオマーカーのすべてがダウンレギュレートされる場合があり、または分泌タンパク質バイオマーカーのうちの1つ以上はアップレギュレートされるが、該分泌タンパク質バイオマーカーのうちの1つ以上はダウンレギュレートされる。
本発明は、高効率タンパク質発現と関連づけられるバイオマーカープロフィールを明示する高効率細胞または細胞培養物にさらに提供する。詳細には、本発明は、高効率タンパク質発現と関連づけられる分泌バイオマーカープロフィールを明示する高効率細胞または細胞培養物を提供する。例えば、限定としてではないが、前記細胞または細胞培養物は、表1から7に示す1つ以上の分泌タンパク質バイオマーカーの発現の変調を提示する。
1.1 オルガネラ分画
目的の組換え糖タンパク質を生産する2つのチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞系統を以下の実施例全体を通して利用した。両方の細胞系統がg/Lレベルの所望の産物を生産すること、しかし培養条件が産物力価の大きな増加を助長することを示した(図1)。同じクローンを使用するがこれらの異なる培養条件下で分泌経路タンパク質レベルの差を比較することにより、同じ遺伝子構成および遺伝子増幅レベルを有する細胞を使用して細胞レベルで如何なる差が存在するかを発見することができた。
実施例1において説明したオルガネラ濃縮後に2Dゲル電気泳動(2DGE)を行った(図3)。2DGEは、複合混合物中の1000から2000のタンパク質を一次元でこれらの等電点により、次に二次元でSDS−PAGEを用いてこれらの分子量により分解することができる、十分に確立された分析法である。2Dゲル上を泳動するタンパク質の検出は、図3に含めたゲルに関して用いた銀染色技術を含む、多数の異なる技術によって遂行することができる。
実施例1.2.において同定し、切り出したタンパク質スポットを、次に、ナノフローESI Q−TOF MS/MS分析を用いて処理して、特定のバイオマーカー分泌タンパク質を同定した。Spectrum Millソフトウェア(Agilent)およびSwissProtデータベースを用いて個々のタンパク質指定を行った(図4)。上のセクション2の表1は、ERまたはゴルジ濃縮画分いずれかにおける時間経過サンプルのうちの少なくとも1つに関する2Dゲルからの正規化スポット体積強度の少なくとも2倍の増加または減少の差次的発現を有するバイオマーカー分泌タンパク質のリストであり、これらのバイオマーカー分泌タンパク質を、その後、質量分析による分析を用いて同定することができた。
2.1.3つの別個のタンパク質生産細胞系統の比較
この実施例は、異なる濃度レベルを有する培地のもとで培養した3つの別個のタンパク質生産細胞系統の比較、ならびに天然培地の限定培地に対する比較を説明するものである。細胞培養、オルガネラ単離、タンパク質分析およびタンパク質同定は、別の説明がない限り、上の実施例1、セクション1.1.から1.3.において説明したとおりに行った。
2つの別個の工程モードおよび2つの別個の培養基を用いて、細胞系統1を培養した。細胞系統1の培養物1には半回分工程モードおよび天然リッチ培地を用いた。対照的に、細胞系統1の培養物2には回分工程モードおよび天然リーン培地を用いた。細胞系統1の比較のために産物力価、比生産性(qp)および生細胞密度の積分(IVC)の相対値(培養物1/培養物2)を図5に提供する。差次的に発現されたタンパク質を同定するために、各培養物のサンプルを第5、8および11日に採取し、これらのサンプルを2−Dゲル電気泳動によって分析した。差次的に発現されたタンパク質に関する要約データを図6(小胞体濃縮画分)および7(ゴルジ濃縮画分)に提示する。差次的に発現されたものとして同定された特異的タンパク質を表2(小胞体濃縮画分)および表3(ゴルジ濃縮画分)に提示する。
細胞系統2は、同じ回分工程を用いるが別個の培養基で2回培養した。細胞系統2の培養物1には天然リッチ培地を用い、一方、培養物2には天然リーン培地を用いた。細胞系統2の比較のために産物力価、比生産性(qp)および生細胞密度の積分(IVC)の相対値(培養物1/培養物2)を図8に提供する。差次的に発現されたタンパク質を同定するために、各培養物のサンプル第8および11日(小胞体濃縮画分)ならびに第5、8および11日(ゴルジ濃縮画分)に採取し、これらのサンプルを2−Dゲル電気泳動によって分析した。差次的に発現されたタンパク質に関する要約データを図9(小胞体濃縮画分)および10(ゴルジ濃縮画分)に提示する。差次的に発現されたものとして同定された特異的タンパク質を表4(小胞体濃縮画分)および表5(ゴルジ濃縮画分)に提示する。
細胞系統3は、2つの別個の工程モードおよび2つの別個の培養基を用いて培養した。培養系統3の培養物1には回分工程モードおよび天然培地を用いた。対照的に、細胞系統3の培養物2には、半回分工程モードおよび合成培地を用いた。細胞系統3の比較のために産物力価、比生産性(qp)および生細胞密度の積分(IVC)の相対値(培養物1/培養物2)を図11に提供する。差次的に発現されたタンパク質を同定するために、各培養物のサンプル第5/6、8/9および11/13日に採取し、これらのサンプルを2−Dゲル電気泳動によって分析した。差次的に発現されたタンパク質に関する要約データを図12(小胞体濃縮画分)および13(ゴルジ濃縮画分)に提示する。差次的に発現されたものとして同定された特異的タンパク質を表6(小胞体濃縮画分)および表7(ゴルジ濃縮画分)に提示する。
Claims (16)
- 高効率細胞または細胞培養物の同定方法であって、
(a)細胞または細胞培養物における高効率細胞または細胞培養物バイオマーカーの発現レベルを判定する段階、および
(b)前記細胞または細胞培養物における高効率細胞または細胞培養物バイオマーカーの前記発現レベルを公知の高効率細胞または細胞培養物における前記バイオマーカーの発現レベルと比較する段階
を含み、
公知の高効率細胞または細胞培養物におけるレベルより高いバイオマーカー発現レベルが、高効率細胞または細胞培養物を示し、および公知の高効率細胞または細胞培養物におけるレベルより低いバイオマーカー発現レベルが、より低効率の細胞または細胞培養物を示す、方法。 - バイオマーカーが分泌タンパク質である、請求項1に記載の方法。
- 分泌タンパク質バイオマーカーが小胞体画分内在性タンパク質である、請求項2に記載の方法。
- 分泌タンパク質バイオマーカーがゴルジ画分内在性タンパク質である、請求項2に記載の方法。
- 分泌タンパク質バイオマーカーが高効率細胞または細胞培養物においてアップレギュレートされる、請求項2に記載の方法。
- 分泌タンパク質バイオマーカーが高効率細胞または細胞培養物においてダウンレギュレートされる、請求項2に記載の方法。
- 多数の分泌タンパク質バイオマーカーのレベルが判定され、比較される、請求項2に記載の方法。
- 分泌タンパク質バイオマーカーのすべてが高効率細胞または細胞培養物においてダウンレギュレートされる、請求項7に記載の方法。
- 分泌タンパク質バイオマーカーのすべてが高効率細胞または細胞培養物においてアップレギュレートされる、請求項7に記載の方法。
- 高効率細胞または細胞培養物において、分泌タンパク質バイオマーカーの1つ以上がアップレギュレートされるが、該分泌タンパク質バイオマーカーの1つ以上はダウンレギュレートされる、請求項7に記載の方法。
- 分泌タンパク質バイオマーカーが、以下の:エンドプラスミン前駆体(GRP 94);セリル−tRNAシンターゼ;ジヒドロリポイルリシン(Dihydrolipolylysine)残基アセチルトランスフェラーゼ/メチオニンアミノペプチダーゼ2;F−アクチンキャッピングタンパク質サブユニットアルファ2;60s酸性リボソームタンパク質PO;ヘテロ核リボ核タンパク質K;真核生物翻訳開始因子3サブユニット7;エンドプラスミン前駆体(GRP 94);伸長因子1ベータ;セリル−tRNAシンセターゼ/RAS GTPase−活性化タンパク質結合2;真核生物翻訳因子3サブユニット3;Pre mRNAプロセシング因子19/T−複合体タンパク質1サブユニットベータ;伸長因子1ガンマ;チューブリンガンマ−1鎖/真核生物翻訳開始因子2サブユニット2;ビメンチン;ミオシン調節軽鎖;グアニンヌクレオチド結合タンパク質サブユニットベータ1;26Sプロテアーゼ調節サブユニット6B;真核生物ペプチド鎖遊離因子サブユニット1;タンパク質ジスルフィドイソメラーゼA−3前駆体;チューブリンアルファ−2;エンドプラスミン前駆体(GRP 94);タンパク質ジスルフィドイソメラーゼA−6前駆体/タンパク質NDRG1(N−myc下流調節遺伝子1タンパク質);60kDa熱ショックタンパク質、ミトコンドリア前駆体(Hsp60);T−複合体タンパク質1サブユニットイプシロン;UPF0027タンパク質;26Sプロテアソーム非ATP−ase調節サブユニット13;SH3ドメインGRB2様タンパク質B1;COP9シグナロソーム(sinalosome)複合体サブユニット4;細胞質ダイニン1中間鎖;リボソーム結合タンパク質1;アルコールデヒドロゲナーゼ(NADP+);グルタミン酸デヒドロゲナーゼ1(ミトコンドリア前駆体);プロテアソーム活性化因子複合体サブユニット1;細胞質2、アクチン;アネキシンA5;コートマーサブユニットイプシロン;グルコシダーゼ2;トリオースリン酸イソメラーゼ;ヘテロ核リボ核タンパク質F;細胞質2/アクチン;ソーティングネキシン6/シナプス小胞膜VAT−1ホモログ;14−3−3タンパク質ゼータ/デルタ;ビメンチン/チューブリンアルファ−2鎖;液胞(Vaculoar)ATPシンターゼ;Ig−Gガンマ−1鎖C;EHドメイン含有タンパク質4;熱ショックタンパク質ベータ1;翻訳開始因子3サブユニット3;ATPシンターゼサブユニットベータ;60S酸性リボソームタンパク質PO;エズリン;ヌクレオホスミン;カルレチクリン;14−3−3タンパク質ガンマ;セプチン−11;アネキシンA2;ADPリボシル化因子様タンパク質2R;熱ショックコグネイト71kDaタンパク質;ミオシン軽ポリペプチド6;および主要ヴォールトタンパク質から成る群より選択される、請求項2に記載の方法。
- (a)高効率タンパク質発現の分泌タンパク質バイオマーカーに対する検出可能な抗体と、
(b)前記抗体を検出するための手段と
を含む、高効率タンパク質発現の分泌タンパク質バイオマーカーの発現の変調を同定するためのキット。 - 高効率タンパク質発現の分泌タンパク質バイオマーカーが、以下の:エンドプラスミン前駆体(GRP 94);セリル−tRNAシンターゼ;ジヒドロリポイルリシン(Dihydrolipolylysine)残基アセチルトランスフェラーゼ/メチオニンアミノペプチダーゼ2;F−アクチンキャッピングタンパク質サブユニットアルファ2;60s酸性リボソームタンパク質PO;ヘテロ核リボ核タンパク質K;真核生物翻訳開始因子3サブユニット7;エンドプラスミン前駆体(GRP 94);伸長因子1ベータ;セリル−tRNAシンセターゼ/RAS GTPase−活性化タンパク質結合2;真核生物翻訳因子3サブユニット3;Pre mRNAプロセシング因子19/T−複合体タンパク質1サブユニットベータ;伸長因子1ガンマ;チューブリンガンマ−1鎖/真核生物翻訳開始因子2サブユニット2;ビメンチン;ミオシン調節軽鎖;グアニンヌクレオチド結合タンパク質サブユニットベータ1;26Sプロテアーゼ調節サブユニット6B;真核生物ペプチド鎖遊離因子サブユニット1;タンパク質ジスルフィドイソメラーゼA−3前駆体;チューブリンアルファ−2;エンドプラスミン前駆体(GRP 94);タンパク質ジスルフィドイソメラーゼA−6前駆体/タンパク質NDRG1(N−myc下流調節遺伝子1タンパク質);60kDa熱ショックタンパク質、ミトコンドリア前駆体(Hsp60);T−複合体タンパク質1サブユニットイプシロン;UPF0027タンパク質;26Sプロテアソーム非ATP−ase調節サブユニット13;SH3ドメインGRB2様タンパク質B1;COP9シグナロソーム(sinalosome)複合体サブユニット4;細胞質ダイニン1中間鎖;リボソーム結合タンパク質1;アルコールデヒドロゲナーゼ(NADP+);グルタミン酸デヒドロゲナーゼ1(ミトコンドリア前駆体);プロテアソーム活性化因子複合体サブユニット1;細胞質2、アクチン;アネキシンA5;コートマーサブユニットイプシロン;グルコシダーゼ2;トリオースリン酸イソメラーゼ;ヘテロ核リボ核タンパク質F;細胞質2/アクチン;ソーティングネキシン6/シナプス小胞膜VAT−1ホモログ;14−3−3タンパク質ゼータ/デルタ;ビメンチン/チューブリンアルファ−2鎖;液胞(Vaculoar)ATPシンターゼ;Ig−Gガンマ−1鎖C;EHドメイン含有タンパク質4;熱ショックタンパク質ベータ1;翻訳開始因子3サブユニット3;ATPシンターゼサブユニットベータ;60S酸性リボソームタンパク質PO;エズリン;ヌクレオホスミン;カルレチクリン;14−3−3タンパク質ガンマ;セプチン−11;アネキシンA2;ADPリボシル化因子様タンパク質2R;熱ショックコグネイト71kDaタンパク質;ミオシン軽ポリペプチド6;および主要ヴォールトタンパク質から成る群より選択される、請求項12に記載のキット。
- 多数の検出可能な抗体を含むキットであって、各抗体が、エンドプラスミン前駆体(GRP 94);セリル−tRNAシンターゼ;ジヒドロリポイルリシン(Dihydrolipolylysine)残基アセチルトランスフェラーゼ/メチオニンアミノペプチダーゼ2;F−アクチンキャッピングタンパク質サブユニットアルファ2;60s酸性リボソームタンパク質PO;ヘテロ核リボ核タンパク質K;真核生物翻訳開始因子3サブユニット7;エンドプラスミン前駆体(GRP 94);伸長因子1ベータ;セリル−tRNAシンセターゼ/RAS GTPase−活性化タンパク質結合2;真核生物翻訳因子3サブユニット3;Pre mRNAプロセシング因子19/T−複合体タンパク質1サブユニットベータ;伸長因子1ガンマ;チューブリンガンマ−1鎖/真核生物翻訳開始因子2サブユニット2;ビメンチン;ミオシン調節軽鎖;グアニンヌクレオチド結合タンパク質サブユニットベータ1;26Sプロテアーゼ調節サブユニット6B;真核生物ペプチド鎖遊離因子サブユニット1;タンパク質ジスルフィドイソメラーゼA−3前駆体;チューブリンアルファ−2;エンドプラスミン前駆体(GRP 94);タンパク質ジスルフィドイソメラーゼA−6前駆体/タンパク質NDRG1(N−myc下流調節遺伝子1タンパク質);60kDa熱ショックタンパク質、ミトコンドリア前駆体(Hsp60);T−複合体タンパク質1サブユニットイプシロン;UPF0027タンパク質;26Sプロテアソーム非ATP−ase調節サブユニット13;SH3ドメインGRB2様タンパク質B1;COP9シグナロソーム(sinalosome)複合体サブユニット4;細胞質ダイニン1中間鎖;リボソーム結合タンパク質1;アルコールデヒドロゲナーゼ(NADP+);グルタミン酸デヒドロゲナーゼ1(ミトコンドリア前駆体);プロテアソーム活性化因子複合体サブユニット1;細胞質2、アクチン;アネキシンA5;コートマーサブユニットイプシロン;グルコシダーゼ2;トリオースリン酸イソメラーゼ;ヘテロ核リボ核タンパク質F;細胞質2/アクチン;ソーティングネキシン6/シナプス小胞膜VAT−1ホモログ;14−3−3タンパク質ゼータ/デルタ;ビメンチン/チューブリンアルファ−2鎖;液胞(Vaculoar)ATPシンターゼ;Ig−Gガンマ−1鎖C;EHドメイン含有タンパク質4;熱ショックタンパク質ベータ1;翻訳開始因子3サブユニット3;ATPシンターゼサブユニットベータ;60S酸性リボソームタンパク質PO;エズリン;ヌクレオホスミン;カルレチクリン;14−3−3タンパク質ガンマ;セプチン−11;アネキシンA2;ADPリボシル化因子様タンパク質2R;熱ショックコグネイト71kDaタンパク質;ミオシン軽ポリペプチド6;および主要ヴォールトタンパク質から成る群より選択される異なる分泌タンパク質バイオマーカーに特異的に結合するものである、請求項13に記載のキット。
- 陽性対照サンプルを含む、請求項13に記載のキット。
- 陰性対照サンプルを含む、請求項13に記載のキット。
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