CN105031072A

CN105031072A - 三叶青抗肿瘤提取物、及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN105031072A
Application number: CN201510338493.4A
Authority: CN
Inventors: 丁丽; 邱彦
Original assignee: Zhejiang Medical College
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2015-06-11
Filing date: 2015-06-11
Publication date: 2015-11-11

Abstract

本发明公开了一种三叶青抗肿瘤提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将三叶青药材粉碎，90％-95％高浓度乙醇回流提取3次，每次1小时，提取温度80-85℃，得提取液I；再用60％-65％低浓度乙醇回流提取3次，每次1小时，提取温度80-85℃，得提取液II；合并提取液I和提取液II；(2)将所述步骤(1)合并的提取液过滤、减压浓缩得乙醇浸膏；(3)将所述步骤(2)所得浸膏用水分散，石油醚先萃取，液料比为1∶1，萃取五次，除去石油醚层，再用二氯甲烷萃取，液料比为1∶1，萃取四次，分取二氯甲烷层，旋干有机溶剂，得本发明所述三叶青抗肿瘤提取物。

Description

三叶青抗肿瘤提取物、及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及三叶青抗肿瘤提取物、及其制备方法和应用。

背景技术

三叶青(Tetrastigmatishemsleyani)是葡萄科植物三叶崖爬藤(TetrastigmatishemsleyaniDielsetGilg)的干燥块根，在民间常被用于小儿惊厥高热、支气管炎、肺炎、扁桃体炎、咽喉炎、肝炎及病毒性脑膜炎的治疗。

目前，三叶青在浙江民间还常被用于肿瘤的治疗，药理实验表明，三叶青粗提物在体内外有抗肿瘤作用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供了三叶青抗肿瘤提取物的制备方法。本发明制备方法采用二氯甲烷提取，提取效率高，获得的提取物抗癌活性较高。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种三叶青抗肿瘤提取物的制备方法，包括如下步骤：

(1)将三叶青药材粉碎，90％-95％高浓度乙醇回流提取3次，每次1小时，提取温度80-85℃，得提取液I；再用60％-65％低浓度乙醇回流提取3次，每次1小时，提取温度80-85℃，得提取液II；合并提取液I和提取液II；

(2)将所述步骤(1)合并的提取液过滤、减压浓缩得乙醇浸膏；

(3)将所述步骤(2)所得浸膏用水分散，石油醚先萃取，液料比为1∶1，萃取五次，除去石油醚层，再用二氯甲烷萃取，液料比为1∶1，萃取四次，分取二氯甲烷层，旋干有机溶剂，得本发明所述三叶青抗肿瘤提取物。

所述三叶青药材为三叶青的干燥块根。

所述步骤(1)中高浓度乙醇浓度为95％；所述步骤(2)中低浓度乙醇浓度为60％。

所述步骤(1)提取温度优选80℃。

所述步骤(2)中，“减压浓缩”在30～50℃下进行。

本发明所述“浓度”为质量浓度。

本发明的有益效果：

(1)目前发明专利或文献报道的关于三叶青具有抗肿瘤作用的提取物有水提取物、乙醇提取物、三叶青黄酮，未见有二氯甲烷提取物的报道。因此，本发明首次制备得到具有抗肿瘤活性的三叶青二氯甲烷提取物。

(2)本发明制备方法提取效果好，原材料中抗肿瘤有效成分转移率高；制备得到的三叶青提取物的有效成分含量高，抗肿瘤活性较高。

(3)本发明采用高浓度乙醇和低浓度乙醇结合的热回流提取法，对三叶青抗肿瘤有效部位进行提取，提取效率高。在萃取溶剂选择上，选用毒性低、对有机物溶解度大，且使用率较少的二氯甲烷；进一步提高了提取中效果较好的活性成分的含量。

附图说明

图1为三叶青二氯甲烷提取物GC-MS图谱。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1

将三叶青干燥块根7kg粉碎后，加95％乙醇回流提取3次，提取温度80℃，每次1小时；60％乙醇回流提取3次，提取温度80℃，每次1小时，合并提取液；过滤，30℃减压浓缩得乙醇浸膏，用少量水将上述浸膏分散，石油醚先萃取，液料比为1∶1，萃取五次，除去石油醚层；再用二氯甲烷萃取，液料比为1∶1，萃取四次，分取二氯甲烷层，旋干有机溶剂，得本发明所述三叶青抗肿瘤提取物，即二氯甲烷提取物25.724g。

实施例2

将三叶青干燥块根20kg粉碎后，加90％乙醇回流提取3次，提取温度80℃，每次1小时；65％乙醇回流提取3次，提取温度80℃，每次1小时，合并提取液；过滤，30℃减压浓缩得乙醇浸膏，用少量水将上述浸膏分散，石油醚先萃取，液料比为1∶1，萃取五次，除去石油醚层；再用二氯甲烷萃取，液料比为1∶1，萃取四次，分取二氯甲烷层，旋干有机溶剂，得本发明所述三叶青抗肿瘤提取物，即二氯甲烷提取物72.5g。

实施例3

对实施例1制备得到的三叶青二氯甲烷提取物同时进行体内外抗肿瘤研究，证明了该提取物在体内、体外均具有较强的抗肿瘤作用

一、动物试验：

(一)急性毒性试验

操作方法：ICR小鼠20只(18-22g)，雌雄各半，分成二组，每组10只，禁食12h，自由饮水，一组灌胃给药，二氯甲烷提取物溶液(以生理盐水配制，浓度为1g/ml)，灌胃量0.4ml/10g。观察24h及2周内动物死亡数、状态；另一组灌胃给生理盐水。

结果：未见小鼠有明显症状，也无死亡，三叶青二氯甲烷对雌雄大鼠灌胃给药，LD50均大于40g/kg体重，无毒。

(二)药效试验

1体外抗肿瘤试验

1.1操作方法

采用MTT法，取对数生长期A375和Hela229细胞，用0.25％的胰蛋白酶进行消化后，分别配成3.2×10⁴·mL^-1的细胞悬液接种于96孔培养板中，每孔加细胞悬液150μL；培养24h后，分别加入不同浓度的二氯甲烷提取物溶液50μL，终浓度为3、6、12.5、25、50、100、200μg·mL^-1。空白对照组加50μL培养液，阳性对照组分别加入不同浓度的5-氟尿嘧啶溶液50μL，分别培养48h后，每孔加入5g·L^-1MTT20μL，培养4h后，弃去上清液，加入150μLDMSO震荡10min，570nm波长下测定OD值，每剂量组设3复孔，重复3次。按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率。

肿瘤细胞生长抑制率(％)＝(1-实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100％

1.2统计方法

所有实验数据均用表示，采用SPSS17.0统计软件对其进行处理，统计分析方法采用Dunnett检验，以P＜0.05为有统计学意义。

1.3结果

三叶青二氯甲烷提取物对A375和Hela229细胞有较强的体外抑制作用。结果见表1。

表1三叶青二氯甲烷提取物对Hela229和A375细胞的抑制作用(n＝3)

注：与阴性对照组比较^#P＜0.05

2体内抗肿瘤试验

2.1操作方法

取腹腔接种7～9d生长良好的荷S₁₈₀小鼠4～5只，断颈处死。无菌抽取1～2mL腹水，再用无菌生理盐水按1∶3比例稀释成瘤细胞悬液，并用0.4％苔盼蓝染色，计活细胞率＞90％，调整瘤细胞浓度为1×10⁷·mL^-1。取50只小鼠，每只小鼠右前肢腋下皮下接种0.2mL。接种次日，按体重随机分成5组，每组10只。阴性对照组ig给予等体积的蒸馏水；阳性对照组ipCTX0.02g·kg^-1·d^-1；三叶青二氯甲烷提取物高、中、低剂量组分别ig给予相当于饮片20、10、5g·kg^-1·d^-1的药物。每日1次，连续10d。末次给药24h后称重，脱臼处死动物，剪开肿瘤部位，完整剥离瘤块，用滤纸吸净其上血和液体，称取瘤块重量，计算抑瘤率。并且分离胸腺和脾脏，精密称重，计算胸腺和脾脏指数。

2.2统计方法所有实验数据均用表示，采用SPSS17.0统计软件对其进行处理，统计分析方法采用Dunnett检验，以P＜0.05为有统计学意义。

2.3结果

三叶青二氯甲烷提取物高、中、低剂量组对小鼠S₁₈₀肉瘤的抑制作用与阴性对照组比较，低剂量组无明显差异，而中、高剂量组表现出显著的差异(P＜0.05)；与阴性对照组比较，各剂量组小鼠脾脏指数和胸指腺数均呈下降趋势，低剂量组下降较多，其胸腺指数有显著差异性(P＜0.05)；高剂量组与中剂量组下降较少(P＞0.05)。结果见表2。

表2三叶青二氯甲烷提取物对荷S₁₈₀小鼠肿瘤生长的抑制作用(n＝10)

二、GC-MS分析

对实施例1制备得到的三叶青二氯甲烷提取物进行GC-MS分析

气相色谱条件：ThermoTRACETR-WAXMS毛细管色谱柱30.0m×0.25mm，液膜厚度0.25μm，分流比20∶1，气化温度250℃，接口温度240℃，程序升温(起始温度140℃，保持2min，以3℃·min^-1升至220℃，保持10min)；载气为氦气，流速1.0mL·min^-1。质谱条件为EI源电子能量70eV；离子源温度240℃；扫描范围50～650amu。

采用GC-MS从三叶青二氯甲烷提取物中分离出85个峰，通过ThermoXcalibur工作站检索NIST标准质谱图库，同时结合文献解析，指认出21个化合物。按峰面积归一化法进行计算，求出各化学成分的相对百分含量，见表3和图1。

表3三叶青二氯甲烷提取物中各化学成分及其相对含量

对比例1

对比例1采用的方法与实施例1基本相同，其区别仅在于用三氯甲烷替换二氯甲烷。

对比例2

对比例2采用的方法与实施例1基本相同，其区别仅在于用水替换二氯甲烷。

本发明方法与对比例1、对比例1的比较见表4

表4

因此，本发明方法提取效率较对比例1、对比例2等方法，提取效率高。

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种三叶青抗肿瘤提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(2)将所述步骤(1)合并的提取液过滤、减压浓缩得乙醇浸膏；

2.如权利要求1所述的一种三叶青抗肿瘤提取物的制备方法，其特征在于，所述三叶青药材为三叶青的干燥块根。

3.如权利要求1所述的一种三叶青抗肿瘤提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中高浓度乙醇浓度为95％；所述步骤(2)中低浓度乙醇浓度为60％。

4.一种三叶青抗肿瘤提取物，其特征在于，采用权利要求1-3的任意一项制备得到。

5.根据权利要求4所述的三叶青抗肿瘤提取物的应用。