CN108396048A - 牡蛎活性多肽的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了牡蛎活性多肽的制备方法，包括：预处理、发酵、纯化，首先将长牡蛎肉匀浆后以异丙醇脱脂，调节浓度、pH值后灭菌得发酵基质，将米曲霉种子液接种入发酵基质中进行发酵培养，将水解液经超滤、凝胶柱层析得各洗脱组分，混合得牡蛎活性多肽。有益效果为：以发酵法制备牡蛎活性多肽，牡蛎糖原回收率和蛋白回收率分别可达85%和90％，蛋白质水解为多肽后，变成了易于吸收、溶解性好、乳化性好、具有多种生理活性的水解液，改善了蛋白质的功能特性，提高了蛋白质的营养及利用价值。

Description

牡蛎活性多肽的制备方法
技术领域
本发明涉及牡蛎加工领域，尤其是涉及牡蛎活性多肽的制备方法。
技术背景
牡蛎（ostreagigastnunb）及其近缘动物的全体，是海产贝壳。在亚热带、热带沿海都适宜蚝的养殖，我国分布很广，北起鸭绿江，南至海南岛，沿海皆可产蚝。蚝乃软体有壳，依附寄生的动物，咸淡水交界所产尤为肥美。牡蛎是软体动物，有两个贝壳，一个小而平，另一个大而隆起，壳的表面凹凸不平。肉供食用，又能提制蚝油。肉，壳，油都可入药，也叫蚝或海蛎子。
牡蛎壳含80%～95%的碳酸钙、磷酸钙及硫酸钙，并含镁、铝、硅及氧化铁等，牡蛎壳煅烧后碳酸盐分解，产生氧化钙等。牡蛎含糖原、牛磺酸、10种必需氨基酸、谷胱甘肽、维生素A、B1、B2、D，无机质如铜、锌、锰、钡、磷及钙等，其中所含的亮氨酸、精氨酸、瓜氨酸含量最丰富，是迄今为止人类所发现的含量最为高的海洋物种之一。我国广东、福建台湾养殖较多。肉味鲜美，含有丰富蛋白质、脂肪和肝糖，可以鲜食或烹食，也可加工制成蚝豉或蚝油。
发明内容
本发明的目的在于提供牡蛎活性多肽的制备方法，利用米曲霉发酵牡蛎肌肉蛋白制备活性多肽的成本更低，水解反应较温和，水解过程易控，发酵水解速度较快，同时牡蛎活性多肽得率与纯度较高，具有良好的抗氧化作用，可用于制作抗氧化功能制剂用于医药及食品添加剂。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：牡蛎活性多肽的制备方法，包括：预处理、发酵、纯化，具体包括以下步骤：
预处理：取新鲜的长牡蛎，清洗干净，取出牡蛎肉，高速匀浆机匀浆，按照肉液比1:4-6的比例与异丙醇混合均匀，在32-35℃温度下反应3-5小时，过滤，在4500-5000r/min转速下离心20-30分钟，晾干粉碎即得脱脂粉，以蒸馏水稀释脱脂粉至质量分数为15-18%，调节pH值至6.8-7.0，在102-105℃温度下灭菌15-20分钟即得发酵基质；经脱脂处理后，牡蛎蛋白的含量增高，无用的脂肪等杂质被清除，既提高了发酵效率，又避免了脂肪对米曲霉发酵的影响；
发酵：以发酵基质4-5%体积份的米曲霉种子液接种，在140-160r/min转速、28-30℃温度条件下发酵培养48-72小时；发酵结束后，将发酵液煮沸12-15分钟灭酶，8000-9600r/min离心30-45分钟，上清液过0.2-0.25μｍ微孔滤膜，滤液即为水解液；在此发酵条件下，牡蛎糖原回收率和蛋白回收率分别可达85%和90％，蛋白质水解为多肽后，变成了易于吸收、溶解性好、乳化性好、具有多种生理活性的水解液，改善了蛋白质的功能特性，提高了蛋白质的营养及利用价值，同利用商品蛋白酶酶解牡蛎肌肉蛋白相比，利用米曲霉发酵牡蛎肌肉蛋白制备活性多肽的成本更低，水解反应较温和，水解过程易控；
纯化：收集水解液，用去离子水配成质量浓度为10-15mg/mL的样液，分别通过截留分子质量为1、3、6KDa的超滤膜进行超滤，得到分子量为<1KDa、1-3KDa、3-6KDa、>6KDa的多肽组分，将各组分经凝胶柱层析收集各洗脱组分混合，将混合多肽液进行低温干燥即得牡蛎活性多肽；将发酵多肽分段提取后能显著提高多肽的利用率，避免了活性多肽的浪费，牡蛎活性多肽具有较强的自由基清除能力、亚铁离子螯合能力和还原力，因此具有良好的抗氧化作用，可用于制作抗氧化功能制剂用于医药及食品添加剂。
作为优选，随种子液接种入发酵基质1.2-1.4‰的4-苯基丁酸、0.3-0.32‰（R）-乳酸乙酯；特殊配比的4-苯基丁酸与（R）-乳酸乙酯具有协同作用，该协同作用会高效的促进米曲霉更快更多的生产出乙酰辅酶A，从而大大提高乙酰辅酶A的酶活性与酶浓度，促进乙酰基与草酰乙酸的羧基间发生的醛醇缩合反应，从而有效加快米曲霉体内的三羧酸循环反应，促进微生物的生长繁殖，加快促使米曲霉产酶，进而提高发酵速度，缩短发酵时间。
作为优选，凝胶柱层析步骤为：采用Sephadex G-50葡聚糖凝集柱层析法，以纯水为流动相，流速为2-3mL/min，在210、280 nm下测定其紫外吸收，并收集洗脱组分；凝胶柱层析中的葡聚糖凝胶可以使不同分子量的分子以不同的速度流经注床，从而使不同大小的分子得以分离。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1）特殊配比的4-苯基丁酸与（R）-乳酸乙酯具有协同作用，该协同作用会高效的加快米曲霉体内的三羧酸循环反应，促进微生物的生长繁殖，加快促使米曲霉产酶，进而提高发酵速度，缩短发酵时间；
2）在此发酵条件下，牡蛎糖原回收率和蛋白回收率分别可达85%和90％，蛋白质水解为多肽后，变成了易于吸收、溶解性好、乳化性好、具有多种生理活性的水解液，改善了蛋白质的功能特性，提高了蛋白质的营养及利用价值，同利用商品蛋白酶酶解牡蛎肌肉蛋白相比，利用米曲霉发酵牡蛎肌肉蛋白制备活性多肽的成本更低，水解反应较温和，水解过程易控；
3）将发酵多肽分段提取后能显著提高多肽的利用率，避免了活性多肽的浪费，牡蛎活性多肽具有较强的自由基清除能力、亚铁离子螯合能力和还原力，因此具有良好的抗氧化作用，可用于制作抗氧化功能制剂用于医药及食品添加剂。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
牡蛎活性多肽的制备方法，包括以下步骤：
1）取新鲜的长牡蛎，清洗干净，取出牡蛎肉，高速匀浆机匀浆，按照肉液比1:4的比例与异丙醇混合均匀，在32℃温度下反应3小时，过滤，在4500r/min转速下离心20分钟，晾干粉碎即得脱脂粉，以蒸馏水稀释脱脂粉至质量分数为15%，调节pH值至6.8，在102℃温度下灭菌15分钟即得发酵基质；2）以发酵基质4%体积份的米曲霉种子液接种，随种子液接种入发酵基质1.2‰的4-苯基丁酸、0.3‰的（R）-乳酸乙酯，在140r/min转速、28℃温度条件下发酵培养48小时；发酵结束后，将发酵液煮沸12分钟灭酶，8000r/min离心30分钟，上清液过0.2μｍ微孔滤膜，滤液即为水解液；3）收集水解液，用去离子水配成质量浓度为10mg/mL的样液，分别通过截留分子质量为1、3、6KDa的超滤膜进行超滤，得到分子量为<1KDa、1-3KDa、3-6KDa、>6KDa的多肽组分，将各组分经凝胶柱层析收集各洗脱组分混合，凝胶柱层析步骤为：采用Sephadex G-50葡聚糖凝集柱层析法，以纯水为流动相，流速为2mL/min，在210、280 nm下测定其紫外吸收，并收集洗脱组分；将混合多肽液进行低温干燥即得牡蛎活性多肽。
实施例2：
牡蛎活性多肽的制备方法，包括以下步骤：
1）预处理：取新鲜的长牡蛎，清洗干净，取出牡蛎肉，高速匀浆机匀浆，按照肉液比1:6的比例与异丙醇混合均匀，在35℃温度下反应5小时，过滤，在5000r/min转速下离心30分钟，晾干粉碎即得脱脂粉，以蒸馏水稀释脱脂粉至质量分数为18%，调节pH值至7.0，在105℃温度下灭菌20分钟即得发酵基质；经脱脂处理后，牡蛎蛋白的含量增高，无用的脂肪等杂质被清除，既提高了发酵效率，又避免了脂肪对米曲霉发酵的影响；
2）发酵：以发酵基质5%体积份的米曲霉种子液接种，随种子液接种入发酵基质1.4‰的4-苯基丁酸、0.32‰（R）-乳酸乙酯，在160r/min转速、30℃温度条件下发酵培养72小时；发酵结束后，将发酵液煮沸15分钟灭酶，9600r/min离心45分钟，上清液过0.25μｍ微孔滤膜，滤液即为水解液；在此发酵条件下，牡蛎糖原回收率和蛋白回收率分别可达85%和90％，蛋白质水解为多肽后，变成了易于吸收、溶解性好、乳化性好、具有多种生理活性的水解液，改善了蛋白质的功能特性，提高了蛋白质的营养及利用价值，同利用商品蛋白酶酶解牡蛎肌肉蛋白相比，利用米曲霉发酵牡蛎肌肉蛋白制备活性多肽的成本更低，水解反应较温和，水解过程易控；
3）纯化：收集水解液，用去离子水配成质量浓度为15mg/mL的样液，分别通过截留分子质量为1、3、6KDa的超滤膜进行超滤，得到分子量为<1KDa、1-3KDa、3-6KDa、>6KDa的多肽组分，将各组分经凝胶柱层析收集各洗脱组分混合，凝胶柱层析步骤为：采用Sephadex G-50葡聚糖凝集柱层析法，以纯水为流动相，流速为3mL/min，在210、280 nm下测定其紫外吸收，并收集洗脱组分；将混合多肽液进行低温干燥即得牡蛎活性多肽；将发酵多肽分段提取后能显著提高多肽的利用率，避免了活性多肽的浪费，牡蛎活性多肽具有较强的自由基清除能力、亚铁离子螯合能力和还原力，因此具有良好的抗氧化作用，可用于制作抗氧化功能制剂用于医药及食品添加剂。
实施例3：
牡蛎活性多肽的制备方法，包括：预处理、发酵、纯化，具体包括以下步骤：
预处理：取新鲜的长牡蛎，清洗干净，取出牡蛎肉，高速匀浆机匀浆，按照肉液比1:5的比例与异丙醇混合均匀，在34℃温度下反应4小时，过滤，在4800r/min转速下离心25分钟，晾干粉碎即得脱脂粉，以蒸馏水稀释脱脂粉至质量分数为16%，调节pH值至6.8，在104℃温度下灭菌18分钟即得发酵基质；经脱脂处理后，牡蛎蛋白的含量增高，无用的脂肪等杂质被清除，既提高了发酵效率，又避免了脂肪对米曲霉发酵的影响；
发酵：以发酵基质4.2%体积份的米曲霉种子液接种，在150r/min转速、28℃温度条件下发酵培养60小时；发酵结束后，将发酵液煮沸14分钟灭酶，8000-9600r/min离心35分钟，上清液过0.2μｍ微孔滤膜，滤液即为水解液；在此发酵条件下，牡蛎糖原回收率和蛋白回收率分别可达85%和90％，蛋白质水解为多肽后，变成了易于吸收、溶解性好、乳化性好、具有多种生理活性的水解液，改善了蛋白质的功能特性，提高了蛋白质的营养及利用价值，同利用商品蛋白酶酶解牡蛎肌肉蛋白相比，利用米曲霉发酵牡蛎肌肉蛋白制备活性多肽的成本更低，水解反应较温和，水解过程易控；
纯化：收集水解液，用去离子水配成质量浓度为12mg/mL的样液，分别通过截留分子质量为1、3、6KDa的超滤膜进行超滤，得到分子量为<1KDa、1-3KDa、3-6KDa、>6KDa的多肽组分，将各组分经凝胶柱层析收集各洗脱组分混合，将混合多肽液进行低温干燥即得牡蛎活性多肽；将发酵多肽分段提取后能显著提高多肽的利用率，避免了活性多肽的浪费，牡蛎活性多肽具有较强的自由基清除能力、亚铁离子螯合能力和还原力，因此具有良好的抗氧化作用，可用于制作抗氧化功能制剂用于医药及食品添加剂。
随种子液接种入发酵基质1.3‰的4-苯基丁酸、0.3‰（R）-乳酸乙酯；特殊配比的4-苯基丁酸与（R）-乳酸乙酯具有协同作用，该协同作用会高效的促进米曲霉更快更多的生产出乙酰辅酶A，从而大大提高乙酰辅酶A的酶活性与酶浓度，促进乙酰基与草酰乙酸的羧基间发生的醛醇缩合反应，从而有效加快米曲霉体内的三羧酸循环反应，促进微生物的生长繁殖，加快促使米曲霉产酶，进而提高发酵速度，缩短发酵时间。
凝胶柱层析步骤为：采用Sephadex G-50葡聚糖凝集柱层析法，以纯水为流动相，流速为2.5mL/min，在210、280 nm下测定其紫外吸收，并收集洗脱组分；凝胶柱层析中的葡聚糖凝胶可以使不同分子量的分子以不同的速度流经注床，从而使不同大小的分子得以分离。
本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.牡蛎活性多肽的制备方法，其特征在于：所述牡蛎活性多肽的制备方法包括：
预处理：取新鲜的长牡蛎，清洗干净，取出牡蛎肉，高速匀浆机匀浆，将匀浆经异丙醇脱脂后晾干粉碎即得脱脂粉，以蒸馏水稀释脱脂粉并调节pH值，在102-105℃温度下灭菌15-20分钟即得发酵基质；
发酵：接种米曲霉种子液进行发酵培养，发酵结束后，将发酵液煮沸12-15分钟灭酶，8000-9600r/min离心30-45分钟，上清液过0.2-0.25μｍ微孔滤膜，滤液即为水解液；
纯化：收集水解液，稀释后分别通过截留分子质量为1、3、6KDa的超滤膜进行超滤，得到分子量为<1KDa、1-3KDa、3-6KDa、>6KDa的多肽组分，将各组分经凝胶柱层析收集各洗脱组分混合，将混合多肽液进行低温干燥即得牡蛎活性多肽。
2.根据权利要求1所述的牡蛎活性多肽的制备方法，其特征在于：所述预处理步骤中，异丙醇脱脂操作为：按照肉液比1:4-6的比例将牡蛎肉匀浆与异丙醇混合均匀，在32-35℃温度下反应3-5小时，过滤，在4500-5000r/min转速下离心20-30分钟。
3.根据权利要求1所述的牡蛎活性多肽的制备方法，其特征在于：所述预处理步骤中，发酵基质中脱脂粉的质量分数为15-18%，pH值为6.8-7.0。
4.根据权利要求1所述的牡蛎活性多肽的制备方法，其特征在于：所述发酵步骤中，种子液的接种量为发酵基质体积的4-5%。
5.根据权利要求1所述的牡蛎活性多肽的制备方法，其特征在于：所述发酵步骤中，随种子液接种入发酵基质1.2-1.4‰的4-苯基丁酸、0.3-0.32‰（R）-乳酸乙酯。
6.根据权利要求1所述的牡蛎活性多肽的制备方法，其特征在于：所述发酵步骤中，发酵培养的摇床转速为140-160r/min，发酵温度为28-30℃，发酵培养时间为48-72小时。
7. 根据权利要求1所述的牡蛎活性多肽的制备方法，其特征在于：所述纯化步骤中，凝胶柱层析步骤为：采用Sephadex G-50葡聚糖凝集柱层析法，以纯水为流动相，流速为2-3mL/min，在210、280 nm下测定其紫外吸收，并收集洗脱组分。
8.根据权利要求1所述的牡蛎活性多肽的制备方法，其特征在于：所述纯化步骤中，稀释操作为：用去离子水将水解液配成质量浓度为10-15mg/mL的样液。
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