CN112680492A - 一种无腥味低分子量牡蛎肽及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物活性成分技术领域，具体涉及一种无腥味低分子量牡蛎肽的制备方法，包括以下步骤：S1.以新鲜无壳牡蛎粉为原料，分散于pH值6.5～7.5的乙酸‑乙酸钠缓冲溶液中，配成质量浓度为5～8％的牡蛎粉溶液，添加蔗糖脂肪酸酯；S2.向牡蛎粉溶液添加复合酶进行酶解，在酶解结束后加入普鲁兰多糖，制得牡蛎酶解液；S3.对牡蛎酶解液进行灭酶操作，调节牡蛎肽酶解液的pH值为5.5～6.0，离心取上清液；将上清液用再生纤维素透析袋进行透析，再进行浓缩干燥得牡蛎肽。本发明制备的牡蛎肽无腥味和异味，顾客极易接受，具有较佳抗过敏效果，且牡蛎酶解液中蛋白质水解度可达到42％以上，回收率可达到90％以上。

Description

一种无腥味低分子量牡蛎肽及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物活性成分技术领域，尤其是涉及一种无腥味低分子量牡蛎肽及其制备方 法。

背景技术

牡蛎(Oyster)是一种资源丰富、极具经济价值的水产品，其肉质鲜美，营养丰富，具 有很高的食用和药用价值。研究表明，利用不同水解酶及反应条件水解牡蛎蛋白得到的水解 产物具有多种生物活性。牡蛎软体干物质中蛋白质含量高达50％，其氨基酸组成完善，超过 牛乳和人乳，具有“海底牛奶”的美誉。因此，牡蛎生物活性肽的开发和应用也得到广泛关注。 如包卫洋等人在中国专利201811214654.9中公布了一种牡蛎来源的ACE抑制及抗肿瘤活性 肽；叶常青等人在中国专利201810127963.6公布了牡蛎活性多肽的制备方法；楼良水等人在 中国专利201810171659.1中公布了补肾生精的虫草牡蛎肽复合物的制备方法和应用。

现有专利技术(申请号201711065482.9)公开了一种牡蛎肽提取方法，该方法利用碱溶 酸沉蛋白的方法提取牡蛎粗蛋白，利用双频超声与微波辅助酶解，提高了酶解效率，节约了 成本。由于碱溶酸沉的方法并不能沉淀出牡蛎中所有的蛋白，因此，利用该方法制备牡蛎肽 未能实现牡蛎原料中蛋白利用的最大化。此外，牡蛎肉中富含不饱和脂肪酸，这些物质不断 地代谢、氧化和相互作用，令许多含硫含氮化合物发生转化游离脂肪酸发生酸败，产生难以 去除的腥臭味，以及其在水解过程中释放出的苦味肽，风味不佳，影响牡蛎肽及其产品的感 官性能，是制约牡蛎肽及其相关产品开发的重要因素之一。常规水产品酶解多肽的脱腥方法 有：一、物理吸附或包埋法，使用粉末活性炭对腥味物质进行吸附，使用β-环糊精，甲壳素 和壳聚糖进行包埋，缺点为蛋白质损失率高；二、遮蔽法，加入辛香味调料，比如乙基麦芽 酚，乙酸乙酯等物质遮挡原有腥味，引入其他味道；三、超临界萃取脱腥，一般与其他工艺 配合使用，设备成本高，不能工业化生产。

因此，亟需一种蛋白质回收率高、制备的牡蛎肽无腥味和异味，香气浓郁，无不良气味， 风味可口，顾客极易接受，并且可工业化生产的无腥味低分子量牡蛎肽的制备方法。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种无腥味低分子量牡蛎肽及其制备方 法，制备的牡蛎肽质量佳，无腥味和异味，香气浓郁，无不良气味，风味可口，顾客极易接 受；本发明采用碱性蛋白酶、中性蛋白酶和角蛋白酶复配，结合牡蛎酶解液的pH值、酶解 温度和酶解时间的调节，使得牡蛎酶解液中蛋白质水解度和回收率明显增强，其蛋白质水解 度可达到42％以上，回收率可达到90％以上。

本发明的上述发明目的是通过以下技术方案得以实现的：

一种无腥味低分子量牡蛎肽的制备方法，包括以下步骤：

S1.以新鲜无壳牡蛎粉为原料，分散于pH值6.5～7.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，配成质 量浓度为5～8％的牡蛎粉溶液，添加蔗糖脂肪酸酯；

S2.向牡蛎粉溶液添加复合酶进行酶解，在酶解结束后加入普鲁兰多糖，制得牡蛎酶解液；

S3.对牡蛎酶解液进行灭酶操作，调节牡蛎肽酶解液的pH值为5.5～6.0，离心取上清液； 将上清液用再生纤维素透析袋进行透析，再进行浓缩干燥得牡蛎肽，所述牡蛎肽的分子量在 1000道尔顿以下。

优选地，所述复合酶包括碱性蛋白酶、中性蛋白酶和角蛋白酶，所述碱性蛋白酶、中性 蛋白酶和角蛋白酶的质量比为1:(2.5～4):(1.5～3)。

优选地，所述碱性蛋白酶、中性蛋白酶和角蛋白酶的质量比为1:3.5:2。

优选地，所述牡蛎粉溶液与碱性蛋白酶的质量比为1:(0.1～0.3)。

优选地，所述蔗糖脂肪酸酯的添加量为无壳牡蛎粉重量的0.2～0.7倍。

优选地，所述蔗糖脂肪酸酯的HLB为6～9。

优选地，所述普鲁兰多糖的添加量为无壳牡蛎粉重量的0.3～0.9倍。

优选地，所述步骤S1中，酶解温度为50～60℃，酶解时间为2～3h。

优选地，所述步骤S1中灭酶温度为85～95℃，所述离心速度为8000～9000r/min，离心 时间为15～20min。

蔗糖脂肪酸酯，是一种非离子型表面活性剂，含有亲水性和亲油性基团，乳化稳定性高， 耐水解性强，能降低表面张力，蔗糖脂肪酸酯含有的亲水性基团可以破坏大分子分子间和分 子内的氢键，以提高牡蛎的溶解性，在本发明的技术方案中，发明人意外在牡蛎粉酶解过程 后添加HLB为6～9的蔗糖脂肪酸酯，发现制备的牡蛎肽腥味和异味大大减弱，风味较佳。 本发明机理还在研究中，推测酶解过程中蔗糖脂肪酸酯可以减慢不饱和脂肪酸氧化，使得不 容易释放牡蛎原有的海腥物质，阻止了蛋白质酶解产物中大量释放的氨基酸与其他脂肪氧化 产物发生反应，以减少酸败的作用，减少牡蛎酶解液色、香、味的不断恶化。并且添加普鲁 兰多糖后降低牡蛎肽的腥味和异味的效果达到最佳，牡蛎肽香气浓郁，无不良气味，风味可 口，顾客极易接受，并且两者复配还可以提高牡蛎肽抗过敏的效果，目前现有技术中还暂未 公开蔗糖脂肪酸酯和普鲁兰多糖具备去腥的作用，且当蔗糖脂肪酸酯和普鲁兰多糖单独使用 时，达不到降低牡蛎肽腥味和异味的最佳效果。

本发明使用碱性蛋白酶、中性蛋白酶和角蛋白酶三种蛋白酶以特定的比例复配，结合牡蛎酶解液pH值、酶解温度和酶解时间的调节，使得牡蛎酶解液中蛋白质水解度和回收率明 显增强，其蛋白质水解度可达到42％以上，回收率可达到90％以上。此外，本发明制备的牡蛎肽粉具有抑制透明质酸酶的活性较佳，进而提高了抗过敏作用。

综上所述，本发明包括以下至少一种有益技术效果：

1.本发明提供了一种无腥味低分子量牡蛎肽，创造性引入蔗糖脂肪酸酯和普鲁兰多糖复 配，制备的牡蛎肽的气味、口感和整体可接受度三方面均较佳，不引入带有味道的物质，无 腥味和异味，香气浓郁，无不良气味，风味较佳，顾客极易接受，并且可增强抗过敏作用；

2.本发明提供了一种无腥味低分子量牡蛎肽的制备方法，其蛋白质的水解度和回收率明 显增强，其蛋白质水解度可达到42％以上，回收率可达到90％以上；

3.本发明提供了一种无腥味低分子量牡蛎肽的制备方法，制备方法简单，可工业化生产， 提高了牡蛎肽的品质。

具体实施方式

以下对本发明作进一步详细说明。

牡蛎肉为市售产品，营养成分含量(以鲜重％计)如下：蛋白质9.80±0.31，脂肪2.65 ±0.33，糖2.74±0.11，灰分1.69±0.06，水分79.12±0.95；本发明将新鲜牡蛎肉通过常规技 术进行干燥，然后粉碎，制得新鲜无壳牡蛎粉。

蔗糖脂肪酸酯(深圳乐芙生物科技有限公司)；普鲁兰多糖(上海源叶生物科技有限公 司，CAS号为9057-02-7)；碱性蛋白酶(Alcalase2.4L，诺维信中国生物技术有限公司)、 中性蛋白酶(上海前尘生物科技有限公司，货号为04942078001)和角蛋白酶(深圳乐芙生 物科技有限公司)。

实施例1

本发明无腥味低分子量牡蛎肽的制备方法，包括以下步骤：

S1.以新鲜无壳牡蛎粉为原料，分散于pH值6.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，配成质量浓 度为5％的牡蛎粉溶液，添加0.2倍无壳牡蛎粉重量的蔗糖脂肪酸酯，蔗糖脂肪酸酯的HLB 为6；

S2.向牡蛎粉溶液添加碱性蛋白酶、中性蛋白酶和角蛋白酶，在温度为50℃恒温酶解2h， 在酶解结束后加入0.3倍无壳牡蛎粉重量的普鲁兰多糖，形成牡蛎酶解液；

S3.对牡蛎酶解液进行灭酶操作，灭酶温度为85℃，调节牡蛎肽酶解液的pH值为5.5， 冷却后于8000r/min离心15min，取上清液用分子截留量为500Da的再生纤维素透析袋透析， 再进行浓缩干燥得牡蛎肽，制备的牡蛎肽的分子量在1000道尔顿以下。

所述碱性蛋白酶、中性蛋白酶和角蛋白酶的质量比为1:2.5:1.5。

所述牡蛎粉溶液与碱性蛋白酶的质量比为1:0.1。

实施例2

本发明无腥味低分子量牡蛎肽的制备方法，包括以下步骤：

S1.以新鲜无壳牡蛎粉为原料，分散于pH值7.0的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，配成质量浓 度为6％的牡蛎粉溶液，添加0.5倍无壳牡蛎粉重量的蔗糖脂肪酸酯，蔗糖脂肪酸酯的HLB 为8；

S2.向牡蛎粉溶液添加碱性蛋白酶、中性蛋白酶和角蛋白酶，在温度为55℃恒温酶解2.5h， 在酶解结束后加入0.6倍无壳牡蛎粉重量的普鲁兰多糖，形成牡蛎酶解液；

S3.对牡蛎酶解液进行灭酶操作，灭酶温度为90℃，调节牡蛎肽酶解液的pH值为5.8， 冷却后于8500r/min离心15min，取上清液用分子截留量为1000Da的再生纤维素透析袋透析， 再进行浓缩干燥得牡蛎肽，制备的牡蛎肽的分子量在1000道尔顿以下。

所述碱性蛋白酶、中性蛋白酶和角蛋白酶的质量比为1:3:2。

所述牡蛎粉溶液与碱性蛋白酶的质量比为1:0.15。

实施例3

本发明无腥味低分子量牡蛎肽的制备方法，包括以下步骤：

S1.以新鲜无壳牡蛎粉为原料，分散于pH值7.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，配成质量浓 度为8％的牡蛎粉溶液，添加0.7倍无壳牡蛎粉重量的蔗糖脂肪酸酯，蔗糖脂肪酸酯的HLB 为9；

S2.向牡蛎粉溶液添加碱性蛋白酶、中性蛋白酶和角蛋白酶，在温度为60℃恒温酶解3h， 在酶解结束后加入0.9倍无壳牡蛎粉重量的普鲁兰多糖，形成牡蛎酶解液；

S3.对牡蛎酶解液进行灭酶操作，灭酶温度为95℃，调节牡蛎肽酶解液的pH值为6.0， 冷却后于9000r/min离心15min，取上清液用分子截留量为1000Da的再生纤维素透析袋透析， 再进行浓缩干燥得牡蛎肽，制备的牡蛎肽的分子量在1000道尔顿以下。

所述碱性蛋白酶、中性蛋白酶和角蛋白酶的质量比为1:4:3。

所述牡蛎粉溶液与碱性蛋白酶的质量比为1:0.3。

实施例4

本发明无腥味低分子量牡蛎肽的制备方法，包括以下步骤：

S1.以新鲜无壳牡蛎粉为原料，分散于pH值6.8的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，配成质量浓 度为6％的牡蛎粉溶液，添加0.6倍无壳牡蛎粉重量的蔗糖脂肪酸酯，蔗糖脂肪酸酯的HLB 为8；

S2.向牡蛎粉溶液添加碱性蛋白酶、中性蛋白酶和角蛋白酶，在温度为55℃恒温酶解2h， 在酶解结束后加入0.7倍无壳牡蛎粉重量的普鲁兰多糖，形成牡蛎酶解液；

S3.对牡蛎酶解液进行灭酶操作，灭酶温度为90℃，调节牡蛎肽酶解液的pH值为5.7， 冷却后于9000r/min离心20min，取上清液用分子截留量为1000Da的再生纤维素透析袋透析， 再进行浓缩干燥得牡蛎肽，制备的牡蛎肽的分子量在1000道尔顿以下。

所述碱性蛋白酶、中性蛋白酶和角蛋白酶的质量比为1:3.5:2。

所述牡蛎粉溶液与碱性蛋白酶的质量比为1:0.15。

对比例1

与实施例4相比，本对比例的区别在于，牡蛎肽制备过程中，不添加蔗糖脂肪酸酯和普 鲁兰多糖。

对比例2

与实施例4相比，本对比例的区别在于，牡蛎肽制备过程中，不添加蔗糖脂肪酸酯。

对比例3

与实施例4相比，本对比例的区别在于，牡蛎肽制备过程中不添加普鲁兰多糖。

对比例4

与实施例4相比，本对比例的区别在于，牡蛎肽制备过程中，使用相同量的异戊四醇硬 脂酸酯替换蔗糖脂肪酸酯。

对比例5

与实施例4相比，本对比例的区别在于，牡蛎肽制备过程中，不含有角蛋白酶，碱性蛋 白酶和中性蛋白酶的质量比为3:3.5。

对比例6

与实施例4相比，本对比例的区别在于，牡蛎肽制备过程中，不含有中性蛋白酶，碱性 蛋白酶和角蛋白酶的质量比为2.5:4。

试验例一、感官评定

从气味(鲜香味，腥味)、口感(腥苦味、异味)和整体可接受度三方面对实施例1～4及对 比例1～4制备的牡蛎肽进行感官评定，随机编号，由10名经过培训的感官评定人员按表1 标准评分，分值越大表示风味越优，越易接受，最后评分取平均值，见表2。

表1

评分	整体气味(鲜香味、腥味)	口感(腥苦味、异味)	整体可接受度
				5	香气浓郁，无不良气味	无腥苦味，无异味	极易接受
4	有较浓郁的鲜香味，轻微腥味	略有腥苦味，轻微异味	轻易接受
				3	牡蛎香味较淡，腥味较淡	腥苦味较淡，异味较淡	大多数人能接受
2	鲜香味几乎没有，腥味明显	腥苦味明显，异味明显	不易接受
				1	无鲜味，腥味重	腥味重，异味重	难以接受

表2

组别	评分平均值
		实施例5	4.8
实施例6	4.8
		实施例7	4.9
实施例8	5.0
		对比例1	1.0
对比例2	2.2
		对比例3	4.0
对比例4	2.5

从表2的数据可知，实施例1～4制备的牡蛎肽评分平均值均大于4，整体气味香气浓郁， 无不良气味，感官评定人员认为口感无腥苦味，无异味，整体上极易接受。

对比例1不添加蔗糖脂肪酸酯和普鲁兰多糖制备的牡蛎肽，整体气味上无鲜味，腥味重， 口感上腥味也重，异味重，感官评定人员难以接受，其评分最低；

对比例2不添加蔗糖脂肪酸酯，整体气味上鲜香味几乎没有，腥味明显，腥苦味明显， 异味明显，整体上不易接受，说明蔗糖脂肪酸酯的添加可以大大去除牡蛎肽的腥味和异味， 推测酶解过程中蔗糖脂肪酸酯减慢了不饱和脂肪酸氧化，使得不容易释放牡蛎原有的海腥物 质，阻止了蛋白质酶解产物中大量释放的氨基酸与其他脂肪氧化产物发生反应，以减少酸败 的作用，减少牡蛎酶解液色、香、味的不断恶化。

对比例3缺少普鲁兰多糖，复合蛋白粉具有较浓郁的鲜香味，轻微腥味，略有腥苦味， 轻微异味，能轻易接受，说明添加普鲁兰多糖后降低牡蛎肽的腥味和异味的效果达到最佳， 使得牡蛎肽香气浓郁，无不良气味，风味可口，顾客极易接受。

对比例4使用异戊四醇硬脂酸酯替换蔗糖脂肪酸酯，制备的牡蛎肽的气味、口感和整体 可接受度达不到实施例1～4的风味效果，与对比例1风味效果类似，说明蔗糖脂肪酸酯是不 能随意替换的，本发明在制备牡蛎肽过程中添加蔗糖脂肪酸酯，可以提升牡蛎肽的气味、口 感和整体可接受度，风味佳。

试验例二、抗过敏活性检测

0.25mmol/L CaCl₂ 0.1mL加入0.5mL透明质酸酶溶液(50mg透明质酸酶溶于20mL0.1 mol/L醋酸缓冲液中，pH 4.01)37℃培养20min；分别加入0.5mL实施例1～4及对比例1～ 4制备的含有牡蛎肽的复合蛋白粉相同质量浓度的溶液(60mg/ml)，37℃保温20min；然后 在加入0.6mL透明质酸钠(0.6mg/mL)37℃保温20min；加入0.4mol/L NaOH 1mL，迅速 置于冰上冷却15min；加入0.2mL硼酸，沸水水浴3min，立即冰水冷却5min，加入P-DAB 试剂3mL，37℃保温20min，显色，在585nm下测定OD值。

抗过敏活性计算:

式中:A，对照溶液(酶+缓冲液+底物)的OD值；B，对照空白(缓冲液+缓冲液+底物)的 OD值；C，样品(酶+样+底物)的OD值；D，样品空白对照(缓冲液+样+底物)的OD值。结果见表3。

表3

从表3的数据可知，实施例1～4制备的无腥味低分子量牡蛎肽，具有较高的安全性，作 用温和，对透明质酸酶的抑制率较高，抗过敏活性最强，以实施例4透明质酸酶的抑制率最 高，可达到84.8％。

对比例1～4制备的无腥味低分子量牡蛎肽对透明质酸酶的抑制率较低，抗过敏活性效果 均不及实施例1～4，说明蔗糖脂肪酸酯和普鲁兰多糖相互协同，提高了透明质酸酶的抑制率， 增强了牡蛎肽的抗过敏活性，安全性高。

试验例三、测定蛋白质回收率和水解度

取实施例1～4及对比例5～6经再生纤维素透析袋透析得到的透析液测定其中的蛋白质 回收率和水解度，使用凯氏定氮法测定原料和酶解液的总氮含量，用中性甲醛滴定法测定氨 氮含量，蛋白回收率定义为牡蛎酶解液中蛋白总量与原料蛋白总量的比值，水解度定义为牡蛎酶解液中游离氨氮量与原料总氮量的比值，结果见表4。

表4

组别	蛋白质回收率(％)	蛋白质水解度(％)
			实施例1	39.12	89.43
实施例2	43.89	90.15
			实施例3	42.06	91.43
实施例4	45.89	92.61
			对比例5	28.54	57.23
对比例6	30.62	63.17

根据表4的数据知，本发明实施例1～4制备的牡蛎肽采用碱性蛋白酶、中性蛋白酶和角 蛋白酶三种蛋白酶以特定的比例复配，结合牡蛎酶解液pH值、酶解温度和酶解时间的调节， 使得牡蛎酶解液中蛋白质水解度和回收率明显增强，其蛋白质水解度可达到45.89％，回收率 可达到92.61％；

对比例5或对比例6用相同量的碱性蛋白酶替换角蛋白酶或含有中性蛋白酶，牡蛎酶解 液中蛋白质水解度和回收率不高，不及实施1～4的效果，说明蛋白酶类对蛋白质水解度和回 收率有着较大影响。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术 的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所 属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效 修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种无腥味低分子量牡蛎肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.以新鲜无壳牡蛎粉为原料，分散于pH值6.5～7.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，配成质量浓度为5～8％的牡蛎粉溶液，添加蔗糖脂肪酸酯；

S2.向牡蛎粉溶液添加复合酶进行酶解，在酶解结束后加入普鲁兰多糖，制得牡蛎酶解液；

S3.对牡蛎酶解液进行灭酶操作，调节牡蛎肽酶解液的pH值为5.5～6.0，离心取上清液；将上清液用再生纤维素透析袋进行透析，再进行浓缩干燥得牡蛎肽，所述牡蛎肽的分子量在1000道尔顿以下。

2.根据权利要求1所述的无腥味低分子量牡蛎肽的制备方法，其特征在于，所述复合酶包括碱性蛋白酶、中性蛋白酶和角蛋白酶，所述碱性蛋白酶、中性蛋白酶和角蛋白酶的质量比为1:(2.5～4):(1.5～3)。

3.根据权利要求2所述的无腥味低分子量牡蛎肽的制备方法，其特征在于，所述碱性蛋白酶、中性蛋白酶和角蛋白酶的质量比为1:3.5:2。

4.根据权利要求1所述的无腥味低分子量牡蛎肽的制备方法，其特征在于，所述牡蛎粉溶液与碱性蛋白酶的质量比为1:(0.1～0.3)。

5.根据权利要求1所述的无腥味低分子量牡蛎肽的制备方法，其特征在于，所述蔗糖脂肪酸酯的添加量为无壳牡蛎粉重量的0.2～0.7倍。

6.根据权利要求1所述的无腥味低分子量牡蛎肽的制备方法，其特征在于，所述蔗糖脂肪酸酯的HLB为6～9。

7.根据权利要求1所述的无腥味低分子量牡蛎肽的制备方法，其特征在于，所述普鲁兰多糖的添加量为无壳牡蛎粉重量的0.3～0.9倍。

8.根据权利要求1所述的无腥味低分子量牡蛎肽的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，酶解温度为50～60℃，酶解时间为2～3h。

9.根据权利要求1所述的无腥味低分子量牡蛎肽的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中灭酶温度为85～95℃，所述离心速度为8000～9000r/min，离心时间为15～20min。

10.根据权利要求1所述的无腥味低分子量牡蛎肽的制备方法，其特征在于，再生纤维素透析袋的分子截留量为500～1000Da。