CN108329328B - 银杏内酯的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了银杏内酯的提取方法，包括以下步骤：1)将银杏叶粉碎，加入50～70v％乙醇回流提取，过滤，滤液调节pH值至4～5，减压浓缩，冷藏，备用；2)萃取：将冷藏液先用石油醚萃取，取水相加入乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯相减压浓缩，干燥，得到银杏内酯粗提物；3)将银杏内酯粗提物加水搅拌，加入氯化铵，微波辐射10～30s，得到混合液；4)将混合液上D131大孔树脂柱，水洗柱至无色，然后用60～80v％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收乙醇洗脱液中的乙醇，离心，过滤，取滤渣干燥即得银杏内酯。本发明提取的银杏内酯纯度高达98％以上。

Description

银杏内酯的提取方法

技术领域

本发明属于生物提取技术领域，具体涉及一种银杏内酯的提取方法。

背景技术

银杏(Ginkgo biloba L.)为银杏科银杏属多年生落叶乔木，属于中生代侏罗纪裸子植物，味甘、苦、涩，性平，归心、肺经，具有活血化瘀，通络止痛，敛肺平喘，化浊降脂的功效。银杏叶主要的化学成分包括黄酮类、萜内脂、聚戊烯醇和多糖类化合物。银杏萜内酯化物又称银杏叶萜内酯，由二萜内酯和倍半萜类内酯组成，目前已分离出多种萜内酯，统称为银杏内酯，主要银杏内酯有银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、银杏内酯M、银杏内酯J和白果内酯，它们都具有特殊立体化学结构。国外对这类成分做了大量化学、药理和临床研究，发现银杏内酯均为血小板活化因子强拮抗剂，其中银杏内酯B由于分子中醚氧与羰基氧之间的距离和血小板活化因子(PAF)中的相一致，活性最强。血小板活化因子(PAF)是由血小板和多种炎症细胞产生分泌的一种内源性磷脂，它是迄今为止发现最强的血小板聚集诱导剂，它直接参与血栓形成，与许多疾病的发生、发展密切相关。此外，银杏内酯对单一缺血损伤和中枢神经系统有保护作用，具有抗过敏、抗休克、抗器官移植排斥反应等作用。因此，银杏内酯类是银杏叶中特殊生理活性的最重要成分，具有很高的药用价值和广阔的临床应用前景。银杏内酯化合物的分子骨架由20个碳原子组成，具有6个五元环，其中有2个五元碳环、3个五元内酯环、1个四氢呋喃环，两个五元碳环以螺环的形式连接在一起，其余的环以稠合的方式连接，形成一个刚性笼状的特殊立体化学结构，具有天然产物中罕见的叔丁基。银杏内酯的复杂化学结构决定了化学合成的困难性，因此天然提取工艺将是生产银杏内酯的主要发展方向。银杏内酯含量很低，干燥叶片含量仅为0.001～0.8％，且结构独特，提取分离步骤繁琐，得率低。国外一般采用有机溶剂多级萃取与硅藻土、硅胶吸附-洗脱或活性炭吸附-洗脱与醋酸沉淀法相结合的提取方法。国内有研究学者将甲醇浸提的粗提物经氧化铝、硅胶柱、活性炭三柱分离与乙酸己酯萃取相结合的办法，最终得到90％的内酯产品，工艺应用了三种柱色谱法，加上萃取过程，非常复杂。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供一种银杏内酯的提取方法，该方法对设备要求简单，提取纯度高。

本发明提供的技术方案是银杏内酯的提取方法，包括以下步骤：

1)将银杏叶粉碎，加入50～70v％乙醇回流提取，过滤，滤液调节pH值至4～5，减压浓缩，冷藏，备用；

2)萃取：将冷藏液先用石油醚萃取，取水相加入乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯相减压浓缩，干燥，得到银杏内酯粗提物；

3)将银杏内酯粗提物加水搅拌，加入银杏内酯粗提物重量1～5％的氯化铵，在微波300M～3000MHz、50～80W下辐射下10～30s，得到混合液；

4)将混合液上D131大孔树脂柱，水洗柱至无色，然后用60～80v％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收乙醇洗脱液中的乙醇，离心，过滤，取滤渣干燥即得银杏内酯。

步骤1)中，采用枸橼酸、苹果酸或山梨酸调节pH值。调节pH值是为了防止银杏内酯在碱性条件下开环，银杏内酯为5元环，在弱酸性条件下稳定。

加入抗氧化剂可以防止银杏内酯受热氧化分解。抗氧化剂为丝氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺或苏氨酸。

冷藏是为了使油水分离，去除水中脂溶性杂质。冷藏温度为1～4℃。

步骤2)中，正己烷或石油醚萃取，银杏内酯不溶于石油醚，是为了去除叶绿素，银杏酚酸等杂质，银杏内酯进入水相。再用脂溶性溶剂乙酸乙酯，银杏内酯溶于乙酸乙酯，而银杏黄酮在乙酸乙酯中的溶解性较低，在热水中和含水醇中溶解度较大，因此乙酸乙酯萃取银杏内酯，将其与银杏黄酮类化合物分离。

步骤3)中，银杏内酯具有独特的C₂₀笼型结构，这类化合物都含有一个螺[4,4]壬烷系统(A环和B环)，一个四氢呋喃环(D环)和3个γ-内酯环(C、E和F环)，并有一个特丁基侧链。顺式稠合的五元环F、A、D、C以特定方式折叠，形成一个大小恰当的半球形腔，这个半球形腔富含电子。在300M～3000MHz较低频率的微波辐射下，NH₄ ⁺进入银杏内酯独特的半球形腔室内部并与形成微弱的键和。

步骤4)中，D131大孔树脂是在大孔结构的丙烯酸共聚交联高分子基体上带有羧酸基-COOH的交换树脂，由于银杏内酯与氯化铵形成了微弱的键和，由于NH₄ ⁺被包覆于半球形腔体内，无法与树脂上的羧酸基-COOH进行反应，只能形成微弱的键和，导致银杏内酯借由NH₄ ⁺被优先吸附于树脂上，并迅速达到吸附饱和，其他杂质则不被吸附。

60～80v％的乙醇强的洗脱作用，可顺利将吸附于树脂上的银杏内酯洗脱下来，氯化铵与树脂发生离子交换，NH₄ ⁺进入树脂，HCl被乙醇一并洗脱下来。乙醇用量为6～8BV。盐酸溶于水，而银杏内酯不溶于水，因此通过离心过滤，可以顺利将盐酸除去。

本发明对设备要求简单，提取的银杏内酯的纯度为98％以上。

具体实施方式

以下具体实施例对本发明作进一步阐述，但不作为对本发明的限定。

实施例1

1)将银杏叶粉碎，加入其重量0.1％的丝氨酸，加入50v％乙醇回流提取1h，过滤，采用枸橼酸调节滤液pH值至4，减压浓缩，在1℃下冷藏，备用；

2)萃取：将冷藏液先用石油醚萃取，取水相加入乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯相减压浓缩，干燥，得到银杏内酯粗提物；

3)将银杏内酯粗提物加水搅拌，加入银杏内酯粗提物重量1％的氯化铵，在微波300MHz、50W下辐射下10s，得到混合液；

4)将混合液上D131大孔树脂柱，水洗柱至无色，然后用60v％乙醇洗脱，乙醇用量为6BV，收集乙醇洗脱液，回收乙醇洗脱液中的乙醇，离心，过滤，取滤渣干燥即得银杏内酯。

经HLPC法分析，银杏内酯的纯度为98.1％。

实施例2

1)将银杏叶粉碎，加入其重量1％的蛋氨酸，加入70v％乙醇回流提取2h，过滤，采用苹果酸酸调节滤液pH值至5，减压浓缩，在4℃下冷藏，备用；

2)萃取：将冷藏液先用石油醚萃取，取水相加入乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯相减压浓缩，干燥，得到银杏内酯粗提物；

3)将银杏内酯粗提物加水搅拌，加入银杏内酯粗提物重量5％的氯化铵，在微波3000MHz、80W下辐射下30s，得到混合液；

4)将混合液上D131大孔树脂柱，水洗柱至无色，然后用80v％乙醇洗脱，乙醇用量为8BV，收集乙醇洗脱液，回收乙醇洗脱液中的乙醇，离心，过滤，取滤渣干燥即得银杏内酯。

经HLPC法分析，银杏内酯的纯度为98.2％。

实施例3

1)将银杏叶粉碎，加入其重量0.5％的天冬酰胺，加入60v％乙醇回流提取，过滤，采用山梨酸调节滤液pH值至4.5，减压浓缩，在2℃下冷藏，备用；

2)萃取：将冷藏液先用石油醚萃取，取水相加入乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯相减压浓缩，干燥，得到银杏内酯粗提物；

3)将银杏内酯粗提物加水搅拌，加入银杏内酯粗提物重量2％的氯化铵，在微波1000MHz、60W下辐射下25s，得到混合液；

4)将混合液上D131大孔树脂柱，水洗柱至无色，然后用70v％乙醇洗脱，乙醇用量为7BV，收集乙醇洗脱液，回收乙醇洗脱液中的乙醇，离心，过滤，取滤渣干燥即得银杏内酯。

经HLPC法分析，银杏内酯的纯度为98.5％。

实施例4

1)将银杏叶粉碎，加入其重量0.1％的苏氨酸，加入70v％乙醇回流提取，过滤，采用枸橼酸调节滤液pH值至4，减压浓缩，在4℃下冷藏，备用；

2)萃取：将冷藏液先用石油醚萃取，取水相加入乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯相减压浓缩，干燥，得到银杏内酯粗提物；

3)将银杏内酯粗提物加水搅拌，加入银杏内酯粗提物重量1％的氯化铵，在微波3000MHz、50W下辐射下30s，得到混合液；

4)将混合液上D131大孔树脂柱，水洗柱至无色，然后用60v％乙醇洗脱，乙醇用量为8BV，收集乙醇洗脱液，回收乙醇洗脱液中的乙醇，离心，过滤，取滤渣干燥即得银杏内酯。

经HLPC法分析，银杏内酯的纯度为98.4％。

Claims (2)

1.银杏内酯的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)将银杏叶粉碎，加入其重量0.1～1％的抗氧化剂，加入50～70v％乙醇回流提取，过滤，滤液采用枸橼酸、苹果酸或山梨酸调节pH值至4～5，减压浓缩，在1～4℃下冷藏，备用；所述抗氧化剂为丝氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺或苏氨酸；

2)萃取：将冷藏液先用石油醚萃取，取水相加入乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯相减压浓缩，干燥，得到银杏内酯粗提物；

3)将银杏内酯粗提物加水搅拌，加入银杏内酯粗提物重量1～5％的氯化铵，在微波300M～3000MHz、50～80W下辐射下10～30s，得到混合液；

4)将混合液上D131大孔树脂柱，水洗柱至无色，然后用60～80v％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，回收乙醇洗脱液中的乙醇，离心，过滤，取滤渣干燥即得银杏内酯。

2.根据权利要求1所述的银杏内酯的提取方法，其特征在于：步骤4)中，乙醇用量为6～8BV。