CN108342347A - Bdsf高产菌株及其发酵优化方法和应用 - Google Patents

Bdsf高产菌株及其发酵优化方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种BDSF高产菌株BL21(DE3)plysS/pET14b‑rpfF(BLSF)及其构建方法和应用，所述BDSF高产菌株是采用基因工程方法，将RpfF蛋白编码基因rpfF克隆至BL21(DE3)plysS菌株中获得。该菌株可稳定且高效生产BDSF。本发明还提供了一种用于培养BDSF高产菌株的培养基及发酵方法，由此可显著提高BDSF的产量，且BLSF高产菌株在优化培养基中能保持后期产量的稳定性，最高产量可达到1937.75±72.25μM。

Description

BDSF高产菌株及其发酵优化方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程菌株技术领域和微生物发酵优化方法技术领域，具体地说，涉及一种顺式-2-十二碳烯酸(BDSF)高产菌株及其发酵优化方法和应用。
背景技术
群体感应(Quorum Sensing,QS)是细菌感知自身群体密度、进行相互交流的一种重要方式。具体地说，细菌在特定的环境中，能够产生并释放一种或多种小的信号分子，即群体感应信号分子，当这些信号分子的胞外浓度达到某一特定阈值时，可以被细菌表面或胞质中的受体感应，诱导相关基因表达，调节特定的生物学功能。DSF(diffusible signalfactor)是近年来在野油菜黄单胞菌中首先鉴定的一个新型群体感应信号分子，其化学结构为顺式-11-甲基-2-十二碳烯酸，可诱导致病相关基因的表达、抑制生物膜形成、促进黄单胞菌通过调整代谢适应高群体密度环境。DSF信号分子依赖的群体感应机制是一类在革兰氏阴性菌广泛存在且保守的细胞之间相互交流的一种重要机制。随后的研究表明，DSF信号家族(DSF family signals)主要包括如下几种信号分子：DSF(顺式-11-甲基-2-十二碳烯酸)、BDSF(顺式-2-十二碳烯酸)、CDSF(顺式-11-甲基-2,5-十二碳二烯酸)、IDSF(顺式-10-甲基-2-十二碳烯酸)等顺式-2-不饱和脂肪酸，参与调节黄单胞菌多种生物学功能。因此，该类顺式-2-不饱和脂肪酸信号小分子统称为DSF群体感应信号家族。
BDSF是DSF群体感应信号家族的一员，由野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampetris pv.campestris,Xcc)、水稻白叶枯菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)、洋葱伯克氏菌(Burkholderia cepacia complex,Bcc)合成，作为种内群体感应信号分子，具有调控生物膜形成和致病因子表达等多种生物学功能。BDSF也作为种间信号分子，在微生物稳态和竞争生存中发挥重要作用。近年来研究发现，BDSF可以调节根植于囊性纤维化气管中的铜绿假单胞菌的致病性、抗生素耐药性，可以显著抑制白色念珠菌对导尿管的黏附作用，还可以引发植物免疫反应、协同抵御病害侵染。因此，BDSF已成为了一种极具科研价值和应用潜力的群体感应信号分子。
抗生素的广泛使用，特别是滥用，促进了耐药超级病菌的出现，对耐药超级病菌的防治已成为全球医疗卫生领域的一项难题。前期研究表明，DSF家族信号分子与抗生素联用可提高一系列致病菌或机会致病菌对抗生素的敏感性，包括苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)、微黄奈瑟氏菌(Neisseria subflava)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。其中，BDSF与抗生素联合作用，能有效降低洋葱伯克氏菌的致病性，BDSF与伊曲康唑联合用药对临床耐药白色念珠菌也呈现协同抑菌作用。由此可见，BDSF具备一定的医疗应用潜力。
RpfF是黄单胞菌DSF家族信号分子生物合成过程中的关键酶，具有脱水酶和硫酯酶双重活性，但其生物活性受到RpfC蛋白的抑制。此外，RpfB具有酯酰辅酶A连接酶的功能，参与降解DSF家族信号分子。通过对Xcc中DSF家族信号分子生物合成途径的研究发现，DSF、BDSF、IDSF的生物合成需要大量的碳水化合物(如蔗糖、葡萄糖等)。然而，培养基中亮氨酸含量的增加有利于DSF合成，异亮氨酸含量的增加则有利于IDSF合成，因此，发酵培养基的组成对各种DSF信号分子的产量及比率至关重要(Zhou L,Yu YH,Chen XP,et al.TheMultiple DSF-family QS Signals are Synthesized from Carbohydrate and Branchedchain Amino Acids via the FAS Elongation Cycle.Scientific Reports,2015,5:13294)。
目前BDSF生物合成方法主要依赖于野油菜黄单胞菌(Xcc)双敲除突变体ΔrpfCΔrpfB(rpfC和rpfB被同时敲除)的发酵。利用微生物丰富培养基NA，28℃发酵该菌株，所获得BDSF的最高产量为10μM(Zhou L,Wang XY,Sun S,et al.Identification andcharacterization of naturally occurring DSF-family quorum sensing signalturnover system in the phytopathogen Xanthomonas.EnvironmentalMicrobiology.2015Nov；17(11):4646-58)。然而，28℃控温发酵生产过程会产生高能耗的问题，增加了BDSF生产成本。且Xcc作为植物病原菌，发酵后处理工艺也比大肠杆菌更为复杂。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，针对现有技术不足，提供一种顺式-2-十二碳烯酸(BDSF)高产菌株及其发酵优化方法和应用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
第一方面，本发明提供了一种BDSF高产菌株，采用基因工程方法，将RpfF蛋白编码基因rpfF克隆至BL21(DE3)plysS菌株中获得。
第二方面，本发明提供了一种BDSF高产菌株的构建方法，所述构建方法具体包括以下步骤：
以野油菜黄单胞菌野生型菌株8004的基因组DNA为模板，通过聚合酶链式反应扩增BDSF生物合成所必须的RpfF蛋白编码基因rpfF，并将该基因片段插入表达质粒中，置于强启动子T7控制下，构建重组质粒；
然后将该重组质粒导入BL21(DE3)plysS菌株中，构建成基因工程菌株，即所述BDSF高产菌株。
优选地，所述表达质粒为pET14b，所述构建的重组质粒为pET14b-rpfF。
优选地，所述用于扩增RpfF蛋白编码基因rpfF的引物序列如SEQ No.1和SEQ No.2所示。
第三方面，本发明提供了一种用于培养BDSF高产菌株的BBM培养基，其特征在于，所述BBM培养基包括以下浓度的各组分：胰蛋白胨12.15～13.32g/L；酵母粉15.12～15.35g/L；甘油5.7mL/L；蔗糖为20g/L；黄豆粉为40g/L；磷酸氢二钾为12.54g/L；磷酸二氢钾为2.31g/L。
优选地，所述BBM培养基初始pH为6.9-7.2。
第四方面，本发明提供了一种BDSF高产菌株的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
将BDSF高产菌株接种于LB培养基平板上，在37℃下活化培养16-24小时；
将经活化的BDSF高产菌株的单菌落接种于含羧苄青霉素的液体BBM培养基中，摇床震荡培养12小时；然后进行扩大发酵培养，即可。
优选地，所述BBM培养基包括以下浓度的各组分：胰蛋白胨12.15～13.32g/L；酵母粉15.12～15.35g/L；甘油5.7mL/L；蔗糖为20g/L；黄豆粉为40g/L；磷酸氢二钾为12.54g/L；磷酸二氢钾为2.31g/L。
优选地，所述含羧苄青霉素的液体BBM培养基中，羧苄青霉素的浓度为100mg/L。
优选地，所述BBM培养基初始pH为6.9-7.2。
第五方面，本发明提供了一种如权利要求1所述的BDSF高产菌株在生物合成BDSF中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、本发明通过将合成BDSF所必须的RpfF蛋白编码基因rpfF克隆至大肠杆菌菌株BL21(DE3)plysS中，获得了一种BDSF高产工程菌株，可稳定且高效生产BDSF。与现有技术中采用野油菜黄单胞菌或洋葱伯克霍尔德菌等致病菌培养相比生产更安全，且其发酵温度为37℃，大大降低了生产过程中的控温能耗，节约了生产成本。
2、本发明通过将BDSF高产菌株在改良后的培养基中进行发酵，可显著提高BDSF的产量，菌株BLSF在优化培养基中能保持后期产量的稳定性，最高产量可达到1937.75±72.25μM，比利用野油菜黄单胞菌(Xcc)双敲除突变体ΔrpfCΔrpfB发酵生产BDSF所能获得的最高产量提高近200倍。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为基因重组质粒pET14b-rpfF的构建示意图；
图2为实施例2和对比例1-3中各工程菌株利用LB培养基发酵培养72小时BDSF产量；
图3为实施例2和对比例1-3中各工程菌株利用LB培养基发酵培养过程中的生长曲线；
图4为实施例3中BLSF在各培养基中的生长曲线及BDSF产量比较；其中，图4A为BDSF产量；图4B为发酵液吸光光度值OD600；
图5为实施例3中不同辅助碳氮源下BDSF产量比较；其中图5A为不同辅助碳源；图5B为不同辅助氮源；
图6为实施例3中发酵培养基中各单一培养基组分浓度对BDSF产量的影响；
图7为实施例3中7因素的标准化效应；
图8为实施例3中影响BDSF产量的胰蛋白胨和酵母粉两种培养基组分相互影响的等高线图；
图9为实施例3中影响BDSF产量的胰蛋白胨和酵母粉两种培养基组分相互影响的3D图；
图10为对比例3中pET28a-rpfF的构建示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明以野油菜黄单胞菌野生型菌株8004(Xanthomonas campetrispv.campestris strain 8004)基因组DNA为模板，通过聚合酶链式反应扩增BDSF生物合成所必须的RpfF蛋白编码基因rpfF，并将该基因片段插入表达质粒pET14b中，置于强启动子T7控制下，构建重组质粒pET14b-rpfF；然后将该重组质粒pET14b-rpfF导入BL21(DE3)plysS菌株中，构建成基因工程菌株BL21(DE3)plysS/pET14b-rpfF，并将其命名为BLSF。
随后对BLSF的培养基进行优化，得到BLSF高产BDSF的最优培养基BBM，该培养基含有碳源、氮源、无机盐和水，培养基初始pH为6.9-7.2。
实施例1BDSF高产菌株(BLSF)的构建
1、扩增BDSF生物合成所必须的RpfF蛋白编码基因rpfF。
首先根据GenBank中Xcc8004菌株RpfF蛋白编码基因rpfF序列设计引物，引物的核苷酸序列如下：
上游引物(SEQ ID No.1)：
5'-CCGCTCGAGATGTCTGCAGTTCAACCCTTCATTC-3'；
下游引物(SEQ ID No.2)：
5'-CCGCTCGAGTCAGCCCGCGTCGAGCCCTG-3'。
序列中下划线为限制性内切酶XhoⅠ的酶切位点。该引物委托上海生工生物工程技术服务公司合成。然后，以Xcc8004菌株基因组DNA为模板，利用DNA聚合酶Taq和设计的引物来扩增BDSF生物合成的编码基因。扩增产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的条带。PCR产物的全长为888bp。基因片段的准确性经核苷酸测序验证。
Xcc8004菌株为实验室保存菌株，NCBI(National Centre for BiotechnologyInformation，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上全基因组序列编号为NC_007086.1。Xcc8004菌株的RpfF蛋白编码基因rpfF序列如SEQ ID No.3所示。Xcc8004菌株基因组DNA的制备利用细菌基因组DNA小量提取试剂盒(北京普博欣生物科技有限责任公司)进行，基因片段的回收利用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(上海正晃商务有限公司)进行。DNA聚合酶Taq购自Takara上海博彩生物有限公司，具体的反应条件和使用的方法均参考商业说明书。
2、构建重组质粒pET14b-rpfF
将回收的PCR片段，经限制性内切酶XhoⅠ酶切，T4连接酶连接，插入同样经限制性内切酶XhoⅠ酶切的表达质粒pET14b，将BDSF生物合成编码基因rpfF的表达置于强启动子T7的控制下，形成重组质粒pET14b-rpfF并转化进入大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布到含羧卞青霉素(carbenicilin,carb)100mg/L的LB培养基平板上于37℃培养，得阳性克隆菌落pET14b-rpfF/DH5α，从中提取构建的基因重组质粒pET14b-rpfF。上海生工生物工程技术服务公司对重组质粒中的RpfF蛋白编码基因rpfF插入片段进行测序。测序序列与GenBank中Xcc8004菌株RpfF蛋白编码基因rpfF序列比对，一致性为100％。
构建的基因重组质粒pET14b-rpfF如图1所示。
限制性内切酶Xho Ⅰ和T4连接酶购自Takara公司，具体的反应条件和使用的方法均参考商业说明书。大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备、转化以及重组质粒的提取和验证参照J.萨姆布鲁克、D.W.拉塞尔编著，2012年科学出版社出版的《分子克隆实验指南(第三版)》中提供方法进行。
3、构建基因工程菌株BL21(DE3)plysS/pET14b-rpfF
制备大肠杆菌BL21(DE3)plysS的感受态细胞，并将上述重组质粒pET14b-rpfF转化到BL21(DE3)plysS的感受态细胞中，在37℃条件下，培养一天，从中筛选出基因工程菌株BL21(DE3)plysS/pET14b-rpfF，并将其命名为BLSF。
BL21(DE3)plysS细胞购自Thermo Fisher公司。BL21(DE3)plysS的感受态细胞的制备方法、重组质粒pET14b-rpfF转化进入大肠杆菌DH5α以及高产BDSF的基因工程菌株BL21(DE3)plysS/pET14b-rpfF的筛选方法，均参照J.萨姆布鲁克、D.W.拉塞尔编著，2012年科学出版社出版的《分子克隆实验指南(第三版)》中提供方法进行。
实施例2BDSF高产菌株(BLSF)的常规发酵培养
将基因工程菌株BLSF接种在LB培养基平板上，在37℃下活化培养16-24小时；然后将活化的BLSF单菌落接种到含羧苄青霉素100mg/L的10mL液体培养基、体积为250毫升的三角瓶中，在37℃的摇床中振荡培养12小时。最后转接到含羧苄青霉素100mg/L的50mLLB液体培养基、体积为250毫升的三角瓶中，进行扩大发酵培养，在37℃的摇床中以220转/分的转速振荡培养72小时。BLSF菌株的最高产量为161.79μM(图2)，生长曲线如图3所示。
1升LB培养基中包括胰蛋白胨10克、酵母提取物5克、氯化钠10克、琼脂15克，且pH7.0-7.4。BDSF的提取方法：取发酵菌液500μL于2mL离心管中，加入1mL乙酸乙酯，涡旋振荡2分钟，将1mL乙酸乙酯上清转移至新的1.5mL离心管中，40℃离心浓缩20分钟，乙酸乙酯挥发后所得干粉保存于负二十度冰箱中。BDSF的分析方法采用实验室常规BDSF分析方法(Zhou L,Wang XY,Sun S,et al.Identification and characterization of naturallyoccurring DSF-family quorum sensing signal turnover system in thephytopathogen Xanthomonas.Environmental Microbiology.2015Nov；17(11):4646-58)。
实施例3优化BDSF高产菌株(BLSF)发酵培养基
1、初始发酵培养基的选择
通过比较了工程菌株BLSF在LB、TB、SOB、M9四种液体培养基中的生长情况(OD600值)和相应的BDSF产量发现：在同样的发酵条件下(发酵温度：37℃，摇床转速：220转/分；发酵时间：72小时)，工程菌株BLSF在TB液体培养基培养基中BDSF产量最高，可达638.42μM(图4A)，且生物量最高(图4B)。因此，在今后的发酵条件优化实验中，TB培养基被选定为工程菌株BLSF发酵生产BDSF的初始培养基。
2、单因素试验
在TB培养基的基础上分别添加不同的辅助碳氮源，并维持所添加组分的终浓度均为40g/L，比较工程菌株BLSF在添加了这些组分后的BDSF产量。在不改变初始发酵培养基组分及发酵条件下，分别添加乳糖、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖作为辅助碳源，经发酵后测得BDSF产量如图5A所示，当以蔗糖为辅助碳源时，BDSF的产量明显高于以乳糖、葡萄糖、麦芽糖作为碳源时的产量，所以确定培养基辅助碳源确定为蔗糖。在不改变初始产BDSF培养基组分及发酵条件，分别添加黄豆粉、牛肉膏、硫酸铵、玉米浆作为辅助氮源，经发酵后测得BDSF产量如图5B所示，当以黄豆粉为辅助氮源时，BDSF的产量最高，因此黄豆粉是所测试氮源中最有助于提高BDSF产量的辅助氮源。综上所述，蔗糖和黄豆粉对提高高产菌株BLSF的BDSF产量具有显著作用。
3、各组分最佳浓度试验
在初始培养基TB的基础上，在不改变其他培养基组分和发酵条件的基础上，通过单一性地调整培养基中各组分(包括酵母粉、胰蛋白胨、蔗糖、甘油和黄豆粉)在培养基中的含量，并比较工程菌株BLSF的BDSF产量，以进一步优化发酵培养基中各组分的最适浓度。结果如图6所示：当酵母粉浓度为0.3g/50mL时，BDSF的产量达到最大，随后随着酵母粉浓度的升高，BDSF的产量逐渐下降。胰蛋白胨浓度为0g/50mL时，BDSF的产量达到最高，随着胰蛋白胨浓度的增加，BDSF的产量逐渐下降。随着蔗糖浓度的增加，BDSF的产量先增加后下降，在蔗糖浓度为1g/50mL时，BDSF的产量达到最高。甘油和黄豆粉对BDSF的产量影响如蔗糖，甘油的最适浓度为0.36g/50mL(即5.7mL/L)，黄豆粉的最适浓度为2g/50mL。
4、Plackett-Burman(PB)实验
如表1所示，选择酵母粉、胰蛋白胨、蔗糖、甘油、黄豆粉、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾这7个培养基组分作为筛选的变量，参考单因子实验结果，各变量取-1和1两个水平，得到共12种培养基(实验组)。分别以同样的发酵条件(发酵温度：37℃，摇床转速：220转/分；发酵时间：72小时)展开PB实验，比较高产菌株BLSF在各培养基中BDSF的产量。最后，运用统计学软件Minitab 15.0分析实验结果，设计置信区间为95％。PB实验结果如表2所示，在由7个培养基组分组合配置的12种培养基中发酵高产菌株BLSF，所得BDSF产量具有显著差异。其中，第11实验组所得BDSF产量最高，可达658.64μM，而第12组所得BDSF产量最低，仅为50.59μM。由不同培养基组分的标准效应图(图7)可知，酵母粉和胰蛋白胨是影响BDSF产量的主效应成分，并且酵母粉对BDSF产量的作用强于胰蛋白胨的作用效果。
表1PB设计筛选各因素变化水平表
表2PB试验设计发酵BDSF的产量
表2中，变量水平(X1～X7)与表1中的变量(x1～x7)的关系为：X7＝40+8x7；X6＝40+8x6；X5＝2.25+0.45x5；X4＝15+3x4；X3＝7.2+1.2x3；X2＝1+x2；X1＝1+x1。
5、最陡爬坡试验
当PB实验设计中的各实验组可能不包含使目标产物产量达到最高的组合时，通常采用最陡爬坡法来逼近目标产物最大产量。最陡爬坡法以实验值变化的梯度方向为爬坡方向，根据各因素效应值的大小确定变化步长，能快速地逼近最佳区域。由PB实验可以得到如下简化的模型，其中Y代表BDSF的产量，x1、x2、x3、x4、x5、x6、x7分别代表如表1所示培养基组分的量：Y＝362+127x1+150x2+41.4x3-3.3x4-4.6x5+6.9x6-40.5x7。该模型的R-Sq(调整)为88.3％，表示88.3％的情况都可以被该模型预测成功。该模型的F值为12.90，其P值为0.013<0.05，则证明该模型有差异显著性。由于在PB实验中已经确定酵母粉和胰蛋白胨是影响BDSF产量的主效应成分，故爬坡实验中也选用这两个组分作为变量，并根据PB实验模型x1和x2变量的系数127：150(根据前述的公式计算得到)，确定x1和x2在最陡爬坡试验中的步长为Δx2＝1，Δx1＝0.8。首先进行了最陡爬坡试验的预实验，将x1和x2的步长设计为4步Δx2＝4，4步Δx1＝3.2，逼近x1和x2的最优范围，实验结果如表3所示，第4组培养基(12Δx1、12Δx2)的BDSF产量最高，因此该组培养基已经靠近最优培养基范围。随后，将x1和x2的步长设计为1步，Δx2＝1，Δx1＝0.8，进一步逼近x1和x2的最优范围，结果如表4所示，组合2的BDSF产量最高，证明其接近最优点，故将其最为中心组合实验的中心点。
表3最陡爬坡试验设计(步长设计为4步)与结果
表4最陡爬坡试验设计(步长设计为1步)与结果
6、RSM优化培养基组分模型的建立及分析
通过最陡爬坡实验，我们可以确定中心组合实验的中心点，以此为基础，对2种培养基组分，包括酵母粉和胰蛋白胨，进行了优化设计。分别以这2种培养基组分作为中心组合实验的2个变量，其中，x1和X1代表胰蛋白胨，x2和X2代表酵母粉。两个变量设定的编码值(x1和x2)和真实值(X1和X2)如表5所示。中心组合试验设计共有13次的试验组合，在各个试验组合下，高产菌株发酵所得BDSF产量如表5所示。利用Design expert 8.0数据处理软件进行数据分析，得到回归方程：Y＝1834.78+12.52×2x1+82.89×x2﹣12.67×x1×x2-110.85×x1 2-181.54×x2 2。回归方程式中的Y为预测的响应值，x1和x2分别为胰蛋白胨和酵母粉的编码水平值。
表5中每组试验均有一个模型预测值和实际值相对应，两者数值具有很好的一致性，模型的调整相关系数R2为0.9604，说明96.04％的变化都在此模型的拟合范围内。模型的预测相关系数为0.8642，和调整相关系数具有很好的一致性。响应面二次方程模型的回归系数和显著性结果如表6所示。模型的F值为59.19，显示了该模型具有差异显著性，仅有0.01％可能性该模型发生误差。失拟值为4.67，显示失拟值是不显著的，有8.52％的可能失拟值发生误差。酵母粉对BDSF的产量有显著影响(p<0.01)。该模型能够充分地预测变量在给定范围内的变化趋势，并对BDSF的产量进行准确的预测。
图8和图9分别显示了影响BDSF产量的两种培养基组分，包括酵母粉和胰蛋白胨，两两相互影响的等高线图和3D图。胰蛋白胨和酵母粉的等高线图呈现椭圆形状，显示了胰蛋白胨和酵母粉都对BDSF的产量具有促进作用，且胰蛋白胨对BDSF的产量影响更大。
由回归方程经过换算,得到的最优培养基(BBM)配方为：胰蛋白胨12.15～13.32g/L；酵母粉15.12～15.35g/L，甘油5.7mL/L，蔗糖20g/L，黄豆粉40g/L，磷酸氢二钾12.54g/L，磷酸二氢钾2.31g/L。
表5中心组合实验设计的实验值和预测值
表5中，X1＝0.8×x1+12.2；X2＝1×x2+15。
表6响应面二次方程模型的回归系数和显著性
实施例4利用优化培养基BBM摇瓶发酵培养BDSF高产菌株BLSF
将基因工程菌株BLSF接种在LB培养基平板上，在37℃下活化培养16-24小时；然后将活化的BLSF单菌落接种到含羧苄青霉素100mg/L的10mL BBM液体培养基(胰蛋白胨12.15～13.32g/L；酵母粉15.12～15.35g/L，甘油5.7mL/L，蔗糖20g/L，黄豆粉40g/L，磷酸氢二钾12.54g/L，磷酸二氢钾2.31g/L)、体积为250毫升的三角瓶中，在37℃的摇床中振荡培养12小时。最后转接到含羧苄青霉素100mg/L的50mLBBM液体培养基、体积为250毫升的三角瓶中，进行扩大发酵培养，在37℃的摇床中，以220转/分的转速，振荡培养96小时，BDSF产量可达1937.75±72.25μM。
对比例1工程菌株BL21(DE3)/pET14b-rpfF的构建及其发酵培养
1、扩增BDSF生物合成所必须的RpfF蛋白编码基因rpfF。
首先根据GenBank中Xcc8004菌株RpfF蛋白编码基因rpfF序列设计引物，引物的核苷酸序列如下：
上游引物(SEQ ID No.1)：
5'-CCGCTCGAGATGTCTGCAGTTCAACCCTTCATTC-3'；
下游引物(SEQ ID No.2)：
5'-CCGCTCGAGTCAGCCCGCGTCGAGCCCTG-3'。
序列中下划线为限制性内切酶XhoⅠ的酶切位点。该引物委托上海生工生物工程技术服务公司合成。然后，以Xcc8004菌株基因组DNA为模板，利用DNA聚合酶Taq和设计的引物来扩增BDSF生物合成的编码基因。扩增产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的条带。PCR产物的全长为888bp。基因片段的准确性经核苷酸测序验证。
Xcc8004菌株基因组DNA的制备利用细菌基因组DNA小量提取试剂盒(北京普博欣生物科技有限责任公司)进行，基因片段的回收利用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(上海正晃商务有限公司)进行。DNA聚合酶Taq购自Takara上海博彩生物有限公司，具体的反应条件和使用的方法均参考商业说明书。
2、构建重组质粒pET14b-rpfF
将回收的PCR片段，经限制性内切酶XhoⅠ酶切，T4连接酶连接，插入同样经限制性内切酶XhoⅠ酶切的表达质粒pET14b，将BDSF生物合成编码基因rpfF的表达置于强启动子T7的控制下，形成重组质粒pET14b-rpfF并转化进入大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布到含羧卞青霉素(carbenicilin,carb)100mg/L的LB培养基上于37℃培养，得阳性克隆菌落pET14b-rpfF/DH5α，从中提取构建的基因重组质粒pET14b-rpfF。对重组质粒的目的基因片段寄送至上海生工生物工程技术服务公司进行测序。测序序列与GenBank中Xcc8004菌株RpfF蛋白编码基因rpfF序列比对同源性为100％。
构建的基因重组质粒pET14b-rpfF如图1所示。
限制性内切酶Xho Ⅰ和T4连接酶购自Takara公司，具体的反应条件和使用的方法均参考商业说明书。大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备、转化以及重组质粒的提取和验证参照J.萨姆布鲁克、D.W.拉塞尔编著，2012年科学出版社出版的《分子克隆实验指南(第三版)》中提供方法进行。
3、构建基因工程菌株BL21(DE3)/pET14b-rpfF
制备大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞，并将上述重组质粒pET14b-rpfF转化到BL21(DE3)的感受态细胞中，在37℃条件下，培养一天，从中筛选出基因工程菌株BL21(DE3)/pET14b-rpfF。
BL21(DE3)菌株购自Thermo Fisher公司。BL21(DE3)的感受态细胞的制备方法、重组质粒pET14b-rpfF转化进入大肠杆菌DH5α以及高产BDSF的基因工程菌株BL21(DE3)/pET14b-rpfF的筛选方法，均参照J.萨姆布鲁克、D.W.拉塞尔编著，2012年科学出版社出版的《分子克隆实验指南(第三版)》中提供方法进行。
4、BL21(DE3)/pET14b-rpfF的常规发酵培养
将基因工程菌株BL21(DE3)/pET14b-rpfF接种在LB培养基平板上，在37℃下活化培养16-24小时；然后将活化的BL21(DE3)/pET14b-rpfF单菌落接种到含羧苄青霉素100mg/L的10mL LB液体培养基、体积为250毫升的三角瓶中，在37℃的摇床中振荡培养12小时。最后转接到含羧苄青霉素100mg/L的50mL LB液体培养基、体积为250毫升的三角瓶中，进行扩大发酵培养，在37℃的摇床中，以220转/分的转速，振荡培养72小时。BL21(DE3)/pET14b-rpfF菌株的最高产量为128.76μM(图2)，生长曲线如图3所示。
1升LB培养基中包括胰蛋白胨10克、酵母提取物5克、氯化钠10克、琼脂15克，且pH7.0-7.4。BDSF的提取方法：取发酵菌液500μL于2mL离心管中，加入1mL乙酸乙酯，涡旋振荡2分钟，将1mL乙酸乙酯上清转移至新的1.5mL离心管中，40℃离心浓缩20分钟，乙酸乙酯挥发后所得干粉保存于负二十度冰箱中。BDSF的分析方法采用实验室常规BDSF分析方法(Zhou L,Wang XY,Sun S,et al.Identification and characterization of naturallyoccurring DSF-family quorum sensing signal turnover system in thephytopathogen Xanthomonas.Environmental Microbiology.2015Nov；17(11):4646-58)。
5、BL21(DE3)/pET14b-rpfF利用BBM培养基的发酵培养
将基因工程菌株BL21(DE3)/pET14b-rpfF接种在LB培养基平板上，在37℃下活化培养16-24小时；然后将活化的BLSF单菌落接种到含羧苄青霉素100mg/L的10mL BBM液体培养基(胰蛋白胨12.15～13.32g/L；酵母粉15.12～15.35g/L，甘油5.7mL/L，蔗糖20g/L，黄豆粉40g/L，磷酸氢二钾12.54g/L，磷酸二氢钾2.31g/L)、体积为250毫升的三角瓶中，在37℃的摇床中振荡培养12小时。最后转接到含羧苄青霉素100mg/L的50mLBBM液体培养基、体积为250毫升的三角瓶中，进行扩大发酵培养，在37℃的摇床中，以220转/分的转速，振荡培养96小时，BDSF产量为1011.68±11.23μM。
对比例2工程菌株BL21(DE3)plysE/pET14b-rpfF的构建及其发酵培养
1、扩增BDSF生物合成所必须的RpfF蛋白编码基因rpfF。
首先根据GenBank中Xcc8004菌株RpfF蛋白编码基因rpfF序列设计引物，引物的核苷酸序列如下：
上游引物(SEQ ID No.1)：
5'-CCGCTCGAGATGTCTGCAGTTCAACCCTTCATTC-3'；
下游引物(SEQ ID No.2)：
5'-CCGCTCGAGTCAGCCCGCGTCGAGCCCTG-3'。
序列中下划线为限制性内切酶XhoⅠ的酶切位点。该引物委托上海生工生物工程技术服务公司合成。然后，以Xcc8004菌株基因组DNA为模板，利用DNA聚合酶Taq和设计的引物来扩增BDSF生物合成的编码基因。扩增产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的条带。PCR产物的全长为888bp。基因片段的准确性经核苷酸测序验证。
Xcc8004菌株基因组DNA的制备利用细菌基因组DNA小量提取试剂盒(北京普博欣生物科技有限责任公司)进行，基因片段的回收利用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(上海正晃商务有限公司)进行。DNA聚合酶Taq购自Takara上海博彩生物有限公司，具体的反应条件和使用的方法均参考商业说明书。
2、构建重组质粒pET14b-rpfF
将回收的PCR片段，经限制性内切酶XhoⅠ酶切，T4连接酶连接，插入同样经限制性内切酶XhoI酶切的表达质粒pET14b，将BDSF生物合成编码基因rpfF的表达置于强启动子T7的控制下，形成重组质粒pET14b-rpfF并转化进入大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布到含羧卞青霉素(carbenicilin,carb)100mg/L的LB培养基上于37℃培养，得阳性克隆菌落pET14b-rpfF/DH5α，从中提取构建的基因重组质粒pET14b-rpfF。对重组质粒的目的基因片段寄送至上海生工生物工程技术服务公司进行测序。测序序列与GenBank中Xcc8004菌株RpfF蛋白编码基因rpfF序列比对同源性为100％。
构建的基因重组质粒pET14b-rpfF如图1所示。
限制性内切酶XhoⅠ和T4连接酶购自Takara公司，具体的反应条件和使用的方法均参考商业说明书。大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备、转化以及重组质粒的提取和验证参照J.萨姆布鲁克、D.W.拉塞尔编著，2012年科学出版社出版的《分子克隆实验指南(第三版)》中提供方法进行。
3、构建基因工程菌株BL21(DE3)plysE/pET14b-rpfF
制备大肠杆菌BL21(DE3)plysE的感受态细胞，并将上述重组质粒pET14b-rpfF转化到BL21(DE3)plysE的感受态细胞中，在37℃条件下，培养一天，从中筛选出基因工程菌株BL21(DE3)plysE/pET14b-rpfF。
BL21(DE3)plysE细胞购自Thermo Fisher公司。BL21(DE3)plysE感受态细胞的制备方法、重组质粒pET14b-rpfF转化进入大肠杆菌DH5α以及高产BDSF的基因工程菌株BL21(DE3)plysE/pET14b-rpfF的筛选方法，均参照J.萨姆布鲁克、D.W.拉塞尔编著，2012年科学出版社出版的《分子克隆实验指南(第三版)》中提供方法进行。
4、BL21(DE3)plysE/pET14b-rpfF的常规发酵培养
将基因工程菌株BL21(DE3)plysE/pET14b-rpfF接种在LB培养基平板上，在37℃下活化培养16-24小时；然后将活化的BL21(DE3)plysE/pET14b-rpfF单菌落接种到含羧苄青霉素100mg/L的10mL LB液体培养基、体积为250毫升的三角瓶中，在37℃的摇床中振荡培养12小时。最后转接到含羧苄青霉素100mg/L的50mL LB液体培养基、体积为250毫升的三角瓶中，进行扩大发酵培养，在37℃的摇床中，以220转/分的转速，振荡培养72小时。BL21(DE3)plysE/pET14b-rpfF菌株的最高产量为112.53μM(图2)，生长曲线如图3所示。
1升LB培养基中包括胰蛋白胨10克、酵母提取物5克、氯化钠10克、琼脂15克，且pH7.0-7.4。BDSF的提取方法：取发酵菌液500μL于2mL离心管中，加入1mL乙酸乙酯，涡旋振荡2分钟，将1mL乙酸乙酯上清转移至新的1.5mL离心管中，40℃离心浓缩20分钟，乙酸乙酯挥发后所得干粉保存于负二十度冰箱中。BDSF的分析方法采用实验室常规BDSF分析方法(Zhou L,Wang XY,Sun S,et al.Identification and characterization of naturallyoccurring DSF-family quorum sensing signal turnover system in thephytopathogen Xanthomonas.Environmental Microbiology.2015Nov；17(11):4646-58)。
5、BL21(DE3)plysE/pET14b-rpfF利用BBM培养基的发酵培养
将基因工程菌株BL21(DE3)plysE/pET14b-rpfF接种在LB培养基平板上，在37℃下活化培养16-24小时；然后将活化的BLSF单菌落接种到含羧苄青霉素100mg/L的10mL BBM液体培养基(胰蛋白胨12.15～13.32g/L；酵母粉15.12～15.35g/L，甘油5.7mL/L，蔗糖20g/L，黄豆粉40g/L，磷酸氢二钾12.54g/L，磷酸二氢钾2.31g/L)、体积为250毫升的三角瓶中，在37℃的摇床中振荡培养12小时。最后转接到含羧苄青霉素100mg/L的50mLBBM液体培养基、体积为250毫升的三角瓶中，进行扩大发酵培养，在37℃的摇床中，以220转/分的转速，振荡培养96小时，BDSF产量为986.79±22.14μM。
对比例3工程菌株BL21(DE3)plysS/pET28a-rpfF的构建及其发酵培养
1、扩增BDSF生物合成所必须的RpfF蛋白编码基因rpfF。
首先根据GenBank中Xcc8004菌株RpfF蛋白编码基因rpfF序列设计引物，引物的核苷酸序列如下：
上游引物(SEQ ID No.3)：
5'-GGAATTCGATGTCTGCAGTTCAACCCTTCATTC-3'；
下游引物(SEQ ID No.4)：
5'-CCCAAGCTTTCAGCCCGCGTCGAGCCCTG-3'。
上下游引物序列中下划线分别为限制性内切酶EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ的酶切位点。该引物委托上海生工生物工程技术服务公司合成。然后，以Xcc8004菌株基因组DNA为模板，利用DNA聚合酶Taq和设计的引物来扩增BDSF生物合成的编码基因。扩增产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的条带。PCR产物的全长为887bp。基因片段的准确性经核苷酸测序验证。
Xcc8004菌株基因组DNA的制备利用细菌基因组DNA小量提取试剂盒(北京普博欣生物科技有限责任公司)进行，基因片段的回收利用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(上海正晃商务有限公司)进行。DNA聚合酶Taq购自Takara上海博彩生物有限公司，具体的反应条件和使用的方法均参考商业说明书。
2、构建重组质粒pET28a-rpfF
将回收的PCR片段，经限制性内切酶EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切，T4连接酶连接，插入同样经限制性内切酶EcoR Ⅰ和HindⅢ双酶切的表达质粒pET28a，将BDSF生物合成编码基因rpfF的表达置于强启动子T7的控制下，形成重组质粒pET28a-rpfF并转化进入大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布到含卡那霉素(Kanamycin,Kana)50mg/L的LB培养基上于37℃培养，得阳性克隆菌落pET28a-rpfF/DH5α，从中提取构建的基因重组质粒pET28a-rpfF。对重组质粒的目的基因片段寄送至上海生工生物工程技术服务公司进行测序。测序序列与GenBank中Xcc8004菌株RpfF蛋白编码基因rpfF序列比对同源性为100％。
构建的基因重组质粒pET28a-rpfF如图10所示。
限制性内切酶EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ和T4连接酶购自Takara公司，具体的反应条件和使用的方法均参考商业说明书。大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备、转化以及重组质粒的提取和验证参照J.萨姆布鲁克、D.W.拉塞尔编著，2012年科学出版社出版的《分子克隆实验指南(第三版)》中提供方法进行。
3、构建基因工程菌株BL21(DE3)plysS/pET28a-rpfF
制备大肠杆菌BL21(DE3)plysS的感受态细胞，并将上述重组质粒pET28a-rpfF转化到BL21(DE3)plysS的感受态细胞中，在37℃条件下，培养一天，从中筛选出基因工程菌株BL21(DE3)plysS/pET14b-rpfF。
BL21(DE3)plysS细胞购自Thermo Fisher公司。BL21(DE3)plysS的感受态细胞的制备方法、重组质粒pET28a-rpfF转化进入大肠杆菌DH5α以及高产BDSF的基因工程菌株BL21(DE3)plysS/pET28a-rpfF的筛选方法，均参照J.萨姆布鲁克、D.W.拉塞尔编著，2012年科学出版社出版的《分子克隆实验指南(第三版)》中提供方法进行。
4、BL21(DE3)plysS/pET28a-rpfF的常规发酵培养
将基因工程菌株BL21(DE3)plysS/pET28a-rpfF接种在LB培养基平板上，在37℃下活化培养16-24小时；然后将活化的BL21(DE3)plysS/pET28a-rpfF单菌落接种到含卡那霉素50mg/L的10mL LB液体培养基、体积为250毫升的三角瓶中，在37℃的摇床中振荡培养12小时。最后转接到含卡那霉素50mg/L的50mL LB液体培养基、体积为250毫升的三角瓶中，进行扩大发酵培养，在37℃的摇床中，以220转/分的转速振荡培养72小时。BL21(DE3)plysS/pET28a-rpfF菌株的最高产量为4.70μM(图2)，生长曲线如图3所示。
1升LB培养基中包括胰蛋白胨10克、酵母提取物5克、氯化钠10克、琼脂15克，且pH7.0-7.4。BDSF的提取方法：取发酵菌液500μL于2mL离心管中，加入1mL乙酸乙酯，涡旋振荡2分钟，将1mL乙酸乙酯上清转移至新的1.5mL离心管中，40℃离心浓缩20分钟，乙酸乙酯挥发后所得干粉保存于负二十度冰箱中。BDSF的分析方法采用实验室常规BDSF分析方法(Zhou L,Wang XY,Sun S,et al.Identification and characterization of naturallyoccurring DSF-family quorum sensing signal turnover system in thephytopathogen Xanthomonas.Environmental Microbiology.2015Nov；17(11):4646-58)。
5、BL21(DE3)plysS/pET28a-rpfF利用BBM培养基的发酵培养
将基因工程菌株BL21(DE3)plysS/pET28a-rpfF接种在LB培养基平板上，在37℃下活化培养16-24小时；然后将活化的BLSF单菌落接种到含卡那霉素50mg/L的10mL BBM液体培养基(胰蛋白胨12.15～13.32g/L；酵母粉15.12～15.35g/L，甘油5.7mL/L，蔗糖20g/L，黄豆粉40g/L，磷酸氢二钾12.54g/L，磷酸二氢钾2.31g/L)、体积为250毫升的三角瓶中，在37℃的摇床中振荡培养12小时。最后转接到含卡那霉素50mg/L的50mLBBM液体培养基、体积为250毫升的三角瓶中，进行扩大发酵培养，在37℃的摇床中振荡培养，以220转/分的转速，振荡培养96小时，BDSF产量仅为63.37±8.14μM。
综上所述，对比例1采用BL21(DE3)/pET14b-rpfF菌株，与实施例相比，初始菌株由BL21(DE3)plysS变为BL21(DE3)，其他不变的条件下，无论利用LB普通培养基还是BBM培养基进行发酵培养，BDSF产量都显著低于实施例。对比例2初始菌株由BL21(DE3)plysS变为BL21(DE3)plysE，其他不变的条件下，菌株无论利用普通培养基还是BBM培养基进行发酵培养，BDSF产量都显著低于实施例。对比例3利用BL21(DE3)plysS/pET28a-rpfF菌株，与实施例相比，RpfF蛋白编码基因rpfF表达质粒由pET14b变为pET28a，无论利用LB普通培养基还是BBM培养基进行发酵培养，BDSF产量都显著低于实施例。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。
序列表
<120> BDSF高产菌株及其发酵优化方法和应用
<130> DAG32623
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccgctcgaga tgtctgcagt tcaacccttc attc 34
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccgctcgagt cagcccgcgt cgagccctg 29
<210> 3
<211> 870
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgtctgcag ttcaaccctt cattcgtacc aatattggct cgaccctacg catcatcgaa 60
gaaccgcagc gtgacgttta ctggatccat atgcatgccg acctggccat caatcccggg 120
cgggcctgtt tctcgacacg cctggtcgac gacatcactg gctaccagac caacctggga 180
caacgcttga atactgccgg tgtgctggcg ccgcacgtgg tgctggcatc ggacagcgac 240
gtgttcaatc tgggcggtga tctggccctg ttctgccaac tgatccgcga aggcgaccgc 300
gcccgccttc tcgactacgc ccaacgctgc gtgcgcggcg tgcatgcctt tcatgtcggc 360
ctgggcgcgc gtgcgcacag cattgcgctg gtccagggca atgcgcttgg cggcgggttc 420
gaagcggcac taagctgcca cacgatcatt gccgaggaag gcgtgatgat ggggctgccc 480
gaagtgctgt tcgacctatt tccggggatg ggcgcctact ccttcatgtg ccagcgcatc 540
agtgcgcacc tggcgcaaaa gatcatgctt gaaggcaacc tgtattcggc cgaacagctg 600
ctcggcatgg gcctggtcga ccgtgtggta ccgcgtggcc agggcgtggc cgcagtggaa 660
caggtgatcc gcgagagcaa gcgcacgcca cacgcgtggg cggcgatgca acaagtgcgc 720
gaaatgacca ccgccgtgcc gcttgaggag atgatgcgca tcaccgaaat ctgggtagat 780
accgccatgc aactcggcga aaaatcactg cgtaccatgg accgcctggt gcgcgcgcag 840
tcgcgtcgct cagggctcga cgcgggctga 870

Claims (9)

1.一种BDSF高产菌株，其特征在于，采用基因工程方法，将RpfF蛋白编码基因rpfF克隆至BL21(DE3)plysS菌株中获得。
2.一种BDSF高产菌株的构建方法，其特征在于，所述构建方法具体包括以下步骤：
以野油菜黄单胞菌野生型菌株8004的基因组DNA为模板，通过聚合酶链式反应扩增出BDSF生物合成所必须的RpfF蛋白编码基因rpfF，并将该基因片段插入表达质粒中，置于强启动子T7的控制下，构建重组质粒；
然后将该重组质粒导入BL21(DE3)plysS菌株中，构建成基因工程菌株，即所述BDSF高产菌株。
3.根据权利要求2所述的BDSF高产菌株的构建方法，其特征在于，所述表达质粒为pET14b，所述构建的重组质粒为pET14b-rpfF。
4.根据权利要求2所述的BDSF高产菌株的构建方法，其特征在于，所述用于扩增RpfF蛋白编码基因rpfF的引物序列如SEQ No.1和SEQ No.2所示。
5.一种用于培养BDSF高产菌株的BBM培养基，其特征在于，所述BBM培养基包括以下浓度的各组分：胰蛋白胨12.15～13.32g/L；酵母粉15.12～15.35g/L；甘油5.7mL/L；蔗糖为20g/L；黄豆粉为40g/L；磷酸氢二钾为12.54g/L；磷酸二氢钾为2.31g/L。
6.一种BDSF高产菌株的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
将BDSF高产菌株接种于LB培养基平板上，在37℃下活化培养16-24小时；
将经活化的BDSF高产菌株的单菌落接种于含羧苄青霉素的液体BBM培养基中，摇床震荡培养12小时；然后进行扩大发酵培养，即可。
7.根据权利要求6所述的BDSF高产菌株的培养方法，其特征在于，所述BBM培养基包括以下浓度的各组分：胰蛋白胨12.15～13.32g/L；酵母粉15.12～15.35g/L；甘油5.7mL/L；蔗糖为20g/L；黄豆粉为40g/L；磷酸氢二钾为12.54g/L；磷酸二氢钾为2.31g/L。
8.根据权利要求6所述的BDSF高产菌株的培养方法，其特征在于，所述含羧苄青霉素的液体BBM培养基中，羧苄青霉素的浓度为100mg/L。
9.一种如权利要求1所述的BDSF高产菌株在生物合成BDSF中的应用。
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