CN108362806B - 一组栀子中具有抗惊厥作用的关键物质群 - Google Patents

一组栀子中具有抗惊厥作用的关键物质群 Download PDF

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Abstract

本发明属于中药领域，具体涉及中药栀子中活性物质结构鉴定和药理活性研究领域。本发明通过对全国不同产地产区的栀子进行多批次的取样，建立了栀子挥发性成分的GCMS共有峰模式图，首次提出了栀子中抗惊厥的关键活性物质群，包括：2,2,5,5‑四甲基‑3‑环戊烯‑1‑酮、β‑异佛尔酮、异佛尔酮、4‑甲烯基异佛尔酮、(E,Z)‑2,4‑癸二烯醛、(E,E)‑2,4‑癸二烯醛。本发明中所涉及的共有物质群是以醒脑静注射液制备工艺为前提下挖掘出来的，尤其适用于醒脑静注射液用栀子药材的相关研究和技术开发。同时，本发明提供了一种从中药复杂繁多成分中寻找活性物质基础的方法，为中药新药开发和中药药效物质基础挖掘提供了新的思路。

Description

一组栀子中具有抗惊厥作用的关键物质群
技术领域
本发明属于中药领域，具体涉及中药栀子中活性物质结构鉴定和药理活性研究领域。
背景技术
栀子为我国传统大宗药材，药用栀子为茜草科栀子属的成熟果实，性苦寒，入心、肝、肺、胃经，具有清热泻火,除烦安神之功效。
栀子药效确切，临床作用广泛；同时，栀子也是众多中成药的重要组成部分，如安宫牛黄丸、牛黄上清丸、龙胆泻肝丸及越鞠丸等。
醒脑静注射液是由“安宫牛黄丸”拆方而来，由麝香、冰片、郁金、栀子提取制成，主要功效为清热解毒、凉血活血、开窍醒脑。栀子为醒脑静注射液醒脑抗惊厥功效提供了重要的活性组分，但是，其活性物质尚不明确。
发明内容
本发明的目的是提供一组栀子中具有抗惊厥作用的关键物质群。
为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一组栀子中具有抗惊厥作用的关键物质群，由2,2,5,5-四甲基-3-环戊烯-1-酮、β-异佛尔酮、异佛尔酮、4-甲烯基异佛尔酮、(E,Z)-2,4-癸二烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛组成。
相应的，一组具有栀子药物活性的关键物质群，包括2,2,5,5-四甲基-3-环戊烯-1-酮、β-异佛尔酮、异佛尔酮、4-甲烯基异佛尔酮、(E,Z)-2,4-癸二烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛。
相应的，所述具有栀子药物活性的关键物质群在抗惊厥中的应用。
相应的，所述关键物质群在抗惊厥中的应用，6种物质的最佳质量配比为2～3:1～2:1～2:5～7:3～5:7～10。
相应的，所述关键物质群的鉴定方法，步骤包括：
(1)使用气相色谱-质谱联用技术建立栀子共有峰模式图；
(2)通过气相色谱-质谱库检索匹配、鉴定步骤(1)所得共有峰的物质。
优选的，步骤(1)所述气相色谱的检测条件为：起始温度50～60℃，以3～5℃/min升至199℃，保持1min，流量1ml/min，进样量1μL，进样口温度200～250℃。
优选的，步骤(1)所述气相色谱检测条件还包括：色谱柱型号为DB-5MS，载气为氦气。
优选的，步骤(1)所述气相质谱检测条件包括：离子源温度：200～230℃，接口温度：250℃，发射电流：150μA，电子能量：30～70eV，扫描范围：50～500。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明通过对全国不同产地产区的栀子进行多批次的取样，建立了栀子挥发性成分的GCMS共有峰模式图；且提到的共有物质色谱峰，其相对面积之和已超过60％，结果准确。基于此，本发明首次提出了栀子中抗惊厥的关键活性物质群。
2、本发明中所涉及的共有物质群，是以醒脑静注射液制备工艺为前提下挖掘出来的，因此，本方法尤其适用于醒脑静注射液用栀子药材的相关研究和技术开发。
3、本发明利用GCMS建立共有峰模式图的方式，提供了一种从中药复杂繁多成分中寻找活性物质基础的方法，为中药新药开发和中药药效物质基础挖掘提供了新的思路。
附图说明
图1为栀子共有峰模式图；
图2为GCMS质谱库匹配结果图。
具体实施方式
实施例1：建立栀子共有峰模式图、寻找共有峰
本发明采用气质联用技术(下述简称GCMS)，建立栀子的共有峰模式图。
1、栀子供试液的制备
依照醒脑静注射液的制备工艺，对栀子进行加工处理，具体方法为：取栀子30g加水1500ml进行蒸馏，收集蒸馏液1000ml。在蒸馏液中再加蒸馏水250ml继续进行蒸馏，再次收集蒸馏液1000ml。再使用等体积石油醚萃取所述蒸馏液三次，合并三次萃取液，减压回收石油醚后得浓缩液，将浓缩液用干燥后的色谱石油醚定容至5ml。
2、使用GCMS方法建立栀子共有峰模式图
气相色谱检测条件为：仪器，安捷伦7000；DB-5MS色谱柱(0.25mm*30m,0.25μm)；载气为氦气；升温程序为：起始温度50～60℃，然后以3～5℃/min升至199℃，保持1min，流量1ml/min，进样量1μL，进样口温度200～250℃。离子源温度：200～230℃，接口温度：250℃，发射电流：150μA，电子能量：30～70eV，扫描范围：50～500。
建立的栀子共有峰模式图如图1所示。
模式图显示：图中有六个共有峰中相对面积之和超过50％，在该色谱条件下，其保留时间分别为：1号峰9.5～10.5分钟，2号峰10.7～11.7分钟，3号峰为19.8～20.8分钟，4号峰22.6～23.6分钟，5号峰24.5～25.5分钟，6号峰25.8～26.8分钟。
实施例2：模式图中共有色谱峰的鉴定
通过GCMS质谱库检索匹配，得到可能的化学结构，再利用对照品进行确认。
1、将实施例1所得结果通过GCMS质谱库检索进行匹配，结果如图2所示。
2、由图2可知，共有峰的保留时间有不同程度的漂移，具体如表1所示。
表1共有峰的保留时间对比
Figure BDA0001590351930000041
3、根据质谱数据库检索匹配得出如下结果：
1号峰鉴定为2,2,5,5-四甲基-3-环戊烯-1-酮(2,2,5,5-tetramethyl-3-cyclopenten-1-one)；
2号峰为β-异佛尔酮(β-isophorone)；
3号峰鉴定为异佛尔酮(isophorone)；
4号峰为4-甲烯基异佛尔酮(4-Methyleneisophorone)；
5号峰鉴定为(E,Z)-2,4-癸二烯醛[(E,Z)-2,4-Decadienal]；
6号峰鉴定为(E,E)-2,4-癸二烯醛[(E,E)-2,4-Decadienal]。
为了确证上述质谱库匹配结果，分别使用了上述对照品进行了对照实验，发现六个色谱峰均与匹配结果相一致。证明上述鉴定是准确的。
实施例3：验证6种物质的抗惊厥作用
1、材料准备
(1)实验动物：460只健康昆明种ICR雌性小鼠，体重为18～24g，二级清洁动物(CL，排除人兽共患病及动物主要传染病的病原体)。
(2)药物准备
将实施例2鉴定的6种物质：2,2,5,5-四甲基-3-环戊烯-1-酮、β-异佛尔酮、异佛尔酮、4-甲烯基异佛尔酮、(E,Z)-2,4-癸二烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛，以在栀子中的平均质量比：2:1:1:5:3:7混合，组成了共有物质群，溶解于50％丙二醇中，配成0.5％的溶液，作为实验组，分为三组：共有物质群高剂量组(6ml/kg)、共有物质群中剂量组(3ml/kg)、共有物质群低剂量组(1.5ml/kg)；阳性对照组(3ml/kg)。
阳性对照药：
1)镇静试验阳性对照组：将地西泮粉末溶解于50％丙二醇中，配成0.5％溶液。
2)催眠试验阳性对照组：将戊巴比妥粉末溶解于50％丙二醇中，配成0.5％溶液。
3)抗惊厥试验阳性对照组：将苯巴比妥粉末溶解于50％丙二醇中，配成0.5％溶液。
将50％丙二醇作为空白对照组。
(3)实验器材：YLS-1A小鼠自主活动记录仪。
2、共有物质群对小鼠的镇静作用试验
采用光电管法。取雌性小鼠90只，按体重分层随机分为9组，每组10只。分别为：共有物质群高剂量组(6ml/kg)、共有物质群中剂量组(3ml/kg)、共有物质群低剂量组(1.5ml/kg)；阳性对照组(3ml/kg)；空白对照组给予等体积的丙二醇。
灌胃给药，每日2次，连续给药15d，分别在给药前和给药后第1、3、5、10、15天，在固定时间(上午9:00，给药60min后)用YLS-1A小鼠自主活动记录仪依次记录各组小鼠30min的自主活动次数。所有数据均与空白对照组第0天的活动次数相比，将给药后的自主活动次数减去给药前的自主活动次数,除以给药前的自主活动次数即为变化率。结果如表2所示。
表2共有物质群对小鼠自主活动的影响
Figure BDA0001590351930000051
Figure BDA0001590351930000061
结果显示：与空白组比较，栀子中共有物质群显著抑制小鼠自主活动，表明该物质群具有镇静作用；与阳性对照组相比，共有物质群起效慢，但随用药时间延长，抑制作用逐渐增强；未见有耐受现象。
3、共有物质群对小鼠的催眠作用
取雌性小鼠90只，按体质量分层随机分为9组，每组10只。
分组方式及给药剂量与步骤2相同。给药60min后，各组均腹腔注射戊巴比妥钠50mg/kg。以翻正反射消失为睡眠潜伏期，以翻正反射消失至恢复为睡眠持续时间。
其中，戊巴比妥钠为动物实验常用催眠、麻醉用药。
结果如表3所示。
表3共有物质对麻醉后小鼠的睡眠时间影响
分组 睡眠延迟(分钟) 睡眠时间(分钟)
空白对照组 6.5±0.9 28.4±8.9
阳性对照组 2.9±0.8 76.3±13.3
共有物质群高剂量组 4.9±0.9 60.2±12.6
共有物质群中剂量组 4.3±0.5 58.3±14.6
共有物质群低剂量组 4.1±0.8 56.2±12.9
结果显示：共有物质群可缩短戊巴比妥钠诱导的睡眠潜伏期,并可延长诱导的睡眠持续时间。
4、共有物质群对催眠药物睡眠诱导作用的影响
取雌性小鼠180只，按体质量分层随机分为9组，每组20只。分组方式及给药剂量与步骤2相同。给药60min后，各组均腹腔注射戊巴比妥钠25mg/kg，全部小鼠注射给药后，半小时后开始记录睡眠小鼠数。结果如表4所示。
表4共有物质对催眠药物睡眠诱导作用的影响
分组 睡眠小鼠数量(只)
空白对照组 0
阳性对照组 15
共有物质群高剂量组 11
共有物质群中剂量组 10
共有物质群低剂量组 7
结果显示：共有物质群可极显著增加阈下催眠剂量戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠个数。
5、共有物质群抗惊厥作用
(1)取雌性小鼠50只,按体质量分层随机分为5组,每组10只,分别为:栀子挥发油共有物质群高、中、低剂量组,分别按40、20、10ml/kg给药；苯巴比妥钠组,按40mg/kg给药；对照组给予等体积的生理盐水。60min后,均腹腔注射37.5mg/kg戊四氮溶液,观察小鼠的阵挛性惊厥。
(2)取雌性小鼠50只，按体质量分层随机分为5组，每组10只，分组方式及给药剂量与步骤2相同。60min后,均腹腔注射100mg/kg戊四氮溶液，同时观察小鼠的阵挛性惊厥和强直性惊厥。
结果显示：腹腔注射戊四氮后，预先腹腔注射了共有物质群的小鼠和苯巴比妥同时未出现了阵挛性惊厥及强直性惊厥,说明共有物质对中枢神经系统产生了抑制作用。

Claims (1)

1.一组栀子中关键物质群在抗惊厥中的应用，其特征在于：关键物质群由2,2,5,5-四甲基-3-环戊烯-1-酮、β-异佛尔酮、异佛尔酮、4-甲烯基异佛尔酮、(E,Z)-2,4-癸二烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛组成，6种物质的质量配比为2～3:1～2:1～2:5～7:3～5:7～10。
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